《早期胃癌和癌前病变临床诊断方法比较及相关标志物的表达研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号Ｒ５７密级公开ＵＤＣ６１０学校代码１０５５５硕士学位论文（专业学位）早期胃癌和癌前病变临床诊断方法比较及相关标志物的表达研究研究生姓名：金莉彬指导教师、职称：刘迪群教授合作导师：周伟伟博士专业学位类别（领域）：临床医学（内科学）研究方向：消化道肿瘤所在学院一：南华大学附属第临床学院二Ｏ—１八年五月 ？？由考史孳早期胃癌和癌前病变临床诊断方法比较及相关标志物的表达研究＂论文作者签名：令翁Ｉ指导教师签名：论文评阅人－１：省系派｜被樹斜鄉峨＿评阅人２：阳ｆａ备£祐备灼１奸＆ｒｉｊ帝今舞坪ｑ评阅人３：答辩委员会主席：射欲谢物大違：逢委员１，、由委员２：＾４委员３：Ｕ＾ｔ委员４栩来＾知ｔｅｉ－：备ｆ＇汾ｒｆｆｅ／Ｉｔｙ巧导耳ｆ委员５：委员６：答辩日期丨《年〇ｒ月＞〇曰： 南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宂工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：＾＿＜月“日＾南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文，。本论文的研宄成果归南华大学所有本论文的研宄内容不得以其它单位的。本人同意南华大学有关保留，即：学校有权保名义发表、使用学位论文的规定留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分、可根国家湖，可它手留学位论文；学校据或南省内容以采用复印缩印或其段保论文。论文加入《中国优博硕士学论文全有关部门规定送交学位同意学校将秀位士学论文全库章程》规享受相》，《国优秀博硕位文数据出版定文据并按中数库《论意授权科学信息技术究所将学位论文收录到中国学位文关权益。同中国研本，全文数库息务。密的学位论文解》，通过网络向社会公众提供信服对于涉据井。密后适用该授权ｋＡ＃＾签；曰名年作者月签：年Ｔ日导师名巧月＾｛ 早期胃癌和癌前病变临床诊断方法比较及相关标志物的表达研究摘要第一部分早期胃癌和癌前病变临床诊断方法比较目的:通过比较内镜黏膜下剥离术（ESD）术前临床诊断方法、术后病理诊断与金标准的相符率，评估术前临床诊断方法对早期胃癌及癌前病变诊断准确率，期望建立一种相对准确的术前诊断体系，对早期胃癌及癌前病变的治疗做出相对准确的指导。方法:采用回顾性分析方法，收集从2014年01月至2018年01月在南华大学第一附属医院行ESD治疗且术后经病理组织学诊断为早期胃癌及癌前病变患者的89例病例。对ESD术前临床诊断方法各组成部分的诊断及术后病理诊断与金标准进行比较，进而对术前各部分临床诊断方法对早期胃癌及癌前病变诊断的准确性进行分析。1）术前临床诊断方法包括白光内镜检查及内镜下活检术、窄谱成像技术联合放大内镜（NBI-ME）、超声内镜（EUS），术后病理诊断是指经ESD整块切除的标本所得到的病理诊断结果，金标准是指前后两次病理诊断中病变程度最重的诊断；2）早期胃癌及癌前病变的术前病理诊断结果主要是依靠内镜检查及内镜下活检的病理诊断；病变分期技术包括NBI-ME及EUS诊断；3）本研究选用Receiver-Operating-Characteristic(ROC)曲线分析，分析术前临床诊断方法及各个部分曲线下面积（theAreasundereachROCcurve,AUC）、I 术后病理诊断AUC，对术前临床诊断方法的准确性进行分析；通过对比术前临床诊断方法及术后病理诊断与金标准的符合率，对术前临床诊断方法的临床应用价值做出综合评估。结果:本研究结果表明，与金标准相比，术前临床诊断方法诊断准确率为75.3%，术后病理诊断准确率为84.3%（P＞0.05），二者无明显差异。ROC曲线表明，术前临床诊断方法AUC为0.838，术后病理诊断AUC为1（P＞0.05），二者无明显差异；术前临床诊断方法中各部分AUC分别为内镜活检诊断0.746，超声内镜诊断0.72，NBI-ME诊断0.813，术前临床诊断方法各部分AUC均大于0.5，认为诊断具有可靠性。结论:术前临床诊断方法具有与黏膜切除术后病理诊断相似的诊断价值，这对早期胃癌及癌前疾病的诊断及治疗具有指导意义。关键词：内镜下粘膜切除术；早期胃癌；癌前病变；II 第二部分早期胃癌及癌前病变相关标志物的表达研究目的:通过比较早期胃癌及癌前病变相关标志物在早期胃癌、胃黏膜不同程度上皮内瘤变与正常胃黏膜组织中的表达情况，分析其与胃癌的发生是否具有一定相关性，探究是否存在一种或几种能对早期胃癌的筛查具有预警意义的标志物。方法:（1）标本来自我院2014年01月至2018年01月在南华大学第一附属医院行ESD术后经病理组织学诊断为早期胃癌及癌前病变患者的72例病例,对其纳入实验组的病例标本的蜡块进行重新切片；（2）通过GEO数据库筛选出在早期胃癌中具有差异表达的基因，从中筛选出OXTR、LRFN4、GPER、VEGF-D作为目标基因，用免疫组化方法检测其所对应表达的蛋白是否在早期胃癌及不同程度上皮内瘤变中存在表达水平差异，试图寻找对早期胃癌有预警意义的肿瘤标志物，为胃癌的发生提供依据。结果：1．OXTR在早期胃癌及不同程度上皮内瘤变中表达情况具有明显差异（P＜0.001）；2.LRFN4在早期胃癌及不同程度上皮内瘤变中表达情况具有明显差异（P＜0.001）；3.GPER在早期胃癌及不同程度上皮内瘤变中表达情况具有明显差异（P＜0.05）；4.VEGF-D在早期胃癌及不同程度上皮内瘤变中表达情况具有明显差异（P＜0.05）。III 结论:OXTR、LRFN4、GPER、VEGF-D在早期胃癌及不同程度上皮内瘤变病变中表达具有明显差异，对早期胃癌及癌前病变具有预警意义。关键词：早期胃癌；胃黏膜上皮内瘤变；OXTR；LRFN4；GPER；VEGF-DIV PartIComparisonofClinicalDiagnosticMethodsandExpressionofRelatedMarkersinEarlyGastricCancerandPrecancerousLesionsLibinJin(medicaloncology)DirectedbyDiqunLiuAbstract:Objective:Bycomparingthepreoperativeclinicaldiagnosisofendoscopicsubmucosaldissection(ESD),postoperativepathologicaldiagnosiswiththegoldstandard.,toevaluatetheaccuracyofpreoperativeclinicaldiagnosismethodsforthediagnosisofearlygastriccancerandprecancerouslesions.Itisexpectedtoestablisharelativelyaccuratepreoperativediagnosissystemtoproviderelativelyaccurateguidanceforthetreatmentofearlygastriccancerandprecancerouslesions.Method:Aretrospectiveanalysismethodwasusedtocollect89casesofpatientswithESDtreatedattheFirstAffiliatedHospitalofNanhuaUniversityfromJanuary2014toJanuary2018andhistopathologicallydiagnosedasearlygastriccancerandprecancerouslesions.TheaccuracyofeachcomponentofpreoperativeclinicaldiagnosisofESDandpostoperativepathologicaldiagnosiswascomparedwiththegoldV standard,andtheaccuracyofpreoperativediagnosisofearlygastriccancerandprecancerouslesionswasanalyzed.1)Preoperativeclinicaldiagnosticmethodsincludewhiteendoscopyandendoscopicbiopsy,narrow-spectrumimagingcombinedwithendoscopy(NBI-ME),endoscopicultrasonography(EUS),postoperativepathologicaldiagnosisreferstotheentireblockofESDThepathologicaldiagnosisresultsoftheresectedspecimens,thegoldstandardreferstothediagnosisofthemostseriouslesionsinthepathologicaldiagnosisbeforeandafter;2)Thepreoperativepathologicaldiagnosisresultsofearlygastriccancerandprecancerouslesionsmainlyrelyonpathologicaldiagnosisofendoscopyandendoscopicbiopsy;thediseasestagingtechniqueincludesNBI-MEandEUSdiagnosis;3)Inthisstudy,Receiver-Operating-Characteristic(ROC)curveanalysiswasusedtoanalyzepreoperativeclinicaldiagnosismethodsandtheAreasundereachROCcurve(AUC),postoperativepathologicaldiagnosisofAUC,andpreoperativeclinicaldiagnosis,andbythisway,weanalyzedtheaccuracyofpreoperativeclinicaldiagnosticmethods.Bycomparingthepreoperativeclinicaldiagnosismethodandpostoperativepathologicaldiagnosiswiththegoldstandard,acomprehensiveassessmentwasmadeoftheclinicalapplicationvalueofpreoperativeclinicaldiagnosticmethods.Results:Theresultsofthisstudyshowthatcomparedwiththegoldstandard,VI theaccuracyofpreoperativeclinicaldiagnosisis75.3%,andtheaccuracyofpostoperativepathologicaldiagnosisis84.3%(P>0.05).Thereisnosignificantdifferencebetweenthetwo.TheROCcurveshowedthatthepreoperativeclinicaldiagnosismethodAUCwas0.838,postoperativepathologicaldiagnosisAUCwas1(P>0.05),therewasnosignificantdifferencebetweenthetwo;thepreoperativeclinicaldiagnosismethodforeachpartoftheAUCwereendoscopicbiopsydiagnosis0.746,ultrasoundEndoscopicdiagnosisof0.72,NBI-MEdiagnosisof0.813,preoperativeclinicaldiagnosisofAUCinallpartsofmorethan0.5,thatthediagnosisisreliable.Conclusion:Thepreoperativeclinicaldiagnosismethodhassimilardiagnosticvaluewithpathologicaldiagnosisaftermucosalresection,whichhasguidingsignificanceforthediagnosisandtreatmentofearlygastriccancerandprecancerousdiseases.Keywords：Endoscopicmucosalresection（EMR）Earlygastriccancer(EGC)PrecancerouslesionVII