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学校代码：１０２８５学号＝２０１４４２２６０１６ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶ硕士学位论文）（学术学位基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因Ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｄｖｅｒｓｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｆｐｄｕｌｏｘｅｔｉｎｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｈｉｇｈｅｘｐｏｓｕｒｅｕｎｄｅｒｔｈｅｄｉａｂｅｔｉｃｃｏｎ－ｄｉｔｉｏｎａｎｄｄｒｕｄｒｕｇｉｇｐｌａｓｍａｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｇｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ研究生姓名牛广豪＿＿＿＾指导教师姓名张全英专业名称剂学研究方向药代动力学所在院部药学院论文提交日期２０１７年４月５ 学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。？ｙ°■瓜ｋ论文作者签名：日期■ｉ 学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在年月解密后适用本。＿规定非涉密论文口论文作者签名：斗績日期：导师签名：日？期：／ 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因中文摘要目的：比较度洛西汀（Duloxetine，DUL）在正常大鼠和糖尿病模型大鼠体内的药代动力学特征，研究度洛西汀和氟西汀（Fluoxetine，FLU）、度洛西汀和阿戈美拉汀(Agomelatine，AGO)基于血浆蛋白结合的相互作用，探讨不良反应发生的可能原因，进而为临床的合理用药提供理论基础。方法：（1）DUL在正常大鼠与糖尿病模型大鼠的血药浓度比较研究。建立液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法测定大鼠血浆中DUL的浓度。以地西®泮（Diazepam，DIA）为内标，色谱柱为WATERSXterraRP18（4.6×100mm，3.5-1-1μm），以甲醇：水（5mmol·L醋酸铵-0.3%甲酸）=75:25为流动相，流速为0.6mL·min，分析时间5.5min。用电喷雾离子源，正离子多反应监测方式检测，DUL和内标DIA的检测离子分别为DUL：m/z298.2→154.0，DIA（IS）：m/z285.5→154.0。采用甲醇直接沉淀蛋白对样品进行预处理。采用腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，将正常组与糖尿病模型组大鼠分-1别分为单次给药组和多次给药组，每组相同剂量(40mg·kg)灌胃给予DUL，于眼眶静脉丛采血测定血药浓度，用DAS3.2.3软件计算药动学参数，用SPSS22软件进行统计分析。（2）DUL在正常大鼠与糖尿病模型大鼠的组织分布比较研究。采用DUL在大鼠血浆中的分析条件，对大鼠组织（包括大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、大肠、睾丸、肌肉、脂肪）匀浆液进行方法学考察和定量测定。-1正常组与糖尿病模型组大鼠分别按照40mg·kg的剂量灌胃给予DUL，正常组大鼠分别于给药后1,2,5,11,24h分离大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、I 大肠、睾丸、肌肉、脂肪，制备成组织匀浆液后测定DUL的浓度。糖尿病模型组大鼠于给药后2h（即血浆中药物的达峰时间）分离上述组织脏器制成匀浆并测定DUL的浓度，并用SPSS22软件将各组织中DUL的含量进行统计分析。（3）DUL和FLU、DUL和AGO基于人血浆蛋白结合相互作用的研究。建立LC-MS/MS法同时测定人血浆和磷酸缓冲溶液(Phosphatebuffersolution，®PBS)中DUL，FLU，AGO的浓度。选用WATERSXterraRP18（4.6×100mm，3.5μm）-1色谱柱，流动相为甲醇（A）和含0.3%甲酸的5mmol·L醋酸铵水溶液（B），梯度洗脱（0~0.1min，65%A；0.1~2.5min，65%-80%A；2.5~4.5min，80%A；4.6~10min，65%A）。用电喷雾离子源，正离子多反应监测模式，待测物和内标地西泮的检测离子分别为：DUL：m/z298.2→154.0；FLU：m/z：310.1→148.2；AGO：m/z244.1→185.0；DIA（IS）：m/z285.5→154.0。将含药血浆分为对照组和实验组，对照组即DUL组、FLU组、AGO组；实验组即DUL+FLU组、DUL+AGO组。每组设置低、中、高三种浓度梯度，用平衡透析法分别测定每种药物的血浆蛋白结合率，将相同血药浓度下实验组药物的血浆蛋白结合率和对照组进行比较。结果：（1）DUL在正常大鼠与糖尿病模型大鼠的血药浓度比较研究。LC-MS/MS法测定大鼠血浆中DUL的浓度。方法学考察结果表明，在大鼠血浆中，内源性物质均不干扰DUL和内标的测定，测定方法具有较好的特异性。DUL在-1大鼠血浆中10~5000ng·mL的浓度范围内线性关系良好；批內、批间精密度均在可接受范围内，提取回收率较高且可重现，稳定性较好，且基质效应不影响测定。-1正常大鼠与糖尿病模型大鼠分别灌胃给予40mg·kgDUL，单次给药的主要药代-1动力学参数为：糖尿病组：Cmax为(1185±190.0)ng·mL，AUC0-∞为(8398±1835)-1-1ng·mL·h，tmax为(1.6±0.4)h，t1/2z为(3.6±0.9)h；正常组：Cmax为(368.1±40.7)ng·mL，-1AUC0-∞为(4145±640.1)ng·mL·h，tmax为(1.6±0.3)h、t1/2z为(4.1±0.8)h。多次给药的主-1要药代动力学参数为：糖尿病组：Cmax为(2597.5±969.5)ng·mL，AUC0-∞为-1(24597±13413)ng·mL·h，tmax为(1.8±0.3)h，t1/2z为(5.9±1.6)h；正常组：Cmax为-1-1(998.4±279.6)ng·mL，AUC0-∞为(9143±2442)ng·mL·h，tmax为(1.9±0.2)h、t1/2z为(5.4±1.8)h。在单多次给药试验中，糖尿病组的DUL暴露量（Cmax与AUC）均显著II 高于正常组，该结果提示糖尿病状态会使DUL的吸收增强，生物利用度提高，暴露量增大。（2）DUL在正常大鼠与糖尿病模型大鼠的组织分布比较研究。方法学考察结果表明，在大鼠上述组织匀浆液中，内源性物质均不干扰DUL和内标的测定，测定方法具有较好的特异性。DUL在大鼠组织匀浆液中0.1~100-1μg·mL的浓度范围内线性关系良好；批內、批间精密度均在可接受范围内，提取回收率较高且可重现，稳定性较好，且基质效应不影响测定。-1正常大鼠与糖尿病模型大鼠分别灌胃给予40mg·kgDUL后，两组的组织分布情况基本类似，除胃肠道以外，主要分布在肝脏、肺、脾脏、肾脏这些血液流动或体液交换较丰富的组织中。糖尿病组大脑中的药物含量是正常组的2倍-1（15.71±6.82vs8.431±4.79μg·g），但是无显著性差异，该结果提示在糖尿病状态下DUL在大脑中的含量有增高的趋势。（3）DUL和FLU、DUL和AGO基于人血浆蛋白结合相互作用的研究。LC-MS/MS法同时测定人血浆和PBS中DUL，FLU，AGO的浓度。在血浆和PBS这两种基质中，内源性物质均不干扰待测物和内标的测定，有良好的特异性。三种待测物的精密度、提取回收率、基质效应、稳定性考察，均在可接受的范围内。在4℃放置72h后，待测药物达到透析平衡。平衡透析法测得的DUL,FLU和AGO血浆蛋白结合率的分别为(96.59±0.47)%，(94.54±0.22)%，(95.61±1.11)%，且不具有浓度依赖性。实验组中相互作用的两种药物的血浆蛋白结合率，与对照组相比，无显著性差异。该结果表明DUL和FLU，DUL和AGO不存在血浆蛋白结合的相互作用。结论：（1）在正常大鼠与糖尿病模型大鼠的药代动力学比较研究中，糖尿病组血浆中DUL的暴露量显著增大，且大脑（靶组织）中DUL的药量也有增高的趋势，推测可能是糖尿病状态下DUL的吸收增强、口服生物利用度升高导致的。糖尿病状态下DUL的不良反应增多，可能和其暴露量增大有关。（2）DUL和FLU、DUL和AGO基于人血浆蛋白结合的相互作用的研究结果提示，DUL和FLU、DUL和AGO联合用药时所产生的药物相互作用及不良反应的增多，不是源于药物血浆蛋白结合率的变化，在今后的研究中，需更多的从药理学作用III 机制上做进一步探索。关键词：度洛西汀；糖尿病大鼠；药代动力学；组织分布；血浆蛋白结合率作者：牛广豪指导老师：张全英IV Studyonthepossiblemechanismofadversereactionsofduloxetinebasedonthehighexposureunderthediabeticconditionanddrug-drugplasmaproteinbindinginteractionsAbstractObjestive:Tocomparethepharmacokineticsinnormalanddiabetesmellitusratmodels.Andtosurveytheeffectsofduloxetinewithfluoxetine,duloxetinewithagomelatineonhumanplasmaproteinbinding.Thegoalistoexplorethepossiblemechanismofadversereactionsandprovideatheoreticalbasisfortheclinicalrationaldruguse.Methods:(1)Tocomparetheconcentrationofduloxetineinplasmabetweennormalratanddiabetesmellitusratmodels.Toestablishaliquidchromatography-tandemmassspectrometric(LC-MS/MS)methodforthedeterminationoftheduloxetineconcentrationinratplasma.Diazepamwas®usedasinternalstandard.TheseparationwasachievedonaWATERSXterraRP18column（4.6mm×100mm,3.5μm）withamobilephaseconsistingofmethanol-0.3%-1formicacidcontaining5mmol·Lammoniumacetate(75:25)attheflowrateof-10.6mL·min.Electrosprayionizationsourcewasappliedandoperatedinthepositivemultiplereactionmonitoringmode.Theanalyteswasdetectedunderthefollowingcondition:m/z298.2→154.0forduloxetine,m/z285.5→154.0fordiazepam.Plasmasampleswerepretreatedbymethanolprecipitation.Theratmodelsofdiabetesmellituswereestablishedbyintraperitonealinjectionofstreptozotocin.Duloxetinewasgivenbyintragastricadministrationtothenormaland-1diabeticrats40mg·kg,bothinthesingle-doseexperimentandinthemultiple-doseexperiment.Bloodsampleswerecollectedfromtheorbitalvenousplexustodeterminateduloxetineconcentrationintheplasma.ThepharmacokineticparameterswerecalculatedbyDAS3.2.3software.StatisticalanalysiswasperformedbySPSS22software.V (2)Tocomparetheconcentrationofduloxetineintissuehomogenatebetweennormalratanddiabetesmellitusratmodels.TousetheLC-MS/MSmethodofratplasmatodeterminatetheduloxetineconcentrationinrattissuehomogenate(includingbrain,heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,smallintestine,largeintestine,testis,muscle,fat).Duloxetinewasgivenbyintragastricadministrationtothenormalanddiabeticrats40-1mg·kg.Thebrain,heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,smallintestine,largeintestine,testis,muscleandfatseparatedandhomogenatedfordeterminationoftheconcentrationofduloxetine.StatisticalanalysiswasperformedbetweenthenormalanddiabetesgroupbySPSS22.(3)Toidentifytheinteractionofduloxetinewithfluoxetine,duloxetinewithagomelatinebasedonhumanplasmaproteinbinding.ToestablishaLC-MS/MSmethodforthesimultaneousdeterminationtheconcentrationofduloxetine,fluoxetineandagomelatineinhumanplasmaandphosphate®buffersolution(PBS).TheseparationwasachievedonaWATERSXterraRP18column(4.6mm×100mm,3.5μm)withamobilephaseconsistingofmethanol(A)-0.1%formic-1-1acidcontaining5mmol·Lammoniumacetate(B)attheflowrateof0.5mL·minundergradientelution(0~0.1min，65%A；0.1~2.5min，65%-80%A；2.5~4.5min，80%A；4.6~10min，65%A).Electrosprayionizationsourcewasappliedandoperatedinthepositivemultiplereactionmonitoringmode.Diazepamwasusedastheinternalstandardandtheanalytesweredetectedunderthefollowingcondition:m/z298.2→154.0forduloxetine,m/z310.1→148.2forfluoxetine,m/z244.1→185.0foragomelatine,m/z285.5→154.0fordiazepam.Controlgroupandexperimentalgroupwasestabolished.Andthecontrolgroupwasasfollow:duloxetinegroup,fluoxetinegroupandagomelatinegroup.Theexperimentalgroupwasasfollow:duloxetinewithfluoxetinegroup,duloxetinewithagomelatinegroup.Eachgroupcontainslow,mediumandhighconcentrationgradient.Theplasmaproteinbindingofeachdrugwasdeterminedbyequilibrationdialysismethod.Theplasmaproteinbindingofthedrugintheexperimentalgroupwascomparedwiththatofthecontrolgroupatthesamedrugconcentrationlevel.Results:(1)TocomparetheconcentrationofduloxetineinplasmabetweennormalratandVI