亚慢性砷暴露对小鼠脑组织rxr表达的影响

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亚慢性砷暴露对小鼠脑组织RXR表达的影响计：学位论文：34页表格：1个插图：5幅王祥虎指导教师：朴丰源教授申请学位级别：硕士学位专业名称：劳动卫生与环境卫生学论文提交日期：2012年4月论文答辩日期：2012年5月学位授予单位：大连医科大学学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席： 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：至叠垫签字Et期：韭年上月盐Et 目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21三、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯roODOOOaOO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30四、附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33五、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34 亚慢性砷暴露对小鼠脑组织RXR表达的影响硕士生姓名：王祥虎指导教师：考}、丰源教授专业名称：劳动卫生与环境卫生学摘要研究背景：砷(Arsenic，As)是一种广泛分布于土壤、岩石和水环境中的有毒类金属元素。As在自然界中主要以化合物的形式存在，对健康具有多方面的危害，可引发多器官和多系统的形态学和功能上的异常改变。As对神经系统的影响主要表现为头痛、嗜睡、烦躁、记忆力减退、定向力障碍，惊厥甚至昏迷等亚临床的神经损伤。儿童由于正处于生理发育阶段对外源化合物的毒作用较为敏感。大量流行病学调查、动物实验表明，As暴露儿童的中枢神经系统损伤主要表现为学习记忆能力的损害，已广泛引起社会的高度关注，但目前，关于砷致学习记忆能力损害的分子作用机制尚不清楚。本课题组的前期研究发现，砷暴露可显著抑制脑组织中钙离子／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(calcium／calmodulin—dependentproteinkinaseIV，Camk4)基因、蛋白的表达及c—Fos、JunB等与学习记忆相关基因、蛋白的表达，破坏脑组织中长时程记忆(LTM)的形成。据文献报道，脑组织Camk4基因的转录和翻译依赖于两种核受体即甲状腺激素受体(TR)和视黄醇X受体(RXR)的存在。我们的前期研究已经发现，砷暴露小鼠大、小脑组织TR受体亚型之一TRl3在基因、蛋白水平均表达显著下调，但砷是否也影响RXR基因表达国内外未见相关报道。目的：观察砷对小鼠大、小脑组织中RXR基因和蛋白的表达影响，为阐明砷的神经毒作用机制以及防治砷的神经毒性危害提供靶基因依据。方法：SPF级小鼠40只，按体重将小鼠随机分为饮用水对照组、1ppmAs203染毒组、2ppmAs203染毒组、4ppmAs203染毒组、4ppmAs203+150mg／l(g牛磺酸保护组。通过自然饮用含不同浓度As203蒸馏水的方式使小鼠染砷，保护剂是以灌胃方式给予，连续染毒60天后取脑组织。用基因芯片技术和PCR技术检测小鼠脑组织视黄醇x受体(RXR)的差异表达，并进一步用Westernblot和免疫组化的方法证实RXR蛋白水平表达和组织分布的改变。采用SPSSl1．5统计软件，用单因素方差分析(ANOVA)，比较各染砷组与对照组间的统计学差异，两组间比较用LSD法分析，以P0．05)。RealTimePCR定量检测结果显示，砷暴露组大脑中RXR基因表达显著上调，差异有统计学意义伊<0．05)，与基因芯片结果一致。同时，Westernblotting检测结果显示，砷暴露导致小鼠大脑RXR蛋白表达上调，差异有统计学意义(尸<0．05)，且呈剂量．反应关系。免疫组化显示RXR在砷染毒小鼠大脑4ppm组高表达。另外，我们发现，在砷暴露小鼠大脑组织，抗氧化剂牛磺酸对砷致2ppm和4ppm剂量组的RXR基因和蛋白表达上调有拮抗作用俨<0．05)。结论：在亚慢性砷暴露可上调小鼠大脑组织中RXR基因表达水平，但在小脑组织中，RXR基因表达水平并无显著差异变化。牛磺酸对亚慢性砷暴露使小鼠大脑组织中RXR基因和蛋白的表达上调有拮抗作用。提示，亚慢性砷暴露导致脑组织中RXR基因异常表达可能与砷诱导的氧化应激作用有关。