PartIIExpressionofMarkersAssociatedwithEarlyGastricCancerandPrecancerousLesionsObjective:Bycomparingtheexpressionofrelatedmarkersinearlygastriccancer,gastricmucosatodifferentdegreesofintraepithelialneoplasiaandnormalgastricmucosaltissue,toanalyzewhetherithasacertaincorrelationwiththeoccurrenceofgastriccancer,toinvestigatewhetherthereareoneormoremarkersthatcanhaveearlywarningofearlygastriccancerscreening.Method:(1)Thespecimenswereobtainedfrom72casesofpatientswithearlygastriccancerandprecancerouslesionsdiagnosedbypathologicalhistologyattheFirstAffiliatedHospitalofNanhuaUniversityfromJanuary2014toJanuary2018inourhospital.Thewaxblocksofthespecimensincludedintheexperimentalgroupwerere-sliced;(2)ThroughtheGEOdatabase,geneswithdifferentialexpressioninearlygastriccancerwerescreenedout,OXTR,LRFN4,GPER,VEGF-Dwereselectedastargetgenes,andthecorrespondingexpressedproteinsweredetectedbyimmunohistochemistrytodetectearlygastriccancerandtovaryingdegreesinintraepithelialneoplasia.Wearetryingtofindtumormarkersthathaveearlywarningsignificanceforearlygastriccancerandprovideevidencefortheoccurrenceofgastriccancer.VIII Results:1.TheexpressionofOXTRwassignificantlydifferentinearlygastriccancerandintraepithelialneoplasia(P<0.001).2.TheexpressionofLRFN4wassignificantlydifferentinearlygastriccancerandintraepithelialneoplasia(P<0.001).3.TheexpressionofGPERwassignificantlydifferentinearlygastriccancerandintraepithelialneoplasia(P<0.05).4.TheexpressionofVEGF-Dwassignificantlydifferentinearlygastriccancerandintraepithelialneoplasia(P<0.05).Conclusion:OXTR,LRFN4,GPER,VEGF-Dexpressioninearlygastriccancerandvaryingdegreesofintraepithelialneoplasiahavesignificantdifferences,andhaveearlywarningsignificanceforearlygastriccancerandprecancerouslesions.Keywords:EarlygastriccancerGastricintraepithelialneoplasiaOXTRLRFN4GPERVEGF-DIX 主要缩略语词及英文索引中文全称英文全称及缩略词内镜下黏膜切除endoscopicmucosaresection,EMR内镜下切除endoscopicresection,ER内镜黏膜下剥离术endoscopicsubmucosadissection,ESD超声内镜endoultrasonography,EUS高级别上皮内瘤变highgradeintraepithelialneoplasia,HGTN低级别上皮内瘤变lowgradeintraepithelialneoplasia,LGIN免疫组化immunohistochemical窄带成像技术narrowbandimages,NBIROC曲线分析Receiver-Operating-Characteristic,ROC术中出血immediatelybleedingXI 目录摘要:.......................................................................................................IAbstract:.....................................................................................................V主要缩略语词及英文索引.....................................................................XI第一部分：早期胃癌及癌前病变临床诊断方法比较............................1第1章前言.........................................................................................1第2章实验方法....................................................................................5第3章实验结果....................................................................................9第4章结论..........................................................................................15第5章讨论........................................................................................17第二部分：早期胃癌及癌前病变相关标志物的表达研究..................21第1章前言.......................................................................................21第2章实验材料..................................................................................29第3章实验方法..................................................................................31第4章实验结果..................................................................................33第5章讨论.......................................................................................41第6章结论.......................................................................................43参考文献...................................................................................................45文献综述...................................................................................................53参考文献...................................................................................................63致谢.......................................................................................................67 第一部分：早期胃癌及癌前病变临床诊断方法比较第1章前言据最新研究报告指出，胃癌是第五大常见的恶性肿瘤，并且是全球癌症相关性死亡的第三大原因[1]，其预后与诊断阶段密切相关，总体5年生存率低于25％。胃癌的预后可以通过早期检测以及对高风险患者的动态监测来改善[2]。目前胃癌筛选的方法主要包括内镜检查、针对高危人群的血清学标志物的检测及“筛选与治疗”的方法[3]。现阶段只有在日本和韩国两大患病率高的国家（分别为29.9%和41.3%）进行胃癌筛查。如何提高早期胃癌的诊治率是当前研究的热点之一。由Lauren在1965年提出的有关于胃癌的组织学类型分为肠型和弥漫型两种，部分胃癌同时具有肠型和弥漫型的特点，称为混合型胃癌。通常肠型胃癌的发展是由“慢性非萎缩性胃炎—慢性萎缩性胃炎—肠化生—上皮内瘤变—早期胃癌—胃癌”逐渐转化而来。目前上皮内瘤变是被公认的癌前病变，与胃癌的发生密切相关，而高级别上皮内瘤变被认为是不可逆转的癌前病变。上皮内瘤变这一概念的提出，主要根据组织学形态结构改变中细胞的异型性和结构紊乱程度分为低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变，取代了以往异型增生、不典型增生和原位癌等术语。早期胃癌（EGC）被定义为癌组织浸润深度仅局限于黏膜或黏膜下层者，而不论是否存在淋巴结转移（LNM）。随着内窥镜设备的发展和诊断能力的提升，目前无症状阶段的早期胃癌检出率较以往明显提高[4]。国外现多采用多点活检来帮助判断病灶的性质，多次黏膜活检的上消化道内镜检查可以诊断EGC，灵敏度高达96％。此外，可采用NBI放大内镜(NBI-ME)的方法来评估病变性质及分型，采用超声内镜（EUS）来对肿瘤的分期及判断是否存在远处转移做评估。现国内多采用常规白光胃镜、色素内镜、电子染色+放大内镜、超声内镜、荧光内镜、激光共聚焦内镜等多种手段相结合的方式对早期胃癌进行筛查。它们提供了早期胃癌的诊断依据，并指导下一步治疗。目前被广泛认可的内镜下鉴别癌变和非癌性病变的标准如下：1）常规内镜检查结果：界限分明的病变、颜色/表面形态不规则；2）放大内窥镜和窄带成像（M-NBI）结果：不规则的微血管分界线1 或不规则的微型表面分界线模式。胃镜结合活检术在目前诊断早期胃癌中占有着重要的地位，内镜下活检病理诊断对疾病的诊断及治疗起着重要的作用。内镜活检在实际操作过程中常因内镜操作者技术水平、操作者对病变本身严重程度的辨别能力，以及取材部位、深浅、形态、内镜视野的清晰度等多因素的作用而影响活检的准确性。术前活检病理诊断与术后病理诊断存在一定的差异，对早期胃癌及癌前病变的检出率也受到一定影响，为此术前活检术对早期胃癌及癌前病变内镜活检准确率有待我们进一步研究。目前窄带成像技术（NBI,narrowbandimaging）和超声胃镜(EUS)逐渐广泛地被运用至临床。