diabetesmellitusratmodels.ToestablishtheLC-MS/MSmethodforthedeterminationoftheduloxetineconcentrationinratplasma.Themethodologicalevaluationshowedthattheendogenoussubstanceswouldnotinterferewiththedeterminationofduloxetineandinternalstandardinratplasma.Andthemethodshadgoodspecificity.Duloxetinehadagoodlinearityinthe-1concentrationrangeof10~5000ng·mLinratplasma.Theprecisionofintra-dayandinter-dayarebothwithintheacceptablerange,Theextrationrecoverywashighandreproducible.Thestabilitywaswell,andthematrixeffectwouldnotaffectthedetermination.Inthesingle-doseexperiment,themajorpharmacokineticparametersofdiabetes-1-1groupwereasfollows:Cmax(1185±190.0)ng·mL;AUC0-∞(8398±1835)ng·mL·h;tmax(1.6±0.4)h;t1/2z(3.6±0.9)h.Themajorpharmacokineticparametersofnormalgroupinthe-1single-doseexperimentwereasfollows:Cmax(368.1±40.7)ng·mL;AUC0-∞(4145±640.1)-1ng·mL·h;tmax(1.6±0.3)h;t1/2z(4.1±0.8)h.Inthemultiple-doseexperiment,themajorpharmacokineticparametersofdiabetesgroupwereasfollows:Cmax(2597.5±969.5)-1-1ng·mL，AUC0-∞(24597±13413)ng·mL·h，tmax(1.8±0.3)h，t1/2z(5.9±1.6)h.Themajorpharmacokineticparametersofnormalgroupinthemultiple-doseexperimentwereas-1-1follows:Cmax(998.4±279.6)ng·mL，AUC0-∞(9143±2442)ng·mL·h，tmax(1.9±0.2)h、t1/2z(5.4±1.8)h.Bothinthesingle-doseexperimentandinthemultiple-doseexperiment,duloxetineexposure(CmaxandAUC)inthediabetesgroupweresignificantlyhigherthanthoseinthenormalgroup.Theresultsshowedthattheconditionofdiabeteswouldincreasetheexposureofduloxetine,andthatcouldbeduetoincreasedabsorptionorbioavailability.(2)Tocomparetheconcentrationofduloxetineintissuehomogenatebetweennormalratanddiabetesmellitusratmodels.Themethodologicalevaluationofrattissuehomogenateshowedthattheendogenoussubstanceswouldnotinterferewiththedeterminationofduloxetineandinternalstandardintissuehomogenate.Andthemethodshadgoodspecificity.Duloxetinehadagood-1linearityintheconcentrationrangeof0.1~100μg·mLinthosetissuehomogenate.Theprecisionofintra-dayandinter-daywerebothwithintheacceptablerange,Theextrationrecoverywashighandreproducible.Thestabilitywaswell,andthematrixeffectwouldnotaffectthedetermination.Thetissuedistributionsofduloxetinebetweenthetwogroupsisbasicallysimilar.InVII additiontothegastrointestinaltract,duloxetinemainlydistributedinthetissueswithfasterbloodflowormoreabundantbodyfluidexchange,suchasliver,lung,spleenandkidney.Thedrugcontentinthebrainofthediabetesgroupwastwicehigherthanthatofthe-1normalgroup(15.71±6.82vs8.431±4.79μg·g),eventhoughtherewasnosignificantdifferenceinthestatistics.Theresultssuggestedthatthecontentofduloxetineinthebrain,whichwasthepharmacodynamictargettissue,hadanincreasingtendencyinthediabeticcondition.(3)Toidentifytheinteractionofduloxetinewithfluoxetine,duloxetinewithagomelatinebasedonhumanplasmaproteinbinding.ToestablishaLC-MS/MSmethodforthesimultaneousdeterminationtheconcentrationofduloxetine,fluoxetineandagomelatineinhumanplasmaandPBS.BothinplasmaandPBS,endogenoussubstanceswouldnotinterferewiththedeterminationoftheanalyteandinternalstandard.Thespecificity,precision,extractionrecovery,matrixeffect,andstabilityofthethreeanalyteswereallwithintheacceptablerange.Theplasmaproteinbindingofduloxetine,fluoxetineandagomelatinewere(96.59±0.47)%,(94.54±0.22)%and(95.61±1.11)%respectively,whichwasnotdependentonconcentration.Therewasnosignificantdifferenceinplasmaproteinbindingbetweentheexperimentgroupcomparedwiththecontrolgroup.Theresultsindicatedthatduloxetinewithfluoxetine,duloxetinewithagomelatinedidnotshowplasmaproteinbindinginteraction.Conclusions:(1)Tocomparethepharmacokineticsofduloxetinebetweennormalratanddiabetesmellitusratmodels,inthediabetesgroup,theduloxetineexposurewassignificantlyincreased,andtheduloxetinecontentinthebrainalsohadanincreasingtendency.Thesemaybecausedbytheincreasedoralbioavailabilityofduloxetineindiabetescondition.Theadversereactionsofduloxetinemaybecausedbythehigherexposureunderthediabetescondition.(2)Toidentifytheinteractionofduloxetinewithfluoxetine,duloxetinewithagomelatinebasedonhumanplasmaproteinbinding.Theresultssuggestedthattheincreaseindruginteractionsandintheadversereactions,whenduloxetineco-administeredwithfluoxetineoragomelatine,wasnotcausedbytheplasmaproteinbindinginteraction.Inthefuturestudy,theinteractionbasedonpharmacologicalmechanismcouldbefurtherVIII considered.Keywords：duloxetine；diabetesrat；pharmacokinetics；tissuedistribution；plasmaproteinbindingWrittenby:NiuGuanghaoSupervisedby:ZhangQuanyingIX 目录前言....................................................................................................................................1第一章度洛西汀在正常和糖尿病大鼠体内的血药浓度比较研究..............................3第一节建立测定大鼠血浆中度洛西汀浓度的LC-MS/MS方法.................................3第二节度洛西汀在正常和糖尿病大鼠体内的血药浓度比较研究............................21第三节讨论与结论........................................................................................................26第二章度洛西汀在正常和糖尿病大鼠体内的组织分布比较研究............................27第一节建立测定大鼠组织中度洛西汀浓度的LC-MS/MS方法...............................27第二节度洛西汀在正常和糖尿病大鼠的组织分布比较研究....................................45第三节讨论与结论........................................................................................................48第三章度洛西汀的血浆蛋白结合率及其相互作用......................................................49第一节建立同时测定人血浆和透析液中度洛西汀、氟西汀、阿戈美拉汀浓度的LC-MS/MS方法..............................................................................................................49第二节度洛西汀的血浆蛋白结合率及其相互作用....................................................66第三节讨论与结论........................................................................................................70总结与展望..........................................................................................................................72参考文献..............................................................................................................................74综述..................................................................................................................................78参考文献..........................................................................................................................83缩写词表..............................................................................................................................86攻读硕士期间发表的文章..................................................................................................87致谢..................................................................................................................................88 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因前言前言度洛西汀（duloxetine，DUL）是第二代选择性5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）再摄取双重抑制剂，同时还具有轻微抑[1,2]制多巴胺再摄取的作用。它主要通过抑制中枢神经系统中的5-HT和NE转运体的活性，来提高5-HT和NE的浓度，从而发挥调控情感和抑制对疼痛的敏感程度等的[3]药效。临床上主要用于治疗抑郁症、广义焦虑症、应力性尿失禁、糖尿病周围神经[4]痛、纤维肌痛等。最近有研究表明它对骨关节痛和背痛疼等慢性疼痛也有较好的疗[5-8]效。[9]DUL口服给药的吸收程度较好，在人体的tmax约为6h，t1/2约为12h；在大鼠[10]体内的tmax约为2h，t1/2约为3h。DUL在机体组织中的分布广泛，一项大鼠的放射性同位素标记实验表明，DUL的生物利用度约为82%，血浆中原型药物的AUC仅[3]占总放射量的4%，大脑皮层中的药物浓度远远高于血浆。DUL在体内经广泛代谢，主要代谢酶为CYP1A2，主要代谢产物为与葡萄糖醛酸结合的4-羟基度洛西汀和与硫[11]酸共轭的4-羟基-5-甲氧基度洛西汀。大鼠体内的主要代谢产物与人体内的相同，[3]14代谢物均没有药理活性。C标记的DUL在给药后，大约72%的放射性物质以代谢物的形式经尿液排出，直到给药后96小时之后从粪便中检测到少量的DUL（小于给[12]药剂量的5%）。糖尿病是当前威胁全球人类健康的最主要的非传染性疾病之一，根据国际糖尿病联盟统计，2011年全球糖尿病患者人数已达3.7亿，其中80%在发展中国家，估计到[13]2030年全球将有近5.5亿糖尿病患者。作为首个被FDA批准的用于治疗糖尿病周[14]围神经痛的药物，DUL同时也可用于治疗伴随糖尿病的抑郁症。随着DUL的广泛应用，其不良反应的报道也逐渐增多，常见的主要有恶心、嗜睡、头疼、口干、尿潴[15-18]留和便秘等，甚至还有肝损伤的报道。已有文献报道DUL用于糖尿病神经痛患者时，疗效虽然显著强于安慰剂，但不良反应发生率却大大提高，高于安慰剂组2[4,18,19]倍以上。[20-22]在糖尿病病理状态下，机体的一些代谢酶和转运蛋白也会发生变化。临床上，糖尿病患者也往往伴随有心脑血管、肝脏或肾脏等器质性病变，甚至会有癌症的发生1 前言基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因[13,23]。已有研究报道，科罗索酸和小檗碱在糖尿病大鼠体内的暴露量明显高于正常大[24,25]鼠。因此，糖尿病状态下DUL的药代动力学行为可能会发生改变，体内暴露量的变化可能与其药效和不良反应有着密切的关系。然而，少有研究关注DUL在糖尿病状态的药代动力学特征。临床上对于DUL的应用，常常需要两种或两种以上的药物联合用药。DUL和氟[17]西汀（fluoxetine，FLU）联用可治疗重度抑郁症。DUL和阿戈美拉汀(agomelatine，[26]AGO)联用治疗抑郁失眠症状，另外有研究表明DUL和AGO还可以协同抑制神经[27]PC12细胞的氧化应激和凋亡。它们联合用药时的药物相互作用受到学者们的广泛[26,28]关注，已有研究表明它们联用时的不良反应发生率显著升高。例如，DUL和FLU[17][29,30]联用时有肝损伤的报道，DUL和AGO联用时有过度出汗和静坐不能的报道。[26,31]而它们联合用药时，药物的体内浓度并未发生显著变化。但是，这三种药物的血浆蛋白结合率（plasmaproteinbinding，PPB）都很高，DUL的血浆蛋白结合率约为[26]96%，FLU和AGO的血浆蛋白结合率约为95%，且都主要结合于白蛋白和α1-酸[1,32,33]性糖蛋白上。