猪瘟病毒感染细胞的代谢组学及葡萄糖促进猪瘟病毒增殖的研究

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’分类号密级公开ＵＤＣ保密期限籌硕士学位论文题口猪癌■病毒感染细胞的代谢组学及葡萄糖促进猪瘟病毒增殖的研究作者姓名张必凯指导教师涂长春研究员培养单位军事医学科学院军事兽医研究所专业名称预防善医学２０１７年５月２３日论文提交日期学位授予单位中国人民解故军军事医学科學院答辩委员会主席钱爱东教授中国人民解放军军事医学科学院制 军事医学科学院研究生学位论文独创性声明秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风，本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得军事医学科学院或其它教育机构的学位或证书而便用过的材料一６与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意，论文作者签字：签字曰期年夂月曰军事医学科学院保护知识产权声明本学位论文作者完全了解军事医学科學院对研究生在学其间撰写的论文知识产权保护的相关规定。本人撰写的论文是在导师具体指导下，并得到二．相关研究经费支持下完成、其数据和研究成果归属导师和怍者本人知识产权鱼位属军事医学科学院。本人保证毕业后，以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为军事医学科学院。军事医学科学院有权保留学位论文及其电子版，，通过网站公布论文的全部或部分内容、可以采用影印缩印或其他复制手段保存论文、汇编以供查阅和借阅４（涉密和延期公开学位论文在解密后适用本审明）：日论文作者签字签字期：年少月曰指导教师签字：签字曰期日：年广月久汽夕｛ｊ 目录英文缩略词表.........................................................................................................................I摘要....................................................................................................................................IIIAbstract.................................................................................................................................V前言......................................................................................................................................1第一章猪瘟病毒感染细胞的代谢组学研究......................................................................31实验材料....................................................................................................................31.1细胞与病毒.....................................................................................................31.2主要试剂.........................................................................................................31.3主要仪器.........................................................................................................32实验方法....................................................................................................................42.1细胞培养.........................................................................................................42.2代谢组学分组安排.........................................................................................42.3色谱串联质谱分析样品信息.........................................................................52.4数据处理及分析.............................................................................................62.5代谢物鉴定.....................................................................................................73实验结果....................................................................................................................73.1原始谱图可视化检查......................................................................................73.2数据预处理.....................................................................................................93.3数据多维统计分析.........................................................................................93.4OPLS-DA模型准确性评价..........................................................................153.5代谢物鉴定...................................................................................................153.6差异代谢物聚类分析...................................................................................243.7差异代谢物的通路分析...............................................................................264小结与讨论..............................................................................................................28第二章葡萄糖促进猪瘟病毒增殖的研究........................................................................301实验材料..................................................................................................................301.1细胞与病毒...................................................................................................301.2主要试剂.......................................................................................................301.3主要仪器.......................................................................................................311.4试剂配制.......................................................................................................322实验方法..................................................................................................................322.1细胞培养.......................................................................................................322.2葡萄糖和谷氨酰胺对猪瘟病毒增殖的影响...............................................33 2.3猪瘟病毒TCID50测定.................................................................................342.4提取RNA及反转录.....................................................................................342.5猪瘟病毒基因组拷贝数测定.......................................................................352.6细胞总蛋白提取...........................................................................................352.7蛋白浓度测定...............................................................................................36pro2.8猪瘟病毒N蛋白表达的检测...................................................................362.9猪瘟病毒感染对ST细胞摄入葡萄糖的影响............................................362.10猪瘟病毒对糖酵解相关酶基因表达的影响.............................................372.11猪瘟病毒对PKM2表达影响.....................................................................393实验结果..................................................................................................................393.1葡萄糖剥夺抑制猪瘟病毒的增殖...............................................................393.2细胞增殖能力检测.......................................................................................403.3葡萄糖回补促进猪瘟病毒增殖...................................................................413.42-DG抑制猪瘟病毒的增殖..........................................................................413.5猪瘟病毒感染促进ST细胞对葡萄糖的摄取............................................423.6猪瘟病毒感染对糖酵解关键酶表达影响...................................................423.7猪瘟病毒感染不影响PKM2的表达..........................................................434小结与讨论..............................................................................................................44结论....................................................................................................................................46参考文献..............................................................................................................................47个人简介..............................................................................................................................52致谢....................................................................................................................................53 军事医学科学院硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称2-DG2-deoxyglucose2-脱氧葡萄糖BVDVBovineviraldiarrheavirus牛病毒性腹泻病毒cDNAComplementaryDNA互补DNACSFVClassicalswinefevervirus猪瘟病毒ddH2Odoubledistilledwater双蒸水DENVDenguevirus登革病毒DMEMDulbecco'sModifiedEagle'sMedium改良必需培养基ESIElectrosprayionization电喷雾电离FAMCarboxyfluorescein羟基荧光素FBSFetalbovineserum胎牛血清GC-MSGasChromatography-MassSpectrometer气相色谱串联质谱HCVHepatitisCvirus丙型肝炎病毒HCMVHumancytomegalovirus人巨细胞病毒IFAIndirectimmunofluorescentantibodyassay间接免疫荧光试验KDKilodaton千道尔顿mAbMonoclonalantibody单克隆抗体Minminute分钟mRNAMessengerRNA信使RNANCNitrocellulosemembrane硝酸纤维素膜ODOpticaldensity吸光度OIEOfficeInternationalDesEpizooties世界动物卫生组织OrthogonalsinglecollectionpartialleastOPLS-DA正交偏最小二乘判别分析squaresdiscriminantanalysisORFOpenReadingFrame开放阅读框PabPolyclonalantibody多克隆抗体PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PBSTPhosphatebufferedsalinetween-20磷酸盐吐温缓冲液PLS-DAPartialleastsquares-discriiminateanalysis偏最小二乘判别分析PCAPrincipalcomponentanalysis主成分分析PRPPPyrophosphate-5-ribosephosphate5-磷酸核糖焦磷酸QCQualityControl质量控制RpmRevolutionsperminute每分钟转速RRTResponsepermutationtesting响应排序检验Reversetranscription-PolymerasechainRT-PCR反转录-聚合酶链式反应reactionssecond秒SodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelSDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳electrophoresisSTSwinetesticlecell猪睾丸细胞I 军事医学科学院硕士学位论文SRBSulforhodamineB磺酰罗丹明BTACTrichloroaceticAcid三氯乙酸TICTotalionchromatogram总离子色谱图TCATricarboxylicacidcycle三羧酸循环TritonX-100TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚TCID5050%Tissuecultureinfectivedose半数细胞感染量Ultraperformanceliquidchromatography-超高效液相色谱串UPLC-Q-TOF/MSquadrupole-timeofflight/massspectrometry联飞行时间质谱VACVVacciniavirus牛痘病毒VIPVariableimportantinprojection变量权重值II 军事医学科学院硕士学位论文猪瘟病毒感染细胞的代谢组学及葡萄糖促进猪瘟病毒增殖的研究摘要猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）是黄病毒科瘟病毒属的一员，为具有囊膜的单股不分节段正链RNA病毒，基因组全长约12.3Kb，其含有一个能编码4个结构蛋白和8个非结构蛋白的开放阅读框（OpenReadingFrame，ORF）。