NBI是一种新的内镜增强技术，它联合了放大内镜，可以提高对早期胃癌诊断的准确率，现被当作早癌的精查项目之一。它可以通过增强胃黏膜表层的对比，更加清晰的去发现黏膜表面的细微结构的改变，同时能分辨微腺体、微血管病变及胃平坦性病变，其缺点是不能显示病变浸润深度。EUS相对NBI-ME来说，它能清楚地显示胃壁的5层结构,能有效地观察病变的侵犯深度。根据二十多年来发表的众多报道，EUS常被报道为胃癌局部分期高度准确的方法，是胃癌局部分期最有前景的工具之一[5]。由此可见两者的作用可以对早期胃癌起到相互补充的作用，在筛查早期胃癌及癌前病变中占有重要地位。随着内镜技术的不断进步，目前早期胃癌及癌前病变内镜下治疗主要包括:黏膜切除术（endoscopicmucosalresection，EMR）和黏膜下剥离术(endoscopicsubmucosaldissection,ESD)两种方式。两种技术都可以切除含有早期肿瘤的黏膜（可能还有一部分黏膜下层），而不会中断更深层。EMR可以整块移除小于2厘米的病变，而较大的病变可能需要分次切除。这可能会限制对病变边缘的评估以及定位病变的边界。ESD在EMR的基础上进行改良，不论其大小如何，都可以对病变进行整块切除。ESD是用专用的针刀进行的，它允许切开，然后小心地剥离黏膜下层的病变。行ESD治疗之后的肿瘤复发很少，但是这种技术掌握难度大，手术耗时长，且穿孔风险较高，这问题均尚待解决。据报道，尽管在几乎所有的胃内ESD中，术中出血很少发生，但ESD发生出血、穿孔等并发症的总发生率较EMR有增多[6]。随着人们对术中、术后生活质量要求的提高，在早期胃癌中，微创内镜治疗已成为EGC的首选治疗方法，内镜切除术（ER）正在2 成为与手术切除地位等同的标准治疗手段之一[7,8]，让更多早期胃癌患者能在内镜下一次性完全切除，使患者免受开腹手术的痛苦。目前早期胃癌及癌前病变术前临床诊断方法包括白光内镜及内镜下活检、NBI-ME、EUS（如图1），术后诊断是指黏膜切除术后病理诊断结果，金标准是指内镜活检诊断及术后病理诊断中病理严重程度最重的诊断。图1早期胃癌内镜下检查及ESD术后（图a、b分别为早期胃癌在白光内镜、NBI-ME镜下表现，图c、d分别为EUS、ESD术后表现）本研究通过分别对比分析ESD术前临床诊断方法、术后病理诊断与金标准的ROC曲线下面积，根据术前临床诊断方法与金标准的符合率，从而评估术前临床诊断方法对早期胃癌及癌前病变诊断的应用价值，期待能够建立一种相对准确的术前诊断体系，为早期胃癌及癌前病变的诊治做出相对准确的指导。3 第2章实验方法2.1病例资料本实验所研究的对象为我院2014年01月至2018年01月在我院消化内科行ESD治疗后诊断为早期胃癌及癌前病变的89例患者。2.2术前各部分临床诊断方法及诊断标准2.2.1胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌的定义上皮内瘤变分为低级别(LGIN)和高级别(HGIN)两级，LGIN包括了轻度和中度异型增生，HGIN包括了重度异型增生和原位癌。选用分类诊断标准[9]，低级别上皮内瘤变异型增生表现为轻度的腺体结构紊乱和轻中度的细胞异型，高级别上皮内瘤变异型增生表现为中重度的腺体结构紊乱和细胞异型，具有高核质比、核分裂像常见、核极性多消失等特征。上皮内瘤变这一名词的提出，取代了以往常用的非典型增生、异型增生和原位癌的病理诊断。早期胃癌（ECG）是指病变范围局限于黏膜层或黏膜下层，而不论病有无周围淋巴结的转移的胃癌。参照巴黎分型标准，早期胃癌可分为三型[10]，分别为（I型）隆起型，（II）型表浅型以及（III）型凹陷型。其中（II）型早期胃癌又包括三个亚型，分别为（IIa）型表浅隆起型，（IIb）型表浅平坦型，(IIc)型表浅凹陷型；而实际临床中还可分为混合型，如Ⅱa+Ⅱc、Ⅱc+Ⅲ型等。2.2.2NBI放大内镜（NBI-ME）分型及诊断标准本研究NBI-ME诊断早期胃癌标准,采用Yao[11]提出的“VS分类系统”,即(1)不规则的表面微结构(irregularmicrosurfacepattern,IMSP)和明显的分界线(demarcationline,DL)；(2)不规则的微血管(irregularmicrovascularpattern,IMVP)和明显DL.只要任意一条符合便可诊断为早期胃癌，反之排除。2.2.3超声内镜（EUS）诊断标准超声内镜（EUS）能够清晰显示胃壁的解剖层次结构，内镜超声回声由内向外依次为：高-低-高-低-高，分别对应黏膜层-黏膜肌层-黏膜下层-固有肌层-浆膜4 层。超声胃镜可以通判断病变组织的大小、浸润深度、组织来源等进行综合判断，从而进一步诊断。2.2.4术前诊断的定义术前诊断主要是指综合术前各部分临床诊断方法中的诊断结果对病变做出的初步诊断，包括病理诊断和分期诊断，其中病理诊断主要是依据内镜下活检术病理诊断结果，而分期诊断是指由NBI-ME和EUS所做出的综合判断。分期诊断它主要判断病变处表面微结构是否存在微血管或微腺体的改变，以及是否伴有各黏膜层次结构的改变及判定病变深度。2.2.5金标准的定义通常临床上将病理诊断作为疾病诊断的金标准，但根据我们所统计的数据显示，术前内镜活检病理诊断与ESD术后病理诊断存在一定差异，通过查阅相关资料[11]，本研究将金标准定义为术前病理诊断和术后病理诊断中严重程度最重的诊断[12-13]。金标准的制定可以对病变的诊断及黏膜切除术后治疗方案的确定有一定指导意义。2.3术前临床诊断方法各部分诊断分析（1）内镜下活检对早期胃癌及不同程度胃粘膜上皮内瘤变的诊断价值分析：所有ESD术前均需行内镜下活检诊断，比较术前内镜下活检诊断与术后病理符合率及ROC曲线下面积。（2）NBI-ME对早期胃癌及不同程度胃黏膜上皮内瘤变的诊断价值分析：所有考虑早期胃癌及癌前病变的患者ESD术前均需行NBI放大染色，比较术前NBI放大染色镜下诊断与术后病理符合率及ROC曲线下面积。（3）EUS对早期胃癌及不同程度胃黏膜上皮内瘤变的诊断价值分析：所有ESD术前均需行EUS检查，判断病变大小、浸润深度及病变性质，比较术前EUS结果与术后病理诊断符合率及ROC曲线下面积。（4）通过比较术前临床诊断方法AUC与术后病理诊断AUC，评估两者之间差异性。5 2.4ROC曲线的定义及价值ROC曲线全名叫做受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve)，又称为感受性曲线(sensitivitycurve)。其纵坐标以真阳性率（即灵敏度）表示，横坐标以假阳性率（1-特异度）表示。本研究中主要利用ROC曲线可以对两种或两种以上不同诊断方式对疾病诊断能力的比较，对比ROC曲线下面积（AUC）大小，AUC越大者诊断价值越好。因此，我们通过分析各部分AUC的大小，进而评估其临床诊断的能力。2.5统计学分析本研究假设术前临床诊断方法与术后诊断对早期胃癌及癌前病变诊断的准确性具有相似的准确性。研究应用SPSS.22进行数据分析，采用X²检验比较计数资料，采用ROC曲线分析准确性，以金标准为对照比较术前临床诊断方法中曲线下面积与黏膜切除术后病理诊断曲线下面积进行比较，评估二者差异。6 第3章实验结果3.1内镜下活检对早期胃癌及癌前病变诊断价值分析1）内镜下活检病理诊断与黏膜切除术后病理诊断比较内镜下活检病理诊断与黏膜切除术后病理诊断相比，诊断相符率为79.8%（71/89），诊断不符为20.2%（18/89），ROC曲线分析，与黏膜切除术后病理诊断比较AUC为0.764。（见表3.1.1、图2）表3.1.1内镜活检病理诊断与黏膜切除术后病理诊断对比黏膜切除术后病理诊断.活检诊断LGTNHGTNEGC合计LGTN56465HGTN412420EGC0044总计59181289图2内镜活检-黏膜切除术后诊断ROC2）内镜下活检病理诊断与金标准比较7 内镜下活检病理诊断与诊断金标准相比，诊断相符率为84.3%（75/89），诊断不符为15.7%（14/89），ROC曲线分析，与金标准比较ROC曲线下面积为0.764。（见表3.1.2、图3）表3.1.2内镜活检病理诊断与金标准诊断对比金标准.活检诊断LGTNHGTNEGC合计LGTN556465HGTN016420EGC0044总计55221289图3内镜活检-金标准比较ROC3.2NBI-ME对早期胃癌及癌前病变诊断价值分析NBI-ME与金标准为早期胃癌相比，诊断相符率为83.3%，诊断不符为2.4%，ROC曲线分析，与金标准诊断为比较ROC曲线下面积为0.813。（见表3.2、图8 4）表3..2NBI-ME与金标准对比金标准.NBI-MELGTNHGTNEGC合计无529263早癌3131026总计55221289图4NBI-ME-金标准比较ROC3.3超声内镜对早期胃癌诊断价值分析临床上超声内镜对早癌的诊断主要用于评估病变浸润深度，而对早期胃癌及癌前病变的阳性检出率却不如NBI-ME，与金标准为早期胃癌符合率为58.3%，ROC分析曲线下面积AUC为0.72。（见表3.3、图5）9 表3.3超声与金标准对比金标准.超声内镜LGTNHGTNEGC合计无5016571早癌56718总计55221289图5超声内镜-金标准诊断比较ROC3.4术前诊断对早期胃癌诊断价值分析本实验将术前临床诊断方法对早期胃癌的诊断评定标准定义为白光内镜下或病理活检提示早期胃癌，同时有NBI-ME或超声内镜二者任意一种检查提示早期胃癌者，则将其术前诊断判定为早期胃癌。术前诊断与金标准相比，诊断相符率75.3%，诊断不符24.7%，ROC分析曲线下面积AUC为0.838。（见表3.4、图6）10 表3.4术前诊断与金标准对比金标准.术前诊断LGTNHGTNEGC合计LGTN503154HGTN0606ECG5131129合计55221289图6术前诊断ROC曲线3.5ESD术后病理诊断对早期胃癌及癌前病变的诊断分析内镜下黏膜切除术后病理与金标准相比，诊断相符率95.5%，诊断不足4.5%，ROC曲线分析线下面积AUC为1。(注：金标准在为前后病理诊断中最重的诊断，本研究统计资料显示，金标准诊断为早期胃癌者的12例患者，与黏膜切除术后病理诊断相比，在关于早期胃癌这一诊断符合率为100%)。（见表3.5、图7）11 表3.5术后病检与金标准对比金标准.术后病检LGTNHGTNEGC合计LGTN554054HGTN018018ECG001212合计55221289图7切除术后病理ROC曲线12 第4章结论术前临床诊断方法具有与黏膜切除术后病理诊断相似的诊断价值，这对早期胃癌及癌前疾病的诊断及治疗具有指导意义。13 第5章讨论胃癌的发生是一个逐渐演变的过程,目前较多的认可肠型胃癌的发展是由“慢性非萎缩性胃炎—慢性萎缩性胃炎—肠化生—上皮内瘤变—早期胃癌—胃癌”逐渐转化而来。异型增生被认为是癌前病变,与胃癌的发生发展有着密切联系。2002年,世界卫生组织WHO引入了上皮内瘤变（GIN）的概念，取消了以往常用的异型增生、不典型增生、原位癌和疑癌等术语，统一用上皮内瘤变(GIN)命名。它主要根据组织形态学上细胞的异型性和结构紊乱程度将胃黏膜上皮内瘤变分为低级别上皮内瘤变（LGIN）和高级别上皮内瘤变(HGIN)。LGIN指细胞学和形态学异常局限于上皮的下1/2，经治疗后具有可逆转性[14]；HGIN指细胞学和形态学异常超过上皮层下1/2甚至全层，这一阶段的病人经治疗后很难消退或逆转。因此对于癌前病变予以及早发现、定期随访，必要时候尽早治疗，这是提高早期胃癌确诊率的有效方法。早期胃癌外科切除术后常易并发吻合口出血、反流性食管炎、倾倒综合征等一系列术后并发症，且需支付高昂的手术费用，承担巨大的心理、身体、经济负担。而内镜下切除术通过自然腔调施行手术，对于病灶直径≤2cm，活检组织病理为高或中分化，超声内镜提示没有穿透粘膜下层、无淋巴管侵犯（LVI）,有清晰的横向及深度切缘[15]的患者，可以达到与外科手术相同的治愈率。在日本，目前微创内镜治疗已成为早期胃癌的首选治疗方法。内镜下治疗早期胃癌及癌前病变的主要方式分为两大类，包括:内镜下黏膜切除术（EMR）和内镜下黏膜下剥离术(ESD)。两种技术都可以切除含有早期肿瘤的黏膜（可能还有一部分黏膜下层），而不会中断更深层。EMR可以整块切除小于2厘米的病变，对于较大的病变可能需要以分次切除，这可能会影响病变切除的完整性，并且限制了对病变边缘的评估以及定位病变的边界。ESD在EMR的基础上进行改良，不论其大小如何，都可以对病变进行整块切除。随着人们对术后生活质量要求的提高，目前微创内镜治疗已成为EGC的首选治疗方法。内镜联合活检术是目前诊断早期胃癌中最常用的检查技术，内镜下活检病理诊断对疾病的诊断及治疗具有一定的指导作用，活检术准确率的高低是早期胃癌14 发现的首要环节因素，因此准确的夹取胃黏膜病变是获得准确病理诊断的前提。