关键词：三氧化二砷神经毒性基因表达视黄酸X受体 EffectofsubchronicexposuretoarseniconRetinoidXreceptorexpressioninbraintissueinmiceMasterdegreecandidate：XianghuWangSupervisor：ProfessorFeng—YuanPiaoMajor：OccupationalandEnvironmentalHealthAbstractBackgroud：Arsenic(Arsenic，As)isatoxicmetalloidelementsWllich、verewidelydistributedinsoil，rockandwaterenvironment．AswasmainlyexistedbvthetOrmofcompoundsinnatureandCancausemanyhealthhazardsandalsoCancauseabnormalchangesinthemorphologyandfunctionofmultipleorgansandsystems．TotheneⅣonssystem，Asismainlymanifestedasheadache，lethargy，irritability，memoryloss，disorientation，convulsionsandevencomaandothersub．clillicalner、，einjury·Forchildrenwerestayinthephysiologicaldevelopmentalstage，SOtheVⅥ，eremoresensitivetothecytotoxicityofexogenouscompounds．Alargenumberofepidemiologicalinvestigations，animalexperimentsshowthatthechikhenexposedAs上1avethecentralnervoussystemdamagewhicharemainlytothedamageinleamin2andmemory，however,butthemolecularmechanismsofarseniccausedthed锄agetolearningandmemoryabilitiesyetunclear，SOthisissuehasbeenwidelyarOusedgreatconcern．Ourpreviousstudyfoundthatarsenicexposurecouldsignificantlyinhibitthebraintissuecalcium／calmodulin．dependentproteinkinaseIV(Camk4)，c—Fos，JunBandotherlearningandmemory-relatedgenes，proteinexpressionaIldalsoCandestructionofbraintissueinlong—termmemory(LTM)formation．Accordingtotheliterature，theCamk4transcriptionandtranslationdependentonthepresenceoftwonuclearreceptors，thyroidhormonereceptor(TR)andretinoidXreceptorfRXR)inbrain．OurpreliminarystudieshavefoundthatTRl3whichisoneoftheTRreceptorsubtypesexpressedlowlyinthecerebellumofmiceexposedofAs，butarsenicalsoaffecttheRXRgeneexpressionhavenorelevantreportsintheWOrld．Objective：ToobservetheRXRgeneandproteinexpressioninthebraintissueofmiceexposedarsenicandtOclarifythemechanismofneurotoxicityinducedbvarsenic Methods：40SPFmicewererandomlydividedintofivegroupsbyweight：thecontrolgroup、1ppmAs203，2ppmAs203、4ppmAs203、bothof4ppmAs203and150mg／kgtaurine．