CSFV引起的猪瘟是猪的一种以广泛出血、高热和免疫抑制为主要特征的烈性传染病。猪瘟爆发造成重大经济损失，被世界动物卫生组织（OfficeInternationalDesEpizooties，OIE）列为必须申报的动物传染病，我国将其列为一类传染病。目前几乎无治疗猪瘟的方法，因此有必要阐释猪瘟病毒感染时宿主和病毒的互作机制，以便开发出疫苗或者靶向药物以有效控制感染。感染病毒的细胞代谢会发生改变，这些改变不仅能为病毒粒子增殖提供特定的物质合成前体，同时也可增加宿主细胞的生存能力。不同病毒对被感染细胞代谢的改变有既有共性，也有差异之处。许多病毒感染会引起宿主有氧糖酵解即瓦尔堡效应，有些病毒感染能促进宿主脂肪酸合成和谷氨酰胺代谢。因此有必要明确病毒怎么改变细胞代谢以及这些改变发生在病毒生活史的哪个阶段，这将有助于人们更好的理解病毒复制与感染所需要的条件，为抑制病毒在细胞内增殖提供潜在靶点，从而为抗病毒研究提供新思路。本研究采用基于超高效液相色谱串联飞行时间质谱（Ultraperformanceliquidchromatography-quadrupole-timeofflight/massspectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）和气相色谱飞行时间质谱联用（GasChromatography-MassSpectrometer，GC-MS）的代谢组学方法对猪睾丸细胞（Swinetesticlecell，ST）感染猪瘟病毒后12h、24h和48h实验组及对照组的代谢物进行了检测和统计学分析，建立包括主成分分析、偏最小二乘判别分析和正交偏最小二乘判别分析在内的多维统计分析模型，并结合单维统计分析筛选出差异代谢物。之后将UPLC-Q-TOF/MS在正负离子两种模式下筛选到的差异代谢物和progenesisQI软件自带数据库比对定性，GC-MS筛选到的差异代谢物通过和NIST数据库及Feihn代谢组学数据库比对判定，综合UPLC-Q-TOF/MS和GC-MS实验数据可知CSFV感染ST细胞后导致214种代谢物发生改变，其中脂类有102个（磷脂占75个）、氨基酸有36个、碳水化合物有33个、核苷酸有24个，其他如辅酶及激素类物质共计19个。将差异代谢物进行pathway分析，发现ST细胞感染猪瘟病毒后发生紊乱的代谢通路包括磷脂代谢、氨基酸合成、氨酰-tRNA合成、嘧啶代谢、碳代谢及泛酸与辅酶A代谢，氨基酸中的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢，代谢组学实验结果证实了猪瘟病毒感染ST细胞后引起宿主细胞代谢的强烈变化。III 军事医学科学院硕士学位论文代谢组学结果显示感染猪瘟病毒后，细胞内关键代谢通路中的多个代谢物有明显变化，然而并不清楚这些改变对猪瘟病毒复制的意义。基于此，本课题研究了葡萄糖和谷氨酰胺代谢对猪瘟病毒增殖的影响，首先用特定培养基培养感染CSFV的ST细胞，结果发现培养基中缺乏葡萄糖时，猪瘟病毒滴度显著低于正常培养基组和缺乏谷氨酰胺组。向葡萄糖剥夺培养基中回补一定的葡萄糖，24h后收集样品测定病毒滴度。结果显示，培养基中葡萄糖浓度在0-1.0g/L时，病毒滴度随着葡萄糖浓度增加而显著升高，当葡萄糖浓度大于1.0g/L后，病毒滴度不再随浓度升高而变化，表明1.0g/L葡萄糖即可实现病毒的最佳增殖。在正常培养基中分别加入0mM、25mM和50mM的葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG），结果显示2-DG处理病毒感染细胞能显著抑制猪瘟病毒增殖，且pro浓度越高抑制效果越明显。Westernblot在蛋白水平验证了葡萄糖对CSFVN蛋白表达影pro响，抗体是针对SM株N抗原表位设计，能与SM株的很好反应，但不能与GD53株反pro应，从感染SM组的结果来看，缺少葡萄糖时，N表达量显著下降。结合培养基剥夺葡萄糖实验和葡萄糖回补及抑制实验，可以证明猪瘟病毒正常复制增殖离不开葡萄糖。本研究也初步研究了葡萄糖影响CSFV增殖的具体环节，分别测定胞内和胞外样品的病毒滴度和基因组拷贝数，发现葡萄糖剥夺组胞内胞外的CSFV基因组拷贝数及感染性病毒粒子均显著低于对照组，说明葡萄糖是猪瘟病毒复制成熟必不可缺的物质。缺少葡萄糖组的胞内胞外滴度几乎无差别，而其基因组拷贝数相差10倍以上，可以排除葡萄糖在猪瘟病毒释放时发挥作用。为进一步研究何种葡萄糖利用方式影响猪瘟病毒增殖，在正常培养基中加入草氨酸盐抑制丙酮酸向乳酸代谢，结果发现抑制乳酸产生并不影响感染性病毒粒子的产生，表明无氧糖酵解之外的糖代谢通路影响了猪瘟病毒的增殖。最后检测了感染猪瘟病毒后对糖代谢的影响，结果表明感染猪瘟病毒组的细胞相较对照组摄入更多葡萄糖。本研究用色谱质谱联用的代谢组学技术手段筛选了猪瘟病毒感染ST细胞后引起的代谢改变，首次获得我国猪瘟病毒流行毒株感染细胞的代谢全谱。并结合猪瘟病毒增殖动力学比较不同时间点接种病毒组与对照组差异代谢物，发现猪瘟病毒感染细胞引起糖类、脂类、氨基酸和核苷酸等多种代谢物显著变化，并且不同时间点差异代谢物的种类以及升降变化侧重不同，这与猪瘟病毒生活史相对应。代谢组学结果为猪瘟病毒研究提供了切入点，针对这些代谢紊乱分析研究，将有助于揭示猪瘟病毒复制和致病的分子机制，并为猪瘟病毒的科学诊断防控提供参考。此外我们也进一步探究了个别重要代谢通路改变对猪瘟病毒增殖影响，实验证明谷氨酰胺的有无对猪瘟病毒增殖影响不大，而葡萄糖的存在及正常代谢对猪瘟病毒增殖至关重要，缺少葡萄糖则CSFV无法正常复制，本研究为进一步揭示CSFV复制过程中对宿主细胞糖代谢的调节和利用的机制提供了实验依据。关键词：猪瘟病毒，代谢组学，葡萄糖，糖酵解IV 军事医学科学院硕士学位论文Metabolomicsprofilingofclassicalswinefevervirus-infectedcellsandglucosepromotesthepropagationofclassicalswinefevervirusAbstractClassicalswinefevervirus(CSFV),amemberofthePestivirusgenusoftheFlaviviridaefamily,isansmallenveloped,non-segmentedsinglestrandedRNAvirus,thegenomeofwhichisabout12.3KbandcarriesonelargeORFencodingapolyprotein,thelattercanbeprocessedbyviralandhostproteaseto4structuraland8nonstructuralproteins.ClassicalswinefevercausedbyCSFVisaseverelyswineinfectiousdisease,whichischaracterizedbyextensivehemorrhage,highfever,andimmunosuppression.Theoutbreakofclassicalswinefeverhascausedhugeeconomiclosses,itislistedasananimalinfectiousdiseasethatmustbedeclaredbytheworldorganizationforanimalhealth(OIE),andruledasclassoneanimaldiseasebyChinesegovernment.SoitisnecessarytoclarifytheinteractionbetweenhostandCSFVduringviralinfection,inordertodevelopvaccinesortargeteddrugstoeffectivelycontrolCSFVinfection.Manyviralinfectionshijackedthehostaerobicglycolysis,thatistheWarburgeffect,theyalsocanexploithostfattyacidsynthesisandglutaminemetabolism.Alterationofthecarbonsourceissuitablewiththedemandforenergyintheprocessofviralreplicationandtheassemblyofviralparticles,thesechangescannotonlyprovidespecificbiosyntheticprecursorsfortheproliferationofvirusparticles,butalsocanincreasethesurvivalofhostcells.Thevirusisnotonlycommontothechangeofmetabolismininfectedcells,butalsohasauniquemetabolicchangeduetothedifferenceofvirusspecies.Soitisnecessarytoidentifyhowtheviruschangescellmetabolismandthesemetabolicchangesoccurredinwhichstageoftheviruslifecycle,whichimprovesbetterunderstandingaboutthevirusrequirementsinreplication,andthiswilalsoprovidenewinsightsintoexploringpotentialtargetsforinhibitionofvirusproliferationincellandthendevelopingeffectiveantiviraldrugs.Inthisstudy,ultraperformanceliquidchromatography-quadrupoletimeofflight/massspectrometry(UPLC-Q-TOF/MS)andGasChromatography-MassSpectrometer(GC-MS)wereusedtodeterminethedifferentialmetabolitesininfectedswinetesticularcells(ST)occurredat12h,24hand48hpostinfection,andsubsequentlyanalyzedwithprincipalcomponentanalysis(PCA),partialleastsquaresdiscriminantanalysis(PLS-DA)andorthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis(OPLS-DA).ThedifferentialmetabolitesscreenedbyUPLC-Q-TOF/MSunderbothpositiveandnegativeionswerealignedwithprogenesisQIsoftwaredatabasetoqualitativetheobtainedmetabolites,andthedifferential,metabolitesscreenedbyGC-MSwereV 军事医学科学院硕士学位论文alignedwithNISTdatabaseandFeihndatabase.TheintegratedexperimentaldataofUPLC-Q-TOF/MSandGC-MSshowthat214differentialmetaboliteswerefoundinCSFVinfected-STcellsatthreedifferenttimepoints,including102lipids(75outof102arephospholipids),36aminoacids,33carbohydrates,24nucleotides,and19coenzymeandhormonessubstances.Formetabolicpathwayanalysis,thedifferentialmetaboliteswereanalyzedwithKEGGandseveralmetabolicpathwaysweresignificantlyalteredduringCSFinfection,includingphospholipidmetabolism,biosynthesisofaminoacids,aminoacyl-tRNAPyrimidinemetabolism,carbonmetabolismandpantothenateandCoAbiosynthesis,planine,aspartateandglutamatemetabolism,andphenylalanine,tyrosineandtryptophanbiosynthesis.TheabovemetabonomicresultsconfirmedthatCSFVinfectionnotablyalteredthehostcellmetabolism.MetabolomicsprofilingofCSFV-infectedcellsshowedthatanumberofmetabolitesinthekeymetabolicpathwayweresignificantlyaltered,butitisnotclearwhichalteredmetabolitesaremoremeaningfultoCSFVreplication.Inthiscase,theeffectsofglucoseandglutaminemetabolismontheproliferationofCSFVwerestudied.First,STcellsinfectedwithCSFVcell-adaptedfieldstrainGD53/2011wereculturedwithDMEMdeprivedofglucoseorglutamine,andtheresultsshowedthatglucosedeprivationsignificantlyinhibitedthetiterofCSFVcomparedtothemockgroup,butglutaminedeprivationhasfeweffectontheCSFVpropagation.InhibitionofCSFVreplicationbyglucosestarvationwasalsoconfirmedbytheprodecreasedNexpressionlevelsininfectedcells.Further,differentconcentrationsofglucosewereaddedtotheDMEMdeprivedofglucose,whichwereusedtocultureSTcellsinfectedwithCSFV,andtheviraltiterwasmeasuredat24hpostinfection.Asaresult,theinfectioustiterofCSFVincreasedwiththeglucoseconcentrationandreachedpeakat1g/Lglucose,indicatingthatglucoseiscriticalfortheoptimalreplicationofCSFV.Inaddition,glucoseanalog2-deoxyglucose(2-DG)wasaddedtonormalDMEMat0mM,25mMand50mMrespectively,thenusedtocultureCSFV-infectedcells,theresultsshowedthattheproliferationofvirusinfectionwassignificantlyinhibitedin2-DGtreatedcells,theinhibitioneffectdependsontheconcentrationof2-DG.Inaddition,theeffectsofglucoseontheviralstagesofCSFVlifecyclewerealsoanalyzed,resultsoftheinfectioustiterandgenomecopynumbersintheintracellularandextracellularsamplesindicatedthatthenumberofCSFVgenomecopiesandtheinfectioustiterinintracellularandextracellularsamplesweresignificantlylowerthanthatofthesamplesinthecompletemedium.Meanwhile,theinfectioustiterinintracellularsamplesunderglucoseVI 