而两种高血浆蛋白结合率的药物联用时，二者可能会竞争性地和血浆蛋白结合，一旦血浆蛋白结合率稍有变化，便会对游离药物的浓度产生较大的影[34-36]响，进而产生药效或毒性的改变。因此，本课题考察DUL和FLU、DUL和AGO联合应用时的血浆蛋白结合率，探讨药物相互作用的可能机制。本研究建立LC-MS/MS法测定大鼠血浆及组织匀浆液中DUL的浓度，并比较正常及糖尿病状态下大鼠体内暴露量的差异；同时，建立平衡透析法结合LC-MS/MS法测定DUL、FLU、AGO在人血浆中的蛋白结合率，并探讨药物间的血浆蛋白结合相互作用，进而探索应用度洛西汀时不良反应发生的可能原因。2 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章第一章度洛西汀在正常和糖尿病大鼠体内的血药浓度比较研究DUL是第二代选择性5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取双重抑制剂，它是首个被[14]FDA批准的用于治疗糖尿病周围神经痛的药物。在糖尿病病理状态下，机体的一些代谢酶和转运蛋白会发生变化，甚至有一些器质性病变，可能会影响药物的代谢进[13,20-23]而影响药物的效应。本实验建立LC-MS/MS法测定大鼠血浆中DUL的浓度，并对DUL在正常和糖尿病大鼠体内的血浆药代动力学做比较研究。第一节建立测定大鼠血浆中度洛西汀浓度的LC-MS/MS方法1材料1.1仪器LC-MS/MS系统：Agilent1260高效液相色谱仪，Agilent公司，美国；API-4000型三重四极杆串联质谱仪，AppliedBiosystemSciex公司，美国；数据处理系统为Analyst1.6，AppliedBiosystemSciex公司，美国。分析天平：XS105DU型（Max2=41g，d2=0.01mg），METTLERTOLEDO公司，瑞士；SARTORIOUSBP121型（Max=120g，d=0.1mg），赛多利斯公司，德国。高速低温离心机：EppendorfCentrifuge5424R，Eppendorf公司，德国。涡旋混合器：VortexGenie-2，ScientificIndustries公司，美国。超声波震荡仪：AS7240B，天津奥特赛思斯特仪器有限公司，中国。超纯水系统：Milli-QAcademic，MILLIPORE公司，美国。冷藏柜：青岛海尔特种电冰柜有限公司，中国。低温冰箱、冰柜：MDF-U333（设定温度-30℃），SANYO公司，日本；MDF-436（设定温度-35℃），松下公司，日本；MDF-U5411（设定温度-40℃），SANYO公司，日本。移液器：2-20μL、10-100μL、20-200μL、100-1000μL、0.5-5mL，Eppendorf公司，德国。3 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因1.2试剂甲醇：Merck.KGaA，HPLC级。甲酸99%：ANAQUACHEMICALSUPPLY，HPLC级。水：石家庄四药有限公司，灭菌注射用水。醋酸铵：国药集团化学试剂有限公司，分析纯。盐酸度洛西汀：迈基生物，批号GHS151012Y，含量99%。地西泮，中检所，批号171225200302，含量100%2方法2.1分析条件®色谱条件色谱柱：WATERSXterraRP18（4.6×100mm，3.5μm），预柱：TMPhenomenexSecurityGuardC18（4×3.0mm）；流动相：甲醇-含0.3%甲酸的5-1-1mmol·L醋酸铵水溶液=75:25；柱温20℃；流速0.6mL·min；进样体积5μL；每个样本的分析时间为5.5min。质谱条件电喷雾离子源，正离子电离模式，多反应监测扫描方式，碰撞气：6psi，气帘气：10psi，雾化气：60psi，加热辅助气：50psi，电喷雾电压：3500V，离子源温度:550℃；待测物和地西泮（内标）的检测离子分别为：度洛西汀：m/z298.2→154.0，地西泮（IS）：m/z285.5→154.0。具体的色谱条件和质谱参数见表1-14 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章表1-1大鼠血浆样本的分析条件HPLC条件®色谱柱XterraRP18（4.6×100mm，3.5μm）TM预柱PhenomenexSecurityGuardC18（4×3.0mm）柱温20℃-1流动相5mmol·L醋酸铵水溶液（含0.3%甲酸）：甲醇=25:75（v/v）运行时间5.5min进样体积5μL自动进样器温度4℃切换阀：0~0.1minA通道，0.1min~5.5minB通道MS条件离子源ESI离子极性Positive扫描模式MRMPrecursorProductDwellDPEPCECXP检测离子IonIonTime（Da）（Da）（msec）（V）（V）（V）（V）度洛西汀298.2154.020045104010地西泮（内标）285.5154.020058105210碰撞气（CAD）6psi气帘气（CUR）10psi雾化气1（GS1）60psi加热辅助气2（GS2）50psi电喷雾电压（IS）3500V离子源温度（TEM）550℃2.2溶液的配制2.2.1标准曲线储备液及工作液的配制精密称取适量度洛西汀对照品（相当于20mg度洛西汀），转移至10mL容量瓶-1中，并用甲醇定容至刻度，混匀得到2.0mg·mL度洛西汀标准曲线储备液I，于冷藏柜中储存。以甲醇为溶剂，于1.5mL塑料离心管中按表1-2配制标准曲线工作液SW1~SW8。5 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因表1-2标准曲线工作液的稀释源溶液吸取体积甲醇加入体积理论浓度标准曲线工作液源溶液-1（μL）（μL）（μg·mL）标准曲线储备液Ⅱ标准曲线储备液I250750500.0SW8标准曲线储备液Ⅱ250750125.0SW7SW856024087.50SW6SW740030050.00SW5SW635035025.00SW4SW53007007.500SW3SW43006002.500SW2SW33007000.7500SW1SW23006000.25002.2.2质控储备液及工作液的配制称取适量度洛西汀对照品（相当于20mg度洛西汀），转移至10mL容量瓶中，·-1并用甲醇定容至刻度，混匀得到2.0mgmL度洛西汀质控储备液I，于冷藏柜中储存。以甲醇为溶剂，于1.5mL塑料离心管中按表1-3配制质控工作液QCWL、QCWM、QCWH及最低定量限工作液LLOQW。表1-3质控工作液及LLOQ工作液的稀释源溶液吸取体积加入甲醇体积理论浓度质控系列工作液源溶液-1（μL）（μL）（μg·mL）质控储备液Ⅱ质控储备液I5005001000QCWH质控储备液Ⅱ100900100.0QCWMQCWH24056030.00质控工作液IQCWM1009003.000QCWL质控工作液I1507500.5000LLOQWQCWL4004000.25002.2.3内标工作液的配制称取适量地西泮对照品（相当于10mg地西泮），转移至10mL容量瓶中，并用-1甲醇定容至刻度，混匀得到1.0mg·mL内标储备液I，冷藏保存。以甲醇为溶剂，于100mL容量瓶中按表1-4配制内标工作液。6 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章表1-4内标工作液的稀释源溶液吸取体积甲醇定容理论浓度内标工作液源溶液-1（mL）（mL）（μg·mL）内标工作液内标储备液I510050.002.3样本的处理和测定2.3.1空白血浆样本（DB）的处理和测定吸取50μL空白血浆至1.5mL塑料离心管中，加入150μL甲醇沉淀蛋白，涡旋-11min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取10μL上清液至进样瓶中，加入190μL流动相，涡旋混匀，按“2.1分析条件”进样测定。2.3.2空白血浆加入内标样本（BK）的处理和测定吸取50μL空白血浆至1.5mL塑料离心管中，加入10μL内标工作液，涡旋混-1匀后加入140μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取10μL上清液至进样瓶中，190μL流动相，涡旋混匀，按“2.1分析条件”进样测定。2.3.3标准曲线血浆样本的制备和测定分别吸取2μL度洛西汀SW1~SW8的标准曲线工作液至1.5mL塑料离心管中，并加入空白血浆48μL，涡旋混匀，制备成相当于含度洛西汀浓度为10.00、30.00、-1100.0、300.0、1000、2000、3500、5000ng·mL的S1~S8标准曲线血浆样本，加入-110μL内标工作液，涡旋混匀后加入140μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取10μL上清液至进样瓶中，加入190μL流动相，涡旋混匀，按“2.1分析条件”进样测定。2.3.4质控血浆样本的制备和测定分别吸取2μL度洛西汀QCWL、QCWM和QCWH的质控工作液至1.5mL塑料离心管中，并加入空白血浆48μL，涡旋混匀，配制成低（QCL）、中（QCM）、高（QCH）-13种不同浓度的质控血浆样本：低浓度质控血浆样本（QCL，20.00ng·mL）、中浓度-1-1质控血浆样本（QCM，1200ng·mL）、高浓度质控血浆样本（QCH，4000ng·mL），加入10μL内标工作液，涡旋混匀后加入140μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000-1r·min、4℃离心10min。吸取10μL上清液至进样瓶中，加入190μL水相，涡旋混匀，按“2.1分析条件”进样测定。7 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因2.3.5含药血浆样本的处理和测定吸取含药血浆50μL至1.5mL塑料离心管中，加入内标工作液10μL，加入甲醇-1140μL沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min，吸取上清液10μL至进样瓶中，加流动相190μL，涡旋混匀，按“2.1分析条件”进样测定。2.4方法学考察2.4.1特异性按“2.3样本的处理和测定”项操作，分别考察6种不同来源的大鼠空白血浆样本、空白血浆加入内标样本、空白血浆加入度洛西汀样本、给药后大鼠血浆加入内标样本，记录色谱图，度洛西汀的保留时间tR和峰面积As，内标保留时间tRi和峰面积Ai。2.4.2标准曲线与线性范围取大鼠标准血浆系列样品50μL，按“2.3.3标准曲线血浆样本的制备和测定”项操作，以度洛西汀的加入浓度C为x轴，以待测物峰面积As与内标峰面积Ai的比值f2(f=As/Ai)为y轴进行权重回归(权重系数为1/C)，同时计算每个浓度实测值的RE。接受标准：最低浓度点的RE在±20%以内，其余浓度点的RE在±15%以内；相关系数r≥0.99。2.4.3最低定量限与精密度和准确度吸取2μL度洛西汀LLOQW、QCWL、QCWM和QCWH工作液至1.5mL塑料离心管中，并加入大鼠空白血浆48μL，涡旋混匀，制备成最低定量限血浆样本，平行制备6份，加入10μL内标工作液，涡旋混匀后加入140μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1-1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取10μL上清液至进样瓶中，加入190μL流动相，涡旋混匀，按“2.1分析条件”进样测定。每个浓度制备6个样本，每天1批，连续测定3批，每批随行一条标准曲线。记录色谱图、度洛西汀峰面积As和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值f(f=As/Ai)，将f值代入随行标准曲线求得实测浓度。用Excel软件将同一浓度3批共18个样本的实测浓度进行单因素方差分析，分别得到差异源为组内和组间的MS值，计算同一浓度所有样本的实测浓度平均值C（N=18）。组内MS批内RSD=×100%C组间MS批间RSD=×100%C8 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章RE=CCC100%实测加入加入接受标准：低、中、高3种浓度质控血浆样本RE应在±15%以内，RSD＜15%；最低定量限血浆样本RE应在±20%以内，RSD＜20%。2.4.4基质效应对照样本（R）：吸取48μL水至1.5mL塑料离心管中，共18个样本，分别加入140μL甲醇，涡旋1min，分别加入2μL度洛西汀QCWL、QCWM、QCWH质控工作液，每个浓度平行制备6个样本，所有样本各加入10μL内标工作液，涡旋混匀后，吸取10μL该溶液至进样瓶中，加入190μL流动相涡旋混匀，按“2.1分析条件”进样测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积A和内标峰面积A。S对照i对照血浆基质样本（T）：取6个不同来源的大鼠空白血浆48μL至1.5mL塑料离心管中，共30个样本（每个来源的大鼠空白血浆平行取5份），涡旋混匀后分别加入-1140μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min，取出上清液作为血浆基质样本溶样溶剂。另取数个塑料离心管，分别加入2μL度洛西汀QCWL、QCWM、QCWH质控工作液，每个浓度平行制备6个样本，所有样本各加入10μL内标工作液，再加入不同来源的血浆基质样本溶样溶剂188μL，涡旋混匀后，吸取10μL该溶液至进样瓶中，加入190μL流动相涡旋混匀，按“2.1分析条件”进样测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积A和内标峰面积A。S血浆i血浆按MEAA100%计算不同浓度质控水平度洛西汀的基质效应，按S血浆S对照MEAA100%计算所有血浆基质样本中内标的基质效应，再按ii血浆i对照MFME/ME100%计算内标归一化基质效应因子及其RSD（n=18）。i接受标准：内标归一化基质效应因子的RSD＜15%。2.4.5提取回收率对照样本（R）：取6个不同来源的大鼠空白血浆48μL至1.5mL塑料离心管中，共18个样本（每个来源的空白血浆平行取3份），涡旋混匀后分别加入140μL甲醇-1沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min，取尽上清液作为对照样本溶样溶剂。另取数个塑料离心管，分别加入2μL度洛西汀QCWL、QCWM、QCWH质控工作液，每个浓度平行制备6个样本，所有样本加入10μL内标工作液，再加入9 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因不同来源的对照样本溶样溶剂，涡旋混匀后，吸取10μL该溶液至进样瓶中，加入190μL流动相涡旋混匀，按“2.1分析条件”进样测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积A和内标峰面积A。S对照i对照血浆提取样本（T）：按“2.3.4”项配制低、中、高3种不同浓度的质控血浆样本（每个浓度用6个不同来源的空白血浆平行制备6份），涡旋混匀后加入10μL内标工作-1液，涡旋混匀后加入140μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min，吸取10μL上清液至进样瓶中，加入190μL流动相涡旋混匀，按“2.1分析条件”项测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积A和内标峰面积A。S提取i提取按RECAA100%计算不同浓度质控水平度洛西汀的提取回收率，S提取S对照同时计算每个浓度水平REC的Mean、SD和RSD（n=6）。按RECAA100%计算所有血浆提取样本中内标的提取回收率，同ii提取i对照时计算所有血浆提取样本中RECi的Mean、SD和RSD（n=18）。2.4.6稳定性2.4.6.1度洛西汀储备液的稳定性精密称取盐酸度洛西汀对照品适量（相当于20mg度洛西汀），转移至10mL容-1量瓶中，并用甲醇定容至刻度，混匀得到2.0mg·mL度洛西汀供试溶液，分装于若干1.5mL塑料离心管中，分别于室温下放置2天、冷藏柜中保存20天后测定，供试溶液测定时新配制度洛西汀储备液作为对照溶液，所有溶液平行配制2份。样本的处理及测定：吸取度洛西汀供试溶液或对照溶液按表1-5稀释，取稳定性-1考察工作液（0.01000μg·mL）200μL至进样瓶中，加入水相600μL，涡旋混匀后按“2.1分析条件”进样测定，每份样本连续测定3次，记录色谱图和度洛西汀的峰面积As。表1-5度洛西汀储备液稳定性工作液的配制步骤源溶液吸取体积加入甲醇体积理论浓度系列溶液源溶液-1（μL）（μL）（μg·mL）工作液I储备液100900200.0工作液II工作液I10090020.00工作液III工作液II1009002.000工作液Ⅳ工作液III1009000.2000工作液Ⅴ工作液Ⅳ1009000.02000稳定性考察工作液工作液Ⅴ5005000.0100010 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章计算度洛西汀储备液的对照溶液峰面积A与浓度C的比值f（fAC），RRRRRR并计算f的RSD（N=6）。同时计算室温下放置4天、冷藏柜中保存30天后的供试R溶液峰面积A与浓度C的比值f（fAC），并计算f的RSD（N=6）。计算fTTTTTTTR的平均值f以及f的平均值f，以f与f计算RE。