ThemicebydrinkingthewatercontainingdifferentconcentrationsofAs203，theprotectiveagentweretreatedbyintragastricadministrationandtissueofbrainwasobtainedafter60daysofcontinuousexposure．ThecriticalgeneexpressionprofilesrelatedtoretinoidXreceptorinbraintissuewereanalyzedbyGeneChipandPCRmethod．WesternblottingandimmunohistochemistrywereusedtodetectRXRproteinexpressionandtissuedistribution．DataanalysisbySPSS11．5，Statisticalanalysisofbothsinglefactorusedtocomparedthesignificantdifferencebetweenthearsenicgroupandcontrolgroup，thecomprisonanalysisbetweenthetwogroupsuseLSDandtheratiolessthanO．05expressedsignificantdifference．Results：OurresultsshowedthatRXRwasup—regulatedinbraintissueofmiceexposedtoAsusingRealTimePCRmethod，confirmingtheresultofGeneChip，especially4ppmgroupraisedsignificantly(p<0．05)betweenthegroups．Meantime，WefunlleranalyzedtheinfluenceofAsoncerebrumRXRexpressionusingWesternblotmethod．ThequantityofRXRbandinthegroupexposedto4ppmAs203significantlyrisedcomparedtothecontrolgroupandexpresseddoes—relationship，agreeingwellwiththegenemicroarrayresult．ImmunohistochemistryshowedhighexpressionofRXRinthecerebrumofmicein4ppmgroup．Furthermore，theinterveningexperimentshowedthatthecoadministeredantioxidantstaurinescavengingROSinvivopartlyantagonizeRXRexpression．Conclusion：Thesub—chronicarsenicexposuremayincreasetheRXRgeneexpressionlevelsinthecerebrumofmice，butinthecerebellum，theRXRgeneexpressionleveldidnotsignificantlychange．ThetaurinecanantagonizeRXRgeneexpressionlevels．Itindicatsthatsub—chronicarsenicexposurebyAsmayinducetheRXRgeneabnormexpressionprobablyviaaoxidation·independentway．KeyWords：As203NeurotoxicityGeneexpressRetinoidXreceptor4 亚慢性砷暴露对小鼠脑组织RXR表达的影响硕士生姓名：王祥虎指导教师：朴丰源教授专业名称：劳动卫生与环境卫生学刖吾砷是一种广泛存在于自然环境中的类金属元素，为国际癌症研究机构(IARC)已确认的人类致癌物之一。地方性砷中毒是居住于特定地理环境下的居民长期通过饮水、空气和食物摄入过量的砷而引起的以皮肤系统损伤为主并累及神经、消化、心血管和呼吸等多个系统的全身性慢性中毒11捌。据世界卫生组织官员报道，全球有22个国家和地区至少5000万的人口遭受着砷中毒的威胁，国外受砷中毒严重危害的国家主要有阿根廷、加拿大、匈牙利、捷克、澳大利亚、智利、墨西哥、孟加拉国和印度等，中国也是砷中毒严重危害区之一，尤其是我国的山西、内蒙古、贵州、云南、陕西、宁夏和黑龙江等省(市)，其危害范围及人口呈逐年递增趋势13,4】，因此，砷的健康危害问题已受到全世界广泛关注。