资源描述：
《针刺结合益气祛风汤对慢性ACD小鼠病变组织中Fas及FasL表达的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
学校代号１０１６２学号２０１３２０１００１４７中Ｉ《乂嗦Ｌｉａｏ打ｉｎｇＵ打ｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＧｈｉ打ｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ硕±学位论义针刺结合益聲接风汤对慢性ＡＣＤ小鼠病变组织中Ｆａｓ及ＦａｓＬ表达的影嘴＇．‘人．Ｊ＆＇学位申请人张露文１■：ｒ指导教师姓名炼＾国一．１．、．施节专业名称针灸推拿学电请学位类型学术学位论文提交日期二〇—六年王月＇羞． 瓦宁中医药大学学位论文独创性与真实性声明本人郑重声明、：在我呈交的学位论文中，本人经硏究所得的数据、原理一结论等切巧容均真实，且经本人认真核对无误；我呈交的与学位论文相关的资料、照片、录像片、检查化验报告单等）确为完整的学位论文研究中（原始记录的原始资料，本人没作任何修改；我呈交的学位论文是我本人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中特别加Ｗ掠注和致谢的地方外，论文中没有其他人已经发表或撰写过的研究成果，其他人对我完成此论文的帮助及对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。一我呈交的学位论文及与该论文相关的资料若有不实之处，本人承担切相关责任。学位论文作者签名’关于日期：如々年月＞日本学位论文使用授权的声明或人完全了解圧宁中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留权向迂国家有关部ｎ机构送交论文的印刷版和电子版，允许被查阅和借阅。本人授宁中医药大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。（保密论文在解密后应遵守此规定）学位论文作者签名！学位论文导师签名日期；＞是年心日／ 目录一、摘要中文摘要.......................................................1英文摘要........................................................3二、英文缩略词表.....................................................5三、正文前言............................................................6针药结合对慢性ACD小鼠耳重量差及病变皮肤组织中Fas/FasL表达的影响.............................................................10材料与方法.....................................................10实验结果.......................................................15讨论...........................................................24结论...........................................................29四、参考文献........................................................30五、附录综述一、变应性接触性皮炎的研究进展.................................32二、变应性接触性皮炎动物模型的研究进展.........................39个人简历...........................................................54致谢...........................................................55 中文摘要目的：建立慢性ACD小鼠模型，并用针刺结合益气祛风汤的方法对慢性ACD模型小鼠进行治疗，进而观察其对小鼠组织形态学的影响，并探讨其对慢性ACD模型小鼠耳病变皮肤组织中Fas及FasL表达的影响，为临床能够更好地应用针刺结合的方法治疗变应性接触性皮炎提供可靠而客观的依据。材料和方法：1.实验材料（1）实验动物：60只健康的雄性昆明种小鼠。（2）实验用药：通过灌胃给药方式，中药组给予益气祛风汤颗粒剂悬浊液；西药组给予氯雷他定片悬浊液；针药组给予益气祛风汤颗粒剂悬浊液；空白组及模型组均给予等量蒸馏水。2.研究方法（1）造模方法：采用局部皮肤涂抹2,4-二硝基氯苯（2,4-DNCB）的方法制备小鼠的慢性ACD动物模型。（2）通过观察针刺结合益气祛风汤对慢性ACD模型小鼠病变耳重量差的影响,进而评价其对慢性ACD小鼠的抑制作用。（3）采用免疫组化的方法，进行对慢性ACD模型小鼠病变皮肤组织中Fas/FasL的含量进行检测，研究其表达的变化，进一步探究针刺结合益气祛风汤对慢性ACD小鼠的抑制作用。结果：1.针刺结合益气祛风汤可明显下调慢性ACD模型小鼠病变耳的重量差值：慢性ACD模型组的小鼠耳重量差值明显高于空白组（P<0.01），针药组及氯雷他定组的耳重量差值明显低于模型组（P<0.05），针刺及中药组的耳重量差值与模型组相比均无显著性差异（P>0.05）；针药组与氯雷他定组之间无显著性差异（P>0.05）。2.针刺结合益气祛风汤可明显上调慢性ACD模型小鼠耳病变皮肤组织中Fas/FasL的表达：慢性ACD模型组的小鼠耳病变皮肤组织中的Fas、FasL的表达均增高；针药组、针刺组及中药组小鼠耳病变皮肤组织中Fas、FasL的表达均 ‐1 ‐ 明显上调；氯雷他定组对小鼠耳病变皮肤组织中Fas、FasL的表达无明显影响，且针刺结合益气祛风汤组与氯雷他定组之间无明显差异。结论：1.针刺结合益气祛风汤对慢性ACD模型小鼠有抑制作用，且能降低其病变耳的重量差值；2.针刺结合益气祛风汤能明显上调慢性ACD模型小鼠的耳病变皮肤组织中Fas和FasL的表达。关键词:益气祛风汤；慢性ACD；针刺；细胞因子 ‐2 ‐ AbstractObjective：Establishchronicallergiccontactdermatitis(ACD)mousemodel,byacupuncturecombinedwiththemethodofYiqiQufengDecoctionchronicACDmousemodelofintervention,toobservetheeffectofmousepathologyandhistology,andtoexploreitseffectontheexpressionofFasandFasLinchronicACDmodelmicewithlesionsofskintissue,forbetterclinicalapplicationofacupuncturecombinedwiththetreatmentofallergiccontactdermatitistoprovideanobjectivebasis.MaterialsandMethods1.Experimentalmaterials（1）Experimentalanimals：60healthymaleKunmingmice.（2）Experimentalmedicine：Bothbyintragastricadministration,thetraditionalChinesemedicinegroupgivenYiqiQufengDecoction;westernmedicinegroupgivenLoratadineTabletsinwatersolution;acupunctureandmedicinegroupgivenYiqiQufengDecoction;blankgroupandmodelgroupweregivenequalvolumeofdistilledwater.2.ResearchMethods（1）Modelapproach：ThemousemodelofchronicACDwaspreparedbythemethodof2,4-twonitrobenzene(2,4-DNCB)skinsmear.（2）ByobservingtheeffectofacupuncturecombinedwithYiqiQufengDecoctiononchronicACDmodelofmouseearweightdifferenceeffect,apreliminaryevaluationofitsinhibitoryeffectonchronicACDmice.（3）Usingimmunohistochemicalmethod,detectingchronicACDmiceskintissuewithpathologicalchangesincytokineexpressionofFas/FasLinstudytheexpressionchanges,furtherexploretheacupuncturecombinedwithYiqiQufengDecoctiononchronicACDmiceinhibition. ‐3 ‐ Results1.AcupuncturecombinedwithYiqiQufengdecoctioncanreducechroniceardiseasemodelmiceACDweightdifference:ChronicACDmodelgroupmiceearweightandthedifferencewassignificantlyhigherthanthatintheblankgroup(P<0.01),needlemedicinegroupandloratadinegroupofearweightdifferenceweresignificantlylowerthanthatinthemodelgroup(P<0.05),acupuncturegroupandmedicinegroupofearweightandthedifferencewiththemodelgroupcomparedwithnosignificantdifference(P>0.05);acupunctureandmedicinegroupandloratadinegroupnosignificantdifference(P>0.05).2.AcupuncturecombinedwithYiqiQufengdecoctioncansignificantlyincreasetheexpressionofFas/FaslinchronicACDdiseasemodelmiceskintissues:ChronicACDmodelgroupmiceearskintissuewithpathologicalchangesofFas,FasLexpressionwereincreased;acupuncturegroup,acupuncturegroupandmedicinegroupcansignificantlyup-regulatedinmouseearskintissuewithpathologicalchangesinFAS,FasLexpression;loratadinegroupofearvariableskintissueofFasandFasLexpressionwasnotobvious,andtheacupuncturecombinedwithYiqiQufengDecoctiongroupandloratadinegroup,therewasnosignificantdifference.Conclusion1.AcupuncturecombinedwithYiqiQufengdecoctionhadaninhibitoryeffectonmicewithchronicACDmodel,canreduceweightoftheeardisease,inhibittheswellingreactionthetargetorgans;2.AcupuncturecombinedwithYiqiQufengdecoctioncansignificantlyincreasetheexpressionofFasandFaslinmicemodelofchronicACDlesionsinskintissue.Keywords：YiqiQufengDecoction；allergiccontactdermatitis；acupuncture；cytokine ‐4 ‐ 英文缩略词表中文全称英文全称英文缩写接触性皮炎contactdermatitisCD变应性接触性皮炎allergiccontactdermatitisACD刺激性接触性皮炎IrritantcontactdermatitisICD超敏反应hypersensitivity迟发型超敏反应delayed-typehypersensitivityDTH接触性超敏反应contacthypersensitivityCHS中医TraditionalChineseMedicineTCM细胞因子cytokineCK辅助T细胞helpTh细胞毒性T细胞cytotoxicTc2,4-二硝基氯苯2,4-dinitrochlorobenzene2,4-DNCB2,4-二硝基氟苯2,4-dinitrofluorobenzene2,4-DNFB免疫组化法immunohistichemicalmethod细胞凋亡cellapoptosis白细胞介素-4interleukin-4IL-4γ-干扰素interferon-gammaIFN-γ肿瘤坏死因子-αtumornecrosisfactor-αTNF-α ‐5 ‐ 前言近年来，由于工业的迅猛发展以及人们对于物质的需求数量逐渐提升，导致生态环境日渐恶化，全球超敏反应性疾病的发病率呈现出连年攀升的趋势。