军事医学科学院硕士学位论文starvationisidenticalwiththatintheextracellularsamples,althoughthegenomecopynumbersinintracellularwas10timeshigherthaninextracellular,indicatingthatglucoseisaessentialmaterialinCSFVreplicationandmatureratherthaninrelease.Further,wefoundthatinhibitionoflacticacidproductionhadnoeffectonthegenerationofinfectiousvirusparticles.Finally,moreglucosewasobservedtobetakenintotheCSFV-infectedcellsincomparisonwiththecontrolgroup.Inthisstudy,themetabolomicsprofilingofCSFV-infectedSTcellswerescreenedbyUPLC-MSandGC-MS，manymetabolitesandassociatedwithmetabolicpathwayswerealteredduringCSFVinfection,includingsugars,lipids,aminoacidsandnucleotides,thetypesandthevariationofindividualmetabolitesweredifferentatdifferenttimepoints,whichiscorrespondstothelifecycleofCSFV.Inaddition,wealsostudiedtheroleofglucoseandglutamineintheviralreplication,assemblyandreleaseofCSFV,andglucosewasfoundtobecriticalfortheoptimalreplicationofCSFV,butglutamineisnotnecessary.Takentogether,thus,thisstudywillbehelpfultorevealthemolecularmechanismsofreplicationandpathogenesisofCSFV.Keywords:classicalswinefevervirus,metabonomics,glucose,glycolysisVII 军事医学科学院硕士学位论文前言猪瘟病毒引起的猪瘟具有很高的发病率及病死率，临床上以预防为主，世界上许多国[1]家使用我国研制的猪瘟兔化弱毒消灭了本国的猪瘟。虽然我国对猪瘟采取强制免疫措施，然而猪瘟在我国仍时有发生，主要原因是猪瘟病毒不断进化变异，有时疫苗接种不能起到[2,3]免疫保护作用。因此需要加强对流行毒株的研究力度，以期增进对流行毒株感染复制机理的认识。病毒的感染和复制，依赖于宿主细胞提供代谢复合物及生物合成机制，分析[4]病毒引发的代谢改变可以挖掘出与病毒复制及致病相关的代谢物。深入研究病毒生活史真正需要的代谢通路有助于揭示病毒感染和致病的机制，从而完善宿主细胞对病毒感染的反应模式。病毒感染对宿主细胞代谢影响是目前病毒学研究领域的一个热点，其中最常用的技术[5]手段是代谢组学。代谢组学是一个用于高通量鉴别、定性和定量内源性或外源性代谢物[6]新的“组学”手段，为整合不同层次的信息以更好的理解生物系统提供了新的内容。该学科的实质是同时获得一定量的代谢物以描述特定情况下的代谢状态，从而反映内源代谢物[7]微小的代谢变化。基于代谢组学的高灵敏度和特异性，它被认为是研究宿主和病毒之间相互作用的有效工具。目前已有关于人巨细胞病毒（Humancytomegalovirus，HCMV）、人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus，HIV）、乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）、丙肝病毒（HepatitisCvirus，HCV）和登革病毒（Denguevirus，DENV）等病毒[8]感染和宿主代谢之间联系的研究，研究发现病毒感染引起宿主细胞核苷酸合成、氨基酸[9][10]代谢、脂合成、糖酵解、三羧酸循环（Tricarboxylicacidcycle，TCA）和磷酸戊糖途[11]径代谢的改变。对与猪瘟病毒同属黄病毒科中的HCV及DENV深入研究发现病毒感染[12]后能引起细胞代谢通路的改变，这些变化与病毒生活史关系密切，只有补足必需的物质[13]和能量才能使病毒粒子高效复制增殖。葡萄糖和谷氨酰胺是哺乳动物细胞维持能量代谢和生物合成利用最多的碳源。通常认[14]为葡萄糖通过氧化磷酸化供给细胞所需ATP。然而研究发现，相较正常细胞，大多数[15]病毒的增殖会引发糖酵解，早在1950和1960年代就有研究显示病毒感染细胞需要糖酵解，在MEM培养基中脊髓灰质炎病毒的传播被阻滞，然而补充葡萄糖能使病毒滴度有明[16]显提高。后来又在逆转录病毒科、双链DNA病毒疱疹病毒及单股正链RNA病毒黄病[17-19]毒科上证实病毒感染会劫持糖酵解途径来完成病毒的生命周期，一些肿瘤细胞或者病毒感染的宿主细胞需要更多的葡萄糖，葡萄糖碳并不参与TCA循环而是靠谷氨酰胺代谢回补TCA循环，比如HCMV感染的细胞用谷氨酰胺维持TCA循环从而使得葡萄糖碳用[20]于脂肪酸合成。而牛痘病毒（Vacciniavirus，VACV）利用碳的程序比较独特，其感染HFF细胞后并不促进糖酵解中间产物产生，葡萄糖的有无不影响其复制增殖，谷氨酰胺对1 军事医学科学院硕士学位论文[21]病毒增殖则必不可少。这些结果说明不同的病毒的代谢需求既有共性也有特性。[22]本研究以近年流行于我国的猪瘟病毒2.1亚型GD53/2011株为研究对象，用代谢组学技术手段对GD53/2011感染细胞后的代谢情况进行分析，筛选出了多种差异代谢物并将其归属到关键代谢通路进行分析。基于代谢组学分析结果，本实验进一步研究了猪瘟病毒增殖过程所必需的营养物。2 军事医学科学院硕士学位论文第一章猪瘟病毒感染细胞的代谢组学研究病毒感染和复制需要宿主细胞提供能量和生物大分子，为了实现最佳复制增殖病毒会引发细胞代谢程序的改变，因此分析病毒感染后宿主代谢变化有助于解释与感染有关的临[23]床症状及病理变化，并为寻找用于早期诊断的生物标志物提供参考。近年来兴起的代谢[24]组学为研究病毒感染引起机体或细胞的代谢变化提供了有力支持，已有多项研究证实病[25]毒感染引起宿主动物或细胞多条代谢通路发生显著变化，这种改变与病毒感染及复制进[26]程密不可分。同时这些研究提供的病毒感染相关代谢谱，对病毒感染的分子机制研究及[27]疾病的防控具有重要意义。本研究利用具有高分辨率和灵敏性的超高效液相色谱串联飞行时间质谱和气相色谱飞行时间质谱联用的代谢组学方法筛选ST细胞感染猪瘟病毒后的差异代谢物，发现猪瘟病毒感染导致细胞内脂质代谢、核苷酸代谢、糖代谢和氨基酸代谢等代谢通路发生明显改变。针对这些感染细胞代谢紊乱的分析研究，将有助于揭示猪瘟病毒复制和致病的分子机制，并为猪瘟病毒的科学诊断防控提供参考。1实验材料1.1细胞与病毒6.5猪瘟病毒体外细胞适应的基因2.1c亚亚型流行毒株GD53/2011（F48，TCID50=10/mL）和猪睾丸细胞系（ST）均由本实验室保存。1.2主要试剂无BVDV污染的胎牛血清FBS购自Sigma公司。DMEM培养基、胰酶购自美国Corning公司，100×青霉素和链霉素双抗购自美国PAA公司。色谱级甲醇购自德国Merck公司，超纯水为实验室自行制备。甲氧胺盐酸吡啶溶液、TMCS、BSTFA和正己烷购自上海安谱实验科技股份有限公司。1.3主要仪器仪器名称厂家及型号二氧化碳细胞培养箱美国ThermoScientific公司3111二级生物安全柜美国ThermoScientific1300系列A2型普通倒置显微镜日本Olympus公司超低温冰箱美国ThermoScientific公司Forma700气相色谱飞行时间质谱联用仪安捷伦科技(中国)有限公司7890A-5975C3 军事医学科学院硕士学位论文超高效液相色谱串联飞行时间质谱美国Waters公司UPLC-Q-TOF/MS超纯水制备装置美国Millipore公司MILLI-Q超声破碎仪宁波新芝生物科技有限公司JY92-IIN型振荡培养箱中国峥嵘仪器厂SHZ-82漩涡振荡器上海汗诺仪器有限公司TYXH-I真空干燥箱上海慧泰仪器制造有限公司DZF-6021冷冻浓缩离心干燥器太仓市华美生化仪器厂LNG-T98UPLC-Q-TOF/MS色谱柱美国Waters公司BEHC18柱GC-MS色谱柱加拿大J&WScientific公司DB-5MS柱2实验方法2.1细胞培养ST细胞在37℃，5%CO2培养箱中培养，使用含有5%无BVDV污染的胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM作为细胞培养基。2.2代谢组学分组安排实验共分12组，每组设置8个重复。其中6组样品用UPLC-Q-TOF/MS筛选差异代谢物，分不同时间点将实验组及相应对照组各设3组。另外6组样品用GC-MS筛选差异代谢物，分组安排与UPLC-Q-TOF/MS相同，具体分组安排如表1.1。表1.1代谢组学样品分组Table1.1GroupingofsamplesforMetabonomics分析方法收集时间正常对照组感染组UPLC-Q-TOF/MS12hpiA1B1UPLC-Q-TOF/MS24hpiA2B2UPLC-Q-TOF/MS36hpiA3B3GC-MS12hpiA4B4GC-MS24hpiA5B5GC-MS36hpiA6B64 军事医学科学院硕士学位论文2.2.1细胞样品收集5ST细胞扩大培养后传代至10cm平皿，计数后将细胞密度调至1.25×10个/mL，培养12h后接种病毒：用PBS洗两遍后加入不含血清及双抗的双无DMEM培养基，按感染复数0.3接种GD53/2011细胞毒，37℃感作2h后用PBS洗去未与细胞结合的病毒，然后换用正常细胞培养基继续培养。分别在感染GD53/2011后12h、24h和48h收集样品：先倒掉细胞培养上清，细胞用预冷的PBS快速洗两次，倒掉PBS并用移液器吸尽残余液体，立即用适量液氮覆盖细胞表面以淬灭细胞代谢，液氮挥发后用预冷的细胞刮刀刮取细胞，然后每个平皿各用1mL预冷的甲醇-水（4:1,v/v）混合液将细胞悬起，之后转移到预冷的1.5mL离心管中，-80℃超低温保存或运输。2.2.2细胞代谢物的提取利用UPLC-Q-TOF/MS和GC-MS分析鉴定细胞内代谢物之前，需采用不同的方法来提取细胞中的小分子代谢物。2.2.2.1用于UPLC-Q-TOF/MS分析的代谢物提取先向样品管中先加入两颗钢珠，然后超声破碎仪破碎细胞，样品超声时应在低温条件下进行;超声程序设置为工作6s，暂停4s，总计工作时间5min。超声结束后于-20℃静置10min，然后于4℃15,000rpm离心10min，离心后分别取200μL上清液利用UPLC-Q-TOF/MS在电喷雾正离子（Electrosprayionization+，ESI+）和负离子（Electrosprayionization-，ESI-）两种模式下进行代谢组学分析。2.2.2.2用于GC-MS分析的代谢物提取细胞用超声破碎仪破碎，超声及离心程序同2.2.2.1。离心后小心吸取300μL上清转入衍生瓶中，衍生化之前需用快速离心浓缩仪处理以使样品干燥。每瓶细胞样品加入80μL浓度为15mg/mL的甲氧胺盐酸吡啶溶液，充分振荡2min，然后置于振荡培养箱中在37°C条件下肟化90min。肟化反应结束后再加入等体积含1%TMCS的BSTFA衍生试剂和20μL正己烷，涡旋振荡2min后，于70℃反应60min。反应结束后于室温冷却30min后可用于GC/MS代谢组学分析。2.3色谱串联质谱分析样品信息样品提取后分别注入UPLC-Q-TOF/MS和GC-MS分析系统，为保证样品前处理和仪器分析系统的可靠性，检测样品时每10个分析样本中插入一个质控（QualityControl，QC）样本，两个平台各自取一组处理后的样品进行混合从而得到QC样品，QC样品和分析样品检测方法保持一致。5 军事医学科学院硕士学位论文2.3.1UPLC-Q-TOF/MS分析色谱程序：进样量为3μL，色谱柱用BEHC18柱，柱温45℃；流动相为A相-水和B相-乙腈体系，二者都含0.1%甲酸。梯度洗脱程序为：0-2min，5-20%B；2-4min，20-60%B；4-12min，60-100%B；12-14min，100%B，然后14-14.5min，100%-5%B，5%B维持1min，流速为0.40mL/min。质谱程序：分别在正离子扫描模式（ESI+）和负离子扫描模式（ESI-）下进行样品质谱信号的采集，采用电喷雾毛细管电压，进样电压和碰撞电压分别为:1.0kV，40V和6eV。去溶剂温度为500℃，载气流量为15L/min，EI源温度设定为120℃，质谱扫描区间为50-1000m/z，信息采集频率为扫描0.1s，间断0.02s。2.3.2GC-MS分析色谱程序：处理后的样品以无分流模式注入，色谱柱选用非极性的DB-5MS（30m×250μmi.d.,0.25 μm）毛细管柱。选择高纯度氮气作为流动相气体，以1.0mL/min的流速分离样品各组分。初温50℃，以15℃/min速率将温度升高至125℃，随后以5℃/min的速率升至210℃，然后以10℃/min的速率升至270℃，最后以20℃/min速率升高到305℃，并维持该温度5min。质谱程序：接口温度和离子源温度分别设置为260℃和230℃，电压-70V。质量扫描范围为50-600m/z，延迟5min后以20谱/秒速度采集信号。2.4数据处理及分析2.4.1UPLC-Q-TOF/MS数据处理及分析采用ProgenesisQI软件分别提取正负离子两种模式下检测所得的数据，然后降低基线噪音、解析包括分子离子峰、同位素离子峰和碎片离子峰在内的谱峰，再经积分、保留时间校正、峰匹配和归一化处理，最后输出三维矩阵，该矩阵含保留时间、质荷比和峰强度等信息，最后将正负离子模式下得到的数据统一整合到一个矩阵内。将获得的数据矩阵导入SIMCA-P+14.0软件包，采用无监督的主成分分析（Principalcomponentanalysis，PCA）和有监督的偏最小二乘法分析（Partialleastsquares-discriiminateanalysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法分析（Orthogonalsinglecollectionpartialleastsquaresdiscriminantanalysis，OPLS-DA）相结合的方式，对实验组与对照组之间的代谢差异进行区分。差异变量的标准是变量权重值（Variableimportantinprojection，VIP）大于1，同时要求经学生氏检验的p值小于0.05，同时满足这两个条件可认定为差异代谢物。