但在实际操作过程中，由于术者操作技术水平不一，对病变严重程度的辨别存在主观性，以及取材部位、大小、形态、内镜视野的清晰度等多因素的存在，使得活检的准确性受到明显干扰。放大内镜（MagnifyingEndoscopyME）是一种强有力的检查手段，它可以清晰的显示胃黏膜表面微血管和腺体结构，其最先进的放大内镜的分辨率小至6.4微米。窄带成像技术(NarrowBandImagingNBI)[16]是一项图像增强内镜技术，可以增强黏膜层及黏膜下血管结构的对比度和提高清晰度。正因为两者具有鲜明的优点，临床上通常将放大内镜和窄带成像技术联合（NBI-ME）使用，其独特的优势在于能早期发现黏膜微小结构的异常，从而提高靶向活检的准确率[17]。这为早期胃癌的诊断带来了革命性进步。正常胃黏膜在NBI-ME下的表现为规则而清晰的集合静脉及上皮下毛细血管网、胃黏膜的浅表微结构无紊乱,若是NBI-ME下发现不规则的微血管变化或腺管开口呈不规则或缺失，则提示早期胃癌可能，由此可见NBI-ME能够提高对早期胃癌诊断的准确率[18]，具有很高的临床诊断价值，现被作为早期胃癌筛查的一项精查项目。EUS结合了超声和内镜共同的优势，既能观察到黏膜表面，又能在腔内直接对病变进行超声检查。EUS能清楚地显示胃壁的5层结构,消化管壁内镜超声回声由内向外依次为：高-低-高-低-高，分别其黏膜层-黏膜肌层-黏膜下层-固有肌层-浆膜层，能有效地观察病变的侵犯深度、大小、来源等。使得消化道黏膜下病变的诊断率得到大大提升,还可以评估病变周围血运情况，能够有效降低内镜切除并发症出血及穿孔的风险。同时，在治疗前进行超声内镜（endoscopicultrasonography，EUS）检查对于胃癌的初始临床分期十分重要，它对于明确黏膜病变浸润深度，有着目前别的检查无法取代的重要地位。根据TNM国际联合癌症研究所（UICC）的分类标准对肿瘤进行分期。T1病变被认为是前三层的破坏（肿瘤侵入黏膜或黏膜下层）。T2病变被认为是第四层（肿瘤侵犯固有肌层）的入侵。T3病变被认为是穿透第五层（肿瘤侵袭浆膜）。T4病变被视为侵及邻近器官和结构。T1期显示早期胃癌的EUS图像，T2-T4期显示进展期胃癌的EUS图像。淋巴结有圆形边界，低回声结构被认为是恶性的。N0期无转移迹象。N+是指胃周淋巴结转移[19]。EUS提供的这些超声影像证据对于那些考虑行EMR或ESD的早期胃癌患者尤为重要[20]。EUS用于确定符合扩大内镜黏膜下剥离术标15 准的早期胃癌的诊断准确率在直径30mm或更小的分化型腺癌（D型）为87.8％（259/295），对于直径大于30mm的D型肿瘤为43.5％（10/23），对于直径20mm以下的未分化型腺癌（UD型）诊断准确性为75％（42/56）。使用多变量分析，确定EUS在预测肿瘤浸润深度方面的诊断准确性可因溃疡病变和肿瘤大小（直径≥30mm）显著降低[20]。EUS对内镜下的治疗具有重要的指导意义，两者的结合可以对早期胃癌的诊治起到互补作用，在筛查早期胃癌及癌前病变中占有重要地位。本实验研究资料共89例，内镜下活检病理诊断为低级别上皮内瘤变65例、高级别上皮内瘤变20例、早期胃癌的4例；术后病理诊断低级别上皮内瘤变59例，高级别上皮内瘤变18例，早癌12例；结果显示：1）内镜下活检病理诊断与黏膜切除术后病理诊断相比，诊断相符率为79.8%（71/89），诊断不符率为20.2%；内镜下活检病理诊断与诊断金标准相比，诊断相符率为84.3%（75/89），诊断不符率为15.7%（14/89）。2）NBI放大染色诊断与金标准为早期胃癌相比，诊断相符率为83.3%，诊断不符率为2.4%；3）超声内镜与金标准为早期胃癌相符率为58.3%；4）内镜下黏膜切除术后病理与金标准相比，诊断相符率95.5%，诊断不符率4.5%，ROC曲线分析线下面积为1；5）术前诊断与金标准相比，诊断相符率75.3%，诊断不符率24.7%。分析此现象可能从以下几个方面解释：1）由于早期胃癌或癌前病变本身具有细胞及组织形态的异型性及多态性，内镜下活检病灶周围黏膜组织存在不同程度的异型增生，所以可能存在内镜下活检正好咬取了极少病变的高级别上皮内瘤变，而黏膜切除术后切除标本中未见高级别上皮内瘤变，而是不同程度的上皮内瘤变或早癌。2）由于虽然黏膜切除后将标本进行了每2mm连续切片，通常病理医师根据显微镜下见到癌组织细胞即可诊断为癌，可能存在早期胃癌和中晚期胃癌在癌变的过程中癌变细胞的数量及异型性发生了变化，从而漏诊了癌细胞，比如临床上常提到的“一点癌”理论。3）可能存在病理组织在切片的过程中对病变的病灶切片过多导致病灶减少甚至消失。4）同时也有可能因为病理医师主观性的原因导致诊断不同，比如有些医师发报告比较保守，而有些医师比较激进，再比如年轻医师可能存在经验不足常常对病变程度判断不准。5）NBI放大内镜对早癌的符合率高，但是误判率相对也高，术前诊断体系与金标准相比诊断相符率为75.3%，从数据分析来看主要是因为NBI放大染色及超声内镜对其诊断过高，16 NBI-ME诊断早期胃癌26例中与金标准符合10例，EUS诊断早期胃癌18例中与金标准符合7例，这主要是由于NBI-ME对于高级别上皮内瘤变表现高度敏感，但是由于高级别上皮内瘤变癌变风险大，在临床上对其识别高度敏高时，能够提高早期胃癌的诊断率。EUS对早期胃癌的阳性检出率不如NEI-ME，主要用于诊断分型。6）内镜下黏膜切除术后病理与金标准相比，诊断具有高符合率（95.5%），ROC曲线分析线下面积为1，结果提示对金标准完全吻合，该结果的高符合率与AUC并非完全一致是因为做ROC曲线的标准设定为早期胃癌，而金标准诊断为早期胃癌的均来自术后病理诊断，因此AUC=1。可是在数据统计中术后诊断并非完全与金标准一致是由于活检病理诊断高于术后病理诊断，而金标准的定义是两者中最重的诊断。7）本实验研究样本量较少以及不同程度病变数量分布不均匀，低级别上皮内瘤变组病例数较多，而高级别上皮内瘤变组及早期胃癌组病例数较少，从而对早期胃癌的识别受到一定影响。8）我们临床上对黏膜切除术后的病理诊断轻于活检病理诊断时，不应单纯根据于黏膜切除标本，而应结合病变的内镜及活检病理诊断、NBI-ME、超声内镜做出综合判断，必要时予以免疫组化进一步诊断。本次研究过程中，还总结了以下几点经验：1.临床上不能单独以内镜活检病理诊断作为确诊疾病及制定治疗方案时的唯一参考标准。2.在对早期胃癌及癌前病变制定治疗方案时，应该要结合NBI-ME分型以及超声内镜表现做出综合判断。3.内镜下黏膜切除术后病理诊断并非就是最终诊断，因为其可能存在诊断不足，而诊断轻于内镜下活检术病理诊断，因此需要结合活检术诊断结果综合评估再次判断；4.NBI-ME对诊断早期胃癌的敏感性高，可以作为筛查早期胃癌的必要检查项目从而提高早癌检出率。本实验研究发现，内镜下切除术对早期胃癌及癌前病变获取准确的病理诊断有重要意义，结合黏膜切除术后标本的各项病理学检查结果，从而对进一步诊断及确定下一步治疗方案做出更加全面的判断。通过本实验对术前临床诊断方法中各个组成部分的准确性进行分析，可以得出术前临床诊断方法在诊断早期胃癌及癌前病变中的准确性可达到与黏膜切除术后病变相似的诊断准确性，因此术前临床诊断方法对诊断早期胃癌及癌前病变具有较高准确性，能对早期胃癌及癌前病变的治疗做出相对准确的指导。17 第二部分早期胃癌及癌前病变相关标志物的表达研究第1章前言胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，也是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。最新的统计表明，每年将会诊断出950,000例新发的胃癌病例，超过720,000例死亡[1]。与其他恶性肿瘤类似,胃癌的发展是一个多步骤过程。早期发现和适当的治疗仍然是改善胃癌患者长期预后的有效方法。越来越多的证据表明，癌基因和抑癌基因表达的改变与胃癌的发生和发展有关[21][22]。因此，更好地理解胃癌的分子机制可以促进新型肿瘤标志物及治疗方法的发展[23]。本课题组前期利用GEO、String等数据库生物信息学分析筛取胃早癌相关Candidategene，筛选出四个与胃癌相关度高的基因，分别为GPER、VEGF-D、LRF4、OXTR。（1）登录NCBI，选择GeneexpressionOmnibus(GEO)数据库，输入“gastriccancer”查询胃癌不同分期的基因芯片数据，仅提取Normal/StageI对比芯片数据（见图8）图8GEO数据库输入“gastriccancer”界面（2）从GEO数据库下载基因芯片数据（共3个），取3个数据库交集，选取logFC大于2或小于-2值，共118个基因(见图9、10，表2.1)。18 图9GEO数据库下载基因芯片数据图10基因芯片交集图（共118个基因）19 基因芯片交集基因（表2.1）Genes.DownexpressionINHBACOL10A1FNDC1FAPTHBS2CST1SULF1SFRP4SPP1CEMIPIGF2BP3MIR675///H19KLK10ADAMTS2CTHRC1COL11A1ASPNPDLIM7BGNWISP1CXCL8GPERCOL1A1COL1A2MFAP2ADAMTS12COL8A1TIMP1RARRES1COL6A3THY1UpexpressionAKR7A3GATA5DUOX2RASSF6B4GALNT3REG1ASCINTCN1CNTN3SPINK7OTCCTSECYP2C18ORM2///ORM1PTPRZ1SH3RF2ATP4BVSTM2ACYP2C9LINC00982ACER2RFX6CA2FAM3BCAPN13ADTRPSCNN1BTRIM74/TRIM73C6orf58SSTUGT2B15TMED6CLDN18MFSD4AC16orf89LINC00675SULT1C2DAZ4/DAZ2/DAZ3/DAZ1ANXA10KCNJ15UPK1BCAPN9HPGDGATA6-AS1MAP7D2VSIG2SSTR1SLC26A7KCNJ16RDH12PSCAFUT9PIK3C2GTPCN2CA9KIAA1324LINC00261ADGRG2SCGB2A1ALDH3A1FBP2MUC5ACSLC26A9MALTFF1ADH7TFF2PGCGSTA1MSMBAKR1B10CXCL17ESRRGLTFDPCR1KRT20PSAPL1KCNE2SOSTDC1LIPFGIFPGA4/PGA3/PGA5ATP4AOXTRLRFN4VEGF-D(3)登录Spring数据库，对上述118个基因进行pathway和功能分析，通过查阅文献，选取在胃早癌中研究较少的四个基因作为Candidategenes:OXTR、LRFN4、VEGF-D、GPER。（见图11）20 图11选取Candidategenes:OXTR、LRFN4、VEGF-D、GPER查阅大量文献后发现以上4个基因均与肿瘤的侵袭、转移相关，但暂无预测早期胃癌的相关研究报道。基于前期工作，我们共选取72例病例资料，对其纳入实验组的病例标本的蜡块进行重新切片，用免疫组化方法检测其所对应表达的蛋白是否在胃癌不同程度癌前病变及早癌中也存在蛋白水平的改变，试图找到一种或几种可以为早期胃癌提供预警的肿瘤标记物。血管内皮生长因子-D(Vascularendothelialgrowthfactor-D,VEGF-D)血管内皮生长因子-D（VEGF-D）是一种分泌蛋白，其可以在血管内皮细胞激活VEGF受体，是内皮细胞的有丝分裂原，可促进疾病中血管和淋巴管的重塑[24,25]。与VEGF家族的其他成员一样，VEGF-D属于包含胱氨酸结基序的生长因子的结构超家族，其涉及三个亚基内胱氨酸桥的高度独特的成簇排列[26]。21 近年来研究发现VEGF-D促进实体瘤内及外周的血管生成和淋巴管生成，以及增强实体瘤生长和转移到淋巴结和远端器官的转移扩散[27-29]。除了促进原发肿瘤附近小淋巴管的生长，从而促进肿瘤细胞进入淋巴管系统外，VEGF-D还通过扩张淋巴管促进了转移，这可能有助于肿瘤细胞通过淋巴管远处转移[30]。大量临床数据表明，VEGF-D的表达与转移性扩散和患者较差的治疗效果相关[31]。比如VEGF-D被报道是上皮性卵巢癌预后不良的独立预测因子[32]，也是结直肠癌无病生存和总体生存的预后指标[33]。此外，据报道，VEGF-D和VEGFR-3是独立的预后标记，有助于鉴定胃癌根治术后预后不良的患者[34]。VEGF-D能够特异性诱导多种恶性肿瘤的淋巴管生成，是预测胃癌根治术后HM发病的重要因素[35]。VEGF-D相关的单克隆抗体，可用于晚期难治性实体瘤和晚期结直肠癌患者。