根据世界超敏反应组织（WAO）针对多个国家过敏性疾病发生率进行的调查结果可知：在调查区域12亿总人口里面，有超过2.5亿人曾得过过敏性疾病，这已经占到了总体比例的20%。而在国内也组织开展过小范围调查，北京地区曾患有超敏反应性疾病的比例达到了37.7%。在超敏反应性各种疾病类型里面，皮肤病的患病率最高，而在与职业相关的皮肤病中，接触性皮炎最常见，且变应性接触性皮炎的发病率高达41.5%。变应性接触性皮炎（Allergiccontactdermatitis，ACD）属中医的湿疹范畴，是皮肤以及黏膜在接触外源性的刺激物或者是致敏物之后，在局部出现皮肤炎症，这也是医院皮肤科临床常见病，被归入Ⅳ型超敏反应。Ⅳ型超敏反应也叫作迟发型超敏反应，主要是效应T细胞和对应抗原接触之后，导致单核细胞浸润及组织细胞损伤，进而产生炎症反应，比如药疹、湿疹以及接触性皮炎等，抗体不参与其反应过程，属细胞的免疫反应。ACD的病因如能被及早查明，且接受适当的处理，可速愈，但日常生活中患者很难躲避其相应的致敏因子，在临床当中难以确定诱因，所以本病经常会反复发作，若是未能做出合适处理，则还会在皮炎基础之上出现继发湿疹样变，为慢性ACD（也叫作接触性湿疹）的病理改变，从而难以治愈。在现代医学当中，针对ACD进行治疗一般是应用到抗组织胺或者是糖皮质激素类药物。其中，抗组织胺药物可以对H1受体产生高抑制作用，并阻断肥大细胞以及嗜碱性粒细胞所释放出来的组胺作用于靶器官，然而临床结果显示其只针对Ⅰ型（速发型）超敏反应具有实际效果，至于Ⅳ型超敏反应则无法确定。根据相关报道可知，如果想在有效抑制炎症介质，并对细胞趋化以及抗炎产生实际作用，则药物浓度应是比体内药物浓度高于上百倍。而且抗组织胺药物针对炎症介质产生的是拮抗作用，并非是对病变部位炎细胞浸润进行直接抑制，所以仅能够起到镇静止痒以及缓解自觉症状的效果，而无法真正控制局部炎细胞浸润，同时 ‐6 ‐ 在长时间使用的情况下，会出现机制耐药性，本身还有一定副作用，比如第一代抗组织胺药物会产生排尿困难的不良反应，并不同程度的出现嗜睡以及乏力等副作用，而第二代抗组织胺药物则会产生心脏毒性；至于糖皮质激素类药物的优势主要表现在疗效作用明显上，然而缺陷也同样明显，即药效持续时间段，无法起到预防作用，再就是副作用较大，会抑制下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴，出现血压升高以及电解质紊乱等现象，因此其无法充当常规治疗药物，一般仅适用于急重症病例。因为Ⅳ型超敏反应往往是反复发作，再加之用药周期长，这就决定了上述两种药物都并非是最佳选择。已有临床实践以及实验研究结果显示：在Ⅳ型超敏反应疾病的治疗方面，许多中药方剂不但疗效确切、副作用较小甚至没有，而且能够做到防治结合，可以被长时间使用。目前在经典方剂上具体包括消风散、养血消风饮、玉屏风散以及龙胆泻肝汤等，或由某些经典方化裁而成的复方，以及大量的单方、中成药、院内制剂等。除此之外，还有一些自拟方以及经验方也都能够对本病产生良好的治疗效果。但是，当前主流研究趋势为基于组方诸多药材中筛选出有效治疗该病的药物。相关报道证实，ACD的炎症反应过程是以Th1细胞介导为主，并由Th2细胞参与过程调节。在由超敏反应性疾病诱发的迟发性炎症发病机制里面，占据首要地位就是Th细胞分化。如果原本正常的机体Th1/Th2细胞出现失衡，那么其分泌出来的细胞因子网络平衡就难以为继，其后需要选择性地对Th1/Th2细胞进行调节，以重新回到平衡状态，这应该是药物疗效作用的内在机理。所以，关于药理作用研究当前大部分都是检测由Th1/Th2细胞分泌出来各种细胞因子，比如IFN-γ以及IL系列，以明确其针对Th1/Th2细胞平衡状态产生的具体影响情况。此外，按照CD4或者是CD8分子实际表达水平，能够把T细胞划分成两类，分别是CD4+T与CD8+T。通过动物实验结果显示，两者都直接参与到了接触性皮炎炎症反应当中。其中，在CD4+T细胞被活化之后会产生Th细胞，继而还可以分成Th1与Th2细胞，由此分泌出的细胞因子可以在很大程度上体现出CD4+T细胞效应情况。CD8+T细胞在ACD反应的时候也会介入并产生影响作用，即CD8+T细胞被活化之后可以分化成Tc，然后借助两种机制产生细胞毒性作用，针对靶细胞可以形成可特异性杀伤。CTL作为机体抗病毒以及抗肿瘤的关键效应细胞， ‐7 ‐ 所产生的细胞毒作用一般是要借助Fas/FasL介导的细胞凋亡及穿孔素介导才会促使细胞凋亡。在CTL诱导靶细胞凋亡方面，其关键机制应该是借助CTL识别靶细胞，然后对FasL表达进行诱导，使其趋于活化，而在CTL表层在和靶细胞Fas结合之后，会导致后者加速凋亡。本实验即对CD8+T细胞分化诱导靶细胞凋亡的具体机制进行分析，明确慢性ACD模型小鼠病变组织里面形成的Fas/FasL表达水平，进而可以研究药物对其表达的产生的影响效果。通过动物ACD模型来研究中药药效的具体方法及模式目前已经相对成熟，在指标选定以及实验方法上具有一致性，一般都是将鼠确定成研究对象，在评价炎症轻重程度上，是选择左右耳重量或者是厚度作为参考指标，而检测药物对超敏反应的抑制程度则是可以脾指数或胸腺指数为指标，在不同实验当中，其差异性只是集中在药物选择上。应用分子生物学以及免疫组织化学等先进实验方法，可以完成对传统中草药的疗效机理进行分析，从而能够更为具体且直观的表现出中医药的作用特征，包括多途径、多靶点、多环节以及多因素等，可以给中医药治疗ACD创造条件支撑，并有效应用到临床治疗领域当中。在现代中医学看来，湿疹的病因在于先天禀赋不足，饮食不节，进而伤及脾胃，脾失健运，不能运化水湿，日久化热，而致湿热内蕴，复外感风湿热邪，风热搏结，浸淫肌肤，出现渗出、水泡、糜烂等皮肤炎症。湿疹以风、湿、热、毒为患，血中热毒是很重要的因素，且慢性湿疹不仅应从“湿热”论治，久病耗气伤血，致血虚生风化燥，也是其发病因素之一。“益气祛风汤”是从事中医科研及临床工作三十余年的陈以国教授，根据多年经验总结而成的，并在临床应用上取得了显著疗效。针对慢性ACD皮肤瘙痒、干燥、脱屑、苔鲜样变等特征，辨证以气虚风燥为本，以益气祛风、清热止痒为基础立法组方，具体组成：生黄芪30g、焦白术15g、防风10g、黄芩20g、白僵蚕10g、乌梅15g、白蛇舌草40g、蝉蜕10g、炙甘草10g。其中，以生黄芪、焦白术共为君药，健脾益气，燥湿利水，此外，黄芪亦有“疮家圣药”之称，以其补气之功展托毒生肌之效，补气以生血，血行则风自灭，为治疮之首选；黄芩、防风、白僵蚕、蝉蜕四者共为臣药，清热解毒，祛风止痒，性平缓而祛内生之风燥；白花蛇舌草功用消肿利湿、清热解毒；乌梅外用以消疮毒，敛疮生肌；炙甘草调和诸药，清热解毒。曲池、血海、天井三穴组合是导师用以滋阴养血、清热 ‐8 ‐ 祛风的基本方，疗效显著。曲池为手阳明大肠经合穴，取其清泄热毒之效；血海归足太阴脾经，功用清热活血；天井，手少阳三焦经合穴，意在行气散结。针药并举共奏祛风除湿，清热解毒之效。本实验拟建立小鼠慢性ACD模型，并采用组织形态学及免疫组化法等现代技术对针药结合的方法进行药效学及其机理的探究，观察其对慢性ACD模型的抑制作用，同时针对慢性ACD的发病机理,探讨其对细胞因子Fas及FasL表达的影响。通过本实验，我们将进一步明确针刺曲池、血海、天井三穴结合益气祛风汤的疗效，并探讨其免疫学机制，为临床更好地应用针药结合的方法治疗慢性ACD提供客观依据。 ‐9 ‐ 针刺结合益气祛风汤对慢性ACD小鼠耳重量差及其病变组织中Fas/FasL表达的影响接触性皮炎(CD)具体指的是皮肤后者是黏膜在与外界致敏性物质直接[1]接触之后，所产生的一种炎症反应。根据发病机理可以将其划分为两个类型，分别是刺激性接触性皮炎（ICD）和变应性接触性皮炎（ACD）。其中，ICD具体指的是受到较强刺激性物质的刺激，也可以是部分低浓度物质，比如强碱、强酸等，在接触皮肤一定时间或者是一定的浓度之后，可以在接触部位短时间之内形成急性炎症症状，最短可为几分钟；而ACD则具体指的是在接触致敏物质之后再接触到相应的过敏原，从而在局部出现炎症病变，被归入Ⅳ型超敏反应，属于皮肤科一种常见病与多发病常，它的发生常与个体的易感性、接触物的致敏力及浓度有关，而临床上常见的皮炎类型就是这种类型。ACD作为一种抗原特异性过敏反应，需要有T细胞介导，所接触的多是小分子半抗原物质，比如燃料、化妆品、农药等。并以局部皮肤表现出炎症细胞浸润、炎症介质释放等症状为特征。引起ACD的致敏物多是低分子物质,常为半抗原。体内蛋白质和小分子半抗原进行结合之后能够产生一种完全抗原，然后通过朗格汉斯细胞摄取以及呈送至T细胞，对其产生激发活化的影响，出现效应T细胞；在机体与抗原再次接触之后，就会出现炎症情况，比如皮肤产生皮疹以及水痘等。在发生的时候具体会经过两个主要阶段：第一，致敏期，也可以说是诱导期。一般机体首次接触致敏原是在四天左右，而首次接触致敏原至形成超敏反应则应持续五天以上；第二，激发期，也叫作反应期。如有充足的潜伏期(4～25天)或已发生过炎症反应，则此时机体内存在足够致敏的T淋巴细胞,当再次接触相应抗原后，局部皮肤于24～48小时内即可发生一系列炎症反应。1.实验材料1.1实验动物及饲养环境采用60只健康雄性昆明种小鼠，体重（20±2）g，由辽宁长生生物科技有限公司购进。实验所需的小鼠饲养在清洁的动物房内,温度(20±2)℃，湿度(40±5)%，常规喂食喂水,定期更换清洁的笼具、垫料,实验开始前12h禁食不禁水。 ‐10 ‐ 1.2实验药品及制备益气祛风汤组成：生黄芪30g、焦白术15g、防风10g、黄芩20g、白僵蚕10g、乌梅15g、白蛇舌草40g、蝉蜕10g、炙甘草10g。组方中草药均使用其相应颗粒剂（商品名：中药配方颗粒，北京康仁堂药业[2]有限公司生产），根据体表面积折算法，按成人每天用药的等效计量制备颗粒剂悬浊液，用加热的蒸馏水调匀制成其悬浊液，浓度为1.6g/ml，冷却后，经灌胃给药，剂量为0.4ml/只。氯雷他定溶液：氯雷他定片（商品名：彼赛宁，国药准字H20030213，浙江[2]京新药业股份有限公司生产），根据体表面积折算法，按成人每天用药的等效计量制备其悬浊液，用蒸馏水调匀制成悬浊液，浓度为0.063g/ml，经灌胃给药，剂量为0.4ml/只。1.3主要试剂本次试验使用的主要试剂包括：由辽宁中医药大学实验中心提供的丙酮（厂家：中国上海试剂总厂；批号:GB686-89）、2,4-二硝基氯苯（厂家：上海统亚化工科技发展有限公司；批号：966174）；购自超市的橄榄油（商品名：LaTourangelle拉杜蓝特级初榨橄榄油，以4:1的丙酮橄榄油混合液分别配制成0.5%和7%的DNCB溶液）；由上海歌凡生物科技有限公司提供免疫组化试剂盒（生产批号：RA1507）。包括：一抗、二抗试剂盒（山羊抗小鼠亲和纯化抗体、正常血清封闭液、SABC)；蒸馏水、PBS缓冲液、DAB显色试剂盒、中性树胶、枸橼酸缓冲液等。1.4仪器及设备由北京赛多利斯仪器有限公司生产的电子分析天平（BT-125D型，0.001g-220g）；由法国捷安公司生产的超速离心机（型号C-412）；由上海沪西分析仪器厂生产高速匀浆仪机（IKAT10basic）；由上海跃进医疗器械厂生产的数码显微镜（型号：LEICADM2000）由；上海跃进医疗器械厂生产的电热恒温培养箱（HH·B11·500型）；购自日本的针灸针（KB短针，规格为0.12mm×7mm）；由天津奥特塞恩斯仪器有限公司生产的电针仪（6805-A型）；由深圳市九钰电器厂生产的九钰宠物电推剪（型号PHC-815-5）；自制的束缚板（长50cm,宽40cm，厚3cm）；由辽宁中医药大学动物实验室提供耳肿打孔器、镊子、眼科剪、湿盒、玻片架、染片缸、盖玻片等器材。 ‐11 ‐ 2.实验方法2.1实验分组将60只小鼠随机分为6组，每组10只，分别为：空白组、模型组、益气祛风汤组（中药组）、针刺组、针刺结合益气祛风汤组（针药组）、氯雷他定组（西药组）。2.2小鼠慢性ACD模型的建立[3]建立慢性ACD小鼠模型，各组小鼠均在其背部2cm×3cm处脱毛，实验第一天（致敏期），用加样器量取7%的DNCB溶液25μL，涂抹于各实验组小鼠背部以致敏，第二天重复1次。5天后（诱发期）取0.5%浓度的DNCB溶液5μL，充当小剂量抗原，在小鼠右耳的外侧涂抹，以达到激发目的。一共需要反复激发四次，每次间隔三天。在末次激发之后的三天，就可以建立起来小鼠慢性ACD模型。而空白组小鼠则是将同样数量的蒸馏水涂抹在右耳的外侧。2.3给药方法从致敏之前的一天进行给药，各个实验组的小鼠都是每天给药一次，剂量保持在0.4ml，连续给药，并于末次激发后6小时再给药一次。中药组及针药组给予益气祛风汤，阳性药物组给予氯雷他定，其余三组均给予等量蒸馏水。2.4针刺方法针刺组采用针刺加电针的方法治疗，根据老师多年临床经验总结，本次选择了曲池、血海以及天井这几个穴位，并对比《实验针灸学》以及动物比较学进行针刺方法确定。