RTTRTRE=（f-f）/f×100%TRR2.4.6.2内标（地西泮）储备液稳定性精密称取地西泮对照品适量（相当于10mg地西泮），转移至10mL容量瓶中，-1并用甲醇定容至刻度，混匀得到1.0mg·mL地西泮供试溶液，分装于若干1.5mL塑料离心管中，分别于室温下放置4天、冷藏柜中保存30天后测定，供试溶液测定时新配制地西泮储备液作为对照溶液，所有溶液平行配制2份。样本的处理及测定：吸取地西泮供试溶液或对照溶液按表1-6稀释成稳定性考察-1工作液（0.1000μg·mL），取该工作液200μL至进样瓶中，加入水相600μL，涡旋混匀后按“2.1分析条件”进样测定，每份样本连续测定3次，记录色谱图和地西泮的峰面积Ai。表1-6内标储备液稳定性工作液的配制步骤源溶液吸取体积加入甲醇体积理论浓度系列溶液源溶液-1（μL）（μL）（μg·mL）工作液I储备液100900100.0工作液II工作液I10090010.00工作液III工作液II1009001.000稳定性考察工作液工作液III1009000.1000计算地西泮储备液的对照溶液峰面积A与浓度C的比值f（fAC），并RRRRRR计算f的RSD（N=6）。同时计算室温下放置4天、冷藏柜中保存71天后的供试溶R液峰面积A与浓度C的比值f（fAC），并计算f的RSD（N=6）。计算fTTTTTTTR的平均值f以及f的平均值f，以f与f计算RE。RTTRTRE=（f-f）/f×100%TRR2.4.6.3血浆样本稳定性按“2.3.4”项制备含度洛西汀的低、中、高3种浓度的稳定性血浆样本，每个浓度3个样本。分别于室温下放置6h、冰箱中（设定温度-30℃）保存并反复冻融3次、11 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因冰箱中（设定温度-30℃）保存至7天。稳定性样本按“2.3.5”项处理测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积As和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值f（f=As/Ai），将f值代入随行标准曲线求得实测浓度和RE，并计算RSD（N=3）。RE=C实测C加入C加入×100%2.4.6.4待进样样本的稳定性按“2.3.4”项制备含度洛西汀的低、中、高3种浓度的稳定性血浆样本，每个浓度3个样本，再按“2.3.5”项下操作处理得到稳定性待进样样本，于自动进样器（设定温度4℃）24h后按“2.1分析条件”项测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积As和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值f（f=As/Ai），将f值代入新制随行标准曲线求得实测浓度和RE，并计算RSD（N=3）。RE=C实测C加入C加入×100%3方法学考察结果3.1特异性在选定的LC-MS/MS条件下，度洛西汀和内标地西泮的产物离子全扫描质谱图见图1-1，方法的特异性色谱图见图1-2。如图1-2所示，度洛西汀和内标的保留时间分别为2.02min和3.55min左右，血浆中内源性物质对测定无干扰，所以本测定方法具有较高的特异性，可用于大鼠血浆中度洛西汀浓度的测定。DULDIA（IS）图1-1DUL和DIA产物离子全扫描12 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章图1-2典型的度洛西汀大鼠血浆样本色谱图A:空白大鼠血浆;B:空白大鼠血浆加入内标;C:LLOQ大鼠血浆样本;D:度洛西-1汀40mg·kg灌胃给药后的大鼠血浆加入内标3.2标准曲线与线性范围-1度洛西汀在大鼠血浆中的线性范围为10~5000ng·mL，浓度与峰面积的比值具有良好的线性关系，标准曲线各浓度点实测值的RE均在±15%以内，r值均在0.9953~0.9994之间，结果见表1-7，血浆标准曲线见图1-3。表1-7度洛西汀在大鼠血浆的标准曲线回归方程及相关系数批次回归方程相关系数1y=0.00789x+0.00695r=0.9974大鼠血浆样本2y=0.00836x+0.0169r=0.99943y=0.00842x+0.017r=0.9953注：y为待测物与内标峰面积比，x为血浆中度洛西汀的药物浓度13 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因45403530252015AnalyteArea/ISArea105005001000150020002500300035004000450050005500AnalyteConc./ng·mL-1图1-3大鼠血浆中度洛西汀的标准曲线（第二批）3.3最低定量限最低定量限测定结果见表1-8，结果表明：本方法中度洛西汀的LLOQ为10.00-1ng·mL，且实测浓度的RE在-13.97%~4.03%范围内，批內RSD为5.28%，批间RSD为6.91%。表1-8最低定量限（LLOQ）测定结果-1加入浓度实测浓度（ng·mL）RE（%）RSD（%）NMean-1（ng·mL）第一批第二批第三批第一批第二批第三批批內批间9.7709.5429.572-2.30-4.58-4.289.7459.2189.409-2.55-7.82-5.919.1518.7319.285-8.49-12.69-7.1510.00189.3835.286.9110.409.0759.0514.03-9.25-9.498.70610.058.603-12.940.54-13.9710.229.4168.9322.21-5.84-10.683.4精密度与准确度精密度与准确度实验结果见表1-9。大鼠血浆中，QCL的实测浓度的批內RSD为4.30%，批间RSD为7.23%，RE在-14.00%~-1.33%；QCM的实测浓度的批內RSD为5.80%，批间RSD为9.13%，RE在-14.25%~8.67%；QCH的实测浓度的批內RSD为6.08%，批间RSD为7.30%，RE在-14.17%~7.44%。14 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章表1-9度洛西汀在大鼠血浆中的精密度与准确度考察结果-1加入浓度实测浓度（ng·mL）RE（%）RSD（%）NMean-1（ng·mL）第一批第二批第三批第一批第二批第三批批內批间17.2518.3017.30-13.76-8.49-13.5119.4717.9617.92-2.64-10.21-10.4118.6117.2017.66-6.98-14.00-11.6820.001818.164.307.2319.7418.1117.28-1.33-9.45-13.5819.0917.2119.51-4.55-13.94-2.4318.3117.3318.67-8.47-13.33-6.67102910581167-14.25-11.82-2.78114911431144-4.28-4.78-4.64112610971149-6.14-8.60-4.2812001811555.809.131205106711720.44-11.11-2.331261109611925.05-8.68-0.711304117012588.67-2.484.82351736243953-12.08-9.41-1.18344736303542-13.82-9.25-11.45351034483799-12.25-13.81-5.0340001836776.087.30392137573818-1.97-6.09-4.56355134333687-11.22-14.17-7.834298343938077.44-14.03-4.833.5基质效应大鼠血浆中度洛西汀的基质效应考察结果见表1-10，内标归一化基质效应的RSD为5.70%，说明大鼠血浆中的内源性物质不干扰度洛西汀的定量分析。3.6提取回收率度洛西汀和内标血浆样本提取回收率结果见表1-11-1和表1-11-2。结果显示：度洛西汀的低、中、高三个浓度大鼠血浆质控样本的平均提取回收率分别为89.4%，RSD在4.49%~8.12%；内标平均提取回收率为88.6%，RSD为5.85%。15 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因表1-10度洛西汀在大鼠血浆中的基质效应考察结果度洛西汀内标（地西泮）内标归一化加入浓度峰面积基质效应峰面积基质效应基质效应-1AAAA(ng·mL)S血浆S对照AS对照ME(%)i血浆i对照Ai对照MEi(%)MF(%)RSD(%)1.194E+041.081E+0499.37.618E+047.296E+04112.688.21.234E+041.235E+04102.66.967E+047.232E+04103.099.61.193E+041.280E+0499.27.252E+047.323E+04107.292.520.001.203E+044.471.191E+041.260E+0499.07.129E+047.027E+04105.493.91.114E+041.127E+0492.66.911E+046.286E+04102.290.61.224E+041.234E+04101.87.096E+046.974E+04104.997.07.225E+056.650E+05101.16.883E+046.006E+04101.899.37.276E+056.438E+05101.87.412E+046.123E+04109.692.96.884E+057.217E+0596.36.838E+046.377E+04101.195.312007.146E+056.763E+043.456.807E+056.555E+0595.37.086E+045.816E+04104.890.96.557E+057.846E+0591.86.832E+047.314E+04101.090.86.471E+058.170E+0590.66.419E+047.267E+0494.995.42.215E+062.226E+06103.86.736E+046.805E+0499.6104.32.236E+061.983E+06104.86.789E+046.097E+04100.4104.42.208E+062.344E+06103.56.677E+047.304E+0498.7104.840002.133E+065.712.313E+062.004E+06108.47.173E+046.655E+04106.1102.22.241E+061.854E+06105.17.059E+046.404E+04104.4100.72.107E+062.389E+0698.87.447E+047.430E+04110.189.716 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章表1-11-1度洛西汀在大鼠血浆样本的提取回收率考察结果提取样本T对照样本R提取回收率(As)提取(As)对照AS对照RECMeanSDRSD1.030E+041.054E+0489.69.889E+031.176E+0486.01.043E+041.180E+0490.81.150E+0485.83.854.499.480E+031.191E+0482.59.770E+031.101E+0485.09.311E+031.196E+0481.06.482E+057.311E+0594.15.974E+057.291E+0586.85.594E+056.864E+0581.26.887E+0591.97.478.126.516E+056.814E+0594.66.318E+056.552E+0591.77.103E+056.489E+05103.11.915E+062.237E+0686.12.099E+062.235E+0694.41.808E+062.205E+0681.32.224E+0690.55.506.082.089E+062.304E+0693.92.069E+062.225E+0693.12.095E+062.135E+0694.2表1-11-2内标在大鼠血浆样本的提取回收率考察结果提取样本T对照样本R提取回收率(Ai)提取(Ai)对照Ai对照RECMeanSDRSD5.987E+047.336E+0486.75.986E+046.645E+0486.76.220E+046.900E+0490.05.827E+046.775E+0484.45.675E+046.656E+0482.26.212E+047.137E+0489.96.022E+046.798E+0487.25.801E+047.315E+0484.05.730E+046.816E+0482.96.908E+0488.65.195.856.263E+046.851E+0490.75.890E+046.737E+0485.36.314E+046.334E+0491.46.408E+046.911E+0492.87.191E+046.755E+04104.16.521E+046.649E+0494.46.209E+047.101E+0489.96.126E+047.159E+0488.75.850E+047.472E+0484.717 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因3.7稳定性3.7.1储备液的稳定性度洛西汀储备液稳定性考察结果见表1-12-1。结果表明：度洛西汀储备液于室温放置4天和冷藏柜中保存30天后仍稳定。地西泮储备液稳定性考察结果见表1-12-2。结果表明：地西泮储备液于室温放置4天和冷藏柜中保存30天后仍稳定。表1-12-1度洛西汀储备液稳定性考察结果储备液浓度峰面积DULMeanSD(%)RSD(%)RE(%)-1(mg·mL)实测校正后1.388E+051.383E+05A2.0071.394E+051.389E+051.413E+051.408E+05对照1.385E+051.517E+031.10-1.371E+051.368E+05B2.0051.372E+051.368E+051.395E+051.391E+051.358E+051.356E+05A2.0021.331E+051.330E+05室温，1.336E+051.335E+051.373E+053.878E+032.82-0.824天1.390E+051.387E+05B2.0041.418E+051.415E+051.420E+051.417E+051.338E+051.344E+05A1.9921.343E+051.349E+054℃，1.348E+051.354E+051.404E+056.110E+034.352.2630天1.463E+051.456E+05B2.0091.471E+051.464E+051.467E+051.460E+0518 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章表1-12-2内标-地西泮储备液稳定性考察结果储备液浓度峰面积IS-DIAMeanSD(%)RSD(%)RE(%)-1(mg·mL)实测校正后2.186E+042.169E+04A1.0082.135E+042.118E+042.110E+042.093E+04对照2.128E+043.076E+021.45-2.131E+042.124E+04B1.0032.109E+042.103E+042.167E+042.161E+042.236E+042.225E+04A1.0052.202E+042.191E+04室温，42.150E+042.139E+042.105E+049.536E+024.53-1.07天2.017E+042.012E+04B1.0021.996E+041.992E+042.075E+042.071E+042.165E+042.158E+04A1.0032.106E+042.100E+044℃，302.081E+042.074E+042.169E+047.812E+023.603.01天2.251E+042.242E+04B1.0042.171E+042.162E+042.284E+042.275E+043.7.2血浆样本稳定性度洛西汀的大鼠血浆样本在室温下放置6h、30℃反复冻融3次、-30℃保存7天以及待进样样本自动进样器4℃放置24h的稳定性考察结果见表1-12-3，结果显示度洛西汀在上述条件下均稳定。19 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因表1-12-3度洛西汀在大鼠血浆中的稳定性考察结果放置条件-30℃，保存7天-30℃，反复冻融3次室温25℃，放置6h待进样，4℃，24h-1加入浓度（ng·mL）20.001200400020.001200400020.001200400020.001200400021.421160410421.241281394019.901210390819.3012403909-1实测浓度（ng·mL）20.861187397719.171167402120.991154407920.621189407420.441204394420.231252404218.721211401618.4112893937-1Mean（ng·mL）20.911184400820.211233400119.871191400119.4412393973SD0.4922.084.41.0459.253.91.1432.386.71.1150.088.4RSD(%)2.351.862.105.124.801.355.712.712.175.724.042.227.10-3.302.596.206.75-1.50-0.500.81-2.31-3.503.29-2.28RE(%)4.30-1.10-0.59-4.15-2.750.534.95-3.831.983.10-0.941.852.200.34-1.401.154.331.05-6.400.880.40-7.957.39-1.5920 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章第二节度洛西汀在正常和糖尿病大鼠体内的血药浓度比较研究1材料与试剂1.1动物SD雄性大鼠，清洁级，体重(180±20)g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。