VEGF-C或VEGF-D可靶向淋巴管生成信号传导以抵抗对癌症的免疫耐受性[36]。有趣的是，Avastin（一种抗VEGF-A抗体）在转移性结直肠癌中的临床研究表明，低VEGF-D表达与Avastin在无进展生存期和总生存期方面的益处更大有关[37]。VEGF-D可作为一种新的血清标志物用于诊断LAM[38-39]。Tabernero等人的研究发现VEGF-D可作为一种新的生物标志物候选物，可用于预测III期RAISE试验中抗VEGFR-2抗体雷莫芦单抗作为转移性结肠直肠癌（mCRC）二线治疗的疗效[40]。G蛋白偶联雌激素受体(Gprotein-coupledestrogenreceptor,GPER)G蛋白偶联雌激素受体（GPER），以前也称为GPR30，该受体属于7TMR超家族，是G蛋白偶联受体（GPCR）家族新发现的一个雌激素受体[41]。在GPER的雌激素介导的快速信号的原始报道中，Filardo等人[42]描述了使用EGFR反式激活的GPER激活ERK1/2的机制。迄今为止，几乎所有的生理系统都已经描述了GPER的功能，包括生殖系统，内分泌系统，泌尿系统，神经系统，免疫系统，肌肉骨骼系统和心血管系统[43]。GPER已被证明能够介导雌激素，植物雌激素和异种雌激素的快速非基因组雌激素效应[43]。GPER的激活可刺激其下游信号，包括促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），磷酸肌醇3-激酶（PI3K）和表皮生长因子受体（EGFRs），然后调节激素反应性癌症。GPR30优先与ER和/或PR共表达，但在HER-2/neu（+）肿瘤中低表达[44]。近年有研究发现在结肠癌患者体内，GPER表达降低，且与GPER水平较高的患者相比，表达较少GPER的患22 者存活率较低（p<0.01）。随着CRC患者的分期和淋巴结转移的增加，GPER的表达显著（p<0.05）降低，表明GPER的丢失可能是CRC进展的早期事件。此外，在具有较高等级的肿瘤（T）的CRC患者中GPER表达降低，具有统计学显著性。不同年龄和性别之间GPER表达没有显著变化[45]。在一类特殊类别乳腺癌（IDC）中GPR30表达下调。而其他大量研究认为GPER的高蛋白质水平与肿瘤大小增加、远处转移、乳腺癌预后不良成正相关[46]。GPER高表达有助于如癌细胞的增殖，迁移和侵袭，特别是乳腺癌的发展[47,48]。在子宫内膜癌[49]和卵巢癌[50]中，GPER高表达可预测存活率差，在青春期睾丸生殖细胞肿瘤中，GPER在精原细胞瘤和胚胎性癌中高度表达，在畸胎瘤少量表达[51]。既往有研究通过免疫组织化学分析发现，所有GPR30染色模式在正常及肿瘤组织中均显示细胞质染色，尽管有些肿瘤表现出比正常组织更多的GPR30表达，但没有观察到GPR30在乳腺癌组织中总体过表达。富含亮氨酸重复序列和纤连蛋白III型结构域（Leucine-richrepeatandfibronectintypeIIIdomain-containing，LRFN）富含亮氨酸重复序列和纤连蛋白III型结构域（LRFN）家族蛋白是一类具有5个成员的I型跨膜（TM）糖蛋白，包括LRFN1-5[52]。所有的LRFN家族成员细胞外含有富含亮氨酸的重复序列（LRR）、免疫球蛋白C2样（IgC2）结构域、III型纤连蛋白（FNIII）结构域、TM结构域及细胞质C-末端尾部[1]。LRFN1,2和4由两个串联的PDZ结构域（postsynapticdensityprotein，disclargeandzonulaoccludens，PDZ）和C端结构域（C-terminaldomain，CTD）组成[53]，通过和PSD-95(突触后致密物质95,postsynapticdensity-95)关联，在突触后相关联的细胞应答中起重要作用。LRFN4的信号通路参与单核细胞/巨噬细胞内皮迁移，通过重组肌动蛋白骨架改变细胞的极性。以前的研究报道LRFN家族成员主要限于神经组织中参与病理生理变化[54]。但是，最近研究表明，LRFN4可以在人类多种癌症和白血病细胞中表达。少数报道研究报道[55]LRFN家族成员可以在非神经组织中表达并发挥功能。比如，LRFN1与参与胰腺癌及胃癌相关的细胞有关，LRFN2参与红细胞生成[56]。LRFN4蛋白的表达谱比其它LRFN家族蛋白更广泛，可以在包括癌细胞、白血病细胞和正常细胞等各种类型的细胞中发挥作用[57]。有研究通过免疫印迹实验23 发现LRFN4蛋白有两条主要的蛋白条带，其中100kDa条带在胃癌MKN7细胞、伯基特氏淋巴瘤Ramos细胞和T细胞白血病Jurkat细胞中显著表达。70-kDa条带在乳腺癌SK-BR-3细胞和两种单核细胞白血病细胞系THP-1和U937中显著表达[58]。催产素受体（oxytocinreceptor,OXTR）催产素受体(oxytocinreceptor,OTR)，又名OXTR，是G-蛋白偶联受体(G-proteincoupledreceptor,GPCR)超家族中的一员,是九肽激素和神经递质-催产素(oxytocin,OT)发挥特异性生理作用的受体[59]。最初因其在分娩过程中刺激子宫收缩和泌乳的作用而得到认可，近来更多地研究其对社会行为的影响。OXTR已在各种癌细胞中被发现[60,61]，最近已经检测到催产素受体表达的新位点[62,63]，包括子宫内膜癌[60]、卵巢癌[64]、前列腺癌[65]、乳腺癌细胞[66]、神经组织肿瘤[67]、脑癌、结肠癌[68]、肺癌、骨肿瘤细胞、BO或OAC[69]、成肌细胞、心肌细胞和内皮细胞。Roth等人[70]研究了45种不同的组织类型，发现OXTR在正常肝，结肠，胃和脾脏中的表达不足，并且在脑，支气管和女性生殖组织中显著过度表达。OXTR配体的作用因细胞而异，催产素促进表达OXTR的前列腺癌细胞系PC3和PC3M的增殖和迁移[65]，促进小细胞肺癌细胞系DMS79，H146和H345的增殖。在乳腺肿瘤衍生的内皮细胞中，催产素治疗促进其生长和迁移[66]。相比之下，催产素导致神经胶质细胞和肿瘤神经组织及某些乳腺癌、子宫内膜肿瘤和骨肉瘤细胞的生长受抑制[71]。在不同细胞类型中这些相反效应的解释依赖于OXTR与多种G蛋白偶联的能力，导致在不同设置中激活不同信号级联[72]。催产素受体的表达位点和功能的多样性与其信号途径的多样性平行，其中许多信号途径尚未开发。OTR常见的可激活的信号转导途径有：a）传统的信号通路导致磷脂酰肌醇水解和胞质Ca2+增加[73]，导致磷酸化和激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的转录活性和细胞外信号调节激酶（ERK），或b）使用cAMP的形成，导致细胞周期蛋白激酶抑制剂p21的诱导非常规途径WAF1/CIP1[63]。有研究通过免疫荧光分析检测和免疫组织化学证实[74]，OTR在体内所有级别的子宫内膜样本中均有表达，OTR信号在正常子宫内膜组织样品中是低/不可检测的，在子宫内膜癌标本的I级和II级以及甚至是低分化III级的上皮细胞和24 腺细胞中观察到OTR表达，但OTR的免疫染色随着分化高级程度而降低，相比之下，OTR免疫反应性在肿瘤组织中强烈表达。在肿瘤从I级到III级进展后，OTR主要定位于上皮细胞和腺体间隙。这些结果表明，OTR的过表达是诱导癌症进展的重要因素。25 第2章实验材料2.1试剂兔抗人OXTR单克隆抗体北京博奥森生物技术有限公司；兔抗人LRFN4单克隆抗体北京博奥森生物技术有限公司；兔抗人VEGF-D单克隆抗体北京博奥森生物技术有限公司；兔抗人GPR-30单克隆抗体北京博奥森生物技术有限公司；通用二步法检测试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司。2.2其他主要溶液及试剂柠檬酸钠抗原修复液（1×）（北京中杉金桥生物技术有限公司）；DABkit（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Mayer苏木素染液（免疫组化）（上海如吉生物科技发展有限公司）；二甲苯（湖南汇虹试剂有限公司）；中性树胶（上海如吉生物科技发展有限公司）及盐酸酒精，氨水，梯度酒精等。2.3主要仪器切片机德国莱卡公司恒温烤箱上海跃进医疗器械厂电热恒温箱上海跃进医疗器械厂电磁炉九阳有限公司高压锅广东顺发牌倒镜显微镜日本OLYMPUS石蜡切片机德国莱卡石1512号切片机PBS(粉剂)武汉BOSTER生物有限公司26 第3章实验方法3.1病例资料标本选自2014年01月至2018年01月在南华大学第一附属医院消化内科行ESD治疗诊断为早期胃癌及癌前病变的患者，标本存于病理科标本库中保存。根据筛选条件从中选取蜡块共72个，分别包括低级别上皮内瘤变20例，高级别上皮内瘤变20例，早期胃癌12例；对照组正常胃柱状上皮20例（标本来自我院经ESD治疗切下的息肉标本，病理诊断为慢性活动性炎症）。所有的标本均先经石蜡包埋，4um切片，HE常规染色，阅片，诊断。选择诊断为低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌以及对照组的石蜡包埋组织，3um切片，每个蜡块切取4张，免疫组织化学染色后观察，摄片。3.2免疫组化(1)脱腊：将石蜡切片在60℃烤箱中烘烤3小时，注意烘烤时间和温度，避免操作过程中脱片。在二甲苯中脱蜡30分钟，用乙醇去除二甲苯2次，每次5分钟。(2)水化：入酒精梯度水化，依次放于浓度为100%—85%—75%—60%—30%，各30秒，先自来水冲洗后，再蒸馏水冲洗3遍。(3)抗原修复：置于高压锅中煮沸的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中，然后至室温下自然冷却，蒸馏水洗后PBS冲洗3遍，每次2分钟。(4)将切片置于H2O2溶液中封闭15分钟去除内源性过氧化氢酶。(5)抗体孵育：滴加一抗，4℃孵育过夜；用PBS浸泡洗3次，每次3分钟。(6)滴加增强剂孵育20分钟，PBST缓冲液浸泡洗3次，每次3分钟。再加入二抗，温室孵育20分钟，PBST缓冲液浸泡洗3次，每次3分钟。(7)显色：选用即用型DAB显色剂显色，约30秒，后用蒸馏水终止显色。(8)复染:苏木素染色约15分钟，自来水冲洗2分钟。盐酸酒精分化，自来水冲洗切片2分钟。氨水返蓝，自来水冲洗。(9)脱水：梯度酒精85%—95%—100%脱水，每个步骤5分钟，再次予以无27 水乙醇脱水5分钟。(10)透明：先后分别用二甲苯（I）和二甲苯（II）透明5-10分钟。(11)在切片上滴加适量的中性树胶，50℃烘干。(12)阅片。3.3评分标准参照以往研究的染色评分标准，强度评分为4级，不着色为0，弱着色为1，中等着色为2，强着色为3；着色细胞占所有肿瘤细胞的比例评分：0（0％），1（1-25％），2（26-50％），3（51-75％）和4（76-100％）。通过将细胞着色强弱和着色细胞比例相乘，计算总体蛋白质表达评分。判定0-3为阴性，3-12分为阳性。由两名病理学家在不知晓病例资料信息的情况下分别进行诊断分析。3.4统计学分析选用SPSS22.0统计软件，对比分析这四个蛋白在正常胃黏膜、不同程度胃粘膜上皮内瘤变及早癌中的表达是否存在差异，并比较这些标志物在胃癌前病变中的表达与不同临床病理特征的关系。P值＜0.05认为有统计学意义。28 第4章实验结果4.1OXTR蛋白在不同程度胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌中的表达情况：OXTR在正常胃黏膜组织-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-早期胃癌中的表达随病变的程度增加而增加，在正常胃黏膜表达15%、低级别上皮内瘤变35%、高级别上皮内瘤变65%、早期胃癌83.3%，在各组之间表达存在明显差异（P＜0.001），但在低级别-高级别、高级别-早期胃癌之间表达无明显差异（P＞0.05）。（见表4.1、图12）表4.1OXTR在不同程度胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌中的表达情况免疫组化染色.组别阴性阳性合计正常组17（85%）3（15%）20LGTH组13（65%）7（35%）20HGTN组7（35%）13（65%）20ECG组2（16.7%）10（83.3%）12合计39（48.6%）33（37.1%）721.在不同程度上皮内瘤变及早期胃癌中OXTR表达存在明显差异（P＜0.001);2.正常组织和高级别上皮内瘤变中OXTR表达有明显差异（P＜0.001）；3.