操作方法：将小鼠固定后，使用0.12×7mm的毫针，曲池穴直刺2-3mm，血海穴直刺2-3mm，天井穴直刺1.5-2mm，针刺后，将针固定，连接6805-A型电针仪，接通电源，施以频率为3-4Hz，强度为1.5-2.5V的连续波实施治疗，刺激强度达到小鼠尾尖轻颤同时处在安静状态为准，每日一次，每次留针15min，于实验开始第一天起连续针刺。2.5取材及检测2.5.1耳重量差于末次激发后72小时采取颈椎脱臼的方式将各组小鼠处死，然后第一时间用医用剪刀将双耳剪下来，以0.9cm直径金属打孔器各自在耳上打孔，通过电子 ‐12 ‐ 天平将耳部组织重量确定下来，以计算其左、右耳片的重量差。2.5.2免疫组织化学于末次激发后72小时颈椎脱臼处死各组小鼠以取材测定指标。用耳肿打孔器取各组小鼠的病变耳组织,使用免疫组化的方法检测各组小鼠病变耳组织炎症区域Fas/Fasl的表达。免疫组织化学实验步骤如下：第一步，脱水：取出固定好的小肠组织，自来水流水下充分冲洗，然后采用梯度浓度的乙醇对固定好的组织进行脱水，即乙醇浓度由低到高，逐层将组织中水分以乙醇置换出来。一般乙醇的浓度为50%、70%、80%、95%（2次）、100%（2次），将组织按照上述浓度梯度的顺序，逐个浸入各级浓度的乙醇中，每个浓度的乙醇浸泡组织的时间以3h为宜，该步骤不需人工完成，只需设定好全自动脱水机的程序，然后脱水机会按照程序在相应时间节点上自动更换相应浓度的乙醇。第二步，透明：次日，将组织块从脱水机中取出，浸入二甲苯中透明，透明步骤直接关系浸蜡效果的好坏，一般以二甲苯浸泡60min，然后更换新的二甲苯，再次浸泡60min，共两次为宜。第三步，浸蜡与包埋：将石蜡块在包埋机中融化，温度55-60℃，将固定好的组织浸入融化的石蜡中，浸蜡需要重复2-3次，每次40分钟左右，总时间约为3小时。然后进行包埋，将蜡块模具放置到包埋机制冷板上，先少量滴加融化的石蜡，在石蜡未完全凝固前，将浸蜡充分的组织立于模具内，待模具底部的石蜡完全凝固后，继续加入新的液态石蜡，淹没整个组织块，然后将包埋框反向固定在模具上，包埋框中继续加入石蜡，待整个蜡块完全凝固后，将模具取下，即为包埋好的蜡块。第四步，切片：首先需要将蜡块表面修理平整，切片机的切片厚度调整为10μm，对蜡块进行粗略休整，直到切下的石蜡薄膜上面可见少量组织时，再将切片机的切片厚度调整为5μm，继续休整蜡块，待肉眼观察切下的石蜡薄膜所涵组织面完整，即可进行切片，切片厚度为4-5μm。将切片薄膜平摊在摊片机中（水温55-60℃），在水面张力的作用下，石蜡薄膜被展平，以载玻片从石蜡薄膜所在位置的正下方水底部缓缓向上捞出薄膜，使薄膜附着在载玻片中央位置，最后将载玻片放置在烤片机上进行烘烤2小时以上。第五步，脱蜡：脱蜡步骤与脱水和透明的步骤反向，首先是二甲苯，然后是 ‐13 ‐ 梯度乙醇（100%、95%、80%、70%、50%），二甲苯脱蜡需要重复一次，每次20分钟，梯度乙醇每个浓度只需浸泡1次，每次5分钟。最后在蒸馏水中浸泡5分钟。第六步，在3%浓度的H2O2去离子水里面孵育，时间是15分钟左右，从而能够去除内源性过氧化物酶活性。第七步，滴入试剂A，在室温条件下孵育15分钟，倒掉试剂，不可冲洗。第八步，滴入已经稀释完成的一抗工作液，在37℃环境下孵育2个小时。第九步，使用PBS冲洗三分钟，反复三次。第十步，滴入试剂B，在室温或者是37℃环境下孵育15分钟。第十一步，使用PBS冲洗三分钟，反复三次。第十二步，滴入试剂C，在室温或者是37℃环境下孵育15分钟。第十三步，使用PBS冲洗三分钟，反复三次。第十四步，使用显色剂显色。第十五步，使用自来水多次冲洗。第十六步，使用苏木素复染，并用盐酸酒精分化。第十七步，透明并封片。第十八步，测定平均光密度值。在对切片进行染色处理之后，选定染色状况较好的区域，通过LeicaQ550CW图象采集分析系统对切片进行观察，分别选择五个彼此不存在重叠的视野区域，然后测量单位面积之内的阳性细胞表达情况，并取五个视野的平均光密度值为该蛋白的相对表达水平。2.6统计学方法用SPSS17.0forwindows进行统计学分析，统计数据用（X士S）表示,先进行实验数据的方差齐性检验,再使用完全随机设计的方差分析法针对不同组[4]间实施两两对比。 ‐14 ‐ 结果1.针刺结合益气祛风汤对于慢性ACD模型小鼠耳重量差产生的影响各组慢性ACD模型小鼠耳重量差的比较如表1-1,图1-1。表1-1慢性ACD模型各组小鼠耳重量差的比较（X±S）分组n右耳（mg）左耳（mg）重量差（mg)空白组1067.7±5.7966.3±6.021.4±2.46模型组10161.6±16.1564.8±4.5496.8±17.52▲针刺组10147±23.6762.6±5.6684.4±24.06▲中药组10151.3±21.0569.7±5.7481.6±19.78▲针药组10145.9±16.9470.3±5.6475.6±18.03*西药组10140.5±16.9765.3±6.8375.2±21.03△注：▲与空白组比较，P<0.01；▲与模型组比较，P>0.05；*△与模型组比较，P<0.05；*与氯雷他定组比较，P>0.05。图1-1慢性ACD模型各组小鼠耳重量差比较通过上表能够发现，在耳重量差值对比分析的过程当中，模型组显著高于空白组（P<0.01）；氯雷他定组及针药组均明显低于模型组（P<0.05）；针刺组及中药组与模型组相比较均无显著差异（P>0.05）；针药组与氯雷他定组比较无 ‐15 ‐ 明显差异（P>0.05），说明针刺结合益气祛风汤组及氯雷他定组对于小鼠的慢性ACD都有显著的抑制作用，并且针刺结合益气祛风汤组与氯雷他定组二者之间无显著性差异。2.各组慢性ACD模型小鼠耳病变皮肤组织中Fas、Fasl的表达情况于各实验组的10只小鼠中随机抽取6只进行其病变皮肤组织中Fas/FasL表达情况的检测。各组小鼠的耳病变皮肤组织中Fas的表达情况，如图2-1～图2-6。通过观察结果能够发现，空白组的表皮以及真皮的角质形成细胞的胞浆里面会有一定数量棕黄色颗粒，同时染色深度不高（见图2-1）；而慢性ACD模型组表皮呈现出的阳性表达较弱，而真皮呈现出的阳性表达水平则有显著提升，同时胞浆里面存在大量棕黄色颗粒,于个别胞核内可见较弱的阳性表达(图2-2)；针药组的真皮呈阳性表达，且胞浆及细胞核内可见棕黄色颗粒,且与模型组比较明显增多(图2-3)；氯雷他定组、针刺组及中药组的图片表现与模型组类似(图2-4～图2-6)。图2-1空白组小鼠耳病变皮肤组织里面Fas表达水平（可见少量散在的棕黄色颗粒且染色较浅） ‐16 ‐ 图2-2模型组小鼠耳病变皮肤组织里面Fas表达水平（胞浆及个别细胞核内可见棕黄色颗粒）图2-3针药组小鼠耳病变皮肤组织里面Fas表达水平（胞浆及胞核内可见棕黄色颗粒） ‐17 ‐ 图2-4氯雷他定组小鼠耳病变皮肤组织里面Fas表达水平（胞浆及个别细胞核内可见棕黄色颗粒）图2-5针刺组小鼠耳病变皮肤组织里面Fas表达水平（胞浆及个别细胞核内可见棕黄色颗粒） ‐18 ‐ 图2-6中药组小鼠耳病变皮肤组织里面Fas表达水平（胞浆及个别细胞核内可见棕黄色颗粒）各组小鼠的耳病变皮肤组织里面FasL表达情况具体可见图2-7～图2-12所示。通过观察能够发现，空白组真皮角质产生的细胞胞浆里面能够观察到一定数量的棕黄色颗粒，分散且染色不深（图2-7）；而慢性ACD模型组表皮呈现出的阳性表达水平不高，然而真皮则呈现出显著的阳性表达，同时能够在胞浆里面观察到大量的棕黄色颗粒，在个别的细胞核里面还可以发现呈弱阳性表达的棕黄色颗粒（图2-8）；针药组表皮与真皮胞浆以及细胞核里面都能够发现有阳性表达水平的棕黄色颗粒，和模型组对比而言，数量明显更多，至于其他三组的表皮阳性表达则都是趋弱，同时真皮阳性表达情况与模型组相似(图2-10～2-12)。 ‐19 ‐ 图2-7空白组小鼠耳病变皮肤组织里面FasL表达水平（可见少量散在的棕黄色颗粒,染色较浅）图2-8模型组小鼠耳病变皮肤组织里面FasL表达水平（在胞浆及个别细胞核里面能够发现棕黄色颗粒） ‐20 ‐ 图2-9针药组小鼠耳病变皮肤组织里面FasL表达水平（在胞浆及胞核内能够发现棕黄色颗粒）图2-10氯雷他定组小鼠耳病变皮肤组织里面FasL表达水平（在胞浆及个别细胞核内能够发现棕黄色颗粒） ‐21 ‐ 图2-11针刺组小鼠耳病变皮肤组织里面FasL表达水平（在胞浆及个别细胞核内能够发现棕黄色颗粒）图2-12中药组小鼠耳病变皮肤组织里面FasL表达水平（在胞浆及个别细胞核内能够发现棕黄色颗粒）Fas、FasL表达的积分光密度值比较如表2-1、图2-13。 ‐22 ‐ 表2-1耳组织Fas、FasL表达的积分光密度值比较(X士S)分组nFasFasL空白组60.12±0.0130.12±0.011模型组60.33±0.032▲0.33±0.039▲针刺组60.27±0.023▲*0.24±0.017▲*中药组60.25±0.019▲*0.25±0.031▲*针药组60.19±0.019▲*0.20±0.027▲*西药组60.19±0.018▲0.21±0.024▲注：▲与空白组比较，P<0.01；*与模型组比较，P<0.01；▲与模型组比较，P<0.01；▲与针药组比较，P>0.05。图2-13各组耳组织Fas、FasL表达的积分光密度值比较通过表2-1能够发现：模型组小鼠的耳病变皮肤组织中Fas及FasL的表达均增加；针刺结合益气祛风汤组能够显著上调耳病变皮肤组织里面的Fas与FasL表达水平，而氯雷他定组针对小鼠耳病变皮肤组织里面的Fas与FasL表达水平影响并不明显，同时针刺结合益气祛风汤组与氯雷他定组二者之间无显著差异。 ‐23 ‐ 讨论1.小鼠慢性ACD模型的选择早在几十年前就已经是采用二硝基氟苯(DNFB)或二硝基氯苯(DNCB)建立小鼠慢性ACD模型，目前是医学免疫学领域分析Ⅳ型超敏反应最常用、也是最有效的模型。一般在ACD模型当中都是以耳廓为靶部位，因其具有在抗原激发时炎细胞浸润量大，同时还可以免去剃毛环节。所以，在本次试验当中是使用DNCB致敏并激发的方式来完成造模。在临床治疗过程当中，因为ACD经常会多次发作，时间长了就会演化为慢性皮炎-湿疹，同时在病发的时候没有明显的抗原接触史。国外学者Boyera构建了[5]豚鼠耳廓慢性接触性过敏反应模型，国内学者则是在构建了小鼠耳廓慢性皮炎-湿疹模型，能够用以更准确地评估不同药物的作用。动物慢性皮炎-湿疹模型通常在构建的时候选在致敏数天之后，采取低浓度抗原多次激发的方法一般20天左右可以成模，且动物的耳廓常为其激发部位。成模后，小鼠耳廓出现肿胀、增厚、角化或表面结痴等症状,较之急性ACD模型其与慢性ACD的相似性更强。2.检测指标的选择应用DNCB致敏检测的时候，小鼠耳廓皮肤一般会有肿胀与发红的现象，然后是角质化和变厚。所以，在实践当中一般是按照耳廓红肿与角化程度来完成ACD评分，同时还要测量激发前后耳重以及厚度等，通过差值来明确炎症发生水平，并分析耳廓病变组织的单位炎细胞数量针对药效做出评价。因为皮损程度评分还有耳廓厚度测量会有一定的主观认为因素，因此在实验中将双耳廓的重量差作为炎症抑制水平的评价指标。每个免疫应答过程都需要由多个细胞与因子的共同参与其中。而在炎症的初始时期，变应原对于皮肤产生刺激作用，于是角质会形成细胞及朗格汉斯细胞，并分泌出多种类型的炎症前因子，然后将淋巴细胞以及多形核细胞等聚集起来，形成局部接触，进而出现炎症反应。所以，通过对研究局部病变组织里面的细胞因子进行分析，评价其表达水平，能够直观的体现出局部病变的具体机理。 ‐24 ‐ 在ACD病发的不同阶段会有多种类型的细胞因子参与。这些不同的细胞因子彼此之间既有协同作用，也会相互拮抗；既会共同促进，也会互相排斥，形成负反馈调节。所以，这就形成了新的网络化结构。在临床领域伴随对IV型超敏反应的认知逐渐深化，发现了一些具有相关性的细胞因子，这使得作用机理得以逐渐明确化。Fas基因处在10号染色体长臂，其具体包括了335个氨基酸，由此形成了糖基化受体蛋白，也就是Fas蛋白(CD95)。其相对分子量约为45000个，都是属于TNF/NGF受体超家族。在主要细胞方面是由三个部分构成：第一，胞内区，包括145个氨基酸，这里面的信号传导区则包括了70个氨基酸，在序列上十分稳定，属于典型的死亡结构域，能够为凋亡信号传导提供必要条件。如果该功能区[7]出现异变，那么Fas介导凋亡也就会不复存在；第二，“跨膜区”，包括了21个氨基酸，能够直接决定Fas分子相关特征。如果Fas基因转录过程当中失去能够影响跨膜区的碱基对，那么就会翻译合成没有跨膜区的Fas蛋白，也就是游离Fas(sFas)，主要是处在血浆或者是体液里面，具备可溶性。膜Fass与sFas[8]进行全面结合与竞争，能够对Fas介导产生阻断影响，进而导致细胞凋亡；第三，胞外区。包括了157个氨基酸，具有“死亡信号激发域”的称谓，可以和FasL相结合，然后启动Fas介导，进而导致细胞出现凋亡。Fas分子作为一种特异性抗原，一般是在活化T淋巴细胞的表层有表达，再就是活跃在外周血中性粒细胞当中，通常认为是与不同组织对应的组织学特征存在关系。除此之外，伴随细胞分化程度的持续提升，Fas表达水平也会有所增强，最终以凋亡的形式清除。FasL基因位于1号染色体,其编码的蛋白质(CD95L)含279个氨基酸,相对分子量为31000，属TNF家族,为Ⅱ型跨膜蛋白。其结构：胞内为由77个氨基酸组成的FasL肽链的N末端,跨膜区含22个疏水性氨基酸,C末端位于胞外,含179个氨基酸。FasL大量存在于活化T细胞表层，还有就是角膜组织或者是甲状腺细胞里面也有一定表达水平[9]。HLA抗原能够T细胞产生激活作用，然后表达FasL。而免疫系统则可通过CTL表达的FasL与肿瘤细胞表面的Fas结合,致使肿瘤细胞凋亡。