长期低剂量砷暴露可导致慢性砷中毒并累及多系统、器官功能障碍，其中对高级神经系统的功能损伤主要表现为学习、记忆下降和认知功能的障碍15J。国内外大量流行病学调查显示，长期砷暴露可改变儿童脑功能，导致智力发育障碍，砷中毒病区儿童的智力水平明显低于对照区【6J，Calderon等对人口因素进行控制后，通过流病调查发现儿童的言语智力水平与尿砷浓度呈负相关17】。动物实验结果表明，慢性砷中毒所致的神经损伤与砷在体内的蓄积量呈剂量反应关系，伴有学习、记忆功能的缺陷瞵J。据以上资料发现的神经行为学的异常改变，表明高级神经系统是砷进入体内的重要靶器官之一，因此，探讨砷的神经毒作用机制，并根据科学依据采取积极性的预防和治疗措施，使得儿童避免受砷的迸一步损伤并使受损的学习记忆功能得到恢复，具有十分重要的现实意义。学习和记忆属于脑的高级功能活动，其生物学基础依赖于长时程记忆(LTM)的形成19J。在中枢神经系统，cAMP反应序列结合蛋白(cAMPresponsiveelementbindingprotein，CREB)是LTM的形成过程中关键蛋白，CREB被磷酸活化后，促进CRE序列的转录并调节位于其下游的学习记忆相关基因(c—Fos、JunB等)的转录和蛋白表达。其中钙离子／钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(calcium／calmodulin．dependentproteinkinaseⅣ，CaMKIV)在CREB磷酸化活化介导的脑LTM形成过程中发挥重要作用llo，l¨。已有文献报道，Camk4与LTM 的形成有密切关系Il21。CaMKIV基因的转录和翻译是由三碘甲腺原氨酸(T3)与甲状腺激素受体(TR)一视黄酸类X受体(RXR)异二聚体(TR-RXR)结合而特异性介导的，此复合体的作用位点为CaMKⅣ基因上游启动子的TH反应元件(TRE)u3，14J。TR、RXR分别为核受体超家族的成员，其中TR的亚型成员中有TRal、TR]31、TRp2，可结合T3，为功能性受体。这些功能性受体与RXR结合以二聚体的形式与T3结合形成功能性复合体，从而解除CaMKlV基因启动子TRE的抑制状态，介导Camk4基因的表达115,16J。在体内，RXR与TR是以二聚体的形式发挥调控下游基因转录和翻译功能，另有文献报道【l71，在脂多糖(LPS)诱导的甲状腺功能综合症的小鼠肝组织中，LPS不仅影响TR的基因表达，还可影响RXR的基因表达。上述这篇文献提示，通过TR．RXR复合体影响下游基因表达的毒物，可能通过影响TR或RXR或TR-RXR复合体的基因表达，来干扰对下游信号通路的正常调控。本课题组前期研究已证实，砷暴露可显著抑制脑Camk4基因及蛋白的表达及学习相关基因c．Fos、JunB的表达【体J。有文献报道，Camk4的基因转录和翻译依赖于TR和RXR形成的异源二聚体ll引。本课题组前期研究发现，砷暴露能够明显抑制功能性TR及其介导的基因的表达，但是否也影响RXR基因表达国内外未见相关报道。因此，本研究采用基因芯片、RealtimePCR、Westernbolt和免疫组化等技术，对亚慢性砷暴露小鼠大、小脑组织中RXR的基因、蛋白表达水平进行了检测分析，为阐明砷的神经毒作用机制以防治砷的神经毒性危害提供靶标依据。材料和方法1．主要试剂、仪器及液体配置1．1试剂：三氧化二砷(As203)、HN03、tt202、牛磺酸(St．Louis，美国)；RNAisoPlus(宝生物工程有限公司，中国)；SYBR@PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)(宝生物工程有限公司，中国)；PrimeScript@RTreagentKit(PerfectRealTime)(宝生物工程有限公司，中国)；RNeasyMiniKit(德国OIAGEN公司)；GeneChip⑧Expression3’AmplificationOne—CycleTargetLabelingandControlReagents(Affymetrix，美国)；DEPC—Water(Ambion，美国)；HerringSpermDNA(Promega，美国)；BiotinylatedAntibody(VectorLabs，美国)；MESFreeAcidMonohydrateSigmaUltra，Sigma·Aldrich(Sigma，美国)；MESsodiumSalt，Sigma-Aldrich(Sigma，美国)；NaCI，5M，RNase．