1.2试药盐酸度洛西汀：批号GHS151012Y，迈基生物，含量99%。链脲佐菌素（streptozocin,STZ）：sigma公司，批号：WXBB6772V，含量≥98%。柠檬酸，分析纯，国药集团。柠檬酸三钠，分析纯，国药集团。灭菌注射用水，石家庄四药有限公司。氯化钠注射液，中国大冢制药有限公司。肝素钠注射液，常州千红生化制药股份有限公司。2方法2.1溶液的配制盐酸度洛西汀水溶液：称取盐酸度洛西汀适量，用灭菌注射用水溶解，配成4-1mg·mL的溶液。柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液：柠檬酸(FW:210.14)2.1g加入生理盐水100mL中配成A液，柠檬酸钠(FW:294.10)2.94g加入生理盐水100mL中配成B液；再分别取65.1mLA溶液和54.9mLB溶液混匀，用NaOH溶液调节pH至4.3，4℃保存。STZ溶液：避光干燥条件下精密称取STZ适量，用pH4.3的柠檬酸/柠檬酸钠缓-1冲溶液溶解，配成13.5mg·mL的STZ溶液。2.2糖尿病大鼠模型的建立-1大鼠适应性饲养两天后，禁食12h，用现配的STZ溶液，按照剂量65mg·kg-1腹腔注射，3天后测空腹血糖，空腹血糖高于11.1mmol·L的大鼠入选糖尿病模型组[37]。21 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因2.3大鼠的给药方式与血样采集2.3.1单次给药试验糖尿病模型组大鼠（n=6）与正常组大鼠（n=6）同等条件下饲养3天，禁食不-1禁水12h后，将盐酸度洛西汀水溶液按照40mg·kg的剂量灌胃给药，分别于给药前(0h)及给药后0.5、1、1.5、2、3、5、8、11和24h从眼眶静脉丛取血0.5mL置于-1经肝素处理的离心管中，离心10min(3000r·min)，分离血浆，于-30℃保存待测。2.3.2多次给药试验随机选取正常组大鼠（n=6）与糖尿病模型组大鼠（n=6）同等条件下饲养3天，-1将盐酸度洛西汀水溶液按照40mg·kg的剂量灌胃给药，一天一次，连续给药8天，于连续给药的第6、7和第8天给药前采集血液0.5mL，然后于第8次给药后0.5、1、1.5、2、3、5、8、11和24h分别采集血液0.5mL。将大鼠血液置于经肝素处理的离-1心管中，离心10min(3000r·min)，分离血浆，于-30℃保存待测。2.4大鼠血浆样本的测定按照本章第一节所建立的LC-MS/MS方法，将所采集的大鼠血浆样本进行处理，并测定度洛西汀的浓度。对于样本浓度低于LLOQ的样本，在峰浓度之前的浓度数据以0计，峰浓度之后的浓度数据以无法定量（notdetectable，ND）表示。2.5药动学参数的计算与统计分析采用DAS3.2.3（上海博佳医药科技有限公司）软件，分别处理测得的血药浓度数据，得到非房室模型统计矩参数，其中Cmax和tmax均为实测值，AUC计算方法为线性梯形法。将正常组和糖尿病组的各药代动力学参数（tmax除外）经对数转换后，用SPSS22（IBM）软件进行独立样本的t检验(α=0.05)，tmax进行Mann-WitneyU检验(α=0.05)。3结果3.1度洛西汀单次给药的药代动力学3.1.1平均血药浓度-时间曲线以给药后的时间为横坐标，度洛西汀的平均血药浓度为纵坐标，绘制正常组和糖尿病模型组大鼠的血药浓度-时间（C-t）曲线图，见图1-4；平均对数血药浓度-时间曲线见图1-522 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章1400正常组1200糖尿病组-11000·ml800600Concentration/ng4002000024681012141618202224t/h-1图1-4正常和糖尿病模型大鼠40mg·kg度洛西汀灌胃单次给药后的平均血药浓度-时间曲线n=6,ݔ̅±ݏ10000正常组糖尿病组1000-1/ng·ml100Clg1010510t/h152025-1图1-5正常和糖尿病模型大鼠40mg·kg度洛西汀灌胃单次给药后的平均对数血药浓度-时间曲线n=6,ݔ̅±s3.1.2单次给药的药代动力学参数-1正常组和糖尿病模型组大鼠，每组6只，按照40mg·kg灌胃给予度洛西汀后，主要药代动力学参数及统计分析结果见表1-13。23 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因-1表1-13正常和糖尿病模型大鼠40mg·kg度洛西汀灌胃给药后的药代动力学参数***n=6,ݔ̅±ݏ.表示P<0.05vs正常组,表示P<0.01vs正常组参数正常组糖尿病组-1**AUC0-t(ng·mL·h)4037±655.68273±1793-1**AUC0-∞(ng·mL·h)4145±640.18398±1835-1**Cmax(ng·mL)368.1±40.71185±190tmax(h)1.6±0.31.6±0.4t1/2z(h)4.1±0.83.6±0.9**MRT0-t(h)7.2±0.35.5±0.5**MRT0-∞(h)7.9±0.65.9±0.6-1**Vz/F(L·kg)58.8±15.825.5±7.1-1-1**CLz/F(L·h·kg)9.8±1.45.0±1.13.2度洛西汀多次给药的药代动力学3.2.1平均血药浓度-时间曲线以给药后的时间为横坐标，度洛西汀的平均血药浓度为纵坐标，绘制正常组和糖尿病模型组大鼠的多次给药的血药浓度-时间（C-t）曲线图，见图1-6；平均对数血药浓度-时间曲线见图1-74000正常组3500糖尿病组3000-1·ml250020001500Concentration/ng10005000-50-45-40-35-30-25-20-15-10-50510152025t/h-1图1-6正常和糖尿病模型大鼠40mg·kg度洛西汀灌胃多次给药后的平均血药浓度-时间曲线n=6,ݔ̅±ݏ24 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第一章10000正常组糖尿病组-11000/ng·mlClg10010-50-45-40-35-30-25-20-15-10-50510152025t/h-1图1-7正常和糖尿病模型大鼠40mg·kg度洛西汀灌胃多次给药后的平均对数血药浓度-时间曲线n=6,ݔ̅±ݏ3.2.2多次给药的药代动力学参数-1正常组和糖尿病模型组大鼠，每组6只，按照40mg·kg灌胃给予度洛西汀，每天一次，连续给药8天后的主要药代动力学参数及统计分析结果见表1-14。-1表1-14正常和糖尿病模型大鼠40mg·kg度洛西汀灌胃多次给药后的药代动力学参***数.n=6,ݔ̅±ݏ.表示P<0.05vs正常组,表示P<0.01vs正常组参数正常组糖尿病组-1**AUCss(ng·mL·h)8663±217922690±11241-1**AUC0-t(ng·mL·h)8663±217922690±11241-1**AUC0-∞(ng·mL·h)9143±244224597±13413-1**Cmax(ng·mL)998.4±279.62597.5±969.5-1*Ctrough(ng·mL)63.7±52.5299.1±243.9-1**Cav(ng·mL)361±90.8945.4±468.4MRT0-t(h)6.6±0.86.9±0.6MRT0-∞(h)7.9±1.78.6±1.7t1/2z(h)5.4±1.85.9±1.6tmax(h)1.9±0.21.8±0.3-1**Vz/F(L·kg)35.1±8.917.2±11.3-1-1**CLz/F(L·h·kg)4.6±1.22.1±1.1DF2.633±0.2982.627±0.51425 第一章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三节讨论与结论文献报道的人血浆中度洛西汀的定量分析方法，常见的有HPLC法，LC-MS/MS[38,39]法等等。而大鼠血浆中度洛西汀的测定方法少有报道。本实验建立的测定大鼠血-1浆中度洛西汀浓度的LC-MS/MS法，定量范围10~5000ng·mL，采用甲醇沉淀蛋白法进行药物的提取，操作简便快速，回收率较高且无基质效应，适用于度洛西汀在大鼠血浆中的浓度测定。在度洛西汀的药代动力学单次给药试验中，从正常和糖尿病模型大鼠的血药浓度-时间曲线及药代动力学参数可知：糖尿病组体内的度洛西汀暴露量（Cmax、AUC0-t与AUC0-∞）显著增大，分别是正常组药动学参数的3、2、2倍。和正常组相比，糖尿病组的MRT0-t与MRT0-∞均显著减小，原因可能是度洛西汀主要经肾排泄，其中70%[3][40]的度洛西汀经尿液排出，而糖尿病状态下大鼠的尿量增加且肾清除率增加，甚至[22]可能存在肾损伤，进而导致药物的排泄加快。另外，度洛西汀主要经CYP1A2代[1][40]谢，有文献报道糖尿病患者体内的CYP1A2的活性增强，这可能是糖尿病组MRT减小的另一原因。多次给药试验中，和正常组大鼠相比，糖尿病模型组的平均稳态血药浓度Cav和谷浓度Ctrough显著增大，Cmax、AUCss与AUC0-∞均显著增大，进一步表明度洛西汀在糖尿病组的暴露量增大。虽然糖尿病组的暴露量增大，但是两组间t1/2z和MRT没有显著性差异，提示糖尿病组药物的消除增强。结合单次给药与多次给药试验，tmax在两组间均无显著性差异，说明糖尿病状态下不会影响药物的达峰时间。药物的不良反应通常与体内暴露量相关。度洛西汀用于糖尿病神经痛患者时不良[41]反应发生率高于安慰剂组2倍，主要为恶心、头痛、困倦等。度洛西汀在糖尿病患者体内不良反应的发生率增加可能源于其暴露量的增大。该结果提示在临床应用中，需关注糖尿病患者体内度洛西汀的暴露量，如暴露量增加可以考虑在不影响疗效的基础上调整糖尿病患者的用药剂量。26 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二章第二章度洛西汀在正常和糖尿病大鼠体内的组织分布比较研究药物分布是药物从给药部位吸收入血液后，由血液循环运送到体内各脏器组织（或靶器官）中的过程。理想的制剂及给药方法，应使各种药物能选择性地送入欲发挥作用的靶器官内，在必要的时间维持一定的药物浓度，然后迅速排出体外，保证高度的安全性，并且尽可能减少向其它不必要的部位分布，使副作用减少到最低，所以分布与疗效有着密切的关系，同时也与药物在组织中的蓄积性与副作用等安全性问题有关。本研究发现糖尿病状态下，度洛西汀血浆暴露量显著增加，因此，我们进一步考察并比较度洛西汀在正常与糖尿病大鼠中的组织分布情况。第一节建立测定大鼠组织中度洛西汀浓度的LC-MS/MS方法1材料1.1仪器高速分散均质机：FJ-200，上海金达生化仪器有限公司。其他同“第一章第一节1.1”。1.2试剂甲醇：Merck.KGaA，HPLC级。甲酸99%：ANAQUACHEMICALSUPPLY，HPLC级。水：石家庄四药有限公司，灭菌注射用水。醋酸铵：国药集团化学试剂有限公司，分析纯。盐酸度洛西汀：迈基生物，批号GHS151012Y，含量99%。地西泮，中检所，批号171225200302，含量100%氯化钠注射液：中国大冢制药有限公司2方法2.1分析条件色谱与质谱条件同“第一章第一节2.1”2.2溶液的配制27 第二章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因2.2.1标准曲线储备液及工作液的配制度洛西汀的标准曲线储备液的配制见“第一章第一节2.2.1”以甲醇为溶剂，于1.5mL塑料离心管中按表2-1配制标准曲线工作液SW1~SW9。表2-1标准曲线工作液的稀释标准曲线工源溶液吸取体积甲醇加入体积理论浓度源溶液-1作液（μL）（μL）（μg·mL）SW9标准曲线储备液I100002000SW8SW95602401400SW7SW8400300800.0SW6SW7350350400.0SW5SW6300700120.0SW4SW530060040.00SW3SW430070012.00SW2SW33006004.000SW1SW24004002.0002.2.2质控储备液及工作液的配制质控储备液配制见“第一章第一节2.2.2”以甲醇为溶剂，于1.5mL塑料离心管中按表2-2配制质控工作液QCWL、QCWM、QCWH及最低定量限工作液LLOQW。表2-2质控工作液及LLOQ工作液的稀释源溶液吸取体积加入甲醇体积理论浓度质控系列工作液源溶液-1（μL）（μL）（μg·mL）QCWH质控储备液I6004001200QCWMQCWH200800240.0质控工作液IQCWM10090024.00QCWL质控工作液I3006008.000LLOQWQCWL2006002.0002.2.3内标工作液的配制内标工作液的配制见“第一章第一节2.2.3”以甲醇为溶剂，于100mL容量瓶中按表2-3配制内标工作液。表2-3内标工作液的稀释源溶液吸取体积甲醇定容理论浓度内标工作液源溶液-1（mL）（mL）（μg·mL）内标工作液内标储备液I610060.0028 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二章2.3大鼠空白组织匀浆的制备取6只不同来源的空白大鼠，股动脉放血处死后，分离各组织脏器（大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、大肠、睾丸、肌肉和脂肪），用生理盐水洗净脏器残血，滤纸吸干多余水分，用电子天平称量各组织脏器湿重，所有组织按重量/体积比1:3加入生理盐水（即1g组织加3mL生理盐水），匀浆即得大鼠空白组织匀浆液，置于-30℃冰箱中保存备用。2.4组织匀浆样本的处理和测定2.4.1空白组织匀浆样本（DB）的处理和测定吸取200μL空白组织匀浆至1.5mL塑料离心管中，加入600μL甲醇沉淀蛋白，-1涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取10μL上清液至进样瓶中，加入390μL流动相，涡旋混匀，按“第一章第一节2.1”进样测定。2.4.2空白组织匀浆加入内标样本（BK）的处理和测定吸取200μL空白组织匀浆至1.5mL塑料离心管中，加入20μL内标工作液，涡-1旋混匀后加入580μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取10μL上清液至进样瓶中，390μL流动相，涡旋混匀，按“第一章第一节2.1”进样测定。2.4.3标准曲线组织匀浆样本的制备和测定分别吸取10μL度洛西汀SW1~SW9的标准曲线工作液至1.5mL塑料离心管中，并加入空白组织匀浆190μL，涡旋混匀，制备成相当于含度洛西汀浓度为0.1、0.2、-10.6、2.0、6.0、20、40、70和100μg·mL的S1~S9标准曲线组织匀浆样本，加入20-1μL内标工作液，涡旋混匀后加入580μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取10μL上清液至进样瓶中，加入390μL流动相，涡旋混匀，按“第一章第一节2.1”进样测定。2.4.4质控组织匀浆样本的制备和测定分别吸取10μL度洛西汀QCWL、QCWM和QCWH的质控工作液至1.5mL塑料离心管中，并加入空白组织匀浆190μL，涡旋混匀，配制成低（QCL）、中（QCM）、高（QCH）3种不同浓度的质控组织匀浆样本：低浓度质控组织匀浆样本（QCL，0.4000-1-1μg·mL）、中浓度质控组织匀浆样本（QCM，12.00μg·mL）、高浓度质控组织匀浆-1样本（QCH，60.00μg·mL），加入20μL内标工作液，涡旋混匀后加入580μL甲醇29 第二章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因-1沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取10μL上清液至进样瓶中，加入390μL水相，涡旋混匀，按“第一章第一节2.1”进样测定。2.4.5含药组织匀浆样本的处理和测定吸取含药组织匀浆200μL至1.5mL塑料离心管中，加入内标工作液20μL，加-1入甲醇580μL沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min，吸取上清液10μL至进样瓶中，加流动相390μL，涡旋混匀，按“第一章第一节2.1”进样测定。2.5方法学考察2.5.1特异性按“2.4组织匀浆样本的处理和测定”项操作，分别考察6种不同来源的大鼠空白组织匀浆样本、空白组织匀浆加入内标样本、空白组织匀浆加入度洛西汀样本、给药后大鼠组织匀浆加入内标样本，记录色谱图，度洛西汀的保留时间tR和峰面积As，内标保留时间tRi和峰面积Ai。2.5.2标准曲线与线性范围取大鼠标准组织匀浆系列样品200μL，按“2.4.5含药组织匀浆样本的处理和测定”项操作。以度洛西汀的加入浓度C为横坐标，以待测物峰面积As与内标峰面积Ai2的比值f(f=As/Ai)为纵坐标进行权重回归(权重系数为1/C)，同时计算每个浓度实测值的RE。接受标准：最低浓度点的RE在±20%以内，其余浓度点的RE在±15%以内；相关系数r≥0.99。2.5.3最低定量限与精密度和准确度吸取10μL度洛西汀LLOQW、QCWL、QCWM和QCWH工作液至1.5mL塑料离心管中，并加入大鼠空白组织匀浆190μL，涡旋混匀，制备成最低定量限组织匀浆样本（LLOQ）和QCL、QCM、QCH组织匀浆样本，加入20μL内标工作液，-1涡旋混匀后加入580μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取10μL上清液至进样瓶中，加入390μL流动相，涡旋混匀，按“第一章第一节2.1”进样测定。每个浓度平行制备6份，每天1批，连续测定3批，每批随行一条标准曲线。