此外，某些恶性肿瘤细胞不但能够将Fas表达水平调低，同时还可以促使FasL表达，于是产生免疫细胞凋亡，最终导致恶性肿瘤免疫逃逸，人体 ‐25 ‐ [10,11]免疫机制失衡。金属蛋白酶类能够分解出于膜结合的FasL，即可溶性[12]FasL(sFasL),但其作用目前尚不清楚。总而言之，Fas与FasL分别是肿瘤坏死因子与神经生长因子的表层因子。FasL和受体Fas结合之后，可以促使包含有Fas的细胞出现凋亡。在免疫系统里面，Fas与FasL都参与到了T细胞毒作用，并促使免疫反应下调。Fas和FasL相互而结合，也是导致T细胞凋亡的一个重要原因。在T细胞出现活化的时候，TCR和MHC分子可与抗原肽结合，且CD4与MHCⅡ类分子结合或CD8与MHCⅠ类分子结合加速TCR结合，于是对T细胞产生活化作用，加剧Fas与FasL分子表达速度。除此之外，Fas系统可以将过度激活的免疫活性细胞去除，于是减少免[13]疫反应。3.中草药的选择陈以国教授根据多年临床经验，总结出益气祛风汤一方，方中黄芪，性微温，味甘，归脾、肺经，具有补脾肺气，益气固表，升阳举陷，利水消肿，托疮生肌[14]等功效。其药理作用有扩血管、强心、利尿、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等。白术，性温，味甘、苦，归脾、胃经，具燥湿利水，益气健脾，止汗安胎等功效。其药理作用有镇静、利尿、提高机体免疫力、降血糖、保肝、抗凝血，抗[15]菌等。防风，性温，味辛、甘，归肝、脾、膀胱经，具有胜湿止痛，止痉，祛风解表，止泻等功效，有着“风药中之润剂，治风之通药”的美称。其药理作用有解[16]热、镇痛、镇静、抗炎、抗菌、抗病毒、抗过敏、调节免疫等。黄芩，性寒，味苦，归脾、肺、小肠、大肠、胆、膀胱经，具有凉血止血，泻火解毒，清热燥湿，安胎的功效。其药理作用有抗炎、抗病毒、解热镇痛、抗[17]氧化、抗肿瘤等作用，对免疫系统、神经系统、肝脏等也具有保护作用。僵蚕，原名白僵蚕，性平，味咸、辛，归肝、脾经，具有化痰散结，祛风通络，熄风止痉的功效。其药理作用有抗惊厥、镇静催眠、抗凝、抗血栓、降糖降[18]脂、营养神经等。蝉蜕，性微寒，味甘、微辛，归肺、肝经，具有透疹止痒，清肝明目，疏散风热，熄风止痉等功效。《医学衷中参西录》:“善托隐疹外出,有以皮达皮之力，故又为治隐疹要药。”其药理作用有抗过敏、镇静、解热、镇痛、抗惊厥、免疫 ‐26 ‐ [19,20]抑制等。白花蛇舌草，性寒，味微苦，归肺，胃，小肠经。具有清泄热毒、利尿通淋[21]等功效。其药理作用有抗炎、抗菌、镇静、镇痛、增强免疫功等。乌梅，性平，味酸，归大肠、肝、肺、脾经。具有生津止渴，涩肠止泻，敛肺止咳，安蛔止痛的功效。其药理作用为抗菌、镇咳、镇静、抗惊厥、抗纤维化、[22]抑制黑色素、抗生育、抗肿瘤、抗结石、协同降脂等作用。炙甘草，性微寒，味甘，肺、胃、心、脾经。具有清热解毒，缓急止痛，补脾益气，祛痰止咳，调和诸药等功效。其药理作用有抗炎、镇咳平喘、镇痛、抗[23]心律失常、调节免疫等。本实验研究的益气祛风汤以生黄芪、焦白术共为君药，益气健脾，利水燥湿，此外，黄芪亦有“疮家圣药”之美称，以其补气之功收展毒生肌之效，“补气以生血，血行风自灭”，为治疮之首选；防风、黄芩、蝉蜕、白僵蚕四者共为臣药，祛风止痒，清热解毒，性平缓而祛内生之风燥；白花蛇舌草清泄热毒、消肿利湿；乌梅外用敛疮生肌，消疮毒；炙甘草调和诸药，同时又有清热解毒之效。4.穴位的选择针灸治病的方法历史悠久，是传统的中医特色疗法，具有疗效好，经济安全，无毒副作用等优点,被广泛应用于临床治疗急慢性疾病。本实验选取曲池、血海、天井三穴用以治疗慢性ACD。其中，曲池穴为大肠经合穴，阳明经多气多血,具有较强的活血通络和调节大肠腑气的作用，且肺与大肠相表里，大肠腑气通畅，可调节肺的生理功能，肺主一身之皮毛，针刺曲池[24]穴可调肺气,加强解肌透表的作用,故取曲池穴治疗皮肤瘙痒疗效显著。《针灸资生经》:“曲池，以刺风瘾疹。”《神应经》:“热风瘾疹，肩髃曲池主之。”血海穴归属足太阴脾经，具有解毒止痒，活血健脾，熄风祛湿的作用，皮肤瘙痒、湿疹、荨麻疹等症状多为风热挟湿、血虚风燥所致，故根据“治风先治血,血行风自灭”的理论,可选取此穴。《医宗金鉴》中提到，血海可治男子肾脏风及两腿疮疡湿痛等病症。《胜玉歌》：“热疮臁内年年发，血海寻来可治之。”天井穴为三焦经合穴，具有行气散结，安神通络等作用，临床可治疗癫痫、郁证、偏头痛、颊肿痛、瘰疬、胞肿瘾疹、疮肿、咳吐脓血、心痛、胁肋、颈项、肩臂麻木痛等病症。《医宗金鉴》：“主治瘰疬，瘾疹。” ‐27 ‐ 三穴组合是导师用以行血活血、清热祛湿的基本方，疗效显著。一些实验研[25]究表明,用针刺的方法治疗过敏性皮肤病变确有独特疗效,如日光性皮炎、接触性皮炎、过敏性紫瘫、荨麻疹、疥疮等。5.中医学对本病的认识中医对湿疹的认识由来已久，许多古书籍对其记载良多。一般认为“疮”为本病的急性期表现，“癣”为慢性期表现。《素问·至真要大论》：“诸痛痒疮，皆属于心”“诸湿肿满，皆属于脾”，就认识到脏腑与皮损发病存在内外的密切关系。《诸病源候论·疮候》：“疮者，由肤腠虚，风湿之气，折乎血气，结聚所生，⋯⋯递相对，如新生茱萸子。痛痒搔抓成疮，黄汁出，浸淫生长，折裂，时瘥时剧。”《诸病源候论·湿癣候》：“湿癣者，亦有匡郭，如虫行，浸淫，亦湿痒，搔之多汁成疮，是其风、毒气浅，湿多风少，故为湿癣也。”清代《医宗金鉴·外科心法要诀》：“此证初生如疥，瘙痒无时，蔓延不止，抓津黄水，浸淫成片，由心火脾湿受风而成。”是对浸淫疮的记载。黄水疮：“此证初生如粟米，而痒兼痛，破流黄水，浸淫成片，随处可生。由脾胃湿热，外受风邪，相搏而成。”由此可见，古人对本病的发病机理已有一定的认识，但尚无明确的辨证及治疗的标准。中医对湿疹的命名，一般可分为局限和泛发两大类。如泛发全身，渗水极多，浸淫遍体者为“浸淫疮”；瘙痒极甚，周身红粟遍起者为“粟疮”；抓之出血者为“血风疮”；局限于一处者为“湿毒疮”等。由于发病部位不同，又有不同名称：如发于耳廓者为“旋耳疮”；发于手背者为“疮”；发于小腿者为“湿臁疮”；发于阴囊部为“肾囊风”或“胞漏疮”；而发于脸部的脂溢性湿疹则为“面游风”等。此外，婴幼儿湿疹称为“胎疮”或“奶癣”等。中医学认为，湿疹乃禀赋不耐，风热湿毒客于肌肤而成；或脾失健运、营血不足，以致湿热稽留，血虚风燥，而风燥湿热郁结、肌肤失养所致。急性湿疹多责之于心，亚急性或慢性多责之于肝、脾。本病各发展阶段症状不同，其病机亦有所改变。发病初起原为风湿热邪客于肌肤；随着病情的进展，湿热蕴结于内，熏蒸于外，或毒热存于血中，此阶段多与心、肝有关；病期迁延，湿热留恋，久恋成瘀，或血热搏结成瘀，而有风湿热瘀并重之势；后期，风热伤阴化燥，血行不畅，瘀阻经络，以致气阴两虚、血虚风燥而血不营肤。 ‐28 ‐ 6.ACD与慢性皮炎-湿疹在ACD病发之后，如果可以在短时间就明确病因然后祛除，并针对病变部位进行适当清洁处理以及做好其他保护措施，那么程度较轻的完全能够自行治愈，而程度较重的也可以在一到两周之内痊愈。然而在生活当中因为存在的致敏原难以被及时确定，导致皮肤连续的接触到致敏原，或者是在皮炎的影响下出现瘙痒感，患者忍受不住会进行摩擦与搔抓，有的还会用碱性香皂清洗病变部位，于是使得皮炎程度加剧，时间长了就会形成湿疹样变，继而转变为湿疹样皮炎(慢性皮炎-湿疹)。近年来，一些国外学者常将ACD和湿疹样皮炎作同义词理解，但许多国内研究人员却认为，湿疹样皮炎应该是建立在皮炎之上的一种继发性湿疹样变，也就是皮炎能够被升级成湿疹，至于湿疹则无法转变成皮炎，两者不存在相互转化的[26]关系。在临床实践当中，经常遇到的大部分都是湿疹样皮炎，至于早期变应性接触性皮炎则很少能够遇到。所以，针对药物作用于湿疹样皮炎的机理进行研究也就具备了现实价值。而这也是本次试验研究的主旨。7.实验结果分析通过实验结果能够发现：针刺结合益气祛风汤对慢性ACD模型小鼠的耳重量差有明显的抑制作用，且与氯雷他定组之间无明显差异。从免疫反应的启动调控及细胞凋亡的调控角度看，针刺结合益气祛风汤可明显上调病变组织中Fas、FasL的表达，使组织里面的Fas以及FasL都出现表达水平提高的现象，加快Fas和FasL之间的结合速度，形成靶细胞凋亡。这可能是针药结合抑制慢性ACD，同时改善其局部症状的一个重要机制。结论第一，针刺结合益气祛风汤对慢性ACD模型小鼠的病变皮肤组织有明显的抑制作用。第二，针刺结合益气祛风汤可降低慢性ACD模型小鼠双耳的重量差。第三，针刺结合益气祛风汤可明显上调慢性ACD模型小鼠病变皮肤组织中Fas/Fasl的表达。 ‐29 ‐ 参考文献[1]欧阳恒,杨志波,间亚平.湿疹的诊断与治疗.北京:人民军医出版社,2004:4.[2]陈奇主编.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社,1993:1103.[3]金慧玲,张汝芝,余其斌.小鼠慢性皮炎-湿疹模型的建立.蚌埠医学院学报.2002,27(3):193～194.[4]陈平雁主编.SPSS13.0统计软件应用教程.北京:人民卫生出社,2005:132～125.[5]BoyeraN,CaverD,BouclierM,etal.ReperaterapplieationofDini-troehlorobenzetotheearsofensitizedguilleaPigs:APreliminarycharacterizationofaPotentialnewanimalmodelforcontacteezemainhumansSkinPharmacol.1992,5(3):185.[6]王国江,顾军.小鼠背部变应性接触性皮炎模型的建立.中国职业医学.2004,31(l):17～19.[7]PeterME,HeufelderAE,HengartnerMD.Advancesinapoptosisresearch.ProcNatlAcadSci,1997,94:12736～12737.[8]RobersonMJ,ManleyTJ,DichertG,etal.FunctionalconsequencesofAPO-1/Fas(CD95)antigenexpressionbynomalandneoplastichemato-poieticcells.LeukLymphoma,1995,17:51～61.[9]OrlinickJR,VaishnawAK,ElkonKB.Struc-tureandfunctionofFas/Fasligand.IntRevIm-munol,1999,18:293～308.[10]HahneM,Rimoldid,SchroterM,etal.MelanomacellexpressionofFas/APO-1(CD95)ligand:implicationfortumerimmuneescape.Scien-ce,1996,274:1363～1369.[11]O'ConnellJ,BennettMW,O'SullivanGC,etal.ResistancetoFas(APO-1/CD95)mediatedapoptosisandexpressionofFasligandinEsoph-agealcancer:theGascounterattack.DisEsophagus,1999,12:83～89.[12]TanakaM,SudaT,HazeK,etal.Fasligandinhumanserum.NatMed,1996,2:317～321. ‐30 ‐ [13]陈慰峰主编.医学免疫学,北京:人民卫生出版社,2006:155～156.[14]唐立明.中药黄芪的现代医学临床应用和研究进展[J].中医临床研究,2013,5(3):117～120.[15]阳柳平.研究白术的化学成分及药理作用概况[J].中国医药指南，2012，10（21）：607～608.[16]窦红霞,高玉兰.防风的化学成分和药理作用研究进展[J].中医药信息,2009,26（2）:15～17.[17]肖灵芝.中药黄芩的药理和应用[J].中医临床研究,2014,6(3):133.[18]李晶峰，孙佳明，张辉等.僵蚕的化学成分及药理活性研究[J].吉林中医药，2015,35（2）：175～177.[19]李晓军,郭玉成等.蝉蜕在皮肤病中应用[J].承德医学院学报，2005，22（4）：319～320.[20]李俊义.蝉蜕的临床应用和药理作用[J].内蒙古中医药,2011,12:89.[21]纪宝玉,范崇庆,裴莉昕,马瑜等.白花蛇舌草的化学成分及药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2014,20（19）:235～240.[22]杨莹菲,胡汉昆,刘萍,刘巍,刘薇芝.乌梅化学成分、临床应用及现代药理研究进展[J].中国药师,2012,15(3):415～418.[23]张玉龙，王梦月，杨静玉等.炙甘草化学成分及药理作用研究进展[J].上海中医药大学学报,2015，29(3):99～100.[24]刘红，杨贤海，张国胜等.艾灸温通血海、曲池治疗皮肤病4则[J].中国中医药信息杂志，2009,16(12):87.[25]盛蓉蓉,章薇.曲池穴的临床应用和实验研究进展[J].中国医药指南，2013,11（20）：81.[26]王侠生,廖康煌.杨国亮皮肤病学.上海:上海科学技术文献出版社,2005:78,389～394. ‐31 ‐ 文献综述一、变应性接触性皮炎的研究进展接触性皮炎（CD）属于常见的一种皮肤病，是因为粘膜和皮肤因为和外界的某些物质接触或者暴露在外界后，发生在接触位置的一种炎症反应，包括刺激性接触性皮炎（ICD）和变应性接触性皮炎（ACD）。