正常组织和早期胃癌中OXTR表达有明显差异（P＜0.001）；4.低级别上皮内瘤变和早期胃癌中OXTR表达有明显差异（P＜0.05）；5.余各组间比较OXTR表达无明显差异（P＞0.05）。29 OXTR在正常胃黏膜、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌中的表达图12OXTR在正常胃黏膜、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌中的表达（原始放大倍数，×200倍,主要表达在胃腺体细胞及间质细胞的胞质）4.2LRFN4蛋白在不同程度胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌中的表达情况：LRFN4在正常胃黏膜组织-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-早期胃癌中的表达随病变的程度增加而增加，在正常胃黏膜表达20%、低级别上皮内瘤变40%、高级别上皮内瘤变65%、早期胃癌75%，在各组之间表达存在明显差异（P＜0.001），但在低级别-高级别上皮内瘤变、高级别-早期胃癌之间表达无明显差异（P＞0.05）。（见表4.2、图13）30 表4.2LRFN4在不同程度胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌中的表达情况免疫组化染色.组别阴性阳性合计正常组16（80%）4（20%）20LGTN组12（60%）8（40%）20HGTN组7（35%）13（65%）20ECG组3（25%）9（75%）12合计38（52.8%）34（38.2%）721.在不同程度上皮内瘤变及早期胃癌中LRFN4表达存在明显差异（P＜0.001）；2.正常组织和高级别上皮内瘤变中LRFN4表达有明显差异（P＜0.05）；3.正常组织和早期胃癌中LRFN4表达有明显差异（P＜0.001）；4.低级别上皮内瘤变和早期胃癌中LRFN4表达有明显差异（P＜0.05）；5.余各组间比较LRFN4表达无明显差异（P＞0.05）。LRFN4在正常胃黏膜、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌中的表达图13LRFN4在正常胃黏膜、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌中的表达（原始放大倍数，×200倍,主要表达在胃腺体细胞及间质细胞的胞质）31 4.3GPER蛋白在不同程度胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌中的表达情况：GPER在正常胃黏膜组织-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-早期胃癌中的表达随病变的程度增加而减少，在正常胃黏膜表达75%、低级别上皮内瘤变60%、高级别上皮内瘤变40%、早期胃癌25%，在各组之间表达存在明显差异（P＜0.05），但在低级别-高级别上皮内瘤变、高级别-早期胃癌之间表达无明显差异（P＞0.05）。（见表4.3、图14）表4.3GPER在不同程度胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌中的表达情况免疫组化染色.组别阴性阳性合计正常组5（25%）15（75%）20LGTN组8（40%）12（60%）20HGTN组12（60%）8（40%）20ECG组9（75%）3（25%）12合计34（47.2%）38（52.8%）721.在不同程度上皮内瘤变及早期胃癌中GPER表达存在明显差异（P＜0.05）；2.正常组织和高级别上皮内瘤变中GPER表达有明显差异（P＜0.05）；3.正常组织和早期胃癌中GPER表达有明显差异（P＜0.05）；4.低级别上皮内瘤变和早期胃癌中GPER表达有明显差异（P＜0.05）；5.余各组间比较GPER表达无明显差异（P＞0.05）。32 GPER在正常胃黏膜、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌中表达图14GPER在正常胃黏膜、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌中的表达（原始放大倍数，×200倍,主要表达在胃腺体细胞及间质细胞的胞质内）。4.4VEGF-D蛋白在不同程度胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌中的表达情况：VEGF-D在正常胃黏膜组织-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-早期胃癌中的表达随病变的程度增加而增加，在正常胃黏膜表达10%、低级别上皮内瘤变25%、高级别上皮内瘤变40%、早期胃癌66.7%，在各组之间表达存在明显差异（P＜0.05），但在低级别-高级别上皮内瘤变、高级别-早期胃癌之间表达无明显差异（P＞0.05）。(见表4.4、图15)表4.4VEGF-D在不同程度胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌中的表达情况免疫组化染色.组别阴性阳性合计正常组18（90%）2（10%）20LGTN组15（75%）5（25%）20HGTN组12（60%）8（40%）20ECG组4（33.3%）8（66.7%）12合计49（68.1%）23（31.9%）7233 1.在不同程度上皮内瘤变及早期胃癌中VEGF-D表达存在明显差异（P＜0.05）；2.正常组织和高级别上皮内瘤变中VEGF-D表达有明显差异（P＜0.05）；3.正常组织和早期胃癌中VEGF-D表达有明显差异（P＜0.001）；4.低级别上皮内瘤变和早期胃癌中VEGF-D表达有明显差异（P＜0.05）；5.余各组间比较VEGR-D表达无明显差异（P＞0.05）。VEGF-D在正常胃黏膜、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌中表达图15VEGF-D在正常胃黏膜、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌中的表达（原始放大倍数，×200倍,主要表达在胃腺体细胞及间质细胞的胞质内）。4.5不同程度胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌中各种不同蛋白的表达情况通过对比OXTR、LRFN4、GPER、VEGF-D在不同程度胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌中的表达，结果发现，OXTR、LRFN4、VEGF-D与早期胃癌及癌前病变的发生呈正相关，其表达随疾病进展而增加；而GPER在正常胃黏膜组织中高表达，在早期胃癌中低表达，其表达随疾病进展而减少。（见表4.5）34 表4.5各种蛋白在不同程度胃黏膜上皮内瘤变及早期胃癌中的表达情况NCLGTNHGTNECGOXTR15%35%65%83.3%LRFN420%40%65%75%GPER75%60%40%25%VEGF-D10%25%40%66.7%35 第5章讨论占所有癌症相关死亡人数8.8％的胃癌（GC）仍然是全球癌症相关死亡的第三大常见原因。与女性（32.7％）相比，GC更常见于男性（67.3％）[75]。GC的发病率也显示出人口统计学差异，全球约有一半出现在东亚国家。中国和美国的GC发病率显着不同，分别为每100,000人46.5个和8个GC病例。由于缺乏典型的早期症状，疾病的早期诊断很困难。目前临床上可用于诊断早期胃癌的无创手段有限，现有的胃癌生物标志物显示临床诊断敏感性和特异性不足，因此迫切需要确定更可靠的临床生物标志物。有研究基于iTRAQ的定量蛋白质组学分析发现，存在数百中蛋白在胃癌中过表达或者低表达，且发现蛋白过高或过低表达与肿瘤的分化、侵袭、转移、预后相关。常见的过表达蛋白有SLC3A2[76]，CDH17，EPHA2，FGFR2[77]，CD44v8-10[78]，MET，EPHA2，CD104/ITGB4，FASN，CEACAM6[79]等；在胃癌中低表达的蛋白有PHLDA1[80]，Muc5AC[81]，TES等。本研究中通过免疫组化方法利用黏膜切除术后标本对胃黏膜不同程度上皮内瘤变及早癌组织进行组织学验证OXTR、GPER、LRFN4、VEGF-D蛋白的表达，观察胃黏膜不同程度上皮内瘤变及早期胃癌中各蛋白表达是否存在差异。本研究结果显示:1）OXTR在正常胃黏膜组织-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-早期胃癌中阳性表达率分别为15%-35%-65%-85%，且表现为随着病变程度的增加阳性表达率也有所增加。经统计学方法验证，在不同程度上皮内瘤变及早期胃癌中OXTR表达存在明显差异（P＜0.001）；但在正常胃黏膜与低级别上皮内瘤变对比、高级别上皮内瘤变与早期胃癌对比，差异无明显统计学意义（P＞0.05）；2）GPER在正常胃黏膜组织-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-早期胃癌中阳性表达率分别为75%-60%-40%-25%，表现为随病变程度的增加阳性表达率有所下降。经统计学方法验证，在不同程度上皮内瘤变及早期胃癌中GPER表达存在明显差异（P＜0.05）；但在正常胃黏膜与低级别上皮内瘤变对比、高级别上皮内瘤变与早期胃癌对比，差异无明显统计学意义（P＞0.05）；3）LRFN4在正常胃黏膜组织-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-早期胃癌中阳性表达率分别为20%-40%-65%-80%，表现为随病变程度的增加阳性表达率也有所增加。36 经统计学方法验证，在不同程度上皮内瘤变及早期胃癌中LRFN4表达存在明显差异（P＜0.001）；但在正常胃黏膜与低级别上皮内瘤变对比、高级别上皮内瘤变与早期胃癌对比，差异无明显统计学意义（P＞0.05）；4）VEGF-D在正常胃黏膜组织-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-早期胃癌中阳性表达率分别为10%-25%-40%-65%，表现为随病变程度的增加阳性表达率也有所增加。经统计学方法验证，在不同程度上皮内瘤变及早期胃癌中VEGF-D表达存在明显差异（P＜0.05）；但在正常胃黏膜与低级别上皮内瘤变对比、高级别上皮内瘤变与早期胃癌对比，差异无明显统计学意义（P＞0.05）；结合统计学分析结果显示，OXTR、LRFN4、VEGF-D在正常胃黏膜组织中低表达，且表达随病变程度的增加而增加，在不同程度上皮内瘤变及早期胃癌中表达存在明显差异，考虑此三种蛋白可能与早期胃癌的发生有关，且表达的高低可以协助评估病变的状态，动态监测其变化情况，可以预测及判断疾病的进展。而GPER在正常黏膜中高表达，在高级别上皮内瘤变及早期胃癌中的表达显著降低，表明GPER的减少可能是胃癌的早期事件。因此可以得出OXTR、LRFN4、VEGF-D在早期胃癌及癌前病变中具有高表达，且随着病变程度的加重而表达增加，对早期胃癌有预警意义；而GPER可能是胃癌的一个保护因素，它在正常胃黏膜-早期胃癌中表达逐渐减少，可以对肿瘤有预警意义。由上可知，OXTR、LRFN4、VEGF-D、GPER可以认为是对早期胃癌有预警意义的肿瘤标志物。本实验的创新之处在于全面的对比了OXTR、LRFN4、VEGF-D、GPER在正常胃黏膜-低级别-高级别上皮内瘤变-早期胃癌的四种不同病理改变中各种蛋白的表达情况，以往的研究都没有对此类蛋白进行早期胃癌及癌前病变的研究。本研究发现了该四种蛋白表达具有差异性，且OXTR、LRFN4、VEGF-D的表达随着病变程度严重程度递增，GPER的表达随着病变程度严重程度递减，这对早期胃癌的诊断具有预警意义。37 第6章结论OXTR、LRFN4、GPER、VEGF-D在早期胃癌及不同程度胃黏膜上皮内瘤变病变中表达具有明显差异，对早期胃癌及癌前病变具有预警意义。38 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文献综述早期胃癌内镜下诊断及治疗的现状、新途径摘要：随着内镜器械和技术的进步，对于一些早期胃癌患者（EGC），内镜下切除术是一种理想的治疗方法。内镜下黏膜剥离术（ESD）已被广泛用于治疗EGC，现在人们要求ESD技术对EGC进行根治性切除的同时，能确保准确预测淋巴结转移（LNM）。