记录色谱图、度洛西汀峰面积As和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值f(f=As/Ai)，将f值代入随行标准曲线求得实测浓度。用Excel软件将同一浓度3批共18个样本的实测浓度进行单因素方差分析，分别得到差异源为组内和组间的MS值，计算同一浓30 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二章度所有样本的实测浓度平均值C（N=18），批内RSD，批间RSD，与准确度RE。组内MS批内RSD=×100%C组间MS批间RSD=×100%CRE=CCC100%实测加入加入接受标准：低、中、高3种浓度质控组织匀浆样本RE应在±15%以内，RSD＜15%；最低定量限组织匀浆样本RE应在±20%以内，RSD＜20%。2.5.4基质效应对照样本（R）：吸取190μL水至1.5mL塑料离心管中，共18个样本，分别加入580μL甲醇，涡旋1min，分别加入10μL度洛西汀QCWL、QCWM、QCWH质控工作液，每个浓度平行制备6个样本，所有样本各加入20μL内标工作液，涡旋混匀后，吸取10μL该溶液至进样瓶中，加入390μL流动相涡旋混匀，按“第一章第一节2.1”进样测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积A和内标峰面积A。S对照i对照组织匀浆基质样本（T）：取6个不同来源的大鼠空白组织匀浆190μL至1.5mL塑料离心管中，共30个样本（每个来源的大鼠空白组织匀浆平行取5份），涡旋混匀后-1分别加入580μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min，取出上清液作为组织匀浆基质样本溶样溶剂。另取数个塑料离心管，分别加入10μL度洛西汀QCWL、QCWM、QCWH质控工作液，每个浓度平行制备6个样本，所有样本各加入20μL内标工作液，再加入不同来源的组织匀浆基质样本溶样溶剂770μL，涡旋混匀后，吸取10μL该溶液至进样瓶中，加入390μL流动相涡旋混匀，按“第一章第一节2.1”进样测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积A和内标峰面积A。S血浆i血浆按MEAA100%计算不同浓度质控水平度洛西汀的基质效应，按S血浆S对照MEAA100%计算所有组织匀浆基质样本中内标的基质效应，再按ii血浆i对照MFME/ME100%计算内标归一化基质效应因子及其RSD（n=18）。i接受标准：内标归一化基质效应因子的RSD＜15%。2.5.5提取回收率对照样本（R）：取6个不同来源的大鼠空白组织匀浆190μL至1.5mL塑料离31 第二章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因心管中，共18个样本（每个来源的空白组织匀浆平行取3份），涡旋混匀后分别加入-1580μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min，取尽上清液作为对照样本溶样溶剂。另取数个塑料离心管，分别加入10μL度洛西汀QCWL、QCWM、QCWH质控工作液，每个浓度平行制备6个样本，所有样本加入20μL内标工作液，再加入不同来源的对照样本溶样溶剂，涡旋混匀后，吸取10μL该溶液至进样瓶中，加入390μL流动相涡旋混匀，按“第一章第一节2.1”进样测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积A和内标峰面积A。S对照i对照组织匀浆提取样本（T）：按“2.4.4项”配制低、中、高3种不同浓度的质控组织匀浆样本（每个浓度用6种不同来源的空白组织匀浆平行制备6份），涡旋混匀后-1加入20μL内标工作液，涡旋混匀后加入甲醇580μL，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min，吸取10μL上清液至进样瓶中，加入390μL流动相涡旋混匀，按“第一章第一节2.1”项测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积A和内标峰面积A。S提取i提取按RECAA100%计算不同浓度质控水平度洛西汀的提取回收率，S提取S对照同时计算每个浓度水平REC的Mean、SD和RSD（n=6）。按RECAA100%计算所有组织匀浆提取样本中内标的提取回收ii提取i对照率，同时计算所有组织匀浆提取样本中RECi的Mean、SD和RSD（n=18）。2.5.6稳定性2.5.6.1组织匀浆样本稳定性按“2.4.4”项操作，制备含度洛西汀的低、中和高3种浓度的稳定性组织匀浆样本，每个浓度3个样本。分别于室温下放置6h、冰箱中（设定温度-30℃）保存并反复冻融3次、冰箱中（设定温度-30℃）保存至7天。稳定性样本按“2.4.5”项处理测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积As和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值（ff=As/Ai），将f值代入随行标准曲线求得实测浓度和RE，并计算RSD（N=3）。RE=C实测C加入C加入×100%2.5.6.2待进样样本的稳定性按“2.4.4”项制备含度洛西汀的低、中和高3种浓度的稳定性血浆样本，每个浓度3个样本，再按“2.4.5”项下操作处理得到稳定性待进样样本，于自动进样器（设定温度4℃）放置24h后按“第一章第一节2.1”项测定。记录色谱图、度洛西汀峰面积As32 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二章和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值f（f=As/Ai），将f值代入新制随行标准曲线求得实测浓度和RE，并计算RSD（N=3）。RE=C实测C加入C加入×100%3方法学考察结果3.1特异性方法的特异性色谱图见图2-1-1到图2-1-12。如图所示，在不同组织匀浆中，度洛西汀和内标的保留时间基本不发生变化，分别为2.02min和3.55min左右，组织匀浆中内源性物质对测定无干扰，所以本测定方法具有较高的特异性，可用于大鼠大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、大肠、睾丸、肌肉和脂肪的组织匀浆中度洛西汀浓度的测定。图2-1-1大脑组织匀浆特异性考察色谱图A：空白大脑组织匀浆样本；B：空白大脑组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ大脑组织匀浆样本；D：给药后大脑组织匀浆样本33 第二章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因图2-1-2心脏组织匀浆特异性考察色谱图A：空白心脏组织匀浆样本；B：空白心脏组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ心脏组织匀浆样本；D：给药后心脏组织匀浆样本图2-1-3肝脏组织匀浆特异性考察色谱图A：空白肝脏组织匀浆样本；B：空白肝脏组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ肝脏组织匀浆样本；D：给药后肝脏组织匀浆样本34 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二章图2-1-4脾脏组织匀浆特异性考察色谱图A：空白脾脏组织匀浆样本；B：空白脾脏组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ脾脏组织匀浆样本；D：给药后脾脏组织匀浆样本图2-1-5肺组织匀浆特异性考察色谱图A：空白肺组织匀浆样本；B：空白肺组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ肺组织匀浆样本；D：给药后肺组织匀浆样本35 第二章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因图2-1-6肾脏组织匀浆特异性考察色谱图A：空白肾脏组织匀浆样本；B：空白肾脏组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ肾脏组织匀浆样本；D：给药后肾脏组织匀浆样本图2-1-7胃组织匀浆特异性考察色谱图A：空白胃组织匀浆样本；B：空白胃组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ胃组织匀浆样本；D：给药后胃组织匀浆样本36 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二章图2-1-8小肠组织匀浆特异性考察色谱图A：空白小肠组织匀浆样本；B：空白小肠组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ小肠组织匀浆样本；D：给药后小肠组织匀浆样本图2-1-9大肠组织匀浆特异性考察色谱图A：空白大肠组织匀浆样本；B：空白大肠组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ大肠组织匀浆样本；D：给药后大肠组织匀浆样本37 第二章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因图2-1-10睾丸组织匀浆特异性考察色谱图A：空白睾丸组织匀浆样本；B：空白睾丸组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ睾丸组织匀浆样本；D：给药后睾丸组织匀浆样本图2-1-11肌肉组织匀浆特异性考察色谱图A：空白肌肉组织匀浆样本；B：空白肌肉组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ肌肉组织匀浆样本；D：给药后肌肉组织匀浆样本38 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二章图2-1-12脂肪组织匀浆特异性考察色谱图A：空白脂肪组织匀浆样本；B：空白脂肪组织匀浆加入内标样本；C：LLOQ脂肪组织匀浆样本；D：给药后脂肪组织匀浆样本3.2标准曲线与线性范围-1在大鼠的组织匀浆液中，度洛西汀在0.1~100μg·mL的浓度范围内，与色谱峰有良好的线性关系，各组织匀浆的标准曲线见表2-4。表2-4度洛西汀在大鼠组织匀浆中的标准曲线方程回归方程相关系数大脑y=13.7x+0.153r=0.9989心脏y=14.0x+0.0851r=0.9980肝脏y=14.0x+0.300r=0.9963脾脏y=14.1x+0.317r=0.9953肺y=14.9x+0.284r=0.9985肾脏y=13.0x+0.477r=0.9994胃y=14.4x+0.368r=0.9984小肠y=13.2x+0.254r=0.9980大肠y=13.1x+0.420r=0.9993睾丸y=14.0x+0.210r=0.9956肌肉y=13.6x+0.157r=0.9980脂肪y=13.2x-0.018r=0.998239 第二章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因3.3最低定量限-1在本实验条件下，度洛西汀在大鼠组织匀浆液的最低定量限为0.1000μg·mL，在所有组织匀浆样本中，均满足RE在±15%以内，RSD<15%。每种组织匀浆样本的最低定量限考察结果见表2-5。表2-5度洛西汀在大鼠组织匀浆中的最低定量限考察加入浓度实测浓度RE（%）RSD（%）-1-1（μg·mL）（μg·mL）批內批间大脑0.10000.1034±0.0063-9.47~12.944.9111.8心脏0.10000.1006±0.0060-9.86~7.984.3112.6肝脏0.10000.1046±0.0049-5.83~10.403.808.7脾脏0.10000.1035±0.0062-6.07~13.385.2310.0肺0.10000.1037±0.0069-10.25~13.516.656.9肾脏0.10000.0948±0.0047-12.20~3.554.845.5胃0.10000.1027±0.0058-10.02~10.555.347.6小肠0.10000.1007±0.0052-8.23~8.075.304.0大肠0.10000.1015±0.0078-10.77~12.438.123.6睾丸0.10000.1018±0.0058-8.76~9.655.298.3肌肉0.10000.1033±0.0070-8.42~13.127.172.8脂肪0.10000.1029±0.0059-7.93~9.966.042.63.4精密度和准确度度洛西汀在大鼠各组织匀浆中的精密度与准确度考察结果见表2-6。由表可知在各个组织匀浆中，低、中和高三种质量浓度的度洛西汀实验结果满足RE在±15%以内，批內RSD和批间RSD均小于15%，精密度和准确度良好。表2-6度洛西汀在大鼠组织匀浆中的准确度、精密度、基质效应和提取回收率考察结果加入浓度准确度精密度RSD(%)内标归一化基质效应提取回收率-1(μg·mL)RE(%)批內批间RE(%)RSD(%)RSD(%)0.400-9.31~12.385.019.063.3376.13±3.134.12大脑12.00-9.57~7.382.6412.424.8185.20±7.448.7460.00-8.90~6.113.199.401.9679.07±4.095.170.400-8.58~7.853.2311.511.6588.54±2.703.05心脏12.00-11.48~5.633.3012.283.9795.59±2.532.6460.00-4.45~9.454.443.233.28101.51±4.264.190.400-9.27~7.733.8610.571.0287.55±4.334.95肝脏12.00-6.60~7.733.885.184.2295.09±2.472.6060.00-8.38~10.383.6813.081.3489.70±1.301.450.400-8.43~11.675.895.532.6587.48±3.063.50脾脏12.00-6.14~11.804.495.893.7593.32±4.484.8060.00-8.96~9.454.1211.752.4697.80±2.352.4140 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二章加入浓度准确度精密度RSD(%)内标归一化基质效应提取回收率-1(μg·mL)RE(%)批內批间RE(%)RSD(%)RSD(%)0.400-9.39~9.783.309.166.6894.96±6.626.97肺12.00-6.76~10.153.2910.594.7896.09±5.765.9960.00-1.16~8.523.221.8310.67100.65±5.175.140.400-4.59~11.925.491.565.0494.28±3.333.54肾脏12.00-5.10~10.494.342.593.5892.93±6.226.6960.00-7.40~9.964.354.153.83106.05±6.906.510.400-0.57~10.892.335.595.8684.26±3.283.89胃12.002.43~11.412.203.882.4896.81±3.643.7660.00-9.96~11.635.038.793.9896.33±7.808.100.400-5.47~9.033.067.175.7099.29±4.744.77小肠12.00-2.06~8.733.173.334.35102.88±4.584.4560.00-7.47~9.384.117.392.3595.13±4.274.490.4000.88~8.882.283.019.1995.85±3.874.04大肠12.00-1.95~9.512.743.088.72105.94±4.414.1660.00-8.33~11.664.0913.575.0097.39±6.256.420.400-10.33~10.717.483.434.4895.70±8.228.59睾丸12.00-2.82~9.433.524.636.23105.94±4.033.8060.00-11.14~8.233.7910.7712.9199.49±3.173.190.4000.14~10.162.733.098.7195.93±4.985.19肌肉12.001.89~10.411.882.633.0099.51±3.753.7760.00-9.04~11.263.7813.405.20102.33±3.743.660.400-10.11~9.957.063.074.2487.70±8.339.49脂肪12.00-5.91~9.804.233.453.2898.32±5.325.4160.00-9.97~8.765.813.174.9386.18±6.998.113.5基质效应大鼠各组织匀浆中度洛西汀的基质效应考察结果见表2-6，内标归一化基质效应的RSD均满足小于15%，说明大鼠各组织匀浆中的基质不干扰度洛西汀的定量测定。3.6提取回收率度洛西汀在大鼠各组织匀浆样本的提取回收率结果见表2-6，内标的提取回收率结果见表2-7。在各组织匀浆中，度洛西汀和内标的提取回收率均满足RSD小于15%，考察结果精密且可重现。表2-7各组织匀浆中内标的提取回收率(n=18)内标的提取回收率RE（%）RSD（%）大脑93.07±6.547.03心脏104.52±6.616.32肝脏104.20±4.954.75脾脏97.58±3.383.4741 第二章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因内标的提取回收率RE（%）RSD（%）肺93.54±4.064.34肾脏100.45±4.574.55胃103.57±3.653.53小肠103.43±6.125.91大肠98.35±5.845.94睾丸109.86±8.137.40肌肉101.79±8.228.07脂肪100.02±12.9212.923.7稳定性度洛西汀在大鼠各组织匀浆样本中，稳定性考察结果良好，见表2-8。