其中以变应性接触性皮炎为临床上最常见的类别。接触性皮炎的发生涉及效应Ｔ细胞、表皮角质形成细胞和炎症因子三者的相互作用。此外，特异反应性Ｔ细胞及无需抗原提递细胞提呈的淋巴细胞亚群，在皮肤的变态反应启动和快速放大中也起着重要作用。以下就对近年来ACD的病因、发病机制、诊断、治疗等情况作以综述。1.ACD病因的研究进展一些物质可以造成接触性皮肤炎，基本属于无刺激性，主要包括三种：第一，动物性；第二，植物性；第三，化学性。皮炎发病的主要因素即为接触化学性物质，具有诸多种类，如各种金属以及其制品；日常生活用品，如洗衣粉、肥皂、等；化妆品，如香膏等；外用物质，如汞剂等；化工原料，染料等。关于其中的化学物，有部分直接与原料接触即可引发疾病，如光脚和塑料鞋直接接触所得皮炎，可能就是因为塑料中包含了化学物质导致的；对于橡胶制品，可能是由于其中包含了防老剂，从而造成过敏。通过研究可知，因为化妆品造成的ACD每年都会增加，文献中有很多对于化妆品中常见致敏物质的描述，如在Orton等在对化妆品致敏原的相关问题分析过程中，针对发病率诊断以及如何治疗方面指出，关于造成化妆品皮炎的主要过敏[1]的原包括二苯甲酮-3等。而我国在《化妆品皮肤病诊断标准及处理原则》党中[2]指出了在化妆品皮炎方面，较为常见的致敏原包括a-萘酚、桉树油等。近期糖皮质激素应用范围愈加广泛，在临床中出现的ACD和对此激素的依赖性皮炎越来越多。根据调查显示，在英国关于该激素造成ACD已经达到了4.9%的发病率，西班牙达到了0.2%，温哥华达到了2.3%。因此，接触性皮炎由于该[3]激素所导致的患病率范围是0.2%到4.9%。 ‐32 ‐ 2.ACD发病机制的研究进展该机制较为复杂，通过传统免疫机制等方面参与的机制来看，以及最新得知的神经因素机制，诸多学说均在逐渐被改进与完善。2.1免疫学机制从免疫学角度进行分析，ACD是由T细胞介导的针对机体接触抗原发生的免疫反应。在反应致敏和激发的整个过程中起重要作用的有：T细胞中的细胞因子IL-4、干扰素(IFN)-γ、共刺激分子及趋化因子等，及朗格汉斯细胞(LC)中的细胞因子白介素(IL)-12等。造成ACD的致敏物中基本都是半抗原，它和表皮细胞中的载体蛋白进行结合最终产生出全抗原，通过对表皮朗格汉斯细胞进行提取，然后对抗原进行相应的加工后，引入到局部淋巴结中，被T淋巴细胞锁接收，此时T淋巴细胞就会被致敏变成淋巴母细胞，通过增值与分化后，变成效应T淋巴细胞与记忆细胞，然后在血液循环的作用下传输到全身，该过程即致敏期，这一时期一般时长4到7天。若某个体已经致敏，然后第二次与相同致敏物接触，一般情况下1到2天中就会进入到激发期，然而这个时候致敏物还是需要变为全抗原，同已经致敏完成的淋巴细胞进行结合然后在彼此作用后，对效应T细胞产生作用，使其能够释放出更多种类的淋巴因子，从而对局部炎症起到激发作用。2.2炎症介质2.2.1神经肽不管是迟发型，还是速发型皮肤超敏反应的平衡，SP、CGRP、NKA等神经肽均参与其中。SP，即所谓的P物质，对血管的舒张、血浆的外渗、淋巴细胞的浸4-6]润均有一定的增强作用，进而使耳部接触性皮炎病症恶化[,物质P的拮抗剂能够抑制皮肤组织的免疫应答，而物质P的刺激剂能够增强皮肤细胞的免疫应答[7]。spantide-NK1为物质P的主要受体，通过对其进行SP拮抗剂的皮下注射，[8]能够对耳廓炎症的恶化进行抑制，并且随着药量的增加其抑制作用更中明显。相较于对照组，SP主要受体缺失（spantide-NK1）的小鼠反应迟缓，局部受损部位肿胀，白细胞的浸润量减少一半，在噁唑酮活性激发后一天，相较于正常小[9]鼠，NK-1受体缺陷小鼠的炎症部位的物质P阳性神经纤维显著增加。Scholzen[7]等学者针对此进行了相关实验，结果表明，P物质与spantide-NK1在免疫应答系统中有着至关重要的地位，两者均能促进接触性皮炎模型的免疫应答能力。然而神经激肽A（NKA）与spantide-NK2的功能性却恰好与之相反。神经激肽A能 ‐33 ‐ 够促使超氧负离子的生成，进而导致T细胞表达量的增加与中性粒细胞粘连，并且神经激肽A能够增加血液中NO的含量，从而对局部皮肤炎症产生一定的抑制作用。与神经激肽A的功效类似，降钙素基因相关肽(CGRP)对于ACD(不论是迟[9]发型还是速发型)均有着较好的疗效。2.2.2细胞因子在皮肤细胞炎症的调节中，局部表达的细胞因子有着关键性作用。因接触而引发的过敏中，无论是在朗格汉斯细胞的活化，还是在朗格汉斯细胞的迁移、抗原提取，IL-1（白介素-1）均有着十分关键的作用，以皮内注射方式注射白介素10,11]-1能够导致局部皮肤炎症反应[。Nagai等学者[12]通过使用DNFB方法组建了ACD模型（转基因小鼠），实验结果表明，白介素-5mRNA与血清IgE含量的[13]增加会诱发ACD反应。Plitz等通过对C57BL/6ACD模型（使用DNFB诱发）的组建发现，白介素-18对血管通透性有着一定的增强效果，进而使局部皮肤炎症恶化；该实验中将蛋白与白介素-18结合，能够有效抵制双耳廓部位IFN-γ数量的增加及T细胞的浸润，因此对于局部炎症有一定的疗效。在组建接触皮肤炎症模型中将TNCB作为诱发因素时，接触型反应能够在白介素-4的影响下转化成Th2型反应，同时能够确保损伤部位的皮肤炎症不再加重，由此可见，白介素-4能够结束接触型皮肤炎症反应。不管ACD模型是由TNCB诱发炎症还是由三硝基氯苯来诱发炎症，激发十二小时后，血液中生成IFN-γmRNA，在第十八个小时含量最多，而白介素-4mRNA至始至终并没有生成，然而外界注入白介素-4能够有效减少IFN-γmRNA含量，由此可见，白介素-4对于接触性皮肤炎症有着一定[14,15]的疗效。2.3神经纤维大量实验研究表明，接触性皮肤炎症的诱发过程中神经纤维起着至关重要的作用，主要在产生阶段与生成阶段。之前便有学者指出人体免疫机制与神经系统机制相互影响与作用，如ACD，止血等。ShepherdAJ等学者[16]发现人体免疫反应均需要神经系统的参与，无论是在免疫记忆，还是在宿主全身免疫系统中，神经系统均有着十分关键的地位。部分学者组建ACD模型的过程中发展，激发后皮肤中的NGF与神经纤维数量显著增加，从而为神经生长因子（NGF）导入人体[17]接触性皮肤炎症的治疗提供了理念基础。 ‐34 ‐ [18]KatafuchiT等学者在组建接触性皮肤炎症模型时将实验小鼠的肾上腺摘除，并且与神经纤维去除（利用辣椒辣素）的小鼠进行对比实验，相较于正常小鼠，上述两组小鼠的反应速度更快，恢复速度也更强，由此可见两组均对HPA有着一定的抑制效果，进而反映出丘脑垂体肾上腺轴（HPA）对接触性皮炎症的[19]两面作用：一，初期抑制ACD；二，后期加强ACD。而学者LoranBerespord等针对各种神经纤维在ACD模型的功能性进行了研究，结果表明在接触性皮炎的过敏阶段与发生阶段，所有的神经纤维均有参与。过敏期受损部位的肽能神经失去活性，CHS也无法被激发。此时受损部位的真皮树突状细胞含量与朗格汉斯细胞表达量均呈上升趋势，后者还会移动至淋巴结处，所以，本人以为因神经纤维失去活性致使朗格汉斯细胞的抗原提呈能力增加，进而导致CHS不能被引出。部分学者作了进一步的探讨，结果表明ACD致敏期与激发期因肽能神经活性丢失而产生变化，由此他们认为其原因为肽能神经的失活致使人体无法感受化学物质的[17]刺激。可是，部分学者通过大量的实验分析得到，将辣椒辣素注射进小鼠颈部[20,21]14天后激发，纤维神经去除，相较于正常组，该组CHS反应较强。通过对ACD模型致敏阶段与激发阶段的时间拉长（3，6，9，12，15天）以进一步研究去纤维神经对CHS的作用，相较于ACD模型，整个过程中CHS均不能被引出。学[22]者张帆等基于CAP的止痛原理发现，0.25％的辣椒辣素能够致使神经元细胞轻微水肿、线粒体嵴絮状变形等，上述变化均能够修复，可是当辣椒辣素的浓度为0.5％时，所造成神经元的变化为不可逆的，如体积减小、数量减少、核内染色体斑块状分布、线粒体嵴断裂等。究其原因可能因辣椒辣素的浓度过高生成了神经毒性作用。2.4其他血管紧张素转化酶，简称ACE。它能够对物质P和缓激肽（由物质P诱发生成）进行分解消化以抑制皮肤炎症反应。组建接触性皮炎模型，相较于正常组，血管紧张素转化酶缺失型小组由于P物质与缓激肽量过多，致使肿胀、渗出、红斑等炎症反应更加明显，将血管紧张素转化酶拮抗剂用于正常组，症状相似，所[23]以，血管紧张素转化酶在接触性皮炎的发病机理中起着至关重要的作用。NEP，即所谓的中性肽链内切酶，它主要存在于细胞表层，能够对物质P进行分解，组建ACD模型，相较于正常组，中性肽链内切酶缺陷组的肿胀程度为正常组的 ‐35 ‐ 250%，同时血浆渗出严重、炎症细胞浸润，激发前三天、注射NK1受体拮抗剂后或者受损部位多次使用CAP后能够抑制上述病情，正常小鼠注射中性肽链内切酶拮抗剂，其炎症反应加强，由此推测中性肽链内切酶和神经肽在接触性皮炎的发[24]病机理中起着至关重要的作用。3.变应性接触性皮炎临床研究的研究进展尽管变应性接触性皮肤炎症的病症简单易懂，可是这不代表其诊断也简单。这是因为在实际生活与工作过程中，所接触的东西丰富多样，致使诱发病因的确定非常繁杂。通常我们依据病患近期所接触的特殊物或工作环境等找到急性接触皮肤炎症的诱因，可是对于慢性接触性皮炎的病因诊断却有着很大的难度。尽管ACD没有较为明显的病症特点，可是我们依然可以通过其部位与形状来进行诊断。Krasteva等学者[25]重点指出在明确ACD病因前需对病患进行详细的寻问、评价，同时他列举出常见的ACD发病部位的对应病因。由此损伤的具体位置是ACD确诊的重要方式。像毒橡树、樱草等植物应变性ACD的形态通常为线性，而像菊科倍半萜烯内酯等气体致敏原造成的ACD通常损伤在暴露在外的部位。与之相反的是衣物性变应原多发生衣物遮盖处。镍导致的ACD多在钮扣、耳部区域，有时也会出现在手部、面部。理发品的敏感部位一般在耳部、颈部、面部。而鞋袜导致的过敏通常位于脚部。而腿部溃疡物质导致的ACD多为腿部，而[26]眼睑ACD多由丙烯酸树脂、福尔马林树脂等引起。下颈部呈线状多为福尔马林树脂（衣物抗皱、固定用的化学物质）或偶氮阿尼林（衣服染料）导致的ACD。而“腋窝四周有，顶部无”多为衣物引起的ACD。而一般弹性衣物感染源多为橡胶等。如果一个ACD病患，因静脉注射、口服、内给、肌肉注射等再次引起全身性过敏，导致上述物质的化学成分被人体吸收，产生全身性ACD（秘鲁香脂、秘[27]鲁香脂、镍等均为全身应变原）。尽管很少见，可是人们对它的关注度也越来越大。因物质本身的光敏性可导致局部或者全身性ACD，抗生素、青霉素、抗真菌药、噻嗪类利尿剂等均为较为常见的光敏性ACD的应变原。现今部分学者针对局部使用光敏性物质（四环素类物质、喹诺酮类物质、磺胺类物质、抗生素、灰黄霉素等）作了相关探讨，实验结果表明，抗生素的种类不同，其引起光敏性的机率、强度均存在很大的差异。若物质引起光敏性的机率低、强度小并且可恢复，临床医学易于掌控，那么可以说相较于隐性的光敏反应，抗生素外用物质的好处 ‐36 ‐ [28]更大。。针对光敏性ACD是否更易留斑学者Mcfadden[29]等进行了探讨分析，基于皮肤光敏程度把志愿者划分成五个级别，使用SLS斑贴进行实验，四个小时后对皮肤急性刺激反应临界值进行测定，发现不管是哪个级别的皮肤，结果基本一致。若上述常见治疗方法还是无法解决ACD时，则有可能是医用药引起的ACD。其应变原可能是糖皮质激素、外用抗生素等各种物质。学者李林峰等[30]在进行斑贴实验时应用不同皮质类固醇激素，结果表明皮质类固醇激素为第五大常规ACD变应原。比如麦收季节出现的麦收皮肤炎症，它的变应原为半裸镰刀菌及串[31]珠镰刀菌。。呼吸道过敏最常见的变应原即为尘螨，而尘螨同样能够导致ACD，通过点刺试验与斑贴试验的分析论证，得出搞好个人卫生、做好防尘杀螨工作，[32]能够有效抑制接触性湿疹的发生。4.变应性接触性皮炎诊断方法的研究进展通常我们可以对漆树造成的ACD在免除斑贴试验的情况下就能确诊，因为漆树造成的ACD会有显著的临床表现，如果其他情况下怀疑患者为ACD，确诊前应[33]使用斑贴试验。到目前为止，对ACD最准确的诊断还是斑贴试验。临床医师一般会使用斑贴试剂标准对患者进行诊断，同时进行适当的变应原的选择，患者在医师严谨的诊断方式下一般都能得到准确的诊断结果。Larsen等[34]在斑贴试验中加入混合香料，原本使用市售标准斑贴试剂，其香料过敏阳性率为81%，当加入混合香料后就有95%的香料过敏阳性率。另外还有体外对ACD诊断的方式，[35]如在评价动物和人类ACD时使用巨噬细胞迁移抑制以及淋巴细胞转化等。虽然体外诊断方式还有很多问题存在，但体外诊断也是未来一个发展方向。5.变应性接触性皮炎治疗及预防的研究进展治疗ACD的关键是将造成ACD的原因找到，同时对患者进行指导，帮助其不再接触致病的变应原。在很多种变应原中，它们的抗原成分都是一样的，因此临床医师需要对患者进行指导，避免因为交叉反应的变应原使患者再次出现ACD。当患者的变应原是苯唑卡因时，和苯唑卡因起交叉反应的麻醉剂都不能接触；如果患者因为某一种磺胺物质产生接触性皮炎，其他磺胺类物质也不能接触；如果患者的过敏原是染发剂，患者对于其它染料也不能过多接触。但是一般医师不了解接触物的化学结构，所以在ACD的交叉过敏上不能给予患者过多的指导意见。[36]Halbert等对铬酸盐过敏的患者进行研究，他们发现虽然患者尽管不与铬酸盐 ‐37 ‐ 接触，但是70%患者皮炎症状并没有消失。通过深入研究发现，如果在发生皮炎12个月后才进行治疗，患者已经转变为慢性接触性皮炎，因此，对于该病症的[37]诊断需要越早越好。