ESD或内镜下全层切除联合前哨淋巴结导航的新技术，使LNM高危患者的肿瘤切除术和腹腔镜淋巴结清扫术成为可能。这篇综述涵盖了EGC内镜下诊断及治疗的现状、新技术和挑战。关键词：内镜下切除术（ER），早期胃癌（EGC），前哨淋巴结导航ThestatusandnewapproachesofendoscopicdiagnosisandtreatmentofearlygastriccancerAbstract:Withtheadvancementofendoscopicinstrumentsandtechniques,endoscopicresectionisanidealtreatmentforsomepatientswithearlygastriccancer(EGC).Endoscopicmucosaldissection(ESD)hasbeenwidelyusedforthetreatmentofEGC,anditisnowrequiredthatESDbeusedforradicalresectionofEGCwhileensuringaccuratepredictionoflymphnodemetastasis(LNM).ESDorendoscopicfull-thicknessresectioncombinedwithanewtechniqueforthenavigationofsentinellymphnodesmakesitpossibletoperformtumorresectionandlaparoscopiclymphadenectomyinhigh-riskpatientswithLNM.Thisreviewcoversthestatus,newtechnologiesandchallengesofEGCendoscopicdiagnosisandtreatment.Keywords:Endoscopicresection(ER),earlygastriccancer(EGC),sentinellymphnodenavigation胃癌的预后取决于病理分期，因此，疾病的早期诊断是非常重要的，早期胃癌尚有行ESD或者外科手术条件。早期胃癌（EGC）被定义为肿瘤侵及范围局限于黏膜或黏膜下层，而不管是否存在淋巴结转移（LNM）。早期识别疾病可47 在发生淋巴管浸润之前切除胃癌，通过对早期胃癌白光内镜检查的深入了解，可以提高诊断的准确性，通过结合使用其他影像学方法，如包括彩色内镜在内的影像增强内镜和内镜超声检查，可以进一步提高诊断水平。早期胃癌的内镜治疗可以使用内镜下黏膜切除术（EMR）或内镜下黏膜剥离术（ESD）完成。两种技术都可以切除含有早期肿瘤的黏膜（可能还有一部分黏膜下层），而不会中断更深层。EMR可以整块移除小于2厘米的病变。较大的病变可能需要以零碎的方式切除。这可能会限制对病变边缘的评估以及定位病变的边界。而不论其大小如何，ESD都可以对病变进行整体解剖。ESD是用专用的针刀进行的，它允许切开，然后小心地解剖粘膜下层的病变。ESD之后的肿瘤复发很少，但是这种技术是劳动密集型的，穿孔风险增加。目前微创内镜治疗已成为早期胃癌的首选治疗方法，内镜切除术（ER）正在成为与手术切除地位等同的标准治疗手段之一[1,2]。在这篇综述中，将总结早期胃癌内镜下诊断及切除的现状并，提出未来EGC治疗策略的展望。1早期胃癌的介绍尽管胃癌的发病率和死亡率均呈下降趋势，但胃癌仍是全世界肿瘤中最常见的死亡原因之一[3,4]。胃癌流行病学存在显著的地域差异，与西方国家相比，包括日本和韩国在内的东亚国家发病率特别高。根据PARIS分类消化道浅表性肿瘤病变类型分为三类，分别对应于隆起性病灶（0-I），浅表性病灶（0-II）和凹陷性病灶（0-III）。类型0-I被细分为带蒂（0-Ip）和扁平（0-Is）病变。类型0-II分为三个亚型，a，b和c，分别对应于隆起，平坦和凹陷的病变。0-III型全部是溃疡型。伴有隆起和凹陷的混合型也出现，分为两组：0-IIc+0-IIc型病灶大部分表面凹陷；隆起是存在于外围的病变部分；在0-IIa+0-IIc病变中，在大部分隆起的病变中存在中央凹陷。溃疡和凹陷的组合模式被称为0-III+IIc或0-IIc+III。早期胃癌（EGC）被定义为当癌症侵入限于黏膜或黏膜下层时，不管是否存在淋巴结转移（LNM）。随着内窥镜设备的发展和诊断能力的提升，目前无症状阶段的早期胃癌检出率较以往明显提高[5]。内镜下鉴别癌变和非癌性病变的标准如下：1）常规内镜检查结果：界限分明的病变、颜色/表面形态不规则；2）放大内窥镜和窄带成像（M-NBI）结果：不规则的微血管分界线或不规则的微型表面分界线模式。48 2早期胃癌的内镜评估方法在给早期胃癌患者行内镜治疗之前，广泛而准确的诊断和分期是至关重要的。多次黏膜活检的上消化道内镜检查可以诊断EGC，灵敏度高达96％。国外现多采用多点活检来帮助判断病灶的性质；采用放大内镜或色素内镜的方法来评估病变侧方范围；采用超声内镜来辅助判断病变浸润深度。国内采用常规白光胃镜、色素内镜、电子染色+放大内镜、超声内镜、荧光内镜、激光共聚焦内镜等手段对早期胃癌进行精细的检查。它们提供了诊断早期胃癌的重要信息，并指导适当的治疗。胃癌的准确分期对于内镜治疗资质至关重要。肿瘤浸润深度，肿瘤边缘识别和淋巴结受累评估对于确定内镜治疗的可行性和选择是至关重要的。以下是一些可以帮助选择适合于内窥镜治疗的病变的技术。2.1色素内镜胃癌的一些肉眼特征可以通过传统的白光内镜进行鉴别，如结节，溃疡或狭窄。然而，一些早期胃癌，特别是重度不典型增生，在肉眼上正常。白光内窥镜需使用一些一些染料。所使用的染料主要包括三类：吸收性染料、对比染料和反应性染料。吸收性染料对一些粘膜成分具有亲和力，包括卢戈氏碘，亚甲蓝，甲苯胺蓝和结晶紫（龙胆紫）。色素使用的两个主要途径：内镜下直接喷洒和口服色素法。用不同染料或组合的内镜染色可以使胃黏膜病变的存在和程度更清楚。色素内镜在EMR和ESD之前识别早期病变的边界中起关键作用。2.2NBI/FICE/i-scan和放大内窥镜白光内窥镜波长范围从400到800纳米左右，而窄带成像[6]（NBI）是一种使用窄带宽的蓝光和绿光的技术。光穿透组织的深度取决于其波长。NBI中使用的窄带光优先增强蓝光，其穿透表面并突出表面毛细血管网和粘膜凹点图案。NBI与放大或高分辨率内窥镜检查技术相结合，可以观察黏膜微细结构和细血管网。这可增强对鳞状上皮内毛细血管内袢（IPCL）模式的识别，提高对早期胃癌的检测率[7]。另外两种用于内窥镜的与NBI相似的技术是FICE[8]和i-SCAN[9]。这两种技术都使用光学过滤器或电子方法来突出表面图案和血管结构的细节。它49 们都被称为虚拟染色内镜，对早期胃癌具有相似的诊断价值。虚拟染色内窥镜更易于使用，不需要喷涂染料的时间，而且可以通过点击内窥镜上的一个按钮进行施加。2.3超声内镜（EUS）EUS与其他影像学方法相比，在评估局部肿瘤和区域淋巴结浸润深度方面更敏感，评估局部肿瘤分期的准确度达到90％。尽管使用高频超声探头的EUS用于那些未分化的肿瘤、溃疡型、扩大适应症、0-1型病变和位于胃的上三分之一的病变的患者时，其准确性相对降低，但是使用高频超声探头的EUS用于早期胃癌分类时的准确度却可以高达80％，而常规EUS的准确率为63％[10]。当超声内镜检查和使用高频超声探头的结果综合考虑用于肿瘤分类时，达到了92%的准确率。虽然EUS使用高频超声探头有局限性，但它的入侵准确性较高，是鉴别食管和胃内病变的有效方法。EUS检测局部淋巴结恶性特征的灵敏度为80％[11]。EUS引导的FNA可以证明是一种微创，安全的获取细胞学标本进行分期的方法。加入FNA可以提高精度高达92-98％[12]。3早期胃癌的内镜下治疗3.1内镜下黏膜切除术（EMR）EGC的EMR首先在1974年被描述，局部注射将黏膜与固有肌层分离，切除局部隆起的黏膜。这项技术是从结肠息肉息肉切除术中学到的。1984年引入的“条状活检”可以轻易切除小的胃部病变。黏膜下注射生理盐水后，用抓紧器提起病灶，用圈套器取出病灶。1988年，引入环周状预切开后内镜下黏膜切除术（EMR-P），然而，这种技术有较高的穿孔和出血风险。从那以后，带盖帽内窥镜（EMR-C）的EMR在1992年开发出来，用于治疗相对较小的EGC[13]。另一项技术是EMR结扎（EMR-L），该技术是作为标准的内镜下曲张静脉结扎开始的。目前，EMR被认为是一种微创和安全的技术，并成为EGC治疗的一个轴心[14]。EMR的适应证各国、各医院均并无统一标准，甚至各医生掌握的适应证也不完全一样,更多的是与医师的操作技术相关。以下是日本胃癌协会于1998年宣布的EGC的EMR的绝对适应征：（I）直径小于2cm的肿瘤隆起灶;和（II）没有溃疡的小（<1厘米）凹陷灶。病变也必须局限于黏膜层的分化型腺癌。与50 手术相比，EMR显示出极好的结果。EMR和手术组的5年总生存率和复发率没有差异（93.6％vs。94.2％和1.2％VS。1.1％）[15]。虽然EMR组的异时性胃癌发生风险高于手术组（5.8％和1.1％），但EMR或手术也可成功挽救其他病灶[16]。EMR的一个主要局限性是由于器械的尺寸限制，对于直径大于2cm的病变不完全切除。部分切除引起局部复发的高风险（2.3-36.5％）[17]。因此，促使人们思考发明更新的技术去剥离更大、更完整组织。3.2内镜下黏膜剥离术（ESD）ESD由EMR发展而来，是近年来出现的一项新的治疗手段，临床应用前景很好，让更多的早癌能够在内镜下一次性完全切除，使患者免受开腹手术的痛苦。ESD的主要步骤如下：1）利用针型切开刀或APC于病灶边缘0.5cm处电凝标记切除范围；2）黏膜下注射液体使肿瘤抬高，临床常用的黏膜下注射液体有生理盐水、甘油果糖、透明质酸钠等；3）预切除肿瘤周边黏膜；4）剥离病变。目前ESD主要治疗的消化道病变有：早期癌、巨大平坦息肉（＞2cm）、黏膜下肿瘤等，对部分来源于黏膜下层和固有肌层的黏膜下肿瘤可以采用ESD方法进行黏膜下挖除术（ESE）。随着ESD技术的发展，EGC的ER的适应症得到了扩展。目前对EGC患者ER扩展指征是没有淋巴管浸润证据的分化型肿瘤，包括：（I）无溃疡的分化型黏膜内癌，与肿瘤大小无关；（II）溃疡型黏膜内癌，直径小于3厘米；和（III）最小（距肌层黏膜500μm）尺寸小于3cm，无溃疡发生,无淋巴及血行转移的黏膜下浸润性癌[18]。最近的荟萃分析比较了ESD和EMR对EGC的疗效和安全性，结果显示，即使对于小病灶，ESD在整块切除率，组织学完全切除率和局部复发率方面也有优势。据报告ESD的5年总生存率和无复发率分别为93.6-100％和98.7-100％。对于并发症，ESD期间发生延迟出血的比例更高，发病率高达7-15.6％。在ESD过程中穿孔率较高（3.6-4.5％比1.0-1.2％），在大多数情况下是内镜治疗后。ESD技术解放患者痛苦带来福音的同时，其局限性亦不可忽视。ESD治疗EGC的主要局限性是淋巴结状态不准确。最终，只有当EGC没有区域性LNM时，ESD才能达到根治的目的。EGC的N分期主要通过CT或EUS进行，但诊断结果不尽如人意。EUS的局限性不仅在于区域LNM的评估，而且在于预测入51 侵深度。ESD后需要很多患者和内镜医师决定和跟进。最后，决定EGC患者有可能逃脱扩大的ESD指示的微创治疗是最重要的。一些接受手术的患者最终病理被诊断为没有LNM的黏膜癌。相反，一些患者ESD术后仍需考虑需要再次手术的现象并不罕见。尽管在几乎所有的胃内ESD中，术中出血几乎没有发生。但ESD发生出血、穿孔等并发症的总发生率较EMR有增多[19]。据报道术中出血并发症的危险因素是肿瘤部位，其中富含血管的黏膜下层有一些大血管从肌层渗透。为了防止术中出血并发症，有必要进行黏膜下剥离、创造清晰的内窥镜视野、适当的牵引和水灌溉、切割前在黏膜下层找到血管及使用抗凝血药物、局部注射皮质醇激素等[20]。延迟出血通常发生在24小时内，可能在2周内。出血风险因素有：肿瘤的部位、切除范围、患者年龄、使用抗凝药物、手术时间等[21,22]。据LibinioD等荟萃分析认为，合并PPB的发生率为5.1％（95％可信区间，4.5％-5.7％），这并不因研究设计的不同而有所不同。男性（OR，1.25），心脏病（OR，1.54），抗血栓药物（OR，1.63），肝硬化（OR，1.76），慢性肾病（OR，3.38），肿瘤大小>20mm切除标本大小>30mm（OR，2.85），定位于小弯（OR，1.74），扁平/凹陷形态（OR，1.43），癌组织学（OR，1.46）和溃疡（OR，1.64）作为PPB的重要危险因素，而年龄，高血压，黏膜下浸润，纤维化和局限性（上，中，下三分之一）则不是。