在-30℃保存10天、-30℃反复冻融3次、室温放置24h、待进样样本4℃放置6h的条件下均稳定。42 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二章表2-8度洛西汀在大鼠组织匀浆中的稳定性考察加入浓度-30℃保存10天-30℃反复冻融3次室温放置24h自动进样器4℃放置6h-1(μg·mL)Mean±SDRSD(%)Mean±SDRSD(%)Mean±SDRSD(%)Mean±SDRSD(%)0.4000.4211±0.0225.320.4252±0.0194.570.4240±0.0092.020.4113±0.0112.71大脑12.0012.51±0.1891.5112.77±0.1821.4312.53±0.6885.4912.48±0.3672.9460.0055.86±1.2392.2254.98±3.7446.8160.94±2.0753.4063.54±0.8921.400.4000.4073±0.0081.990.3758±0.0051.420.3948±0.0112.870.4186±0.0184.37心脏12.0012.90±0.7535.8412.33±0.2391.9412.90±0.2301.7812.88±0.4683.6360.0055.46±1.2492.2555.21±1.0191.8455.07±2.6574.8253.60±0.6951.300.4000.4153±0.0133.230.3930±0.0061.430.4057±0.0071.710.4126±0.0235.56肝脏12.0012.66±0.1541.2212.60±0.2942.3412.66±0.3792.9912.84±0.1170.9160.0054.66±0.8951.6456.59±1.5582.7553.95±0.3830.7156.33±1.9133.400.4000.4156±0.0133.110.3907±0.0071.790.4243±0.0081.990.4153±0.0174.08脾脏12.0011.77±0.0840.7112.53±1.0238.1712.09±0.7276.0112.49±0.2131.7060.0061.07±4.2737.0060.92±3.2495.3364.72±1.1321.7560.33±3.9606.560.4000.4168±0.0286.740.3804±0.0051.230.3846±0.0102.530.4073±0.0266.50肺12.0011.44±0.2362.0712.47±0.3823.0710.83±0.7116.5611.51±0.2742.3860.0061.36±3.2925.3764.32±2.7454.2759.37±1.7522.9559.06±2.3804.030.4000.4024±0.0215.130.3688±0.0153.980.3798±0.0143.650.4091±0.0245.90肾脏12.0011.09±0.1361.2212.15±0.4974.0911.04±0.1361.2410.79±0.1331.2360.0060.27±2.7494.5661.68±1.6972.7556.47±1.9553.4656.97±2.2663.980.4000.3976±0.0297.250.3754±0.0092.300.3768±0.0030.800.3989±0.0194.81胃12.0011.37±0.2322.0412.31±0.6335.1411.11±0.1741.5611.02±0.1181.0760.0062.67±2.9894.7761.43±2.8834.6957.42±2.4524.2757.99±1.0791.8643 第二章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因加入浓度-30℃保存10天-30℃反复冻融3次室温放置24h自动进样器4℃放置6h-1(μg·mL)Mean±SDRSD(%)Mean±SDRSD(%)Mean±SDRSD(%)Mean±SDRSD(%)0.4000.4003±0.0215.360.3665±0.0061.530.3707±0.0041.060.3961±0.0153.81小肠12.0011.29±0.2912.5812.19±0.4853.9810.98±0.2402.1911.03±0.1050.9660.0059.90±3.3555.6062.15±2.7344.4057.24±1.1932.0856.60±2.9305.180.4000.3991±0.0092.140.3669±0.0061.750.3710±0.0030.770.3998±0.0276.70大肠12.0011.23±0.0210.1812.21±0.3813.1210.92±0.3513.2210.89±0.1661.5260.0058.85±3.1295.3260.94±3.5205.7857.25±1.4522.5455.75±2.9805.340.4000.3972±0.0082.000.3664±0.0071.930.3788±0.0071.900.4023±0.0164.06睾丸12.0011.46±0.1321.1512.58±0.8246.5510.95±0.7226.5911.23±0.1821.6260.0062.10±2.5994.1962.01±1.3192.1357.04±1.5522.7257.10±4.3977.700.4000.4130±0.0194.660.3700±0.0082.170.3795±0.0102.510.3990±0.0204.92肌肉12.0011.30±0.1761.5612.48±0.5594.4811.24±0.2642.3510.92±0.0370.3460.0060.16±2.4334.0461.62±2.9154.7357.17±1.6992.9756.57±1.9773.490.4000.4007±0.0143.590.3766±0.0102.730.3850±0.0051.320.4035±0.0276.80脂肪12.0011.47±0.1151.0012.51±0.5234.1811.11±0.7466.7211.29±0.3743.3160.0062.14±2.5454.1064.20±2.3753.7057.79±1.9823.4357.99±2.8995.0044 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二章第二节度洛西汀在正常和糖尿病大鼠的组织分布比较研究1材料与试剂1.1动物SD雄性大鼠，清洁级，体重(180±20)g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。1.2试药盐酸度洛西汀：批号GHS151012Y，迈基生物，含量99%。链脲佐菌素（streptozocin,STZ）：sigma公司，批号：WXBB6772V，含量≥98%。柠檬酸，分析纯，国药集团。柠檬酸三钠，分析纯，国药集团。灭菌注射用水，石家庄四药有限公司。氯化钠注射液，中国大冢制药有限公司。2方法2.1溶液的配制参照“第一章第二季2.1”项，分别配置盐酸度洛西汀水溶液、柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液、STZ溶液。2.2糖尿病大鼠模型的建立参照第一章第二节。2.3大鼠组织匀浆的制备与测定正常大鼠分为5组，每组6只，同等条件下饲养3天，禁食不禁水12h后，将-1盐酸度洛西汀水溶液按照40mg·kg的剂量灌胃给药，分别于给药后1、2、5、11和24h股动脉放血处死一组，分离血浆于-30℃保存待测。糖尿病模型组大鼠6只按同样方法处理，于给药后2h处死。并分离大鼠的大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、大肠、睾丸、肌肉和脂肪，用生理盐水洗净组织脏器残血（或内容物），滤纸吸干多余水分，用电子天平称量各组织脏器湿重，所有组织按重量与体积比1:3加入生理盐水（即1g组织加3mL生理盐水），匀浆即得大鼠组织匀浆液，置于-30℃冰箱中保存。然后按照“第二章第一节”建立的方法对不同组织中度洛西汀的浓度进行定量测定。45 第二章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因3度洛西汀的组织分布测定结果3.1正常大鼠的组织分布度洛西汀在大鼠的大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、大肠、睾丸、肌肉和脂肪的组织分布结果见图2-2。AB-1图2-2大鼠灌胃给予40mg·kg度洛西汀后组织中的分布情况（其中A为全部组织分布图，B为不含胃肠道组织分布图）46 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二章由图2-2可知，度洛西汀经灌胃给药后，在大鼠体内的分布广泛，主要分布在胃和小肠中；在消化道以外，度洛西汀主要分布在肝脏、肺、脾脏、肾脏这些血液流动或体液交换较丰富的组织中。给药1h后，即可在大脑中检测到度洛西汀，说明度洛西汀口服给药后起效较快。除肺和睾丸以外，24h后组织中的度洛西汀大部分被清除，不存在蓄积。3.2糖尿病大鼠与正常大鼠组织分布的比较度洛西汀经灌胃给药2h后，正常大鼠与糖尿病大鼠体内药物的组织分布情况见表2-9和图2-3。-1表2-9度洛西汀40mg·kg灌胃给药2h后正常大鼠与糖尿病大鼠组织中的药物含量-1含量Mean±SD（μg·g）组织正常组糖尿病组大脑8.431±4.78615.71±6.82心脏7.567±3.4528.519±4.278肝脏40.89±26.8637.31±12.04脾脏19.54±9.9618.18±9.35肺38.50±11.0646.23±15.38肾脏20.76±10.5927.03±14.31胃103.6±54.690.43±45.87小肠46.46±34.7667.05±33.53大肠16.23±10.8823.97±15.57睾丸5.418±4.378.185±2.755肌肉5.349±6.5317.852±5.575脂肪3.745±4.85611.60±9.12由结果可知，正常大鼠2h的组织中度洛西汀的含量顺序依次为：胃＞小肠＞肝脏＞肺＞肾脏＞脾脏＞大肠＞大脑＞心脏＞睾丸＞肌肉＞脂肪。糖尿病组大鼠2h的组织中度洛西汀的含量顺序依次为：胃＞小肠＞肺＞肝脏＞肾脏＞脾脏＞大肠＞大脑＞心脏＞睾丸＞肌肉＞脂肪。在大脑、肺、肾脏、小肠、大肠、睾丸、肌肉和脂肪中，糖尿病组的度洛西汀浓度高于正常组，但均无显著性差异；在其他组织中，糖尿病组与正常组的浓度比较接近。47 第二章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因-1图2-3度洛西汀40mg·kg灌胃给药2h后正常大鼠与糖尿病大鼠组织中的分布情况第三节讨论与结论为了比较度洛西汀在正常大鼠和糖尿病大鼠体内的组织分布情况，本实验用大鼠血浆的分析条件，分别对12种组织进行了方法学验证。组织匀浆液中度洛西汀的定-1量限范围为0.1~100μg·mL，采用甲醇沉淀蛋白法进行药物的提取，提取回收率较高且无基质效应。结合文献及本实验前期的结果可知，度洛西汀在正常与糖尿病大鼠血浆中的达峰时间约为2h，因此选择给药后2h对两组间的组织分布情况进行比较。在给药后2h，糖尿病组的肺、肾脏、小肠、大肠、睾丸、肌肉和脂肪中，度洛西汀含量略高于正常组，但均无显著性差异；在其他组织中，糖尿病组与正常组的浓度比较接近。这一结果和糖尿病大鼠和正常大鼠的消除特征相吻合：单次给药实验中，度洛西汀虽然在糖尿病组的暴露量显著高于正常组，但是糖尿病组的MRT显著减小，提示糖尿病状态下血浆药物的消除加快，这可能是导致两组间的组织分布情况无显著性差异的原因。比较正常组和糖尿病组脑组织中的度洛西汀浓度，糖尿病组是正常组的2倍-1（15.71±6.82vs8.431±4.786μg·g），虽然经统计分析两组无显著性差异（P=0.061），该结果仍然提示糖尿病组药效靶组织的药物含量可能会高于正常组。48 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章第三章度洛西汀的血浆蛋白结合率及其相互作用药物吸收进入血液以后，一部分游离于血浆之中，称为游离型药物，另一部分则会和血浆蛋白相结合，称为结合型药物。只有游离型药物可以透过生物膜进而发挥药[42]效；结合型药物不能透过生物膜，无药理活性。本文前期结果表明，度洛西汀在糖尿病大鼠的暴露量增大，目前没有研究探讨度洛西汀在糖尿病状态下或在高血药浓度条件下的蛋白结合率是否会改变。当两种高血浆蛋白结合率的药物联合用药时，会分别竞争性地和血浆蛋白结合，一旦血浆蛋白结合率稍有变化，便会对游离药物的浓度[34]产生较大的影响，进而产生药效或毒性的改变。DUL，FLU，AGO的血浆蛋白结[1,32,33]合率都很高，且都主要结合于白蛋白和α1-酸性糖蛋白上。DUL和FLU，DUL和AGO联合用药时，有时会发生一些严重的不良反应，而它们的药动学行为并未发[26,31]生显著变化。目前没有研究探讨DUL和FLU、DUL和AGO联合应用时基于血浆蛋白结合的相互作用。因此，本研究建立平衡透析法结合LC-MS/MS法同时测定DUL、FLU、AGO在人血浆中的蛋白结合率，探讨在糖尿病状态下或高血药浓度下度洛西汀的血浆蛋白结合率，以及药物间的血浆蛋白结合相互作用。第一节建立同时测定人血浆和透析液中度洛西汀、氟西汀、阿戈美拉汀浓度的LC-MS/MS方法1材料与试剂1.1材料LC-MS/MS系统：Agilent1260高效液相色谱仪，Agilent公司，美国；API-4000型三重四极杆串联质谱仪，AppliedBiosystemSciex公司，美国；数据处理系统为Analyst1.6，AppliedBiosystemSciex公司，美国。分析天平：XS105DU型（Max2=41g，d2=0.01mg），METTLERTOLEDO公司，瑞士；SARTORIOUSBP121型（Max=120g，d=0.1mg），赛多利斯公司，德国。真空离心浓缩仪：DNA-23050-J00,GeneUac公司，英国。高速低温离心机：EppendorfCentrifuge5424R，Eppendorf公司，德国。涡旋混合器：VortexGenie-2，ScientificIndustries公司，美国。49 第三章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因超声波震荡仪：AS7240B，天津奥特赛思斯特仪器有限公司，中国。超纯水系统：Milli-QAcademic，MILLIPORE公司，美国。冷藏柜：青岛海尔特种电冰柜有限公司，中国。低温冰箱、冰柜：MDF-U333（设定温度-30℃），SANYO公司，日本；MDF-436（设定温度-35℃），松下公司，日本；MDF-U5411（设定温度-40℃），SANYO公司，日本。移液器：2-20μL、10-100μL、20-200μL、100-1000μL、0.5-5mL，Eppendorf公司，德国。透析袋：MD25，截留分子量8~14kDa，联合碳化。人空白血浆：苏州大学附属第二医院Ⅰ期临床研究室提供。1.2试剂甲醇：Merck.KGaA，HPLC级。甲酸99%：ANAQUACHEMICALSUPPLY，HPLC级。水：石家庄四药有限公司，灭菌注射用水。醋酸铵：国药集团化学试剂有限公司，分析纯。PBS缓冲盐：pH7.4，青岛日水生物技术有限公司。盐酸度洛西汀，迈基生物，批号GHS151012Y，含量99%。地西泮，中检所，批号171225200302，含量100%盐酸氟西汀，上海中西制药有限公司，批号141001（GB02-012），含量99.66%。阿戈美拉汀，安耐吉化学，批号DG230120，含量99%。2方法2.1分析条件®色谱条件：色谱柱：WATERSXterraRP18(4.6×100mm，3.5μm)，预柱：TMPhenomenexSecurityGuardC18(4×3.0mm)；流动相：甲醇（A）和含0.3%甲酸的-15mmol·L醋酸铵水溶液（B），梯度洗脱（0~0.1min，65%A；0.1~2.5min，65%-80%A；-12.5~4.5min，80%A；4.6~10min，65%A）；柱温20℃；流速0.5mL·min；进样体积10μL；每个样本的分析时间为10.0min。质谱条件：电喷雾（ESI）离子源，正离子电离模式，多反应监测（MRM）扫描方式，碰撞气：6psi，气帘气：10psi，雾化气：60psi，加热辅助气：50psi，电喷50 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章雾电压：3500V，离子源温度（TEM）：550℃；待测物和内标（IS）的检测离子分别为：DUL:m/z298.2→154.0;FLU:m/z310.1→148.2;AGO:m/z244.1→185.0;DIA(IS):m/z285.5→154.0。