Lips等研究发现，当患者在病症出现早期就能进行治疗，就能尽早找出过敏原从而不再与过敏原进行接触，患者一般具有较好的预后。因为很多ACD患者无法避免和变应原进行接触，所以应该采取积极的治疗方式对该类患者进行治疗。干燥剂是治疗急性期皮疹的药物，润滑剂用于治疗慢性苔藓状皮疹，口服抗组胺药和局部止痒药主要治疗瘙痒症，因为可能出现继发性过敏，所以麻醉药和局部抗组胺药应尽可能不要使用，最好的治疗方式是使用紫外线照射疗法和糖皮质激素，当体表面积的25%出现损伤，或是长时间处于某些变应原中，全身使用糖皮质激素是最好的治疗方式。如果ACD患者是因为本身职业造成的，在仍然与变应原接触的情况下，患者的临床症状可以通过长期的紫外线照射治疗减少甚至完全消除。近年来，有学者研究出一些具有发展前景的新的治疗方式，包括细胞粘附分子抑制剂，抗细胞因子抗体，在皮肤上使用的细胞因子调节剂，可溶性细胞因子受体，细胞代谢活性抑制剂以及新一代免疫抑制剂等等[38-40]。因为某些化学物质即使在带防护手套的情况下也会和皮肤有所接触，因此手套对皮肤的保护作用并不明显。比如使用过甘油巯基乙酸盐后几个月，头发中仍然存在甘油巯基乙酸盐，该物质也能透过乳胶手套，因此美容师在美容时常常会接触到这种变应原，而且也无法有效避免。现在保护性乳膏仅能帮助患者避免接触毒橡树、毒常青藤，要想完全有效还必须在接触后几个小时中进行清洗，目前这种保护性乳胶使用起来感觉较为油腻，因此需要改善目前的配方。有最新研究发现，应对MCIMI、镍、秘鲁香脂、芳香剂等过敏原的保护剂成分可以是碳氧甲基-1,3-葡聚糖钠。从理论上来说，通过减敏治疗对致敏免疫耐受进行治疗，从而可以对ACD进行治疗。但是，一些接触性化学制剂不仅对人体产生过敏反应，甚至会出现致癌或致毒的可能，因此对这些化学制剂的防护措施尚有待进一步研究。 ‐38 ‐ 二、变应性接触性皮炎动物模型的研究进展在构建变应性接触性皮炎动物模型时分为两种，一种是急性变应性接触性皮炎模型，另一种是慢性变应性接触性皮炎模型，不同的模型是根据造模时间，试剂的浓度和激发方式进行区分，下面分别介绍两种模型:1.急性变应性接触性皮炎模型在对某些药物治疗皮炎-湿疹的治疗效果进行评价时，急性接触性过敏反应的动物模型是第一选择，即以致敏6、7天后一次性激发的方式造模，能够简单、快速、较好地反映临床急性皮炎-湿疹的病理过程。小鼠耳廓ACD模型最为常见，建立的时间也较长，模型构建中需要使用二硝[41]基氟苯（DNFB）以及二硝基氯苯（DNCB）。在该模型中皮炎的靶部位是耳廓，抗皮炎药物的治疗效果实在单位面积炎细胞数以及炎症耳廓的厚度的基础上进行判断。该模型的优点是在二次抗原激发时毛发不需要剔除，同时具有较多的炎细胞浸润数量，但该模型也有不足之处，例如因为耳廓较薄，对耳廓厚度及肿胀度就不能准确进行测量。文献中所述的小鼠模型使用不同浓度的2，4-二硝基氯苯(DNCB)或2，4-二硝基氟苯(DNFB)进行外涂；也没有使用相同的小鼠品系。[42]如周氏运用的小鼠品种是8～10周龄没有病的雌性昆明品种，将小鼠背部毛去除，将0.5%DNFB25?l在第0、1天对小鼠进行涂抹，促使小鼠致敏，第5天将0.2%DNFB20?l涂在小鼠的右耳处。用游标卡尺分别对激发前及激发后24h小鼠的右耳廓厚度进行测量。[43]宋氏运用的小鼠品种是昆明种远交系雌性无病小鼠，每只小鼠具有23～25g的重量。在进行实验前1天剔除小鼠腹部固定部位的毛发。将0.5%DNFB在实验第l、2天涂抹于于去毛部位。中间几天不对小鼠涂药，第6天使用小量乙醚麻醉小鼠，乙醚的用量为lml/只，将0.2%DNFB20?l涂抹于左耳背，为了进行对比，将4:1丙酮橄榄油20?涂抹于右耳背。经过24小时对指标进行测试。[44]陈氏运用的小鼠品种是BALB/C雌性小鼠，每只有18～20g种。在进行实验前第l天剔除腹部固定部位的毛发；将0.5%DNFB进行局部涂抹。在第6天，将0.5%DNFB5?l涂抹于小鼠左耳。经过24小时后对指标进行检测。[45]林氏运用的小鼠是昆明种远交系健康小鼠，每只20～30g重，将0.25%和0.5%的溶液在小鼠腹部去毛后涂抹。第0天和第1日将0.5%DNFB25?1涂抹于 ‐39 ‐ 去毛部，0.25%DNFB20?l在第5天涂抹于左耳背,将基质20?l涂抹于右耳涂进行对比。[46]陈氏运用的小鼠品种是40只615纯系小鼠，每只18～22g重。在实验前1日剔除小鼠颈背部的毛发。实验当日将1%DNCB无水乙醇溶液50?l涂抹于颈背部去毛区，连续三天都进行涂抹。将1%DNCB无水乙醇溶液20?1在实验第6议案涂抹于小鼠左耳(两面)。[47]杨氏运用的小鼠品种是ICR小鼠,体重20～25g,实验当日剃除小鼠背部3×3cm2毛,暴露皮肤，在去毛处皮肤外涂5%DNCB，10天后将%DNCB丙酮溶液30?l涂抹于小鼠右耳壳内外侧，将丙酮30pl涂抹于在小鼠左耳壳内外侧，15天后再进行一次诱发,接触性皮炎模型在17天后可以得到。[48]杜氏的实验对象为30只重量在18至22克之间的昆明种小白鼠，雌性与雄性鼠的数量分别是15只，按照任意原则进行分组，共三组。在每组小白鼠背部皮下组织，注射0.02ml的7％DNCB丙酮液，等待八天之后，在小白鼠左耳下方涂抹0.03ml的l％DNCB甘油液，等到16小时之后，将小白鼠处死，两只耳朵取下，对炎症肿胀水平的判断依据是两只耳朵重量的差值，然后将抑制率算出。[49]吕氏选择健康的、体重为(24±1)g的雄性昆明种小鼠进行实验，正式实验之前的一天将小鼠腹部约3cm2区域的体毛去掉，正式实验时将25ml的0.5％DNFB液涂抹在这块区域，使小鼠产生过敏反应，等到5d之后，将20ml的0.25％DNFB液涂抹在小鼠左耳的背面，使小鼠产生皮炎反应，将20ml的基质涂抹在右耳相同位置，起到对照作用。[50]闫氏的实验对象为32至40只重量在18至22克之间的昆明种小白鼠，雌性与雄性鼠的数量相同，按照任意原则进行分组，共4至5组。将2ml70g·L-1DNCB丙酮液注射到实验组小鼠的颈背部皮下组织中，使小鼠产生过敏反应，等到6d之后保持5天的中药灌胃操作，频率为1次/d，在最后一次给药结束之后，等待6h，在实验鼠右耳涂抹30ml的70g·L-1DNCB丙酮液，并将30ml的丙酮液涂抹在左耳，进行对比。等到16h之后将左右耳的耳郭取下，采取φ9mm的打孔器，得到两耳的耳片，并对耳片的厚度与重量进行记录，接触性皮炎的严重水平由左右耳片质量的差值来体现。 ‐40 ‐ [51]温氏选择重量为18至22克的昆明种小鼠作为实验对象，在小鼠腹部涂抹0.1ml的5％DNCB乙醇液，使其产生过敏反应，等到7d之后，在其右耳涂抹0.1ml的1％DNCB，等待24h，将实验动物处死，迟发型超敏反应的数值由两耳质量的差值来体现。[52]黄金玲用近交系昆明种小鼠，体重(20土2)g，雄性与雌性的数量相同，保持7d的给药时长，在第3日将所有实验动物腹部的体毛去除，并涂抹1％DNCB丙酮麻油液50ml，使其产生过敏反应，第4日再涂抹一次，第5日在实验鼠右耳正反两侧涂抹1％DNCB丙酮麻油液10ml，等到24h之后将实验鼠处死，测量其体重，并采取φ7mm的打孔器，对双耳进行取片操作，测量其重量，还要对实验鼠的脾脏与胸腺的重量进行记录，对脏器指数和耳朵肿胀水平进行计算。部分观点认为耳廓区域没有脂肪层，此处皮肤厚度较小，所以很难对其厚度与肿胀水平进行准确测量，为了解决该问题，小鼠背部急性变应性接触性皮炎动[53]物模型被设计出来。此模型的特征是将模型构建在实验鼠的耳廓与背部区域，进行皮炎反应测试。实验过程为：将25ml的0.5%DNFB丙酮液涂抹在实验鼠腹部体毛被去除的区域，使其产生过敏反应，等待5日之后，将10ml0.2%DNFB丙酮液涂抹在实验鼠的右耳耳廓外部，并将20ml的0.2%DNFB丙酮液涂抹在左耳后侧22cm的去毛区域，产生二次抗原反应，而右耳相同区域不涂抹药物，产生对比，当抗原被激发之后，于第2、4、5、8、10日将一组实验鼠处死。得到的结论是：耳廓与背部皮炎模型相比，后者的肿胀水平更严重，时刻不同，这两个位置的单核与多形核细胞、皮肤肿胀水平等内容的改变情况之间具有正相关的联系。在建立ACD模型的过程中，将致敏原的原料定为除DNCB、DNFB之外类型的[54]试剂，也有着一些实验结果，例如：戴氏在研究职业性药疹性皮炎的试验中，选择了三氯乙烯试剂，通过该实际将ACD模型复制出来，效果比较出色。具体实验内容为：选择二级周龄为3的白色豚鼠，根据OECD皮肤变态反应实验豚鼠最大值法，开展实验操作。于第1、8日开展一次致敏反应，并在第15日将5%三氯乙烯液注射到致敏组小鼠的皮下组织内，涂皮诱导与激发浓度分别是40%、20%。将20%三氯乙烯在激发过程中涂抹l次。处理阳性对照组的方法为，将0.25%DNCB注射到小鼠的皮下组织内，涂皮诱导与激发浓度分别是0.5%、0.25%。将受试物清除干净后，等待24h，对小鼠皮 ‐41 ‐ 肤的变化状况进行观测与统计，然后将小鼠杀死，对其脾脏指数进行运算，对皮肤组织开展病理学分析。得到的结论是：致敏组小鼠受到了三氯乙烯的作用，发生了过敏，症状是皮肤肿胀有红斑等，有着66.7%的致敏率。表面皮肤增生状态较轻微，容易观测到淋巴与嗜酸粒细胞，聚集性及浸润性体现在乳头层嗜酸粒细胞的集群中，其中还含有巨噬与淋巴细胞，血管附近存在炎症，炎细胞主要是嗜酸粒细胞，存在于皮下组织中，DNCB致敏组豚鼠起到对照作用，三氯乙烯致敏组也有着一致的症状，体现出其导致的过敏反应具有迟发型超敏性。[55]郭氏对DNFB、FITC、邻苯二甲酸二丁酷致敏模型的相同与不同之处进行了分析，具体的实验内容是：在实验开始前或实验第1日将小鼠腹部的体毛去除，并将20ml的0.5%DNCB丙酮橄榄油液、或者40ml的0.5%FITC涂抹在此区域，于第5或6日将20ml的0.5%FITC或20ml的0.2%DNFB再次涂抹进行激发，反应现象是等待24h，实验鼠耳朵会出现肉眼能够观察到的红肿现象，并且重量与厚度显著增加，从组织学角度研究可发现右耳表皮厚度提高，细胞出现轻微水肿，真皮水肿覆盖全层，众多单核细胞、主要是淋巴细胞以及部分多核细胞出现了浸润，胶原纤维具有了更大的间隙，真皮有着显著的充血现象，同时血管直径增加。不过对于细胞因子的表达来说，上述两种模型存在区别，主要区别在于：DNFB组主要表达了Ⅰ型细胞因子IL-2；FITC组主要表达了Ⅱ型细胞因子IL-4。它们对应的淋巴结细胞表达的细胞因子同样存在不同，DNFB组与FITC相比，前者表达的IFN-γ量为后者的5倍多，后者表达的IL-4量为前者的2倍。前者与后者构建的模型具有差异，后者构建的模型又被称作Ⅱ型ACD模型。2.慢性变应性接触性皮炎模型因为皮炎-湿疹的复发率很高，不及时治愈逐渐会形成慢性皮炎-湿疹，并且强抗原接触史不会出现与此病发病阶段，所以分析此病时要将和急性接触性不一样的动物模型构建起来。此类模型通常在致敏一至二周后，通过低浓度的抗原，进行重复激发，通常将动物的耳廓作为激发区域。[56]Boyera将豚鼠耳廓慢性接触过敏反应模型构建起来，此模型与人体变应性湿疹模型更为类似，具体构建方法为选择7%DNCB丙酮进行致敏，等到2周后，在动物耳朵涂抹0.1%DNCB，进行致敏激发，单次激发等待48h后，会观察到部分区域发生肿胀现象，激发结束之后，等到48h，结痂现象会出现，等到72h， ‐42 ‐ 单核细胞浸润、乳头瘤外观改变、过度增生等现象会从皮肤病理学角度被观察到。得到的结论是湿疹会因为低浓度抗原的不断刺激而发生。因为使用豚鼠做实验的成本较高，所以HiroiChiNagai[57]在研究时选择了BALB/c及c57BL/6小鼠，在其耳部涂抹DNFB与赋形剂，保持5周，频率为1次/周，5周后在耳部内外两侧涂抹25ml的0.15%DNFB，对耳朵厚度进行测量。我国也进行了相关方面的研究，金氏将小鼠耳廓慢性接触性皮炎模型构建起[58]来，选择的是CXA1重组近交系小鼠作为实验动物，具体方法为在实验鼠背部涂抹100ml的7%DNCB丙酮液使其过敏，等待5d在实验鼠右耳内部涂抹5ml的0.1%DNCB丙酮液，用于激发，在之后的24h、48h、72h，对其耳部肿胀水平进行测量，激发频率为3d/次，得到的结论是第四次激发可以将小鼠的慢性皮炎-湿疹模型构建起来，总周期大致为20日。根据上述内容可知，通过研究近些年来应用DNCB或DNFB建立的小鼠耳廓ACD模型的基本情况之后，我们不难看出，在构建小鼠模型时通过外涂方式具有便捷性及较出色的推广价值，也不需要小鼠具有很纯正的品种，近交或者远交的小鼠均可使用。常用品系为BALB/c、C57BL/6、ICR、昆明种属小鼠。小鼠性别也没有很大的影响。根据实验结论可知试剂浓度与激发时间均会带来不一样的效果。后期的主要工作是研究激发时间、浓度与剂量对研究结果的干扰。3.接触性皮炎动物模型在中医药研究领域的应用概况鼠耳廓ACD模型主要用于急性接触性皮炎药物的观察与分析，属于第三型超敏反应模型。而慢性皮炎-湿疹模型主要通过对慢性接触性皮炎和湿疹病变情况的模仿实现过程再现，主要用于对亚急性接触性皮炎、慢性皮炎-湿疹和慢性接触性皮炎的药效学观察、分析。现今研究的重点主要放在中药方上。从大量的中药皮炎祖方中挑选出药效最徍的方子。例如对消风散、玉屏风散等祖传方子的研究，又如对基于祖方研制出的复方、院内自制药剂、经验方、中成药的研究与针对性研究。3.1经典复方的研究[59]李氏针对加味玉屏风颗粒（复方中药剂）的ACD模型进行了研究，以分析其对小鼠的药效，实验表明相较于生理盐水组，服用加味屏风颗粒小组的小鼠体 ‐43 ‐ 重减少量较少，实验组能够有效抑制小鼠发病前后耳厚度与耳片质量差，并且IFN-γ（Ⅰ型细胞）、IL-4（Ⅱ型细胞）的表达量大幅度减少,可是加味玉屏风颗粒的量越大，IFN-γ/IL-4的比值越小。