模型质量的评估是通过响应排序检验（随机排列200次），以此避免模型过拟合。6 军事医学科学院硕士学位论文2.4.2GC-MS数据处理及分析GC/MS的原始数据经ChromaTOF软件预处理后导出包含样品信息、保留时间、质核比和质谱响应强度等信息的数据矩阵，需要甄别剔除矩阵中内标峰和包括衍生物化试剂峰、柱流失及噪音在内的的假阳性峰。经过消除冗余及峰合并，即可获得代谢物列表。用峰面积归一化法对样本质谱峰的响应强度进行归一化，得到归一化后的数据矩阵。随后矩阵的统计学分析及模型验证方法同2.4.1。2.5代谢物鉴定UPLC-Q-TOF/MS筛选的代谢物比对ProgenesisQI软件自带数据库从而对代谢物进行定性；GC-MS筛选的差异代谢物与Feihn数据库和NIST数据库进行比对，GC-MS工作站软件自行将获得的化合物特定离子片段谱的碎片质荷比及丰度与标准离子片段谱库比对，将匹配度在70%以上的物质认定为标准物。3实验结果3.1原始谱图可视化检查3.1.1UPLC-Q-TOF/MSST细胞感染猪瘟病毒组和对照组的细胞样品经超声破碎处理后，然后利用具备高分辨率和灵敏度UPLC-Q-TOF/MS进行分析，分别在正负离子源两种模式下检测。为监测分析系统的稳定性，将A2组的8个样品混合以制备QC样品，每测10个样品即加入1个QC样品用同样的方法分析，机器检测得到基峰离子流图。图1.1所示的是QC样本分别在正负两种电离模式下的基峰离子流图。该图可以反映测试样本中的代谢物丰度高低，可以看出相较正离子模式，负离子模式下检测到的代谢物的个数更多，丰度相对更高，进一步多元统计分析需将两种模式下得到的数据统一处理分析。图1.1QC样本的（A）ESI+基峰离子流图（B）ESI-基峰离子流图Figure1.1TICsofQCsamplesunder(A)ESI+and(B)ESI-7 军事医学科学院硕士学位论文3.1.2GC-MS猪瘟病毒感染的ST细胞和正常对照组ST细胞提取的代谢物经经超声破碎及衍生化处理后注入GC-MS系统进行分析，为监测分析系统的稳定性，将B4组的8个样品混合以制备QC样品，每测10个样品即加入1个QC样品用同样的方法分析，机器检测得到基峰离子流图，将QC样本经GC-MS得到总离子流图(Totalionchromatogram，TIC)进行重叠后可以看出QC样本质谱峰的保留时间和相应强度拟合度很高（见图1.2），这表明本研究从样品制备到仪器上样分析整个过程中采用的方法可靠；图1.3是其中几组样品TIC图，可见样品测试重复性好。1e+0078e+0066e+0064e+0062e+006Time(minutes)1013.333316.66672023.333326.66673033.3333TICQC-1TICQC-2TICQC-3TICQC-4图1.2重叠QC样本经GC-MS得到总离子流图Figure1.2TheoverlappingTICsofQCsamplesunderGC-MS图1.3GC-MS检测（A）正常ST细胞12h对照样品（B）正常ST细胞24h对照样品（C）GD53/2011感染ST细胞12h后收集的样品（D）GD53/2011感染ST细胞24h收集的样品总离子流图Figure1.3TICofmetabolitesextractedfromcontrolsamplescollectedat12hpi(A)and24hpi(B)andGD53/2011-infectedsamplescollectedat12hpi(C)and24hpi(D)8 军事医学科学院硕士学位论文3.2数据预处理3.2.1UPLC-Q-TOF/MS数据预处理UPLC-Q-TOF/MS获得的原始数据用Waters平台配套的ProgenesisQI代谢组学处理软件进行处理，经过去噪声、峰识别、积分、修正保留时间、峰对齐和数据归一化，最终得到一个含有保留时间、质荷比和峰强度这些信息的数据矩阵，正离子模式下检测到550个质谱峰，负离子模式下检测到更多的信息，质谱峰数量高达4570个，整合数据共得到5120个质谱峰。3.2.2GC-MS数据预处理将GC-MS的原始数据导入ChromaTOF软件进行预处理，之后将会输出三维数据矩阵，该CSV格式矩阵包括的信息除了样品信息之外还有保留时间、质荷比以及质谱响应强度等信息，分析后得到547个质谱峰，去除内标峰和已知假阳性峰这些冗余后再进行峰合并，最终得到241个质谱峰。3.3数据多维统计分析3.3.1UPLC-Q-TOF/MS对所有样本分别进行经典的无监督PCA多维统计分析，该方法不仅能分析接种病毒组与对照组的代谢差异，也能反映各组重复样品之间的变异度大小，从而直观反应代谢物22的分布。RX和Q是用于评估模型质量的重要指标，前者表示可解释度，本批样品的22RX=0.725，常规标准认为R值大于0.25则符合要求，和1相差越小表示模型越可靠。后2者代表可预测度，一般大于0.1表明有差异，大于0.4表示差异显著，本批样本Q=0.561，说明差异显著。从图3.1中可以看出共有8个主成分，考察质控（QC）样本聚类情况，可看到QC样本密集聚拢，综上可以看出包括前处理方法和仪器分析系统在内的整个分析方法具有很高可靠性。图1.4所有组样品的PCA得分图Figure1.4ThePCAscoreplotsofinfectedandcontrolgroupsanalyzedbyLC-MS9 军事医学科学院硕士学位论文为了区别组间差异，将感染组与对照组的数据做进一步的PLS-DA和OPLS-DA分析，这两个分析的方法是增加分组信息作为额外的变量，两个变量（2个主成分或者主成分、22正交成分各1个）把不同组的样本很好的区分开，RY和Q是评估模型质量的重要指标，2RY代表可解释度，三个时间点接种病毒组与空白对照组的值均在0.949以上，说明该模2型有非常高的解释度，Q值也都在0.688，说明建模结果理想，运用的分析方法能有效区分接种病毒组与对照组的样品。不同时间点接种病毒组与对照组的PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析得分图分别见图1.5、图1.6和图1.7，各个分析模型的参数见表1.2。图1.5不同时间点（A）12hpi（B）24hpi和（C）48hpiGD53/2011感染ST细胞实验组与ST细胞对照组的PCA得分图Figure1.5PCAscoreplotsofGD53-infectedgroupsandmockcontrolgroupscollectedat12hpi(A),24hpi(B),and48hpi(C)10 军事医学科学院硕士学位论文图1.6不同时间点（A）12hpi（B）24hpi和（C）48hpiGD53/2011感染ST细胞实验组与ST细胞对照组的PLS-DA得分图Figure1.6PLS-DAscoreplotsofGD53-infectedgroupsandmockcontrolgroupscollectedat12hpi(A),24hpi(B),and48hpi(C)图1.7不同时间点（A）12hpi（B）24hpi和（C）48hpiGD53/2011感染ST细胞实验组与ST细胞对照组的OPLS-DA得分图Figure1.7OPLS-DAscoresplotsofGD53-infectedgroupsandmockcontrolgroupscollectedat12hpi(A),24hpi(B),and48hpi(C)11 军事医学科学院硕士学位论文表1.2不同时间点感染组与对照组各验证模型参数Table1.2ParametersofmodelsforcontrolgroupsversusGD53-infectedgroups222组别分析模型RXRYQA1-B1PCA-X0.5610.18A1-B1PLS-DA0.350.9490.708A1-B1OPLS-DA0.350.9490.716A2-B2PCA-X0.6170.328A2-B2PLS-DA0.3280.9640.688A2-B2OPLS-DA0.5970.9940.878A3-B3PCA-X0.5520.199A3-B3PLS-DA0.690.9970.883A3-B3OPLS-DA0.690.9970.7123.3.2GC-MS2本批GC-MS样品PCA分析时一共有6个主成分，模型参数RX=0.697（大于0.25），2说明该模型可靠。Q=0.548（大于0.4），说明各组分差异显著。同时考察质控（QC）样本聚类情况，从所有组样品的PCA得分图1.8可看到QC样本密集聚拢，表明样品处理方法得当且仪器检测系统及建立的PCA分析模型可靠，可以进一步分析。图1.8所有组样品的PCA得分图Figure1.8TheglobalPCAscoreplotsofinfectedandcontrolgroupsanalyzedbyGC-MS为了区别组间差异，将感染组与对照组的数据做进一步的PLS-DA和OPLS-DA分析，这两个统计学分析的方法是增加了分组信息作为额外的变量，两个变量（2个主成分或者22主成分、正交成分各1个）把不同组的样本很好的区分开，RY和Q是评估模型质量的2重要指标，RY代表可解释度，三个时间点感染组与空白对照组的值均在0.992以上，表2明该模型有非常高的解释度，Q值也都在0.873，说明建模分组参数理想，运用的分析方12 军事医学科学院硕士学位论文法能很好区分感染组与对照组样品。不同时间点感染组与对照组的PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析得分图分别见图1.9、图1.10和图1.11，各分析的建模参数见表1.3。图1.9不同时间点（A）12hpi（B）24hpi和（C）48hpiGD53感染ST细胞实验组与对照组的PCA得分图Figure1.9PCAscoresplotsofGD53-infectedgroupsandmockcontrolgroupscollectedat12hpi(A),24hpi(B),and48hpi(C)图1.10不同时间点（A）12hpi（B）24hpi和（C）48hpiGD53/2011感染ST细胞实验组与对照组的PLS-DA得分图Figure1.10PLS-DAscoresplotsofGD53-infectedgroupsandmockcontrolgroupscollectedat12hpi(A),24hpi(B),and48hpi(C)13 军事医学科学院硕士学位论文图1.11不同时间点（A）12hpi（B）24hpi和（C）48hpiGD53/2011感染ST细胞实验组与ST细胞对照组的OPLS-DA得分图Figure1.11OPLS-DAscoresplotsofGD53-infectedgroupsandmockcontrolgroupscollectedat12hpi(A),24hpi(B),and48hpi(C)表1.3不同时间点感染组与对照组各验证模型参数Table1.3ParametersofmodelsforcontrolgroupsversusGD53-infectedgroups222组别模型类别RXRYQA4-B4PCA-X0.5960.279A4-B4PLS-DA0.5230.9970.91A4-B4OPLS-DA0.5230.9970.896A5-B5PCA-X0.5870.267A5-B5PLS-DA0.5780.9920.929A5-B5OPLS-DA0.6320.9990.873A6-B6PCA-X0.4320.21A6-B6PLS-DA0.420.9980.942A6-B6OPLS-DA0.4960.9970.93514 军事医学科学院硕士学位论文3.4OPLS-DA模型准确性评价为防止UPLC-Q-TOF/MS数据用OPLS-DA模型进行分析时过拟合，使用200次RRT来考察模型的质量，防止有监督模式下的分类是随机产生的，该方法是在保证X矩阵不变的前提下，将分类Y矩阵的变量随机排列200次，算出随机排列产生的OPLS模型累积的222RY和QY值。三个时间段实验组与对照组的OPLS-DA模型验证的RY值分别为0.675、220.825和0.712，QY值分别为-0.525、-1.05和-0.687。使用RPT检验时，要求QY小于0，可见构建的OPLS-DA模型达到标准要求，预测分类有效。对GC-MS数据的OPLS-DA模型采用了和UPLC-Q-TOF/MS相同的有监督模式模型2验证方法，三个时间段实验组与对照组的OPLS-DA模型验证的RY值分别为0.951、0.8382和0.966，QY值分别为-0.385、-0.479和-0.271，均小于0，可见分析中构建的OPLS-DA模型达到标准要求，预测分类有效。3.5代谢物鉴定采用多维分析（OPLS-DA）和单维分析（t检验）相结合的方法来筛选组间差异代谢物，即当代谢物在OPLS-DA模型中的VIP值大于1且t检验中p小于0.05时才认定为差异代谢物。UPLC-Q-TOF/MS筛选到的差异代谢物则通过和代谢组学处理软件progenesisQI自带数据库比对定性，GC-MS筛选到的差异代谢物则通过和NIST数据库及Feihn代谢组学数据库比对判定。两个检测平台对GD53/2011感染ST细胞后的三个时间点接种病毒组及对照组的样品检测分析鉴定后，一共筛选到214种差异代谢物，其中UPLC-Q-TOF/MS正离子模式下筛选到25种差异代谢物，负离子模式下筛选到113种差异代谢物，GC-MS平台筛选到76种差异代谢物，说明猪瘟病毒感染ST细胞后引起宿主细胞代谢的明显变化，差异代谢物名称及其变化情况见表1.4。15 军事医学科学院硕士学位论文表1.4CSFV感染引起ST细胞代谢明显改变Table1.4DifferentialmetabolitesobtainedthroughcomparisonofmetabolomicprofilingbetweenCSFV-infectedcellsandcontrolcells12hpiFc24hpiFc48hpiFc检测代谢物名称KEGG分析所在代谢通路(STCSF(STCSF(STCSFV模式V/STM)V/STM)/STM)glucoseGlycolysis/Gluconeogenesis0.001.960.61GCglucose-6-phosphateGlycolysis/Gluconeogenesis25.570.562.27GCfructose-6-phosphateGlycolysis/Gluconeogenesis1.690.880.95GCD-Fructose1,6-bisphosphatePhenylalanine,tyrosineandtryptophan5.880.801.91GCbiosynthesis3-phosphoglycerateGlycolysis/Gluconeogenesis0.520.991.74GCPhosphohydroxypyruvicacidGlycolysis/Gluconeogenesis1.240.901.14ESI-PyruvicacidGlycolysis/Gluconeogenesis3.010.401.57GCL-LacticacidGlycolysis/Gluconeogenesis1.371.961.21ESI-ribulose-5-phosphatePentosephosphatepathway1.200.721.72GCerythrose4-phosphatePentosephosphatepathway0.750.831.48GCsucroseGalactosemetabolism0.721.531.58GCxylitolPentoseandglucuronateinterconversions1.441.230.56GCFructose2,6-biphosphatedegrprodGlycolysis/Gluconeogenesis1.070.850.55GCglucuronicacidAminosugarandnucleotidesugarmetabolism33.451.681.05GCtrehalose-6-phosphate1.761.180.49GCphosphomycin1.161.020.76GCErythrose1.061.651.37GC3-Hydroxypyridine0.991.131.04GCDithioerythritol0.691.030.85GC1-Kestose7.771.410.42GCIsopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside0.881.840.54GCMethyl-beta-D-galactopyranoside0.660.441.90GC16 