free，DNase．free(Sigma，美国)；SDS．PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物有限公司，中国)；RIPA强裂解液(碧云天生物有6 限公司，中国)；BeyoECLPlus(碧云天生物有限公司，中国)；考马斯亮蓝染色液(碧云天生物有限公司，中国)；丽春红染色液(碧云天生物有限公司，中国)；10％surfact．Amps20(Tween．20)(Pierce，美国)；SSPE，20x(Cambrex，美国)；R-PhycoerythrinStreptavidin(Invitrogen，美国)；DMSO(Sigma，美国)；BSA(美国Invitrogen公司)：13-Mercaptoethanol(上海Sagon公司)；PVDF膜(Millipore，美国)；凯基BCA蛋白含量检测试剂盒(凯基生物科技发展有限公司，中国)；RIPA强裂解液(碧云天生物有限公司，中国)；PMSF(碧云天生物有限公司，中国)；陀氓Ⅱ(美国Abcam公司)；RXRf；(美国SANTACRUS公司)；13-actin(美国SANTACRUS公司)；山羊抗兔IgG(美国Sigma公司)；山羊抗小鼠IgG(美国Sigma公司)。1．2仪器：Agilent7500ce型电感耦合等离子体质谱(Agilent7500ceIC削S，美国Agilent公司)；GeneArrayTM扫描仪3000(Affymetrix公司，美国)、全自动芯片洗涤工作站450(Affymetrix公司，美国)、基因芯片杂交箱640(Affymetrix公司，美国)、MicroarraySuiteVersion5．0分析软件(Affymetrix公司，美国)；超声细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司，中国)；HC．2518R高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司，中国)；徼电脑电热恒温水槽(上海博讯实业有限公司医疗设备常，中国)；DYCZ一240型垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂，中国)；DYY．12型电脑三恒多用电泳仪(北京市六一仪器厂，中国)；酶标仪(ThermoElectronCorporation，美国)。UVP凝胶成像系统(UVP公司，美国)；ThermalCyclerDiceRealTimeSystemTP800(TAKARA公司，日本)。1．2主要液体配制：(1)1．74mg／ml(10mmol／L)PMSF：取PMSF0．174g，再加入100ml异丙醇溶解之后，分装于1．5ml离心管中，．20℃保存。(2)10％SDS溶液：用天平秤取10g的SDS，再加蒸馏水至100ml，在50℃水浴下溶解之后，室温下保存。如果保存时间由于过长而出现沉淀，利用水浴进行溶化后，可继续使用。(3)10％过硫酸胺：取过硫酸胺O．1g，然后溶解于1．Oml去离子水。之后可在4℃下保存1周。(4)8xTfis·CI(pH8．8)：秤取182gTris碱溶解于300ml双蒸水，用lmol／HCl调pH值至8．8，然后，补加双蒸水至500ml，最后用O．45pm滤膜过滤溶液后4℃保存。(5)4xTris·CI(pH6．8)：40ml双蒸水中溶解6．05gTris碱，用1mol／HCl调至pH6．8，补加水至100ml。用0．45lxm滤膜过滤溶液后4℃保存。 (6)20％Tween20：Tween20取20ml，加去离子水至100ml，混匀后保存4℃冰箱中。(7)0．15mol／LNaCl：秤取NaCl(MW58．44)0．877g，加蒸馏水至100ml，然后，高温灭菌，室温20℃下保存。每次使用时将其稀释10倍后，浓度降至0．15mmol／LNaCl下应用。(8)5xSDS上样缓冲液：分别称取0．5mol／LTris．HCl(pH6．8)2．5ml，二硫苏糖醇(DTT)0．39g，SDS0．5g，溴酚蓝0．025g，甘油2．5“，混匀，然后分装于1．5ml离心管中，保存于4℃冰箱。(9)30％丙烯酰胺液：称取丙烯酰胺(Ach)29gN，N，．亚甲双丙烯酰胺(Bic)lg，再补加去离子水至100ml，用O．45pm滤膜滤去杂质，避光保存于4℃条件下。(10)电泳液缓冲液：称取Tris(MWl21．14)3．039，甘氨酸(MW75．07)l8．