各项生理指标的变化均与药量有着密切的联系。由于可见小复方加味玉屏风颗粒对于炎症、应激反应有着一定的疗效。同时对IL-4、IFN-γ、的表达量有着明显的降低作用，并且对Th1/Th2的比值也有下调作用。[60]郑氏通过对ACD模型的组建对消风散颗粒的药效进行了研究，由实验数据分析可知，消风散颗粒对动物型皮肤过敏、皮损组织病理损伤均有着一定的药效，同时可以减少血液中IL-2的表达量。[61]李氏根据《外科正宗》记载的有关消风散配方配制出消风散颗粒，并用于小鼠耳廓ACD模型（小鼠经DNCB诱导作用），以对其药效进行研究。由实验数据分析可知，消风散颗粒对于脾指数的升高有着一定的抵制作用，当药剂剂量增大时，对胸腺指数也有着明显的抵制作用，它能够有效的减少IL-1、IL-4的表达量，同时对IL-2（含量正常）的表达量也有所降低。[62]梁氏同样根据《外科正宗》进行了消风散传统药剂（煎煮剂）的配制，并用于小鼠耳廓ACD模型实验，由实验结果数据可知，消风散对于因超敏反应引发的耳部肿胀与耳厚度与耳片重量差有着一定的疗效，能够抑制血液中白细胞表达量的增加，对IL-4、IFN-γ、的表达量有着明显的降低作用，同时能提高IL-4的表达量。3.2非经典复方制剂以及中成药的研究[63]熊氏通过组建耳廓ACD模型实验对喘可治注射液（国家二类新药）的药效进行了研究，由实验数据分析可知，喘可治注射液对于耳廓的厚度差、质量差均无抵制作用，可是能够减轻诱发前后的体重差，并且对局部皮损炎性细胞的感染的有着一定的抵制作用。[64]连氏利用ACD模型对乌蛇败毒胶囊（自拟方）的药效进行了研究，并与成药龙胆泻肝丸进行对比实验，由相关数据分析可知，该药对于血清中中IL-2、TNF-α的表达量有着明显的减少，可抑制耳廓的肿胀，同时对血液中的白细胞数量的增加有着一定的抑制，药效与龙胆泻肝丸类似。 ‐44 ‐ [65]宋氏指出除湿止痒合剂（院内制剂）主要成分为生地、银花、赤芍、地肤子、丹皮等，能够有效抵制小鼠诱发前后的耳厚度差、质量差，能够有效下调IL-4与IL-4/IFN-γ比值，但对IFN-γ表达量没有作用，同时指出该制剂能够有效抵制小鼠病变部位的炎症，能够抑制Th1/Th2比例失调的恶化。[66]尤氏利用耳廓ACD模型（二次激发第十七天成模的小鼠动物模型）对皮炎煎剂1号药剂（属于自拟方，药物成分包括黄芩15g、黄柏12g、苦参10g、桅子12g、白鲜皮15g、地肤子10g、板蓝根15g、生甘草10g）、皮炎煎剂2号（药物成分包括黄芪15g、当归10g、山药10g、茯苓15g、赤芍10g、陈皮6g、地龙10g、鸡血藤15g、炙甘草6g）的效果进行了研究，由实验数据分析可知：皮炎煎剂1号药剂能够有效的抑制水肿、红斑、渗出损伤等皮炎症，对局部皮损重量与炎性细胞的有感染均有着一定的抑制作用。同时基于中医针对湿疹皮炎局部皮肤损害的辩证理论，可将接触性皮炎皮损归为湿热症型，由此，相较于皮炎煎剂2号（主要功效为活络经血、滋润皮肤、健脾除湿），皮炎煎剂1号（药效为清热除湿、祛风止痒）更加对症。可见中医学辩证理论在皮炎病症的医治上起着十分关键的作用。[67]与尤氏的实验方法相同，佘氏对马齿苋液的药效进行了研究，马齿苋液药剂(自拟剂)的主要成分为：苦参30g,诃子30g,白鲜皮30g,马齿苋30g,五倍子30g等。由实验数据分析得出，该药对于水肿、充血等导致的局部皮肤损害有着一定的疗效，能够减少局部皮损的炎性细胞浸润。与尤氏的实验方法相同，金氏对新创清肌饮（自拟方）的药效进行了研究，新创清肌饮药剂的主要成分如下：生地15g、赤芍12g、生黄芪15g、防风10g、苦参10g、羊蹄根10g、苍术10g、漏芦10g、生甘草10g、丹皮10g、生薏苡仁20g、胡黄连6g等,由实验数据分析可知，针对小鼠皮肤的红斑、水肿、渗出等皮肤病症，新创清肌饮均有着一定的疗效。3.3单方研究[68]陈氏使用ACD模型对雷公藤甲素的药效进行了研究，将小鼠脾脏解剖分离，并提取淋巴细胞进行体外培育，以对Th细胞Fas的含量进行观测（流式细胞检测仪），由实验数据分析可知，不管雷公藤甲素剂量的多少，均对Th细胞 ‐45 ‐ Fas的含量有着明显的增多，且随着公藤甲素量的增多，Th细胞Fas的表达量越多。[69]黄氏利用耳部接触性皮炎模型（经DNFB诱导）对六种中药煎煮药剂的药效进行研究，实验数据表明，白鲜皮、当归及金银花能够有效抵制皮肤损害处的肿胀。[70]与黄氏实验方法相同，梁氏对生地、苦参、黄芩、丹皮、赤芍、白鲜皮六种草药的药理进行了研究，由实验数据分析可知：上述六种草药对于局部皮损引起的肿胀均有着一定的疗效，可是都无法完全治愈；丹皮、白鲜皮无法抑制肿胀引起的重量差；可是这六味草药都能够有效抑制因肿胀引起的厚度差，特别是赤芍、苦参、黄芩三味效果最佳，能够治愈；与此同时，除苦参外的其他五种中药均能够减少血液中的白细胞含量，特别是赤芍、黄芩、生地三种效果最佳，基本可以治愈。[71]王氏利用ACD模型对大黄素（大黄药剂的主要成分）进行了药效研究，由实验数据发现，该药对局部皮损引起的耳厚度差、质量差有着一定的疗效，同时对IFN-γ、IL-4的表达量有明显的下调作用，并且相较于安慰剂组，它对白细胞数量的表达无明显作用。4.变应性接触性皮炎模型实验研究的指标选取4.1皮损严重程度的评价ACD模型一般是将耳廓作为基准部位，它在对双耳廓局部损伤所引起的渗出、水肿、红斑进行程度划分时，通常是对诱发发后小鼠耳廓厚度、质量进行计量，可由下式得出耳廓肿胀程度：耳廓肿胀度(%)=(患侧皮肤重量-健康皮肤重[72]量)/健康皮肤重量×100%。4.2组织形态学及免疫病理学观察能够通过HE染色、免疫组织化学、免疫荧光法对活检样品进行观察研究，并记录其炎症细胞浸润程度、真皮水肿程度、表皮增生程度、胶原纤维变性表达程度、神经纤维变性含量、神经肽含量等计算单位面积中浸润炎症细胞的数量[73,74]。4.3细胞因子等的检测检测细胞因子、炎症感染介质、皮肤损害内表达受体、酶的含量，主要应用 ‐46 ‐ 以下四种方法：一，蛋白印迹技术；二，RT-PCR技术；三，皮肤微量渗析法，四,ELISA法。综上所述,目前我国使用使用ACD模型研究中药医学药理的技术已非常成熟，分析方式与研究指标的确定也基本相同，通常将动物诱发前后的耳重量差、厚度差当作判断炎症程度的依据，将胸腺指数、脾脏指数当作判断药物对超敏反应药效的依据。不同的实验，单单在研究的药物方面有所差异。而进行药物的作用机理研究时,则往往选择不同的指标进行观察,一般多选用IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF、Fas/Fasl、ICAM-1/LFA-1等细胞因子进行检测。参考文献[1]蔡瑞康,陈锐,刘玮等.《化妆品皮肤病诊断标准及处理原则》实施指南[S].北京:中国标准出版社,1997。[2]周承藩,沈彤.刺激性接触性皮炎的研究进展[J].中华劳动卫生职业病杂志，2005，23(6):474～476.[3]LagosB,MaibachH.Frequencyofapplicationoftopicalcorticosteroi-ds:anoverview[J].BrJDermatol,1998,139:763～766.[4]GoebelerM,HenseleitU,RothJ,eta.lSubstancePandcalcitoningenerelatedpeptidemodulateleukocyteinfiltrationtomouseskinduringallergiccontactdermatitis[J].Arch.DermatolRes,1994,286(6):341～346.[5]GutwaldJ,GoebelerM,SorgC.Neuropeptidesenhanceirritantandallergiccontactdermatitis[J].JInvestDermato,1991,96(5):695～698.[6]ShepherdAJ,BeresfordLJ,BellEB,MobilisationofspecificTcellsfromlymphnodesincontactsensitivityrequiressubstanceP.Neuroi-mmunol.2005Jul;164(1～2):115～123.[7]ScholzenTE,SteinhoffM,SindrilaruA,etal.CutaneousallergiccontactdermatitisResponsesarediminishedinmicedeficientin ‐47 ‐ neurokinin1receptorsandaugmentedbyneurokinin2receptorblockage[J].FASEBJ,2004,18(9):1007～1009.[8]BabuRJ,KikwaiL,JaianiLT,eta.lPercutaneousabsorptionandanti-inflammatoryeffectofasubstancePreceptorantagonist:spantideII[J].PharmRes,2004,21(1):108～113.[9]El-NourH,LundebergL,BomanA,etal.Studyofinnervation,sensoryneuropeptides,andserotoininmurinecontactallergicskin[J].ImmunopharmacolImmunotoxico,2005,27(1):67～76.[10]CumberbatchM,DearmanRJ,KimberI.Langerhanscellsrequiresignalsfrombothtumournecrosisfactor-alphaandinterleukin-1betaformigration[J].Immunology,1997,92(3):388～395.[11]WestphalGA,SchnuchA,MoessnerR,eta.lCytokinegenepolymorph-ismsinallergiccontactdermatitis[J].ContactDermatitis,2003,48(2):93～98.[12]NagaiH,UedaY,TanakaH,etal.EffectofoverproductionofInterleukin5ondinitrofluorobenzene-inducedallergiccutaneousresponseinmice[J].JPharmacolExpTher,1999,288(1):43～50.[13]PlitzT,Saint-MezardP,SathoM,etal.IL-18bindingproteinprotectsagainstcontacThypersensitivity[J].JImmunol,2003,171(3):1164～1171.[14]OkazakiF,KanzakiH,FnjiiK,etal.Initialrecruitmentofinter+-feron-gamma-producingCD8effectorcells,followedbyinfiltration+ofCD4cellsin2,4,6-trinitro-l-chlorobenzene(TNCB)-inducedmurinecontacthypersensitivityreactions[J].JDermatol,2002,29(11):699～708.[15]BiedermannT,MailhammerR,MaiA,etal.ReversalofestablisheddelayedtypeHypersensitivityreactionsfollowingtherapywithIL-4orantigen-specificTh2cells[J].EurJImmunol,2001,31(5):1582～1591. ‐48 ‐ [16]ShepherdAJ,DowningJE,MiyanJA.Withoutnerves,immunologyremainsincompleteinvivoveritas.Immunology.2005Oct;116(2):145～63.[17]KinkelinI,MötzingS,KoltenzenburgM,etal.IncreaseinNGFcontentandnervefibersproutinginhumanCellTissueRes.2000Oct;302(1):31～37.[18]KatafuchiT,KondoT,HoriT.ComparableeffectsofadrenalectomyandCfiberdepletionondelayed-typehypersensitivityinrats.Neuroi-mmunomodulation.2001,9(3):157～162.[19]LornaBeresford,OliverOrange,EricBBell,etal.Nervefibresarerequiredtoevokeacontactsensitivityresponseinmice.[J]Immu-nology.2004;111(1):118～125.[20]GirolomoniG,TigelaarRE.Capsaicin-sensitiveprimarysensoryneuronsarepotentmodulatorsofmurinedelayed-typehypersen-sitivityreactions.JImmunol.1990;145:1105～12.