军事医学科学院硕士学位论文N-Acetyl-beta-D-mannosamine11.862.961.00GCTagatoseGalactosemetabolism3.161.131.48GCterephthalicacidPolycyclicaromatichydrocarbondegradation0.640.991.03GCThreitol1.241.241.05GCD-Talose9.191.100.90GCOxalicacidChloroalkaneandchloroalkenedegradation1.000.901.04ESI-citricacidCitratecycle1.431.231.44ESI-succinicacidCitratecycle0.971.060.67GCfumaricacidCitratecycle0.741.011.51ESI-L-MalicacidCitratecycle1.430.981.43GCmaleicacid70.552.030.92GCoxamicacid0.610.971.02ESI-L-GlutamicacidAlanine,aspartateandglutamatemetabolism1.331.501.10ESI-L-GlutamineAlanine,aspartateandglutamatemetabolism1.331.371.41ESI-AdenosinetriphosphatePurinemetabolism1.031.151.22ESI-dADPPurinemetabolism2.251.102.14ESI-GuanosinediphosphatePurinemetabolism1.121.040.86ESI-Biotinyl-5'-AMPPurinemetabolism1.231.291.30ESI-xanthosinePurinemetabolism1.021.081.15GCAdenosine5-monophosphatePurinemetabolism3.231.091.38GCinosine5'-monophosphatePurinemetabolism56.171.100.85GCadenosinePurinemetabolism1.481.210.79GCadeninePurinemetabolism0.741.031.25GCuracilPyrimidinemetabolism1.171.311.30GCuridinePyrimidinemetabolism2.261.221.23GCUridine5'-diphosphatePyrimidinemetabolism1.101.080.86ESI-dUMPPyrimidinemetabolism1.482.651.34ESI-Uridine5'-monophosphatePyrimidinemetabolism1.261.070.58ESI-17 军事医学科学院硕士学位论文Pseudouridine5'-phosphatePyrimidinemetabolism1.300.960.60ESI-CytidinetriphosphatePyrimidinemetabolism1.001.071.12ESI-CytidinemonophosphatePyrimidinemetabolism0.800.970.01ESI-cytidine-5'-monophosphatePyrimidinemetabolism0.161.290.71GCcytidine-monophosphatePyrimidinemetabolism1.770.971.03GC3-AminoisobutyricacidPyrimidinemetabolism0.550.680.44GCthyminePyrimidinemetabolism0.480.871.17GC6-MethylmercaptopurineDrugmetabolism2.220.991.60GCFormamidopyrimidinenucleosidetriphosphateFolatebiosynthesis1.121.121.31ESI-Imidazoleaceticacidribotide0.911.292.70ESI-N4-Acetylcytidine0.171.260.06ESI+L-SerineGlycine,serineandthreoninemetabolism1.301.011.06ESI-L-AllothreonineGlycine,serineandthreoninemetabolism0.841.190.71GCL-cysteineGlycine,serineandthreoninemetabolism0.520.941.98GCcreatinedegrGlycine,serineandthreoninemetabolism0.801.101.14GCglycineGlycine,serineandthreoninemetabolism1.651.011.24GCNorleucineGlycine,serineandthreoninemetabolism1.431.861.08GClysineLysinebiosynthesis2.151.201.33GCalpha-AminoadipicacidLysinebiosynthesis1.020.760.87GCbeta-AlanineAlanine,aspartateandglutamatemetabolism1.621.051.38GCalanineAlanine,aspartateandglutamatemetabolism0.990.981.18GC4-aminobutyricacidAlanine,aspartateandglutamatemetabolism1.311.081.14GCL-AsparticacidAlanine,aspartateandglutamatemetabolism0.970.810.78ESI-glutathioneCysteineandmethioninemetabolism5.911.621.18GCO-AcetylserineCysteineandmethioninemetabolism1.733.131.18ESI-L-TyrosineUbiquinoneandotherterpenoid-quinone1.221.311.08ESI-biosynthesisN-Carbamylglutamate0.622.881.04GC18 军事医学科学院硕士学位论文Gamma-Glutamyltyrosine1.251.381.39ESI-valineValine,leucineandisoleucinedegradatio1.221.091.11GCL-gamma-glutamyl-L-leucineValine,leucineandisoleucinedegradatio1.251.451.40ESI-2,4-diaminobutyricacid1.412.281.15GCD-alanyl-D-alanineD-Alaninemetabolis1.311.121.50GCcycloleucine0.930.331.33GCprolineArginineandprolinemetabolism1.121.011.36GCIsoleucine1.261.091.13GCthreonine1.040.981.08GCPantothenicacidbeta-Alaninemetabolism1.221.211.04ESI-L-PhenylalaninePhenylalaninemetabolism1.211.281.18ESI-PhenylpyruvicacidPhenylalaninemetabolism1.071.650.00ESI-L-TryptophanTryptophanmetabolism1.231.251.16ESI-L-KynurenineTryptophanmetabolism1.071.211.37ESI-O-phosphonothreonine0.911.060.78GCS-Cysteinosuccinicacid1.530.971.38ESI-Selenomethioninese-oxide1.131.080.79ESI-Hydroxytyrosol1.923.311.25ESI-myo-inositolGalactosemetabolism1.080.991.11GCSynephrine1.170.601.19GCIbuprofen0.740.931.05ESI+1,25-DihydroxyvitaminD3-26,23-lactone1.422.611.89ESI-NADP0.771.040.65ESI-NADOxidativephosphorylation0.000.000.71ESI-FADTryptophanmetabolism1.151.131.01ESI-2,3-dinor-6-keto-prostaglandinF1alpha1.071.361.19ESI-TacrolimusTypeIpolyketidestructures1.071.750.76ESI-D-UrobilinPorphyrinandchlorophyllmetabolism0.941.311.63ESI-19 军事医学科学院硕士学位论文6-Chloroapigenin0.990.961.03ESI-Gingerol1.071.270.95ESI-Tauroursodeoxycholicacid1.211.171.08ESI-20alpha-HydroxycholesterolSteroidbiosynthesi0.971.151.06GCcholesterolSteroidbiosynthesi1.771.200.58GCcortisoneSteroidhormonebiosynthesis1.170.961.16GC11-DehydrocorticosteroneSteroidhormonebiosynthesis1.111.351.00ESI-3a,6b,7b,12b-Tetrahydroxy-5b-cholanoicacid1.611.191.94ESI-Bisnorcholicacid1.091.151.31ESI-3-O-Sulfogalactosylceramide(d18:1/12:0)7.229.580.16ESI-2-arachidonoylglycerol-d50.630.860.88ESI-D-(glycerol1-phosphate)0.841.051.29GCglycerolPentoseandglucuronateinterconversions1.491.101.11GCArachidicacidBiosynthesisofunsaturatedfattyacids1.341.321.20GCstearicacidFattyacidbiosynthesis1.001.151.07GCMyristicAcidFattyacidbiosynthesis0.791.171.09GCbeta-Glycerophosphoricacid0.720.931.18GCheptadecanoicacid1.081.341.04GCPhytanicacid0.981.141.07GCMonostearin1.151.240.86GCMethylPalmitoleate0.961.101.07GCmethyltrans-cinnamate0.611.131.64GC15(S)-HETEArachidonicacidmetabolism1.152.512.37ESI-Palmitaldehyde2.151.581.32ESI-L-Acetylcarnitine1.231.561.44ESI-L-Hexanoylcarnitine1.311.321.37ESI-Octanal1.441.310.66ESI+Phytylphosphate1.110.770.82ESI-20 军事医学科学院硕士学位论文4,2',3',4',6'-Pentahydroxy-5'-neryldihydrochalcone0.981.221.14ESI-PC(14:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))1.591.891.11ESI-PC(15:0/20:2(11Z,14Z))34.842.170.53ESI+PC(P-16:0/18:0)13.122.530.89ESI+PC(16:1(9Z)/18:0)4.421.460.38ESI+PC(P-16:0/20:2(11Z,14Z))1.701.221.06ESI-PC(18:0/14:1(9Z))0.670.850.63ESI+PC(18:0/18:2(9Z,12Z))4.241.260.42ESI+PC(18:1(11Z)/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))1.520.860.73ESI-PC(18:0/20:3(8Z,11Z,14Z))7.951.430.30ESI+PC(18:0/18:2(9Z,12Z))4.241.260.42ESI+PC(18:0/18:1(11Z))7.572.190.38ESI+PC(18:0/16:1(9Z))10.311.600.39ESI+PC(18:0/18:1(11Z))3.601.550.43ESI+PC(18:0/18:2(9Z,12Z))3.351.360.33ESI+PC(18:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))2.031.021.21ESI-PC(24:1(15Z)/14:1(9Z))74.250.670.58ESI-PC(24:1(15Z)/14:1(9Z))1.871.240.65ESI-PC(P-18:0/14:1(9Z))6.311.450.50ESI-PC(O-18:0/14:0)4.351.330.59ESI+PC(O-18:2(9Z,12Z)/22:0)62.430.302.76ESI-PC(24:1(15Z)/14:1(9Z))1.871.240.65ESI-Glc-GP(18:0/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))8.272.323.14ESI-PG(P-16:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))2.490.891.42ESI-PG(P-18:0/15:0)1.501.730.67ESI-PG(18:0/20:3(8Z,11Z,14Z))1.031.121.06ESI-PG(22:0/12:0)22.422.020.42ESI+PG(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))0.800.040.25ESI-21 军事医学科学院硕士学位论文PG(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/22:0)0.610.811.15ESI+PG(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))1.590.640.40ESI-PE(14:0/18:2(9Z,12Z))0.242.990.72ESI-PE(15:0/P-18:0)12.521.180.42ESI+PE(16:0/20:3(5Z,8Z,11Z))14.992.031.53ESI-PE(16:0/20:2(11Z,14Z))1.310.470.95ESI-PE(P-16:0/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))2.180.470.66ESI-PEP-16:0/18:1(11Z))1.120.580.84ESI-PE(16:0/20:3(5Z,8Z,11Z))1.670.520.45ESI-PE(16:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))2.380.650.43ESI-PE(18:1(9Z)/0:0)3.032.200.95ESI-PE(18:2(9Z,12Z)/16:0)1.621.461.00ESI-PE(18:1(11Z)/18:0)0.850.500.99ESI-PE(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/14:0)0.351.110.69ESI-PE(22:1(13Z)/14:1(9Z))1.652.081.14ESI-PE(22:1(13Z)/14:1(9Z))1.340.300.74ESI-SM(d16:1/18:0)0.771.010.70ESI+SM(d18:0/13:0)0.681.880.74ESI-SM(d18:0/16:0)11.791.430.45ESI+CDP-DG(16:0/18:2(9Z,12Z))0.770.610.46ESI-CE(15:0)1.020.651.25ESI-TG(20:2n6/18:3(6Z,9Z,12Z)/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))0.590.801.16ESI+PI(0:0/20:3(8Z,11Z,14Z))0.971.161.52ESI-PI(16:0/0:0)1.051.151.48ESI-PI(16:0/20:2(11Z,14Z))1.531.270.68ESI-PI(16:0/20:3(8Z,11Z,14Z))7.281.441.71ESI-PI(18:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))21.622.170.59ESI-PI(18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)1.011.071.83ESI-22 