操作时间大于69分钟（OR，2.05）和使用组胺-2受体拮抗剂代替质子泵抑制剂（OR，2.13）是与PPB相关的程序性因素，而内镜医师的经验和预处理的质子泵抑制剂则不是。重新进内镜与降低PPB无关（OR，1.34;95％置信区间，.85-2.12）。胃ESD术中和延迟穿孔[23]的发生率分别为5％和0.5％左右。风险分析表明，肿瘤部位、肿瘤大小、溃疡病灶、切除深度等等均可能是手术穿孔的独立危险因素[24]。为了防止术中穿孔，需要使用透明质酸溶液在黏膜下层留出足够的空间，以便于操作。为了防止穿孔并减少随后的恶化，也需要适当的镇静，无需身体移动或用于长时间手术和二氧化碳注气的反应。4早期胃癌内镜下切缘阳性患者复发或转移的风险因素内镜切除后，肿瘤浸润侧缘或垂直缘的病例确定为不完全切除。不完全切除以及低分化癌、淋巴管浸润病例、肿瘤浸润深度超过500μm的病例均被称为非治愈性内镜下切除术。JaeJinHwang[25]等人对接受内镜下黏膜切除（EMR）或52 内镜黏膜下剥离（EGC）的患者进行回顾性分析，选取EMR（n=45）或ESD（n=39）后82例（84个病变）LRM+患者入组。40例患者接受了额外的胃切除术或ESD，其中44例被严密观察到。残留/复发肿瘤率为34.5％（84个病灶中的29个）。单因素分析发现，残留/复发肿瘤与内镜下黏膜切除型（EMR）、未分化组织学、涉及的方向数量、切除边缘受累的比率以及肿瘤累及外侧切缘的总长度（mm）有关。在多因素Logistic回归分析中，未分化组织学类型和比率（％）是独立危险因素（优势比[OR]5.28,95％可信区间[CI]1.13-24.72，P=0.035和OR1.08,95％CI1.03-1.14，分别为p=0.004）。研究者基于这些数据，认为对于无淋巴管浸润的高选择性黏膜下癌症，ER可能是可行的。对于垂直边缘阳性，粘膜下受累具有高风险特征或淋巴血管侵犯的患者，建议采用带淋巴结清扫的胃切除术。SekiguchiM[26]等人在1997年至2010年间，通过ESD治疗的3784例EGC患者（3316例）中，有77例非分化型EGC患者，其中75例在符合以下纳入标准后进行回顾性分析：1）唯一非致命性因素为癌症阳性侧缘；2）ESD后选择密切观察；3）ESD后进行1年以上的随访。结果在59.8个月的中位随访期内发现10个病灶局部复发癌；未发生转移或胃癌相关死亡。ESD后5年局部复发累计发生率为11.9％。所有局部复发的癌症都是粘膜分化型腺癌。多变量分析显示≥6mm的癌侧阳性长度与局部复发显着相关（危险比20.8；95％置信区间5.2％-82.9％；p<0.001）。6mm的截止值由受试者工作特征曲线确定；5年发生局部复发的敏感性和特异性分别为66.7％和95.6％。研究者最终得出结论，认为≥6mm的癌侧阳性边缘长度是局部复发的独立危险因素。5内镜下治疗技术的进展5.1ESD与前哨淋巴结导航前哨淋巴结是假设的第一个淋巴结或淋巴结的一组淋巴结，被认为是沿淋巴引流路线的第一个微转移灶。前哨淋巴结导航被定义为基于前哨淋巴结定位和前哨淋巴结定位诊断淋巴结转移的新型微创手术。前哨淋巴结的概念已经从乳腺癌和黑色素瘤的手术分期发展而来。对于前哨淋巴结阴性的乳腺癌患者，避免了不必要的预防性根治性淋巴结清扫术，如腋窝淋巴结清扫。在前哨淋巴结定位法中，53 使用放射性胶体和蓝色染料的双示踪剂法，目前被认为是在EGC患者中稳定检测前哨淋巴结的最可靠方法，然而，吲哚菁绿（ICG）红外或荧光成像等新技术可能会改变胃癌中的SN图谱[27]。即使在切除的标本中，放射性胶体的积聚也有助于识别前哨淋巴结，并且蓝色染料即使在腹腔镜手术期间也能有效地实现淋巴液流动的术中可视化。通常使用锝-99m锡胶体，锝-99m硫胶体和锝-99m锑硫胶体作为放射性示踪剂。目前，异硫蓝，专利蓝和吲哚菁绿（ICG）是首选的染料示踪剂。临床T1N0（<4cm）胃癌患者可以进行前哨淋巴结活检，而不受肿瘤部位的限制。放射性胶体和蓝色染料在手术前一天和即将手术前使用内窥镜穿刺针注入到原发性肿瘤周围的黏膜下层的四个象限中，以提高检测LNM的准确性。DongLF等人[28]回顾性分析255例EGC患者的淋巴结转移特点，并与23例EGC患者的SLN活检进行比较，发现侵袭深度和肿瘤大小是影响淋巴结转移的独立危险因素。直径<4cm的黏膜癌淋巴结转移率为2.5％，直径≥4cm时为13.3％（p=0.040）。黏膜下层癌肿瘤直径<3cm时为25.4％，直径≥3cm时为50.5％（P=0.003）。EGC中SLN活检的准确性，敏感性和特异性分别为100％。SLN的分布特征与EGC淋巴结转移相一致。她们认为根据可行的标准，可以在EGC中安全地进行SLN引导的微创手术。MitsumoriN等[29]研究中指出前哨淋巴结导航手术（SNNS）在胃癌治疗中的两项前瞻性多中心试验也已在日本完成，EGNS的临床应用可能会帮助我们避免不必要的淋巴结清扫术，以保证患者术后的生活质量。5.2经自然腔道内镜手术自然腔道内镜手术（NOTES）是内窥镜通过自然孔口（例如，口腔，尿道，肛门），然后进入胃、阴道或结肠的内部进行手术的治疗手段，可作为EGC的改良治疗。这个程序允许活动性大的内窥镜穿破空腔脏器到达肠腔外的器官。NOTES这类微创手术和开腹手术相比，其风险较小。基于ESD的混合NOTES技术可进行最小限度的肿瘤切除，并且对于LNM高风险的EGC患者，可以同时进行腹腔镜淋巴结清扫术。混合NOTES技术又称为内镜下全层胃切除联合腹腔镜下区域淋巴结切除（EFTGR），其兼顾了ESD和腹腔镜手术的优点，可以有效切除肿瘤，但如何使较大的手术切口仅仅通过内镜技术实现完全关闭，仍是54 目前待攻克的问题。EFTGR由五个主要程序组成：（1）围绕通过边缘活检证实的病变进行安全边界标记；（2）与损伤周围的黏膜下层一样深的圆周切口；（3）腹腔镜引导下通过黏膜下切口线围绕病变周围的内窥镜全层切除；（4）通过腹膜腔内EFTGR切口线在腹腔镜下进行全层切除；（5）腹腔镜下关闭切缘，全层切除前行淋巴结清扫术。根据病灶位置，在前哨淋巴结导航后切除局部淋巴结。SteinemannDC等人[30]进行系统的文献检索以确定比较混合NOTES和标准腹腔镜检查的RCT和非RCT后发现，杂交NOTES可减少术后疼痛，并与患者更高的美容满意度相关联。ChoWY等人[31]进行的前瞻性研究认为，杂交NOTES可能是内镜切除术与腹腔镜手术之间的桥梁，可以减少EGC患者的广泛胃切除术。6展望现如今，在早期胃癌中，内镜切除术（ER）正在成为与手术切除地位等同的标准治疗手段之一，然而EMR不能确保完全切除大肿瘤，ESD穿孔和出血等并发症的风险较高，且目前内镜下操作在诊断、并发症处理及随访等方面均缺乏专家共识，此外，ER技术掌握难度大、手术耗时长，这问题均尚待解决。只有促进技术、设备和培训系统的进一步发展，才能促进全球ESD的标准化进程，并推进消化内镜技术的蓬勃发展。55 参考文献[1]TakekoshiT,BabaY,OtaH,etal.Endoscopicresectionofearlygastriccarcinoma:resultsofaretrospectiveanalysisof308cases[J].Endoscopy.1994,26(4):352-8.[2]NishizawaT,YahagiN.Endoscopicmucosalresectionandendoscopicsubmucosaldissection:techniqueandnewdirections[J].Currentopinioningastroenterology.2017,33(5):315-9.[3]FerlayJ,SoerjomataramI,DikshitR,etal.Cancerincidenceandmortalityworldwide:sources,methodsandmajorpatternsinGLOBOCAN2012[J].IntJCancer.2015,136(5):E359-86.[4]JemalA,SiegelR,XuJ,WardE.Cancerstatistics,2010[J].CACancerJClin.2010,60(5):277-300.[5]HamashimaC,ShibuyaD,YamazakiH,etal.TheJapaneseguidelinesforgastriccancerscreening[J].Japanesejournalofclinicaloncology.2008,38(4):259-67.[6]YoshinagaS,OdaI,NonakaS,KushimaR,SaitoY.Endoscopicultrasoundusingultrasoundprobesforthediagnosisofearlyesophagealandgastriccancers[J].Worldjournalofgastrointestinalendoscopy.2012,4(6):218-26.[7]BhutaniMS,HawesRH,HoffmanBJ.Acomparisonoftheaccuracyofechofeaturesduringendoscopicultrasound(EUS)andEUS-guidedfine-needleaspirationfordiagnosisofmalignantlymphnodeinvasion[J].Gastrointestinalendoscopy.1997,45(6):474-9.[8]WiersemaMJ,VilmannP,GiovanniniM,ChangKJ,WiersemaLM.Endosonography-guidedfine-needleaspirationbiopsy:diagnosticaccuracyandcomplicationassessment[J].Gastroenterology.1997,112(4):1087-95.[9]HiraoM,MasudaK,AsanumaT,etal.Endoscopicresectionofearlygastriccancerandothertumorswithlocalinjectionofhypertonicsaline-epinephrine.Gastrointestinalendoscopy[J].1988,34(3):264-9.56 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致谢三年的研究生生活即将走向尾声，回首这过去的三年，心中甚是充满了感激和感动。我怀着感恩的心，一路感受、一路前行。首先，感谢我的导师刘迪群主任医师，您渊博的专业知识、认真严谨的工作态度、积极乐观的生活态度、和蔼善良的待人方式一直深深影响着我，感谢您传授我宝贵的临床知识和临床思路的同时，还教导我为人处事之方法。其次，感谢我的实验指导老师周伟伟博士对我的耐心教导，尽管我不是一个聪明和勤奋的人，但您从来没有放弃过我，总是在我需要的时候给予我最大的帮助。周老师卓越的学识和专业才能，认真严谨的工作作风将一直指引我今后的临床科研生涯。感谢南华大学第一附属医院消化内科廖爱军主任、曾斌主任、胡光胜副主任、姚育红副主任、钟华副主任、周徽副主任、钱贤副主任、阳静老师、肖伟升老师、刘晗老师、陈选民老师、李沛元老师，以及邓文兵师兄、谢玉东师兄、陈明师兄、陈娟师姐等消化内科全体老师及护士给我营造了一个温馨的科室氛围，不仅培养我临床知识和技能，更教会我如何待人处事。感谢你们这三年来对我的支持和帮助，让我掌握了消化内科常见病、多发病的诊疗规范，熟练了胃镜操作及活检，培养了我的医患沟通能力，更加坚定了我今后要成为一名好医生的信念。感谢三年轮科期间各位老师给予的教导和关心，感谢各位同事给予的帮助和鼓励，感谢南华大学病理科各位老师对本实验的指导。感谢陈萍芳、许紫薇、符银媚、段无瑕、宋平、兰天同学，以及张超群、曹韵、向萍、王楠楠师妹和曹文波师弟在学习和工作中给我的帮助，感谢我的师弟曹文波愿意牺牲自己的休息时间来帮我管理病人，你的真诚和勤奋感动了我。感谢我的室友匡雨晴，你以最真的善良照顾我陪伴我，在这三年的研究生生活中我们如同亲姐妹一般和睦相处、友爱互助，在工作、学习、生活上你都将一直是我学习的榜样。因为有你们，我的研究生生活才过的多姿多彩。最后，我必须感谢尽全力培养我的父母，是你们默默的付出成就了今天的60 我，你们无私的爱是一直浇灌我健康成长的阳光雨露，感谢父母的养育之恩。这三年的时间里我成长着收获着，在这里学到了很多东西，值得我今后的一辈子去铭记和感受。感谢所有关心及帮助过我的人,祝你们健康快乐，一生平安!61
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