77g，SDS1g，往容量瓶内添加去离子水至1000ml，溶解后在室温条件保存备用。(11)转移缓冲液：甘氨酸2．9g，Tris碱5．8g，SDS0．37g，甲醇200ml，先用去离子水600ml溶解甘氨酸、Tris碱和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体至1000ml。(12)10xTBS缓冲液：在100ml1mol／L嘣s·C1(pH7．5)中溶解88gNaCl，补加去离子水至1000ml，每次使用时稀释成1xTBS缓冲液。(13)TBST缓冲液：加入1．65ml20％Tween20和700mlTBS于烧杯内，用搅拌子混匀之后即可使用，每次使用时最好现用现配。(14)封闭液：称取脱0．5g脂奶粉，加入10mlTBST溶解即可使用。(15)O．01mol／LPBS(pH7．2—7．4)：量取19ml的0．2mol／LN枷2P04，81m1的0．2mol／LNa2HP04，称取17gNaCl，最后加去离子水至2000ml。(16)0．02MPBS(pH7．2．7．6)：称取8．5g的氯化钠，2．8g的Na2HP04，0．4g的NaH2P04，最后加去离子水至1000ml。(17)0．01M枸橼酸盐缓冲液：称取3g的枸橼酸三钠(C6H5Na307·2H20)枸橼酸(C6H807·H20)0．4g，加蒸馏水至1000ml。(18)3％H202溶液：30％H2021份+去离子水10份混合而成。(19)50×Tris．乙酸电泳缓冲液(TAE)：将24．29"Iris碱，5．71ml冰乙酸和3．72gNa2EDTA·2H20溶解80ml去离子水，最后定容至100ml。每次使用时，用去离子水稀释成1xTAE。(20)6×DNA上样缓冲液的配制：秤取溴酚蓝25mg，二甲苯青FF25mg，甘油3ml，用6×TAE缓冲液定容至10ml。分装成1ml／管，在一20℃条件下8 保存。(21)0．1％DEPC水溶液：量取DEPC1m1，加入至1000ml双蒸水配成0．1％DEPC水，至于1000ml容量瓶中静置4小时之后，4。C保存备用。(22)DEPC处理水：量取DEPCO．1m1，加入双蒸水至100ml配成O．1％DEPC水，震荡摇匀后并过夜，然后再高压灭菌，最后保存备用。(23)75％乙醇溶液：量取无水乙醇75ml并用DEPC处理水定容至100m1，4℃冰箱保存备用。2．动物分组及处理实验动物均来自大连医科大学动物实验中心，SPF级小鼠40只，雌雄各半，体重(20-a：2)g，按体重将小鼠随机分为5组，即饮用水对照组、1ppmAs203染毒组、2ppmAs203染毒组、4ppmAs203染毒组、4ppmAs203+150mg／kg牛磺酸保护组。在室温为18-22℃的动物饲养房，实验小鼠正常饮食、饮水。实验小鼠通过自然饮用含不同剂量浓度As203蒸馏水方式暴露于砷，以灌胃方式给予保护剂(牛磺酸)是，每周2次。连续染毒60天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，提取大、小脑组织并在一80℃冻存备用。3．基因芯片3．1总RNA的提取分别将对照组和各实验组(1ppm、2ppm、4ppm和牛磺酸保护组)的小鼠大、小脑组织称量后置于液氮中研磨至呈粉末状之后，再加入1mLRNAisoPlus，保证完全覆盖实验组织，研磨至组织完全融化，之后将样品在15-30。C放置5min，使得核蛋白复合物完全分离，然后再12000rpm，4。C离心5min，取上清。每使用lm1TRNzol加O．2ml氯仿，盖好管盖，充分振荡15s，室温放置5min。4℃，12000rpm离一1二,15min，样品被分成三层：黄色的为有机相，中间层和上层无色的为水相，RNA主要存在于水相中，将水相(约500p．1转到新管中并在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温放置10min。在4。C条件下，12000rpm离，t二,lOmin。小心弃上清，然后缓慢沿离心管壁加入1mL75％乙醇(用RNase—freeddH20配制)洗涤沉淀。每使用lmLTRNzol，用至少l删75％乙醇对沉淀进行洗涤，轻轻上下颠倒洗涤离一tl,管壁，4。C条件下，12000rpm离心5min后小心弃乙醇，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离一tl,后，用枪头吸出，然后室温放置至晾干，再加入30．100ulRNase．free水，反复用吸管吹打，混匀直至RNA充分融解。3．