军事医学科学院硕士学位论文PI(18:0/20:3(5Z,8Z,11Z))3.503.371.92ESI-PI(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0)1.101.221.52ESI-PI(20:3(8Z,11Z,14Z)/0:0)0.931.231.38ESI-PI(18:1(9Z)/0:0)0.991.191.49ESI-PI(20:3(8Z,11Z,14Z)/20:3(5Z,8Z,11Z))1.151.310.60ESI-PI(18:1(9Z)/16:1(9Z))1.241.250.84ESI-PI(18:2(9Z,12Z)/0:0)0.770.921.72ESI-PA(17:1(9Z)/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))85.560.050.05ESI-PA(17:2(9Z,12Z)/18:0)7.605.830.75ESI-PA(17:2(9Z,12Z)/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))0.250.520.33ESI-PA(17:2(9Z,12Z)/18:2(9Z,12Z))8.920.011.08ESI-PA(18:3(9Z,12Z,15Z)/21:0)0.670.830.66ESI+PA(18:3(9Z,12Z,15Z)/21:0)14.051.460.40ESI+PA(18:2(9Z,12Z)/16:1(9Z))0.990.310.73ESI-PA(20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/17:1(9Z))96.520.170.11ESI-PS(17:2(9Z,12Z)/22:1(11Z))1.231.000.92ESI-PS(18:1(9Z)/0:0)1.091.051.31ESI-PS(18:0/18:1(9Z))4.290.281.01ESI+PS(O-20:0/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))0.620.811.11ESI+PS(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/19:0)1.780.880.69ESI-PS(DiMe(9,3)/DiMe(9,3))0.143.370.56ESI-PS(P-20:0/17:0)1.221.291.22ESI-PS(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))1.630.830.45ESI-PS(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:3(8Z,11Z,14Z))0.870.981.07ESI-Etn-1-P-Cer(d14:1/18:0)0.761.561.10ESI-注：Fc(STCSFV/STM)：感染猪瘟病毒组对比未接种病毒组积分值变化倍数。灰色阴影下的Fc值有统计学意义（VIP>1且p<0.05），无阴影的Fc值则无统计学意义（VIP<1或p>0.05）。GC代表用GC-MS平台筛选到的差异代谢物，ESI+表示在UPLC-Q-TOF/MS正离子模式下筛选到的差异代谢物，ESI-则表示在UPLC-Q-TOF/MS负离子模式下筛选到的差异代谢物。23 军事医学科学院硕士学位论文3.6差异代谢物聚类分析根据差异代谢物的性质对其进行归类，一共有214种差异代谢物，其中脂类有102个（磷脂占75个）、氨基酸有36个、碳水化合物有33个、核苷酸有24个，其他如辅酶及激素类物质有19个。病毒感染后各类物质在不同时间点升降变化情况如图1.12所示，横坐标以上的值表示该时间点接种病毒组相较对照组该类物质升高的个数，横坐标以下表示该时间点接种病毒组相较对照组该类物质降低的个数。从图中可以看出猪瘟病毒感染可引起ST细胞脂类、氨基酸、糖类和核苷酸等物质的显著变化，感染后24h内接种病毒组各类物质明显以升高为主，感染后48h则碳水化学物和脂类升高与降低的数量相当，说明在感染前期，猪瘟病毒增殖需要ST细胞提供大量物质和能量，特别在病毒粒子基因组及囊膜形成过程中需要大量的碳源以及脂类物质，而24hpi病毒已经达到复制顶峰，不再需要太多物质用于病毒粒子复制，装配之后病毒需要被运输并释放至胞外，因此对氨基酸类物质需求更大，造成此类物质变化明显。用R软件将所有样品的各类代谢物的相对积分值以热图形式展示，见图1.13。图1.12接种病毒后不同时间点各类物质升降变化Figure1.12DynamicchangesofcellularmetabolitesduringCSFVinfection（A）24 军事医学科学院硕士学位论文（B）（C）（D）25 军事医学科学院硕士学位论文（E）图1.13不同时间点接种病毒组与对照组各样品（A）核苷酸类（B）碳水化合物类（C）TCA相关（D）氨基酸类（E）脂类差异代谢物的热图分析Figure1.13Heatmapofdifferentiallyexpressednucleotides(A),carbohydrate(B),TCAcycle(C),aminoacids(D),andlipids(E)inSTcellsinfectedwithCSFVA1，未感染ST细胞12h对照组样品；B1，GD53/2011感染ST细胞12hpi实验组样品；A2，未感染ST细胞24h对照组样品；B2，GD53/2011感染ST细胞24hpi实验组样品；A3，未感染ST细胞48h对照组样品；B3，GD53/2011感染ST细胞48hpi后实验组样品；3.7差异代谢物的通路分析将筛选到差异代谢物信息输入KEGG进行Pathway分析，虽然差异代谢物中磷脂类物（A）质占了很大比重，但在KEGG中难以将每个磷脂物质归属到具体通路中，故将磷脂类物质单独归类，只针对其他代谢物所在代谢通路做了Pathway分析，综合接种病毒后3个时间点猪瘟病毒引起ST细胞内差异最大的10个代谢通路可以看出，感染猪瘟病毒后细胞内代谢改变集中于氨基酸合成、氨酰-tRNA合成、嘧啶代谢、碳代谢及泛酸与辅酶A代谢，另外氨基酸中的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成变化也很明显，可见猪瘟病毒感染后引起ST细胞代谢物的改变范围广、影响大，病毒实现为了最大限度增殖劫持了宿主细胞内大量的物质和能量，从而引起多条关键代谢通路改变。在差异代谢物中，我们重点关注了碳代谢，糖酵解通路是猪瘟病毒感染ST细胞后发（B）生显著变化的通路之一。如表1.4所示，相较正常细胞，猪瘟病毒感染后24h内的细胞糖酵解通路上的多个中间产物发生显著变化，早期感染引起糖酵解中间产物明显升高，然而26 军事医学科学院硕士学位论文只在感染最后阶段才检测到糖分解代谢的明显升高。我们观察到猪瘟病毒感染过程中糖酵解中间产物变化的时间点都在12hpi和48hpi，而24hpi没有明显变化。其中葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸和果糖-1,6-二磷酸都是12hpi和48hpi明显升高，磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸则只在12hpi升高。3-磷酸甘油酸在12hpi接种病毒细胞低于正常细胞，而在48hpi高于正常细胞，虽然某个中间代谢产物的升高可能是由于合成通路增加或消耗减少引起，虽然根据代谢结果并不能推出糖酵解活动增强，但至少可以说明猪瘟病毒感染调节ST细胞对葡萄糖的利用。病毒感染后48h，细胞中磷酸戊糖途径的中间产物核酮糖-5-磷酸及赤藓糖-4-磷酸水平相较正常细胞明显升高。有趣的是，与之一起升高的还有单磷酸腺苷、三磷酸腺苷、三磷酸胞苷、脱氧单磷酸尿苷，众所周知磷酸戊糖途径终产物核糖-5-磷酸能生成嘌呤嘧啶从[28]头合成所需的重要物质5-磷酸核糖焦磷酸（Pyrophosphate-5-ribosephosphate，PRPP），[29]磷酸戊糖途径与核苷酸合成关系密切，这也反映了物质代谢相互联系。另外我们观察到在猪瘟病毒感染过程中谷氨酰胺代谢的改变。谷氨酰胺通过两个关键的脱氨基步骤分解，谷氨酰胺第一步脱氨基生成谷氨酸，接着第二步生成α-酮戊二酸进入[30]三羧酸循环。代谢组学结果显示感染猪瘟病毒细胞的谷氨酰胺和谷氨酸水平都明显高于对照组。谷氨酰胺在48hpi明显升高，而谷氨酸在3个时间点都明显升高。综上所述，猪瘟病毒在感染过程中引发与众不同的碳利用程序（见图1.15）。图1.14GD53/2011感染ST细胞引起碳代谢通路发生变化Figure1.14CarbonmetabolismisalteredduringCSFVinfection27 军事医学科学院硕士学位论文4小结与讨论[31]病毒已经进化出操纵宿主细胞代谢从而为自身复制增殖提供能量和物质的机制，近来大量研究显示了研究代谢不仅有助于更好理解病毒引起的感染进程，同时对研制出在不[32]影响宿主的正常功能前提下有效抑制病毒增殖的药物十分有意义。这些新研究揭示病毒[33]为了其生活史使用不同的机制，并且这些改变的通路可能是治疗病毒感染的治疗靶点。高通量技术的进步，特别是代谢组学的发展为研究人员揭示病毒复制的代谢机制提供支持，[34]代谢组学最突出的特点是可以反映生物体感染病毒后实际发生的应答。我们分别用UPLC-TOF-MS和GC-MS平台筛选鉴定了猪瘟病毒感染ST细胞后12h、24h和48h的细胞内差异代谢物，差异代谢物主要包括脂类、核苷酸、糖类和氨基酸，其中以磷脂变化最为明显，约占总差异代谢物的1/3。需要注意的是脂类差异代谢物绝大部分是利用UPLC-TOF-MS筛选到的，而糖类亲水性分子量相对较低的差异代谢物是在GC-MS平台筛选定性的，UPLC-Q-TOF-MS以其快速而灵敏的分离效果，加上质谱测定的高精确性，因此被广泛应用于极性或非挥发性的物质的分析，自然界大多数代谢产物都适用于[35]UPLC-Q-TOF-MS，特别是复杂的脂质分离鉴定。但是极性较低和者分子量相对较小或[36]容易挥发的物质因在样品制备过程中会挥发或被破坏，且难以进行低水平的衍生化电离，[37]此类物质更适合用GC-MS。因此，本实验同时利用这两种技术能高效而全面地筛选猪瘟病毒感染细胞后的差异代谢物，这对正确理解猪瘟病毒利用宿主细胞代谢的发生发展过程至关重要。利用非靶向代谢组学筛选，我们发现猪瘟病毒感染后引起一系列代谢通路紊乱。感染猪瘟病毒后差异代谢通路集中于磷脂代谢、氨基酸合成、氨酰-tRNA合成、嘧啶代谢、碳代谢及泛酸与辅酶A代谢，氨基酸中的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成变化也很明显，先前对其他病毒代谢组学研究也显示病毒[38]感染引起宿主细胞代谢的显著变化，我们实验结果验证了这一点。比较病毒感染后3个不同时间点差异代谢物的数目可以看出，感染后24h内升高的物质是降低的物质的数倍，而到了48hpi，碳水化合物及脂类升高与降低的数目已经非常接近。结合GD53/2011增殖动力学数据，24hpiGD53/2011的滴度就能达到最高，所以感染性病毒粒子的产生集中于感染后24h内，这样的进程决定了在短时间内需要大量的碳源及[39,40]脂类以供核苷酸和蛋白质合成从而为病毒组装提供原料。然而病毒编码能力有限，这[41]些生命活动完全依赖于宿主代谢，病毒感染进程正是将细胞正常代谢代谢改编为“病毒[42]工厂”程序的过程，因此代谢组学结果可反映病毒在感染细胞内的生活史。一些RNA病毒以脂肪酸生物合成为靶点，从头合成脂肪酸和脂滴形成能促进番茄丛[43][44]矮病毒和轮状病毒增殖，当抑制脂肪合成酶的活性时轮状病毒复制受到抑制，其他研[45,46]究也揭示了与猪瘟病毒同属黄病毒科的HCV和DENV感染需要脂代谢的参与。本研28 军事医学科学院硕士学位论文究中磷脂代谢变化就很好说明了这一点，感染后24h内，感染病毒的细胞磷脂含量急剧增多很可能与合成猪瘟病毒囊膜有关。病毒除了劫持脂肪酸合成和谷氨酰胺代谢外，有的还能引起有氧糖酵解，即瓦尔堡效[47]应。先前有研究用猪瘟病毒石门株感染PK-15和3D4/2细胞后用代谢组学技术比较了感染组与对照组于48hpi差异代谢物。结果显示，感染SM的两种细胞内糖酵解通路上的一些中间产物的含量均低于对照细胞，作者推测猪瘟病毒感染促进糖酵解致使这些物质消耗[48]过快从而使这些代谢物水平低于对照组。而本实验发现感染GD53/2011的细胞在12hpi和48hpi时，糖酵解通路上的一些代谢物水平高于对照组细胞。GD53/2011作为我国近年来分离自广东的流行毒株，其与强毒株在细胞适应性或致病性方面的某些差异可能造成了代谢组学结果差异。更重要的是因为没有流束分析及绝对定量，通路上中间产物的升高可能是由于上游合成增多，也有可能是下游消耗减少，因此，需要研究在猪瘟病毒感染中是否需要葡萄糖代谢。为了进一步确定猪瘟病毒感染与差异代谢通路之间的关系，还需要进一步验证。29 军事医学科学院硕士学位论文第二章葡萄糖促进猪瘟病毒增殖的研究病毒作为专性胞内寄生生物，完全依赖于宿主细胞提供生物合成所需的物质和能量以[49]完成自身的复制增殖。葡萄糖和谷氨酰胺是哺乳动物细胞能量代谢和生物合成过程中利[14][50]用最多的碳源。通常认为葡萄糖通过氧化磷酸化途径供给细胞所需ATP。然而研究发现，较正常细胞，一些肿瘤细胞或者病毒感染的宿主细胞不仅需要更多的葡萄糖提供能量[51][52]，而且葡萄糖碳并不参与三羧酸循环，而是依赖谷氨酰胺代谢回补TCA循环，比如[53]HCMV感染的细胞通过谷氨酰胺维持TCA循环，从而使得葡萄糖碳用于脂肪酸合成。而VACV利用碳的过程比较独特，病毒增殖必须有谷氨酰胺，而葡萄糖对病毒增殖无影响[21]，这些结果表明病毒对细胞代谢的需要不尽相同。代谢组学研究结果显示，猪瘟病毒感染导致糖酵解通路的变化。因此，本研究利用含有或不含葡萄糖和谷氨酰胺的培养基进行猪瘟病毒的体外培养以探索猪瘟病毒增殖所必需的能量物质，并通过代谢抑制剂鉴定这些代谢物在猪瘟病毒增殖中的作用及相关的分子机制，为进一步解析猪瘟病毒增殖与宿主细胞代谢之间的关系奠定基础。1实验材料1.1细胞与病毒6.55.5猪瘟病毒GD53/2011（F48，TCID50=10/mL）、猪瘟病毒石门株（SM,TCID50=10/mL）和猪睾丸细胞（ST）均由本实验室保存。1.2主要试剂1.2.1细胞培养相关试剂缺失葡萄糖、缺失谷氨酰胺及对照正常DMEM均购自美国GIBCO公司；100×青霉素和链霉素双抗购自美国PAA公司；无BVDV污染的胎牛血清FBS、葡萄糖、2-脱氧葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose，2-DG）、草氨酸钠（Oxamatesodium）、磺酰罗丹明B（SulforhodamineB,SRB）和葡萄糖分析试剂盒Glucose（GO）AssayKit购自德国Sigma公司；PBS购自美国Hyclone公司；截留分子量为10K的超滤管购自德国Merck公司。1.2.2蛋白印迹杂交（Westernblot，WB）相关试剂细胞裂解液购自美国CST公司；Cocktail蛋白酶抑制剂购自美国Thermo公司；Bradford蛋白质定量试剂盒、十二烷基硫酸钠（SDS）和丙烯酰胺购自天根生化科技（北京）有限公司；Tris-Base、三氯乙酸（TrichloroaceticAcid，TAC）、过硫酸铵和TEMED购自德国Sigma公司；甲醇和乙酸购自北京化工厂；预染彩虹蛋白Marker购自美国NEB公司；Odyssey封闭液购自美国Licor公司；Glut1兔多克隆抗体、β-actin鼠单克隆抗体购自美国30 军事医学科学院硕士学位论文SantaCruz公司；PKM2兔单克隆抗体购自英国Abcam公司；WH303鼠单克隆抗体由勃pro林格殷格翰（中国）投资有限公司惠赠；N兔多克隆抗体由哈尔滨兽医研究所仇化吉研究员惠赠；红光标记的驴抗鼠二抗、红光标记的驴抗兔二抗、AlexaFluor488donkeyanti-mouseIgG(H+L)二抗购自美国Thermo公司。1.2.3提取RNA及反转录试剂TrizoL细胞裂解液购自天根生化科技（北京）有限公司；氯仿、异丙醇及无水乙醇购自北京化工厂，DEPC水购自上海生工生物有限公司；反转录试剂盒Eastep®RTMasterMixKit购自上海普洛麦格生物制品有限公司；RNase-freewater购自宝生物工程大连有限公司。1.2.4荧光定量相关材料SYBRPremixExTaqII、ExTaqDNAPoLymeraseHot-StartVersion、dNTPMixture购自宝生物工程大连有限公司；猪瘟病毒标准质粒pGMT-5’UTR由本实验室构建保存。1.2.5引物和探针序列用于荧光定量扩增各个目的基因的引物由吉林库美生物有限公司合成，用于检测猪瘟病毒5’UTRTaqMan探针由上海生工生物有限公司合成，引物和探针序列见表2.1。