[21]GirolomoniG,TigelaarRE.Peptidergicneuronsandvasoactiveintestinalpep-tidemodulateexperimentaldelayed-typehypersen-sitivityreactions.[J]AnnNYAcadSci.1992;650:9～12.[22]张帆，董英伟，刘利等，硬膜外不同浓度辣椒辣素对兔痛阈、神经功能和脊髓神经元结构的影响，[J]中华麻醉学杂志，2006，26（4）：348～351.[23]ScholzenTE,StanderS,RiemannH,etal.ModulationofcutaneousInflammationbyangiotensin-convertingenzyme[J].JImmunol,2003,170(7):3866～3873.[24]ScholzenTE,SteinhoffM,BonaccorsiP,etal.NeutralendopeptidaseTerminatessubstanceP-inducedinflammationinallergiccontactdermatitis[J].JImmunol,2001,166(2):1285～1291.[25]KrastevaM,etal,ContactdermatitisII:clinicalaspectsanddiagnosis.EurJDermatol,1999,9:144～159.[26]BelsitoD.Thediagnosticevaluationtreatmentandpreventionofallergiccontactdermatitisinthenewmillennium.TheJournalof ‐49 ‐ AllergyandClinicalImmunology,2000,105(3):419～420.[27]SlavinRG,Unusualresponsestocontactallergens.AllergyAsthmaProc,1999,20:229～230.[28]VassilevaSnejina,etal.Antimicrobialphotosensitivereactions.ArchivesofInternalMedicine,1998,158(18):1993～2000.[29]McFaddcnJP,etal.AcutiirritationthresholdsinsubjectswithtypeItypeVIskinContactDermatitis,1998,38(3):147～149.[30]李林峰.外用皮质类固醇激素皮肤病患者的斑贴试验研究.中华皮肤科杂志,1994,27(5):276～277.[31]林得宝.麦收皮炎病因的初步研究.中华皮肤科杂志,1994,27(6):337～338.[32]KrastevaM,etal.Eczmadecontactperspectivesthrapeutiques.Objec-tifPeau,1996,4:442～444.[33]DeVriesYL,editorRegulatorycontrolandstandardizationofaller-genicextracts:theEighthInternationalPaulEhrlichSeminar.Stuttgart:GustavFischer,1997,195～202.[34]LarsenW,etal.Astudyofnewfragrancemixtures.AmJContactDermat,1998,9:202～206.[35]BasketterDA,etal.Theperformanceofthelocallymphnodeassaywithchemicalsidentifiedascontactallergensinthehumanmaximizationtest.FoodChemToxicol,1994,32:543～547.[36]HalbertAR,etal.Prognosisofoccupationalchromatedermatitis.ContactDermatitis,1992,27:2149.[37]LipsR,etal.OutcomeofjobchangeinpatientswithoccupationalChromatedermatitis.ContactDermatitis,1996,34:268～271.[38]FunkJO,etal.HorizonsinpharmacologicinterventioninallergicContactdermatitis.JAmAcadDermatol,1994,31:999～1014.[39]EnkAH.Allergiccontactdermatitis:understandingtheimmuneresponseAndpotentialfortargetedtherapyusingcytokines.MolMedToday,1997,3:423～428. ‐50 ‐ [40]CastelliD,etal,PretreatmentofskinwithaginkgobilobaextractsodiumCarboxymethylb-1,3-glucanformulationappearstoinhibittheelicitationofallergiccontactdermatitisinman.ContactDerma-titis,1998,38:123～126.[41]BackO，EgclrudLTopicalghcocorticoidsandsuppressionofcontactdcrrmtifissensitivity．Amombioassayofantiinflnmmtotyeffects[J]．BrJDermat01．1985，112(5)：539.[42]周倩，寇庚，钱卫珠．CTLA4-Ig对变应性接触性皮炎小鼠模型的治疗作[J].中华皮肤科杂志，2002，8，35(4)：256.[43]宋智琦，林熙然．不同类型钙通道阻滞剂对小鼠变应性接触性皮炎及表皮郎格罕细胞的影响[J].中国皮肤性病学杂志，1998，12(3)：137.[44]陈妍，郭在培．咪唑斯汀抑制小鼠变应性接触性皮炎机制的研究[J]．中华皮肤科杂志，2004，37(6)：344.[45]林熙然，涂彩霞．抗Ⅳ型变态反应中药治疗湿疹的研究[J].中国中西医结台杂志,2000，20(4)：258.[46]陈晶，何春涤，王雅坤等．咪唑斯汀等几种抗组胺药对小鼠接触性皮炎作用的实验研究[J].临床皮肤科杂志，2005，34(3)：154.[47]杨保华,陈德宇,肖顺汉.消风胶囊对小鼠迟发型超敏反应的影响及其作用机理研究[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2003,2(1):13～15.[48]杜旭，仉雁,李玉文.温清饮免疫双向调节作用的实验研究[J].中国中医基础医学杂志,1999,5(11)：30.[49]吕宁，匡朴，李景云.生苦黄颗粒对小鼠I、Ⅳ型超敏反应的影响[J]．天津药学，2002，14(6)：37.[50]闫倩，孝运曼.风湿康1号对小鼠变态反应的影响[J]．铁道医学，2001，29(6)：383.[51]温俊，刘星玲，肖进伎.三乌胶的抗炎、镇痛、抗免疫药理作用研究[J].中成药，2002，24(6)：441.[52]黄金玲，龙子江，吴华强．苓桂术甘汤对环磷酰胺模型小鼠免疫功能的影响[J]．中国中医基础医学杂志，2002，(5)：31. ‐51 ‐ [53]王国江,顾军.小鼠背部变应性接触性皮炎模型的建立.中国职业医学，2004，31(1):17～19.[54]戴宇飞,牛勇,冷曙光等.三氯乙烯致皮肤过敏动物模型的建立.中华预防医学杂志，2005,39(1):55.[55]郭丽芳,范卫新,汤爱民.两种变应原致小鼠变应性接触性皮炎的研究.中华皮肤科杂志，2005,38(4):229～231.[56]BoyeraN,CaverD,BouelierM,etal.ReperaterapplieationofdhatroehiorobenzetotheearsofsensitizedguineaPigs:ApreliminarycharacterizationofaPotentialnewanimalmodelforcontacteczemainhumans.SkinPharmacol.1992,5(3):185.[57]HiroichiNagai,YoshifumiUeda.DifferentroleofIL-4intheonsetofhapten-inducedcontacthypersensitivityinBALB/candC57BL/6mice.Br.J.Pharmacol.2000,129(2):299～306.[58]金慧玲,张汝芝,余其斌.小鼠慢性皮炎-湿疹模型的建立.蚌埠医学院学报，2002,27(3):193～194.[59]李莉,罗仁,曾抗等.加味玉屏风颗粒对变应性接触性皮炎小鼠模型的干预及对T细胞分化的影响.南方医科大学学报，2006,26(5):701～702.[60]郑咏秋,戴敏,陈光亮等.消风散颗粒抗过敏作用及其机制研究.中国实验方剂学杂志，2002,8（6）:26～28.[61]李国忠,郑咏秋.消风散颗粒免疫调节作用机理研究.中国实验方剂学杂志，2004，10(4):39～42.[62]梁秀宇,关洪全.消风散对Ⅳ型超敏反应中IL-4、IFN-γ及sIL-2R的影响.中国中医药信息杂志，2007,14(4):37～38.[63]熊恺轩,曾耀英,蔡小嫦等.喘可治注射液抑制小鼠变应性接触性皮炎的实验研究.中国病理生理杂志，2005,22(4):757～760.[64]连莉阳,李治牢,聂爱迪.乌蛇败毒胶囊对接触性皮炎小鼠血清IL-2、TNF-α的影响.陕西中医学院学报，2007,30(2):39～41.[65]宋瑜,李咏梅,马绍尧等.除湿止痒合剂对变应性接触性皮炎小鼠模型TH1/TH2相关细胞因子水平的影响.成都中医药大学学报，2008,3l(l):32 ‐52 ‐ ～33.[66]尤立平,刘永生,刘东玉.皮炎煎剂对小鼠实验性接触性皮炎的疗效及作用机制研究.北京中医药大学学报，2004,27(6):50～52.[67]佘鸿燕,王见宾,刘福来.复方马齿苋液对小鼠实验性接触性皮炎的疗效及作用机理研究.中国实用医药，2007,2(27):30～31.[68]黄磅,吴铁,樊翌明.6种中药抑制二硝基氟苯小鼠接触性皮炎的实验研究.现代中西医结合杂志，2007,l6（13）:1756～1757.[69]梁秀宇,关洪全,刘文力等.常用清热类中药抗Ⅳ型超敏反应的实验研究.中医药学刊，2006,24(6):1053～1054.[70]王丹丹,李维.大黄素对小鼠变态反应性接触性皮炎的作用.广东医学院学报，2008,26(l):14～15.[71]陈保疆,王萍,李晓莉等.雷公藤甲素对体外培养的变应性接触性皮炎小鼠Th细胞Fas表达的影响.时珍国医国药，2008,19(2):443～444.[72]FuehibeK,NabeT,FujiiM,etal.Delayedtypeallergicitch-asso-ciatedresponseInducedbytoluene-2,4-diisocyanateinhairless-mice.JPharmacolSci.2003,93(1):47～54.[73]SeholzenTE,StanderS,RiemannHetal.Modulationofcutaneousinflarnrnationbyangiotensin-convertingenzyme.JImmunol.2003,170(7):3866～3873.[74]OhmuraT,TsunennariI,HavashiT,etal.RoleofsubstancePinanNC/Ngamousemodelofatopicdermatitis-likedisease.IntArchAllergyImmuno1.2004,133(4):359～397. ‐53 ‐ 个人简历一般情况：张露文，女，汉族，1988年2月生，辽宁省抚顺市人。现就读于辽宁中医药大学研究生学院针灸推拿专业。学习经历：2008.9-2013.7辽宁中医药大学杏林学院本科2013.9-2016.7辽宁中医药大学硕士研究生在学期间发表文章：陈以国教授针药结合治疗耳鸣经验研究，医药前沿，2016 ‐54 ‐ 致谢三年的研究生学习生涯如白驹过隙，转瞬间已接近尾声，而我的毕业论文也即将完成定稿。回首这两年的时间，我感觉无比的充实，也有着颇丰的收获。在此，首先要感谢我的导师陈以国教授。从论文选题到课题研究，再到论文的写作，整个过程中导师都是不厌其烦的悉心为我提供指导与帮助，不仅在调查研究方面帮我指点迷津，还在研究思路方面多次进行拓展，无论我遇到什么样的问题或者是困难，导师都会及时的为我答疑解惑。在这个过程当中，我也被导师严谨的治学态度、完美的人格魅力以及渊博的知识素养所深深的折服。师恩殷切，无以为报，谨在此致以深深的谢意！还要感谢我的同学与朋友们，你们为我收集大量有价值的论文研究资料，并提供了宝贵的意见与建议，使得这篇论文能够得以增色添彩。愿我们的友谊地久天长。感谢我的家人，你们是我读取研究生学位最坚强的后盾，给我以无私的帮助与支持，这是我前进最大的动力。感谢为我的实验牺牲的60只昆明种小鼠，是你们的生命成就了人类医学一点一滴的进步。最后，还要感谢本文借鉴引用的原作者，还有在百忙当中抽出宝贵时间审查论文的专家老师，谢谢你们！ ‐55 ‐