2定量和检测总RNA利用紫外分光光度计对提取的RNA的产量进行检测，1OD=40I_tg／ml，计算在260nlTl、280nrn处的OD值。根据在260nlil和280nin处的吸光值，检测RNA9 的纯度，纯RNA的OD260／OD280比值应接近2．0(1．9"--'2．1之间为最佳比值)，然后用变性胶电泳质检测RNA是否发生降解。3．3纯化总RNA将总RNA的体积用RNase．free的水调整N100山，加入350lalRLT工作液充分混匀。然后加入250gl无水乙醇，再次充分混匀(不要离心)。之后将已经混匀好的700gl样品加到QIAGEN纯化柱中，>8000rpm，离心15秒。弃滤液，加入500glRPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，>8000rpm，离心15s。弃滤液，加入500p．1RPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，>8000rpm，离心2分钟。将纯化柱放入一个新的收集管，最大转速，离心1分钟。将纯化柱换入一个EP管中，在纯化柱膜中间加251．tlRNase．free的水，室温放置1分钟，最大转速，离心1min。将EP管中的样品移入另一个新的EP管中。3．4基因芯片杂交：将已经提取出的RNA反转录成cDNA，用RNA转录标记试剂盒进行体外转录合成cRNA探针，同时用生物素对cRNA探针进行标记；已标记的cRNA探针经片段化处理后与MouseGenome4302．0Araay基因芯片在杂交箱640中45。C杂交16h，然后，全自动芯片洗涤工作站450中洗脱、染色；最后，用GeneArrayTM扫描仪3000扫描杂交信号。4芯片数据处理和生物学信息分析：杂交结果用Affymetrix公司的MicroarraySuiteVersion5．0软件进行数据分析。在对单个样本表达分析的前提下，根据P0．06为不表达，分别建立对照组、低剂量组，高剂量组小脑组织的基因表达谱；然后将二者的基因表达谱进行比较，根据signallogratio(SLR)值判断。SLR>1(即表达倍数>21)为表达上调，SLR<一1(即表达倍数<2‘1)为表达下调，在对照组、低剂量组，高剂量组中筛选差异表达的基因探针号输入NetAffy网站(W'ww．affymetrix．corn)中进行批量处理查询(BatchQuery)，查询出相对应的基因和生物学信息。5．脑组织蛋白提取5．1颈椎脱臼法处死小鼠，冰盘上将小鼠断头后立即剪开头皮，除去硬脑膜和头盖骨，小心的分离出完整的脑组织，大、小脑分离开，用冰冷的生理盐水冲洗，以除去附着的血液。用滤纸吸干水分后称重，然后置于．80"C冷冻固化保存备用。5．2取冰冻的脑组织称重，按重量：体积(mg：ml=l：10)加入裂解液(10mM／LTris，150Mm／LNacl，5mM／LEDTA．2Na，1％Triton一100and1mM／LPMSFPH7．5)中，充分研磨使组织匀浆化(约30rain)，15000×g离心45min，收 集上清液．80。C保存备用。5．3BCA法蛋白定量(1)标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂表：BCA蛋白定量法(2)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50：1)配置适量BCA工作液，充分混匀；(3)各孔加入200glBCA工作液：(4)把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nln波长下比色测定OD值。以蛋白含量(“g)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线：(5)稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20¨l，加入BCA工作液200gl，充分混匀，37℃放置30min，以标准曲线0号管做参比，在562啪波长下比色，记录OD值；(6)根据所测样品的OD值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(gg)，除以样品稀释液总体积(2091)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(gg／91)。6．