1.3主要仪器仪器生产厂家及型号超微量分光光度计美国Thermo公司NanoDrop1000光学显微镜日本OlympusCKX41多功能酶标仪日本Tecan株式会社INFINITEM200蛋白免疫印迹系统美国BIO-RAD公司SIM-F140AY65二级生物安全柜美国Thermo公司1300系列电子分析天平上海光学仪器厂FA系列制冰机日本SANYO株式会社脱色摇床海门市其林贝尔仪器制造有限公司TS-2000A双色红外激光成像系统美国Li-cor仪器公司Odyssey倒置荧光显微镜德国Zeiss公司Axioskop4031 军事医学科学院硕士学位论文4℃冰箱江苏格林电器有限公司SH-5型加热磁力搅拌器中科美菱低温科技有限责任公司YC-968L电热恒温水槽上海一恒科技有限公司DK-8D二氧化碳培养箱美国Thermo公司O3111小型低温离心机德国Eppendorf公司5424R超低温冰箱美国Thermo公司Forma700系列1.4试剂配制（1）12%SDS-PAGE分离胶（10mL）：3.2mLddH2O、2.6mL浓度为1.5M的Tris-HCl(pH为8.8)、4mL30%丙烯酰胺、5μLTEMED、10%的过硫酸铵及SDS各0.1mL。（2）5%SDS-PAGE浓缩胶（4mL）：2.8mLddH2O、0.5mL1MTris-HCl(pH为6.8)、0.65mL30%丙烯酰胺、40μL10%过硫酸铵、40μL10%SDS、4μLTEMED、10%的过硫酸铵SDS各0.04mL。（3）SDS-PAGE电泳Tris-甘氨酸缓冲液（5×贮存液）：分别称取1.51gTris-HCL、9.4g甘氨酸和0.5gSDS，于ddH2O中溶解并定容至100mL，并将pH调节为8.3，室温储存，使用时加入ddH2O稀释为1×溶液。（4）1×转膜缓冲液：分别称取2.9gTris-HCl、1.5g甘氨酸和0.19gSDS，先于300mLddH2O中溶解，随后加入100mL甲醇，混匀后将pH值调为8.3，最后用ddH2O定容至500mL，室温储存。（5）80%冷丙酮（V/V）：将100mLddH2O加入400mL丙酮中，-20℃冰箱保存。（6）1%的冰乙酸：向198mL双蒸水中加入2mL乙酸，储存于4℃冰箱。（7）0.4%的SRB：称SRB0.4g溶于100mL配好的1%冰醋酸中，室温存放。（8）10%TAC(m/v)：10gTCA溶于双蒸水并使终体积为100mL，配好后应存于4℃低温条件下，并置于暗处注意避光。（9）10mM的Tris-碱液(pH为10.5)：称0.1211gTris-base加入双蒸水中溶解，定容至100mL，调节pH至10.5后置于4℃冰箱存放。（10）PBST溶液（V/V）：含0.05%吐温-20的PBS(PH为7.4)。2实验方法2.1细胞培养ST细胞于37℃、5%CO2培养箱中培养，DMEM培养基中加入5％FBS及1%青链霉32 军事医学科学院硕士学位论文素双抗，如未特殊说明，ST细胞均用此常规培养基。2.2葡萄糖和谷氨酰胺对猪瘟病毒增殖的影响2.2.1葡萄糖和谷氨酰胺剥夺实验为研究营养物质对病毒增殖影响，需要制备透析血清，其制备方法为取5mLFBS置于截留分子量为10K的超滤管中，5,000×g离心20min，弃去收集管中滤液，血清中加入PBS补足过滤损失的液体继续离心，如此反复5次以去除血清中的葡萄糖及谷氨酰胺等小分子物质。5ST细胞以1.25×10个/mL的密度传代至24孔板或60cm平皿，细胞用正常培养基培养12h，然后弃去培养基，用PBS洗涤两遍，再加入不含血清及双抗的双无DMEM进行饥饿处理。12h后按MOI=0.3接种猪瘟病毒GD53/2011株，感作2h之后换为不含葡萄糖或谷氨酰胺的DMEM加入1%双抗和5%透析血清配置的培养基，病毒感染24h后，分别收集培养上清和细胞进行Westernblot分析、病毒滴度测定和基因组拷贝数测定。2.2.2细胞增殖能力检测采用SRB比色法检测各培养基对细胞增殖能力的影响：ST细胞传代时铺96孔板，3数量约为9×10个/孔。10h细胞贴壁后弃去培养基，用PBS洗2次，用双无DMEM培养基进行饥饿处理12h后换用本章2.2.1所述的各种条件培养基及完全培养基，每个处理设3个重复孔。处理24h后弃去培养基，PBS洗后倒净，然后每孔加入0.1mL的10%TCA溶液，4℃固定30min，随后弃掉TAC，用ddH2O洗3次；室温下将96孔板倒扣于吸水纸上直到完全干燥；然后向每孔加入0.1mL0.4%的SRB，室温条件下染色20min；染色结束倒掉染色液，将96孔板浸于1%的冰乙酸中并迅速捞出扣掉液体，如此反复洗涤3次，之后将96孔板室温干燥2h或更长时间，之后向每孔加100μLpH为10.5的Tris-碱（10mM），脱色摇床上中速摇5-10min，用酶标仪在490nm波长处测样品OD值。实验独立重复3次，用SPSS13.0软件统计分析各组数据，Graphpadprism5软件作图，误差线反应的是3次独立重复实验结果。2.2.3葡萄糖回补实验4为了进一步验证葡萄糖在猪瘟病毒增殖中的作用，ST细胞以7×10个/孔传代至24孔板后饥饿处理及接种病毒过程同2.2.1。感染GD53/2011的ST细胞换用的培养基为在剥夺葡萄糖的DMEM中分别加入0g/L、0.25g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L和4.5g/L葡萄糖、1%双抗和5%透析血清配置而成，每个处理设置3个重复。感染24h后，细胞连同上清一并收集以供病毒滴度的测定，实验独立重复3次。33 军事医学科学院硕士学位论文2.2.4糖酵解代谢通路抑制实验4ST细胞以7×10个/孔传代至24孔板，饥饿处理及接种病毒过程同2.2.1。感染GD53/2011的ST细胞后换用正常培养基，且培养基中分别加入0mM、25mM和50mM2-DG以及0mM、50mM和100mM的Oxamate，每个处理设置3个重复。感染24h后，细胞连同上清一并收集以供病毒滴度的测定，实验独立重复3次。2.3猪瘟病毒TCID50测定除上清样品外，将2.2中收集用于猪瘟病毒滴度测定的样品反复冻融3次，然后用含-1-65%FBS的DMEM将样品从10按10倍梯度稀释到10。之后将稀释液加入汇合度约70%的铺在96孔板的ST细胞，每个稀释度设置6个重复，每孔加100μL稀释液。接种病毒细胞在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。48h后弃去培养上清并作无害化处理，用PBS洗3遍细胞。倒掉PBS，每孔加入60μL80%冷丙酮后将96孔板，然后于-20℃冰箱低温固定1h，之后后弃丙酮，并用PBST洗3次以洗去残余丙酮，5min/次。然后每孔加入100μL按1:1，000用PBS稀释含5%FBS的猪瘟病毒E2单抗WH303。温箱中37℃孵育2h，之后弃去一抗，PBST洗3次，5min/次。每孔加入50μL按1:200用PBS稀释含5%FBS和2%伊文思蓝的AlexaFluor488标记山羊抗小鼠二抗，从加二抗开始，每步均要在暗室操作以防荧光淬灭。二抗于37℃孵育2h后倒掉并用PBST洗3次，5min/次。在Zeiss荧光显微镜下先用伊文斯兰调整视野至细胞层，然后在激发光为绿光条件下观察记录阳性孔。用Reed-Muench法计算TCID50，数据处理及统计分析同2.2.2。2.4提取RNA及反转录将2.2.1中感染GD53/201124h后的ST细胞上清转移至1.5mLEP管，向24孔培养板上的细胞孔中每孔加入500μL的DMEM再反复冻融3次。然后分别取每孔细胞的培养上清和细胞冻融液0.2mL至新的EP管，每管加入1mLTrizol，摇匀后室温裂解10min。再加0.2mL氯仿，上下颠倒猛烈晃动20s以摇匀，室温放置5min后于4℃以13,000×g离心15min，小心移取上层水相0.5mL至新的无RNA酶离心管中，并向其加入0.5mL异丙醇，轻柔混匀，放入-20℃冰箱静置20min，接着取出离心管，在4℃条件下以13,000×g离心15min，离心完毕，取出离心管将上清弃净，沉淀用0.7mL75%乙醇（无水乙醇与DEPC水体积比3:1配置）洗涤，接着于4℃，6,000×g离心5min，弃上清，室温干燥10min后每管加入30μLRNase-FreeWater溶解沉淀。取2μL反转录试剂Eastep®RTMasterMix与上述提取的8μLRNA组成一个10μL反转录体系，涡旋振荡混匀后于恒温水浴锅中42℃反应30min，再95℃酶灭活5min即得到cDNA。34 军事医学科学院硕士学位论文2.5猪瘟病毒基因组拷贝数测定用荧光定量方法检测猪瘟病毒基因组拷贝数时用的是Taqman探针，所用引物及序列18见表2.1，将2.4.1反转录得到的cDNA和按10倍梯度稀释得到的拷贝数为10-10/2μL的pGMT-5’UTR标准参照质粒作为模板进行荧光定量，反应体系见表2.2，反应条件为95℃，10min；45×（94℃，15s；60℃，40s），每个样品设置3个重复。反应结束后，用StratageneMX3000PSequenceDetectionSystemSoftware（Version1.0）分析结果，确定标准曲线，每个样品及标准质粒需设3个重复，结果取平均值。数据处理及统计分析同2.2.2。表2.1引物和探针序列Table2.1PrimersandTaqManprobeusedinthisstudy名称序列(5'-3')FP147GCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCRP267CGCYAGGGTTAAGGTGTGTCTTGProbeCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCAC（5'FAM3'TAMRA）表2.2荧光定量PCR的反应体系Table2.2ReactioncomponentsconditionofReal-timePCR试剂用量（μL）10×EXHotstartbuffer2.5dNTPMixture（2.5mMeach）2FP147（100μM）1RP267（100μM）1Probe（50μM）0.5TaKaRaHotstartTaq0.15cDNA或标准质粒2ddH2O15.85总体积252.6细胞总蛋白提取猪瘟病毒感染ST细胞24h后收样品，培养皿置于冰上，移液器吸尽细胞上清，接着用预冷PBS洗2次细胞后将其弃去，每个平皿加入40μL含cocktail蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，用预冷的细胞刮刀将细胞刮至一侧，随后用移液器将细胞裂解液连同刮下的细胞35 军事医学科学院硕士学位论文转移至1.5mLEP管中，4℃裂解30min，10,000×g离心5min后小心移取上清至新的EP管中，避免混入沉淀。2.7蛋白浓度测定用Bradford法进行蛋白定量，分别取0、1、2、4、6、8和10μL的蛋白标准品BSA（1μg/μL），以及1μL待测样品加入不同EP管中，每管加入相应体积PBS使总体积达到15μL，随后每管加入285μL考马斯亮蓝染色液，将其充分混匀后各取250μL转至96孔酶标板中并于室温静止5min，用酶标仪检测在595nm处已知浓度BSA和未知浓度样品的OD值，依不同浓度BSA样品OD值绘标准曲线，随后求出样品中的蛋白浓度。pro2.8猪瘟病毒N蛋白表达的检测根据2.7测定结果取50μg各样品的总蛋白至EP管，每个样品用PBS定容至20μL，随后各加入5μL的5×SDSLoadingBuffer混匀后加热使蛋白变性，冷却后简短离心备用。按1.1.4所述加入各成分配制15%SDS-PAGE分离胶，室温静置30min，待其凝固后再将5%浓缩胶注入分离胶之上，插入梳子，室温静置30min待其凝固后将其放入电泳槽，倒入电泳液再小心拔出梳子，上样后先以45V电压在浓缩胶中迁移，待溴酚蓝指示带接触到分离胶时将电压调至120V，当溴酚蓝指示带迁移至凝胶底端时即关掉电源，电泳结束。预先将纤维素膜（Nitrocellulosemembrane，NC膜）于转膜液中浸泡5min，随后将胶块切下连同滤纸浸泡于转膜液中，采用半干法转膜，从下到上按照滤纸、NC膜、凝胶、滤纸的顺序置于转膜仪上，操作时应避免各层之间产生气泡，以20V恒压转膜22min。转膜后将NC膜浸于丽春红染液，5s后取出看条带，随后用PBS洗去附在膜上的染液，并根据出现条带的情况将膜裁成合适大小。将裁好的膜放入含Odyssey封阻液的自封袋中，然后室温条件下在摇床上低速摇晃封闭2h。封闭结束后，分别将膜浸于含1:2,000倍稀释的针对β-actin的鼠单克隆单抗和按1:200pro稀释的针对N兔克隆多抗的稀释液中，摇床上4℃孵育过夜。随后用PBST在摇床上强力摇晃将膜洗3次，每次5min。根据一抗种属不同，相应地将膜浸于按1:2,0000倍稀释的红光标记的驴抗兔或驴抗鼠二抗，二抗使用时需注意避光，室温条件下在摇床上缓缓摇晃孵育1h，之后用PBST在摇床上强力摇晃将膜洗3次，每次5min。之后将膜用Odyssey双色红外激光成像系统扫描分析。2.9猪瘟病毒感染对ST细胞摄入葡萄糖的影响4ST细胞以7×10个/孔传代至24孔板后饥饿处理及接种病毒过程同2.2.1，感染后用PBS洗两遍，换用配置的低糖培养基继续培养，另设不接种病毒的ST细胞为空白对照，感染组和对照组各3个孔重复。低糖培养基由一定量的葡萄糖粉末、5%透析血清与1%青链霉36 军事医学科学院硕士学位论文素双抗及缺乏葡萄糖DMEM组成。培养基中使得葡萄终浓度为1.0g/L配置而成。分别于感染后12h、24h和48h吸取培养基，将培养基全部转移至RNase-Free的离心管中混匀，置于4℃以备检测葡萄糖定量。两批样品收集完毕后每个样品各取400μL加至3.6mLPBS中作10倍稀释（为了使葡萄糖浓度在试剂盒检测区间之内）。按照Glucose（GO）AssayKit进行如下操作：先按表2.3配置空白管、标准品管及样品管。每管加入1.0mL检测试剂（包括GlucoseOxidase和Peroxidase）并混匀。37℃反应30min后每管加入2mL12N的H2SO4终止反应，小心彻底混匀。空白管调零并于540nm测吸光度。葡萄糖含量计算公式如下：Glucose（mg）=250×（待测管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）。数据处理及统计分析同2.2.2。表2.3各检测管配方Table2.3Theformulationformulateofeachdetectiontube去离子水葡萄糖标准品待测样品空白管1mL0mL0mL标准管0.95mL0.05mL0mL待测管0mL0mL1mL2.10猪瘟病毒对糖酵解相关酶基因表达的影响4ST细胞于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，细胞长满后以7×10个/孔传代至24孔板，培养12h后弃去正常培养基，用PBS洗涤两遍，加入只含DMEM的双无培养基，按MOI=0.3接种猪瘟病毒GD53/2011株，同时设不接种病毒对照，每个处理设置3个重复。感作2h之后换为正常培养基，分别于12hpi、24hpi、36hpi和48hpi收样品，将上清弃去，每孔细胞分别加入1mLTrizol，-20℃存放，待3个时间点样品收集好之后则按照2.4所述提取RNA，随后测定RNA浓度，每个样品取200ng，加入4μL反转录试剂Eastep®RTMasterMix与相应体积的RNase-freeWater中组成一个20μL反转录体系，涡旋振荡混匀后于PCR仪中42℃反应30min，再于95℃灭活5min即得到cDNA。根据糖酵解通路上的关键酶己糖激酶（HK2，Genbank登录号：NM_001122987）、磷酸果糖激酶（PFKM，Genbank登录号：NM_001044550）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，Genbank登录号：KJ786424）、丙酮酸激酶2型（PKM2，Genbank登录号：XP_005666236）以及内参β-肌动蛋白（β-actin，Genbank登录号：NM_001044612）的mRNA序列利用荧光定量引物设计网站（https://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index）在线设计引物，引物序列见表2.4。37 军事医学科学院硕士学位论文表2.4荧光定量用引物和探针序列Table2.4PrimersandTaqManprobesusedinforReal-timePCR引物名称序列(5'-3')目的基因片段HK2-FPGCATCTGCTCGCCTACTTCTHK2mRNAHK2-RPGTGGTAGCTCCAAGCCCTTTHK2mRNAPFKM-FPGGGTTCTCGTCTCAACATCATPFKMmRNAPFKM-RPTGTCATATCCCAGACGCTTTACPFKMmRNAGAPDH-FPTGGTGAAGGTCGGAGTGAACGAPDHmRNAGAPDH-RPCAGCATCGCCCCATTTGATGGAPDHmRNAPKM2-FPAGGATTTGGGTTGGGTCTTCPKM2mRNAPKM2-RPCTGCTGGGTCTTGAGGAAATPKM2mRNAβ-actin-FPTGGAGAAGAGCTACGAGCTGβ-actinmRNAβ-actin-RPACTTCATGATGGAGTTGAAGGβ-actinmRNA表2.5荧光定量PCR的反应体系Table2.5ReactionconditionscomponentsinofReal-timePCR试剂用量（μL）10×SYBRPremix2FP（100μM）0.2RP（100μM）0.2cDNA2ddH2O15.6总体积20-1将ST细胞提取总RNA后反转录得到的cDNA以10倍为梯度从10连续10倍倍比-6稀释到10供绘制标准曲线。以样品cDNA和倍比稀释后的STcDNA为模板，加上各个参与糖酵解酶基因的特异性引物按表2.5所列配20μL反应体系，需用内参β-actin引物以相同样品配同样的体系一并进行反应。荧光定量PCR程序为95℃，30s；45×（95℃，30s；60℃，45s）；95℃，30s；60℃，45s，95℃，30s；95℃，30s。反应结束后利用标准曲线求出每个基因初始浓度，按照公式利用内参校正后算出接种猪瘟病毒后相对未接种病毒组相关酶基因水平差异。数据处理及统计分析同2.2.2。38 军事医学科学院硕士学位论文2.11猪瘟病毒对PKM2表达影响6ST细胞以1×10个/孔传代至平皿，随后按2.10中方法接种病毒，分别于感染后12h、24h、36h和48h收细胞样品用于Westernblot，蛋白提取定量、SDS-PAGE转膜及封闭步骤同2.6-2.8。PBST洗后将膜浸于1:1,000稀释的针对PKM2蛋白的兔克隆单抗。随后步骤同2.8。3实验结果3.1葡萄糖剥夺抑制猪瘟病毒的增殖ST细胞经不含血清的培养基饥饿处理后与猪瘟病毒GD53/2011株孵育2h，病毒与细胞感作后分别加入谷氨酰胺剥夺、葡萄糖剥夺的DMEM或完全培养基，24h后收集细胞毒进行滴度测定。结果显示，与完全培养基相比，剥夺葡萄糖导致病毒滴度显著下降，而谷氨酰胺剥夺时病毒滴度无差别（图2.1），表明葡萄糖在猪瘟病毒复制过程中发挥正向调节作用，而谷氨酰胺则对其无影响。进一步分析发现，葡萄糖剥夺时，细胞内的病毒基因组拷贝数与对照相比下降20倍，释放至胞外的病毒粒子基因组拷贝数下降10倍，而胞内子代病毒粒子的滴度则下降275倍，释放至胞外的病毒粒子滴度下降35倍（图2.2），但胞内与胞外的病毒滴度相同。图2.1葡萄糖剥夺抑制猪瘟病毒的增殖Figure2.1InhibitionofviralproductionofCSFVbyglucosestarvation图2.2葡萄糖剥夺对猪瘟病毒复制（A）和子代病毒粒子形成（B）的影响Figure2.2EffectofglucosestarvationonthereplicationandviralproductionofCSFV39 军事医学科学院硕士学位论文为分析葡萄糖对病毒蛋白表达的调控作用，使用葡萄糖和/或谷氨酰胺剥夺的培养基进行病毒感染细胞的培养，感染48h后裂解细胞，经蛋白定量后进行Westernblot检测。pro结果发现，抗N多克隆抗体与GD53/2011不反应，因此实验对猪瘟病毒SM株感染的样pro品进行了检测，如图3所示，与正常培养基相比，剥夺谷氨酰胺时N蛋白表达略有降低，而剥夺葡萄糖时则其表达显著降低（图2.3）。pro图2.3葡萄糖剥夺抑制猪瘟病毒N蛋白的表达proFigure2.3StarvationofglucosereducedtheexpressionlevelsofN3.2细胞增殖能力检测96孔板中ST细胞贴壁后，用双无DMEM培养基饥饿处理12h，然后分别设置剥夺葡萄糖组、剥夺谷氨酰胺组及对照组，各组细胞分别用相应培养基培养24h，之后收细胞用SRB染色测剥夺培养基中的葡萄糖和谷氨酰胺对ST细胞生长影响，结果显示剥夺培养基会造成细胞数量减少，但剥夺谷氨酰胺组和剥夺葡萄糖组的ST细胞数量相当（见图2.4），说明2.1中剥夺葡萄糖组的猪瘟病毒滴度显著减少不是因为培养基营养物质缺乏破坏细胞增殖引起的，需要考虑的猪瘟病毒增殖对营养物代谢需求。图2.4剥夺谷氨酰胺与剥夺葡萄糖对细胞生长影响无差别Figure2.4Glutaminedeprivationandglucosedeprivationhavenoeffectoncellgrowth40 军事医学科学院硕士学位论文3.3葡萄糖回补促进猪瘟病毒增殖使用含不同浓度葡萄糖的培养基进行猪瘟病毒感染细胞的培养，24hpi收样品测CSFV滴度。结果表明，培养基中葡萄糖浓度在0-1.0g/L时，病毒滴度随着葡萄糖浓度增加而显著升高，即病毒滴度与葡萄糖浓度呈剂量依赖关系，当葡萄糖浓度大于1.0g/L后，病毒滴度不再随浓度升高而变化（图2.5），表明1.0g/L葡萄糖即可实现病毒的最佳增殖。图2.5葡萄糖促进猪瘟病毒的增殖Figure2.5CSFVrequiresglucoseforitsoptimalreplication3.42-DG抑制猪瘟病毒的增殖[54]糖酵解抑制剂2-DG能与葡萄糖竞争己糖激酶从而抑制糖酵解途径，Oxamate作为[55]乳酸脱氢酶抑制剂能抑制丙酮酸转化为乳酸，即可抑制糖酵解最后一步反应。利用2-DG处理ST细胞能显著抑制猪瘟病毒增殖，浓度越高抑制效果越明显（图2.6），表明2-DG介导的糖酵解途径能抑制猪瘟病毒增殖。而Oxamate对猪瘟病毒增殖的影响不显著（图2.7），说明无氧糖酵解可能不是猪瘟病毒增殖所必需的代谢通路。图2.62-DG抑制猪瘟病毒的增殖Figure2.6InhibitionofviralproductionofCSFVby2-DG41 军事医学科学院硕士学位论文图2.7Oxamate不影响猪瘟病毒增殖Figure2.7OxamatedoesnotimpactviralproductionofCSFV3.5猪瘟病毒感染促进ST细胞对葡萄糖的摄取猪瘟病毒感染ST细胞后，按预定时间收实验组及对照组上清，并用葡萄糖检测试剂盒测定上清中葡萄糖浓度，以此分析接种病毒后ST细胞摄取葡萄糖的变化。如图2.8所示，感染后ST细胞对葡萄糖摄入增多，但感染后24h内变化不明显，感染后48h摄入量有显著差异，说明猪瘟病毒感染能促进细胞摄入更多葡萄糖。*P<0.05图2.8猪瘟病毒感染促进细胞对葡萄糖的摄入Figure2.8CSFVinfectionpromotesglucoseuptakeincells3.6猪瘟病毒感染对糖酵解关键酶表达影响猪瘟病毒感染ST细胞后，在不同时间点收集感染组及对照组细胞，提取细胞总RNA，之后选SYBRGreenI染料用双标准曲线法进行荧光定量RT-PCR比较感染猪瘟病毒和未接种病毒ST细胞中HK2、PFKM、GAPDH和PKM2这些参与糖酵解过程中相关酶的基因水平变化。图3.9显示的是这些基因及内参β-actin的溶解曲线及标准曲线，从图2.9A溶解曲线可以看出每个基因只有一个尖锐的峰，说明每对引物的反应产物单一，PCR反应特异性高，这5个基因的标准曲线（图2.9B）的相关系数均大于0.99，扩增效率90-110%，Ct值15-28之间，说明本实验所用的荧光定量方法可靠，可用于进一步分析。42 军事医学科学院硕士学位论文对比感染接种病毒与对照组的基因表达情况发现，HK2、GAPDH和PFKM基因水平基本无变化，PKM2基因在24hpi及之后较正常细胞有一定升高，但不具有统计学意义，见图2.10。图2.9SYBRGreenI荧光定量待测基因的（A）溶解曲线（B）标准曲线Figure2.9Dissolutioncurve(A)andStandardcurve(B)ofReal-timePCR图2.10猪瘟病毒感染相对正常细胞糖酵解相关酶基因的表达差异图2.10猪瘟病毒感染相对正常细胞糖酵解相关酶基因的表达差异Figure2.10DifferenceofexpressionlevelsofglycolyticenzymesininfectedandcontrolgrouFigure2.10Differenceofexpressionlevelsofglycolyticenzymesininfectedandcontrolgroupsps3.7猪瘟病毒感染不影响PKM2的表达猪瘟病毒感染ST细胞后，分别于感染后12h、24h、36h和48h收集细胞样品用于Westernblot检测，以比较感染猪瘟病毒对细胞糖酵解通路中限速酶PKM2表达的影响。如图2.11所示，在不同时间点，正常细胞和病毒感染细胞中PKM2没有明显变化，该结果表明猪瘟病毒感染不影响PKM2的表达。43 军事医学科学院硕士学位论文58KD46KD32KD图2.11猪瘟病毒感染不影响糖酵解关键酶PKM2的表达Figure2.11CSFVhavenoeffectontheexpressionofPKM24小结与讨论实验室前期研究发现，感染猪瘟病毒石门株的猪血清中糖类、脂类和氨基酸等代谢通路中的代谢物发生了明显的差异（未发表），同时基于本次猪瘟病毒感染细胞的代谢组学结果显示病毒感染细胞引起糖酵解、TCA循环、丙酮酸代谢及磷脂酸代谢通路发生明显变化，我们由此推测猪瘟病毒复制增殖与糖酵解及TCA循环代谢通路密不可分。细胞培养中葡萄糖和谷氨酰胺是主要的营养物质，充当碳源、氮源和能源，二者也与糖酵解及TCA[52]循环通路关系密切。因此，本研究通过葡萄糖和谷氨酰胺剥夺处理，探究其对猪瘟病毒增殖的影响，结果发现缺失葡萄糖培养基的猪瘟病毒滴度和蛋白表达水平均显著低于正常培养基组和缺失谷氨酰胺处理组。此外，葡萄糖回补和抑制实验也证明猪瘟病毒复制增殖离不开葡萄糖。本研究也对葡萄糖调控猪瘟病毒增殖的环节进行了研究，发现培养基中缺乏葡萄糖时胞内猪瘟病毒的基因组拷贝数及感染性病毒粒子均显著低于完全培养基，表明葡萄糖是猪瘟病毒基因组复制和病毒粒子组装过程必不可缺的物质。有趣的是，缺乏葡萄糖时胞内外病毒滴度几乎无差别，表明葡萄糖不参与猪瘟病毒的释放。多种病毒感染细胞后为了高效增殖需要糖酵解，早在1950和1960年代就有研究显示在MEM培养基中脊髓灰质炎病毒的传播被阻滞，然而补充葡萄糖能使病毒滴度有明显提[16]高。后来又在逆转录病毒科、有囊膜的双链DNA病毒疱疹病毒、无囊膜双链DNA病毒腺病毒及单股正链RNA病毒黄病毒科上证实病毒感染会劫持糖酵解途径来完成病毒的[56,57]生命周期。而病毒劫持糖酵解来完成病毒生命周期的相关机制已被部分阐释，比如，[17]HCVNS5A蛋白能结合并激活糖酵解的限速酶己糖激酶以促进病毒复制，HCMV则劫持转运葡萄糖效率更高的葡萄糖转运体4（GLUT4），而不是通常用到的葡萄糖转运体144 军事医学科学院硕士学位论文[58]（GLUT1）使感染细胞摄入更多的葡萄糖，另有研究表明HCMV感染能提高AMP激[59]活酶（AMPK）活性，AMPK激活对病毒的高效复制十分必要。我们也初步探索了猪瘟病毒感染后对糖酵解的影响，首先通过葡萄糖摄入分析证实了猪瘟病毒感染会诱发细胞摄入更多的葡萄糖，用相对荧光定量方法检测了糖酵解通路中HK2、PFKM和PKM2及GAPDH基因表达情况，结果显示12hpi、24hpi和48hpi这几个时间点的接种病毒与否并不影响这些基因表达，随后Westernblot实验也未发现猪瘟病毒引起PKM2蛋白表达变化，推测可能原因是糖酵解通路中其它酶发挥作用，或者这些相关酶发挥作用是通过某个时间段活性的瞬时改变影响代谢，将来需要扩大基因和蛋白的检测范围，并加入酶活性检测试验，从而深入探究猪瘟病毒劫持糖酵解调控病毒复制和组装的分子机制。病毒感染诱发糖酵解所产生的碳去向也是研究人员所关注的，一些病毒激活糖酵解的[60]同时也引发TCA循环中间产物的含量升高，糖酵解的碳流入TCA循环，该反应提供的[61]额外能量和用于氨基酸及脂肪生物合成的前体对感染也很重要。然而在登革病毒研究中[13]发现，用草氨酸盐抑制丙酮酸向乳酸代谢，即抑制无氧糖酵解导致病毒不能正常增殖，提示登革病毒很有可能诱发细胞产生的是无氧糖酵解。我们实验结果显示草氨酸钠对猪瘟病毒无抑制效果，说明抑制乳酸产生不能降低猪瘟病毒滴度，提示无氧糖酵解产物乳酸不是猪瘟病毒增殖所必需的，结合代谢组学结果，推测猪瘟病毒诱发细胞糖酵解产生的丙酮酸进入TCA循环进行有氧糖酵解是猪瘟病毒增殖不可或缺的代谢途径。目前关于病毒感染后对TCA循环代谢扰动的知之甚少，主要因为进入和流出该循环的代谢物数目过多是[62,63]造成检测TCA循环代谢活性困难，另一方面是因为一些中间产物在胞质和线粒体中[64]都存在，这也增加了分析难度。靶向代谢组学和细胞生物学技术的发展将逐渐解决这些困扰。人们已经注意到病毒感染引发细胞代谢的紊乱，近年来兴起的代谢组学技术将全面揭示病毒感染引起的宿主细胞代谢紊乱情况，有助于深入揭示病毒复制和致病的分子机制，为筛选新的抗病毒靶标和制定合理的防控策略奠定基础。45 军事医学科学院硕士学位论文结论1、猪瘟病毒感染ST细胞可引起脂类、氨基酸、糖类和核苷酸等代谢物的显著改变，且代谢物变化与猪瘟病毒生活史相对应。2、猪瘟病毒感染促进宿主细胞对葡萄糖的摄取及代谢，感染后细胞内葡萄糖先是以糖酵解为主要代谢通路，之后则主要经磷酸戊糖途径代谢以促进核酸合成。3、糖代谢通路对猪瘟病毒增殖有重要作用，猪瘟病毒正常复制离不开葡萄糖，而谷氨酰胺对猪瘟病毒增殖并无影响。46 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军事医学科学院硕士学位论文个人简介基本资料：姓名：张必凯性别：男出生年月：1992年9月籍贯：河南省新乡市政治面貌：中共党员主要学习经历：2009年9月-2014年6月西北农林科技大学动物医学院动物医学专业，获农学学士学位；2014年9月-2017年6月军事医学科学院军事兽医研究所预防兽医学专业，攻读硕士。硕士期间发表论文情况：[1]ZhangB,MiS,BaoF,etal.CompleteGenomeSequenceofaSub-Subgenotype2.1iIsolateofClassicalSwineFeverVirusfromChina[J].GenomeAnnouncements,2017,5(14):e00127-17.[2]GongW,JiaJ,ZhangB,etal.Serummetabolomicprofilingofpigletsinfectedwithvirulentclassicalswinefevervirus[J].FrontiersinMicrobiology,2017,8:731.[3]张必凯,米士江,包菲,等.葡萄糖促进猪瘟病毒增殖的研究[J].吉林农业大学学报.（已录用）[4]贾俊杰,张必凯,张莉,等.猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备[J].动物医学进展,2016,37(5):5-10.[5]罗庆华,贾俊杰,张必凯,等.猪瘟病毒Npro蛋白及细胞内环境改变对其IRES活性的影响[J].中国预防兽医学报,2016,38(11):844-848.52 军事医学科学院硕士学位论文致谢研究生的学习生涯转瞬即逝，在军事兽医研究所的求学阶段收获很多，对实验室这个大家庭充满感激和不舍之情，正是在大家帮助下才顺利完成学业，在此郑重表示感谢。非常感谢我的导师涂长春研究员对我的悉心培养，第一次和老师见面，交流时老师的和蔼可亲丝毫没有架子，让人如沐春风。进入实验室接触到的是老师严谨的治学态度、高尚的品格、求真务实的作风，这些都愈发让人心生崇敬之情。老师经常邀请国内外专家进行学术交流，给我们提供宝贵的学习交流的机会，为我们叩开科学殿堂的大门，让我们在实验室这个平台上全面发展。谢谢您的谆谆教导，老师的言传身教是我受之不尽的财富。感谢龚文杰老师对我一步一步的指引，您渊博的知识、开阔的思路、细致严谨的素养给我树立了标杆，是我学习努力的榜样。您不仅是良师更是益友，像兄长一样关心我们的生活和思想，热心的为我们答疑解惑，引导我们在科研和做人方面有更高的追求。还要感谢贾俊杰师兄，带我入门教我实验技能，让我从一无所知到独立开始实验，师兄的自信担当让人敬佩，毕业后仍挂念实验室和我的实验进展，对实验室的赤诚之心薪火相传。感谢实验室的郭焕成老师、刘艳老师、冯烨老师和何彪老师，无论是实验技术方面的指导还是组会汇报时你们的点拨给了我很大启迪，让我走上科研道路的正轨，生活中你们的平易近人、热情相助让实验室的大家庭充满温暖。感谢谢金鑫博士、张莉硕士、罗庆华硕士、米士江硕士、包菲硕士，大家同舟共济，为我完成课题给予了莫大的支持。此外，还要感谢张岩博士后、曹永国博士后、李勇博士后、徐琳博士、涂忠忠博士、李兴宇硕士、刘东晓硕士、蔡建秋硕士、于明洋硕士、杨灵恩硕士、朱爱薇硕士、谈之舟硕士、张培生硕士、王宇洋硕士、任照文硕士、许炜迪助理、赵梓涵助理、刘婷芳助理等，感谢你们对我的无私帮助，大家相处的日子里充满欢声笑语。还要感谢我们的后勤工作人员王素珍和信秀琴阿姨，辛勤的付出为我们创造条件，让我们安心做实验。十分感谢李博、马海彬和王中一等2014级8班同学对我的大力支持和帮助。衷心感谢夏咸柱院士，金宁一院士和扈荣良研究员课题组无私提供相关仪器和材料，帮助实验的顺利完成。特别感谢军事医学科学院军事兽医研究所的培养，博学求是、忠诚卓越的烙印将永远伴我成长。还要特别感谢我的父母和女朋友，你们对我的支持和信任给予我力量，正是你们的默默付出才让我得以全身心投入到喜欢做的事情，能够一步一个脚印向前走。最后，再次向所有帮助过我、关心过我的老师、同学、家人和朋友表示最诚挚的感谢，谢谢你们一直以来对我的指导和陪伴，祝愿你们身体健康、工作顺利、事事顺心。53