RealTimePCR测定RXR基因相对表达情况将脑组织在液氮中磨成粉末，用匀浆器对其进行充分匀浆，用RNAisoPlus试剂分别提取不同剂量组大脑和小脑总RNA，用PrimeScript@RTase反转录反应试剂盒将mRNA反转录成cDNA，用RealTimePCR反应试剂盒进行相对定量PCR检测，全部反应按试剂盒操作(以上试剂盒均为日本TAKARA公司提供)。GADPH作为内参。两个基因引物分别为：(由日本TAKARA公司合成) 7．WesternBlot测定RXR蛋白表达情况将脑组织在液氮中研磨，再用组织匀浆器充分匀浆，用RIPA强裂解液(碧云天生物有限公司提供)4℃条件下裂解细胞30min，在使用前数分钟加入PMSF，13000rpm，20min离心提取大、小脑组织总蛋白，BCA试剂盒对蛋白进行定量，13-actin作为内参，蛋白样品经10％SDS．PAGE电泳分离，电泳结束后湿式转膜35min，抗体结合，BCL显色并用UVP进行扫描分析。RXR．-一抗为兔抗小鼠多克隆抗体，稀释度为1：1000(v～)，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，稀释度为1：2500(v～)；13-actin：一抗为鼠抗鼠单克隆抗体，稀释度为1：350(v～)，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，稀释度为1：2000(V／v)。8．免疫组织化学方法测定大脑组织中RXR蛋白表达分布(1)石蜡切片脱蜡置水：置于通风处，二甲苯I脱蜡8min，二甲苯II脱蜡8min，然后，自来水冲洗，无水乙醇3min，95％乙醇3min，85％乙醇3min，75％乙醇3min。(2)PBSI、II、III、浸泡3分钟。(3)抗原修复：多数指标石蜡切片采用微波方法热修复。即将片子放入装有抗原修复液的容器中，至微波炉加热，使容器内液体温度保持在92"-'98℃，并持续10～15分钟。取出容器，室温20～30分钟自然晾凉(注意，不可将切片从缓冲液中取出冷却，以防止蛋白恢复原有的空间构型)，使蛋白复性。此方法不仅利用热效应，而且通过微波的直接作用，打开蛋白之间的交联键，将己被封闭的抗原决定簇暴露和修复。(4)PBSI、II、III、浸泡3分钟，用滤纸拭去片子上的PBS。(5)3％H202室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。(6)PBSI、II、III、浸泡3分钟，用滤纸拭去片子上的PBS。(7)5～10％正常山羊血清封闭，室温孵育15分钟。倾去血清，勿洗，滴加1：125(v／V)稀释兔抗鼠一抗(美国SANTACRUS公司)，40C过夜。(8)PBSI、II、III、浸泡3分钟，用滤纸拭去片子上的PBS。(9)滴加加入1：400(v～)稀释的山羊抗兔IgG．HRP(美国SIGMA公司)，37℃烤箱或室温l小时。(10)PBSI、II、III、浸泡3分钟，用滤纸拭去片子上的PBS。(11)DAB显色(美国SIGMA公司)(12)自来水充分冲洗，苏木素复染(可省略)，自来水冲洗，PBS洗两次，盐酸酒精2～3分钟，自来水冲洗(时间可稍长一些)。(13)自来水冲洗，酒精由低浓度到高浓度，二甲苯I、II、(2min／次) (14)树胶封片、结果判定并进行图像采集：以胞核、胞质内出现棕黄色或黄色反应判为阳性染色。9统计分析采用SPSS11．5统计软件，数据用i±S表示，用单因素方差分析(ANOVA)比较各染砷组与对照组间的统计学差异，两组间比较用LSD法分析，以P2和<-2分别代表基因表达上调和下调俨<0．05)．2．RealTimePCR定量检测结果：相对定量PCR研究发现大脑组织中RXRa、RXRfj基因在各剂量组之间表达上调，与基因芯片结果一致。通过人为的把内参基因表达量设为1，纵坐标数值即为目的基因与内参基因表达量的比，(尸<0．05)；在小脑组织中各剂量组之间RXRa、彤mp基因表达没有差异(尸>O．05)。 1．60E-031．铷E．0131．ooE弋b7+∞E"-04．I．OOE-041．a0E-04(A)1．20E_031．OOE—038．00E—046．00E—¨4．OOE■H2．OOE弋H0．00E+002．40E—03Z00E—031．d删31．20E—038．00E-044．00E—勺40．ooE+00ControlIppm2ppm4ppmTaurine+As(B)ControlIppm2ppm4ppmTaurine+．4s(C)Conn口lIppm2ppmJppmTaurine+．4z一一【l^一《：)o-cIJ℃-瞢o．．【IHoo>11．{写一一一一^一乙一：{I．1v一一I‘lt一