具体的色谱条件和质谱条件见表3-1表3-1人血浆和透析液样本的分析条件HPLC条件®色谱柱XterraRP18(4.6×100mm，3.5μm)TM预柱PhenomenexSecurityGuardC18(4×3.0mm)柱温20℃-1时间流速5mmoL·L醋酸铵水溶液-1甲醇(%)(min)(μL·min)(含0.3%甲酸)(%)0.15003565流动相2.550020804.550020804.65003565105003565运行时间10.0min进样体积10μL自动进样器温度4℃切换阀：0~0.1minA通道，0.1min~10minB通道MS条件离子源ESI离子极性Positive扫描模式MRMPrecursorProductDwellDPEPCECXP检测离子IonIonTime(Da)(Da)(msec)(V)(V)(V)(V)度洛西汀298.2154.020045104010氟西汀310.1148.220054101310阿戈美拉汀244.1185.020075102110地西泮（内标）285.5154.020058105210碰撞气（CAD）6psi气帘气（CUR）10psi雾化气1（GS1）60psi加热辅助气2（GS2）50psi电喷雾电压（IS）3500V离子源温度（TEM）550℃51 第三章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因2.2溶液的配置2.2.1标准曲线储备液及工作液的配制称取适量盐酸度洛西汀对照品（相当于含10mg度洛西汀），转移至10mL容量-1瓶中，并用甲醇定容至刻度，混匀得到浓度为1.0mg·mL的度洛西汀标准曲线储备液，4℃冷藏保存。称取适量盐酸氟西汀对照品（相当于含10mg氟西汀），转移至10mL容量瓶中，-1并用甲醇定容至刻度，混匀得到浓度为1.0mg·mL的氟西汀标准曲线储备液，冷藏保存。称取适量阿戈美拉汀对照品（相当于含10mg阿戈美拉汀），转移至10mL容量-1瓶中，并用甲醇定容至刻度，混匀得到浓度为1.0mg·mL的阿戈美拉汀标准曲线储备液，4℃冷藏保存。分别用甲醇将上述三种待测物的标准曲线储备液逐级稀释，得到一系列它们的血浆标准曲线工作液和PBS标准曲线工作液。再将三种待测物的每一级标准曲线工作液等体混合，得到血浆混合标准曲线工作液和PBS混合标准曲线工作液。血浆混合标准曲线工作液和PBS混合标准曲线工作液中三种待测物的浓度见表3-2。表3-2血浆混合标准曲线工作液及PBS混合标准曲线工作液中待测物的浓度-1（单位：ng·mL）待测物SW1SW2SW3SW4SW5SW6SW7DUL80.00240.0800.0240080001600024000血浆FLU80.00240.0800.0240080001600024000AGO10.0040.00200.0100040001600024000DUL10.0025.0050.00125.0250.0375.0500.0PBSFLU10.0025.0050.00125.0250.0375.0500.0AGO1.2505.00025.0075.00250.0500.075002.2.2质控储备液及工作液的配制称取适量盐酸度洛西汀对照品（相当于含10mg度洛西汀），转移至10mL容量-1瓶中，并用甲醇定容至刻度，混匀得到浓度为1.0mg·mL的度洛西汀质控储备液，4℃冷藏保存。称取适量盐酸氟西汀对照品（相当于含10mg氟西汀），转移至10mL容量瓶中，-1并用甲醇定容至刻度，混匀得到浓度为1.0mg·mL的氟西汀质控储备液，4℃冷藏保存。52 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章称取适量阿戈美拉汀对照品（相当于含10mg阿戈美拉汀），转移至10mL容量-1瓶中，并用甲醇定容至刻度，混匀得到浓度为1.0mg·mL的阿戈美拉汀质控储备液，冷藏保存。分别用甲醇将上述三种待测物的质控储备液逐级稀释，得到一系列它们的血浆质控工作液和PBS质控工作液。再将三种待测物的每一级质控工作液等体混合，得到血浆混合质控工作液和PBS混合质控工作液。血浆混合质控工作液和PBS混合质控工作液中三种待测物的浓度见表3-3。-1表3-3血浆混合质控工作液及PBS混合质控工作液中待测物的浓度（单位：ng·mL）待测物LLOQWQCWLQCWMQCWHDUL80.00200.0400020000血浆FLU80.00200.0400020000AGO10.0020.00200020000DUL10.0020.00100.0400.0PBSFLU10.0020.00100.0400.0AGO1.2502.50050.00625.02.2.3内标储备液及工作液的配制称取适量地西泮对照品（相当于10mg地西泮），转移至10mL容量瓶中，并用-1甲醇定容至刻度，混匀得到浓度为1.0mg·mL的内标储备液，冷藏保存。以甲醇为溶剂，于100mL容量瓶中按表3-4配制内标工作液。表3-4内标工作液的稀释源溶液吸取体积甲醇定容理论浓度内标工作液源溶液-1（mL）（mL）（μg·mL）内标工作液内标储备液510050.002.2.4PBS缓冲溶液的配制称取PBS缓冲盐8.4g，加1L水溶解，加热至沸腾10min，放冷至室温后，转移1000mL容量瓶中，用新沸并放冷的超纯水定容至刻度，于4℃密闭保存。2.2.5透析用血浆的制备吸取10μL一定浓度的待测物甲醇溶液，于1.5mLEP管中，然后加入990μL空白血浆，涡旋混匀并冷藏保存，供透析使用。53 第三章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因2.3血浆样本的处理和测定2.3.1空白血浆样本（plasma-DB）的处理和测定吸取空白血浆190μL至1.5mL塑料离心管中，加入甲醇660μL沉淀蛋白，涡-1旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取上清液200μL至进样瓶中，按“2.1分析条件”进样测定。2.3.2空白血浆加入内标样本（plasma-BK）的处理和测定吸取空白血浆190μL至1.5mL塑料离心管中，加入内标工作液50μL，涡旋混-1匀后加入甲醇610μL沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取上清液200μL至进样瓶中，按“2.1分析条件”进样测定。2.3.3血浆混合标准曲线样本的制备和测定分别吸取SW1~SW7的血浆混合标准曲线工作液10μL至1.5mL塑料离心管中，加入空白血浆190μL，涡旋混匀，得到S1~S7的血浆混合标准曲线样本，血浆中三种待测物的浓度见表3-5。再加入内标工作液50μL，甲醇600μL，涡旋1min，于-115000r·min、4℃离心10min。吸取上清液200μL至进样瓶中，按“2.1分析条件”进样测定。2.3.4血浆混合质控样本的制备和测定分别吸取LLOQW、QCWL、QCWM和QCWH血浆混合质控工作液10μL至1.5mL塑料离心管中，并加入空白血浆190μL，涡旋混匀，配制成最低定量限（LLOQ）及低（QCL）、中（QCM）和高（QCH）3种不同浓度的血浆混合质控样本，待测物浓度见表3-5。再加入内标工作液50μL，再加入甲醇600μL沉淀蛋白，涡旋1min，-1于15000r·min、4℃离心10min。吸取上清液200μL至进样瓶中，按“2.1分析条件”进样测定。-1表3-5血浆和PBS混合标准曲线样本和质控样本的浓度（单位：ng·mL）基质待测物S1S2S3S4S5S6S7QCLQCMQCH血浆DUL4.00012.0040.00120.0400.0800.0120010.00200.01000FLU4.00012.0040.00120.0400.0800.0120010.00200.01000AGO0.5002.00010.0050.00200.0800.012001.000100.01000PBSDUL0.4001.0002.0005.00010.0015.0020.000.8004.00016.00FLU0.4001.0002.0005.00010.0015.0020.000.8004.00016.00AGO0.0500.2001.0003.00010.0020.0030.000.1002.00025.0054 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章2.3.5含药血浆样本的处理和测定吸取含药血浆（或透析内液）200μL至1.5mL塑料离心管中，加入内标工作液-150μL，加入甲醇600μL沉淀蛋白，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min，吸取上清液200μL至进样瓶中，按“2.1分析条件”进样测定。2.4PBS样本的处理和测定2.4.1空白PBS样本（PBS-DB）的处理和测定吸取空白PBS240μL至1.5mL塑料离心管中，加入甲醇60μL，涡旋1min，于-115000r·min、4℃离心10min。吸取上清液200μL至进样瓶中，按“2.1分析条件”进样测定。2.4.2空白PBS加入内标样本（PBS-BK）的处理和测定吸取空白PBS240μL至1.5mL塑料离心管中，加入甲醇10μL，再加入内标工-1作液50μL，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取上清液200μL至进样瓶中，按“2.1分析条件”进样测定。2.4.3PBS混合标准曲线样本的制备和测定分别吸取SW1~SW7的PBS混合标准曲线工作液10μL至1.5mL塑料离心管中，加入空白PBS240μL，涡旋混匀，得到S1~S7的PBS混合标准曲线样本，PBS中三-1种待测物的浓度见表3-5。。再加入内标工作液50μL，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取上清液200μL至进样瓶中，按“2.1分析条件”进样测定。2.4.4PBS混合质控样本的制备和测定分别吸取LLOQW、QCWL、QCWM和QCWH的PBS混合质控工作液10μL至1.5mL塑料离心管中，并加入空白PBS240μL，涡旋混匀，配制成最低定量限（LLOQ）及低（QCL）、中（QCM）和高（QCH）3种不同浓度的PBS混合质控样本，待测物-1浓度见表3-5。加入内标工作液50μL，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min。吸取上清液200μL至进样瓶中，按“2.1分析条件”进样测定。2.4.5含药PBS样本的处理和测定吸取含药PBS（或透析外液）250μL至1.5mL塑料离心管中，加入内标工作液-150μL，涡旋1min，于15000r·min、4℃离心10min，吸取上清液200μL至进样瓶中，按“2.1分析条件”进样测定。55 第三章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因2.5方法学考察2.5.1特异性按照“2.3血浆样本的处理与测定”（或“2.4PBS样本的处理与测定”）项下操作，分别考察以下样本的特异性：6种不同来源的空白血浆样本（A）、空白血浆加入内标样本（B）、血浆-LLOQ样本（C）、空白PBS样本（D）、空白PBS加入内标样本（E）、PBS-LLOQ样本（F）。并记录色谱图，待测物的保留时间tR和峰面积As，内标保留时间tRi和峰面积Ai。2.5.2标准曲线与线性范围按照“2.3”（或“2.4”）项下操作，制备并测定血浆（或PBS）混合标准曲线样本，记录色谱图、待测物峰面积As和内标峰面积Ai。以待测物加入浓度C为X轴，以2As与Ai的峰面积比值f（f=As/Ai）为Y轴进行权重回归（权重系数为1/C），同时计算每个浓度点实测浓度的RE。2.5.3最低定量限与精密度和准确度按照“2.3.4”（或“2.4.4”）项操作，制备并测定血浆（或PBS）的LLOQ、QCL、QCM、QCH样本，每个浓度制备6个样本，每天1批，连续测定3批，每批随行一条标准曲线。记录色谱图、待测物的峰面积As和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值f(f=As/Ai)，将f值代入随行标准曲线求得实测浓度及RE值。用Excel软件将同一浓度3批共18个样本的实测浓度进行单因素方差分析，分别得到差异源为组内和组间的MS值，计算同一浓度所有样本的实测浓度平均值C（N=18）。组内MS批内RSD=×100%C组间MS批间RSD=×100%CRE=CCC100%实测加入加入接受标准：低、中、高3种浓度质控血浆样本RE应在±15%以内，RSD＜15%；最低定量限血浆样本RE应在±20%以内，RSD＜20%。2.5.4基质效应血浆样本：取6种不同来源空白血浆190μL，加入甲醇600μL，涡旋离心取上清得到空白血浆基质溶液，取上述基质溶液790μL，分别加入血浆样本的低、中和56 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章高3种质量浓度的混合质控工作液10μL及内标工作液50μL，每种浓度6个样本，以其进样得到的待测物峰面积除以同种操作下以水代替空白血浆的待测物峰面积，计算血浆中内源性物质对待测物和内标的绝对基质效应ME，再以待测物的绝对基质ME效应除以内标的绝对基质效应MEi，得到待测物的内标归一化基质效应因子MF，然后计算MF的RSD值。PBS样本的基质效应按照上述同样方法分析计算。2.5.5提取回收率按照“2.3.4”项下操作，分别配制并测定QCL、QCM、QCH血浆混合质控样本，每个浓度6份样本，作为血浆提取样本，记录色谱图、待测物峰面积A和内标S提取峰面积Ai提取。取6个不同来源的空白血浆190μL至1.5mL塑料离心管中，共18个样本（每个来源的空白组织匀浆平行取3份），加入甲醇600μL沉淀蛋白，涡旋1min，于15000-1r·min、4℃离心10min，取尽上清液作为对照样本溶剂。另取数个塑料离心管，分别加入10μL血浆QCWL、QCWM、QCWH混合质控工作液，每个浓度平行制备6个样本，所有样本加入50μL内标工作液，再加入不同来源的对照样本溶剂，涡旋混匀后取上清200μL按“2.1分析条件”进样测定。记录色谱图、待测物峰面积A和S对照内标峰面积A。i对照按RECAA100%计算不同浓度质控水平待测物的提取回收率，同S提取S对照时计算每个浓度水平REC的Mean、SD和RSD（n=6）。按RECAA100%计算内标的提取回收率，同时计算RECi的Mean、ii提取i对照SD和RSD（n=18）PBS样本则以QCL、QCM、QCH质控样本浓度的实测值与加入值的比值计算回收率。2.5.6稳定性2.5.6.1待测物储备液的稳定性分别称取待测物（DUL、FLU、AGO）对照品适量（相当于10mgDUL、10mgFLU、10mgAGO），转移至10mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，混匀得到1.057 第三章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因-1mg·mL供试溶液，分装于若干1.5mL塑料离心管中，分别于室温下放置2天、冷藏柜中保存22天后测定，供试溶液测定时，同法新配制待测物储备液作为对照溶液，所有溶液平行配制2份。样本的处理及测定：吸取待测物的供试溶液或对照溶液按表3-3的血浆-QCWM的浓度稀释成储备液稳定性考察工作液，取该工作液10μL至进样瓶中，加入水190μL、甲醇650μL，涡旋混匀后按“2.1分析条件”进样测定，每份样本连续测定3次，记录色谱图和待测物的峰面积As。2.5.6.2内标储备液的稳定性该部分内标储备液与第一章的内标储备液的成分和制备方法相同，不再考察。2.5.6.3待测样本的稳定性按照“2.3.4”项下操作，分别配制QCL、QCM、QCH血浆混合质控样本，每种浓度配制3份，分别于-30℃保存并反复冻融3次、-30℃保存至10天、室温下放置1天、4℃保存4天。稳定性样本按“2.3.5”项处理测定。记录色谱图、待测物峰面积As和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值f（f=As/Ai），将f值代入随行标准曲线求得实测浓度和RE，并计算RSD（N=3）。PBS样本的稳定性按照上述同样方法考察。3方法学考察结果3.1特异性DUL，FLU，AGO，DIA（IS）的产物离子全扫面图谱见图3-1.。特异性考察结果见图3-2。在血浆和PBS样本中，DUL、FLU、AGO与内标DIA的保留时间分别约为：3.7min，4.1min，6.0min，6.1min。空白基质中的内源性物质与3种待测物和内标互不干扰测定。58 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章DULFLUAGODIA（IS）图3-1DUL,FLU,AGO,DIA的产物离子全扫描图谱59 第三章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因图3-2血浆和PBS样本特异性考察色谱图注：A:空白血浆样本;B:空白血浆加入内标样本;C:含药血浆样本;D:空白PBS样本;E:空白PBS加入内标样本;F:含药PBS样本3.2标准曲线与线性范围在血浆和PBS样本中，标准曲线的线性良好，线性回归结果见表3-6。表3-6典型的标准曲线方程与线性范围线性范围基质待测物标准曲线方程r-1（ng·mL）血浆DULy=0.0177x-0.001390.99944~1200FLUy=0.00638x-0.001730.99904~1200AGOy=0.0413x+0.0004850.99900.5~1200PBSDULy=0.0223x+0.00005630.99840.4~20FLUy=0.00678+0.00004330.99920.4~20AGOy=0.0564x+0.00004360.99930.05~3060 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章3.3最低定量限血浆样本与PBS样本的最低定量限测定结果见表3-7。在血浆样本中，DUL、FLU、-1-1-1AGO的最低定量限分别为4.000ng·mL、4.000ng·mL、0.5000ng·mL。在PBS样-1-1本中，DUL、FLU、AGO的最低定量限分别为0.4000ng·mL、0.4000ng·mL、0.05000-1ng·mL。所有最低定量限样本均满足RE在±20%以内，RSD＜20%。表3-7血浆和PBS样本的最低定量限考察结果加入浓度实测浓度RE（%）RSD（%）-1-1（ng·mL）（ng·mL）批內批间plasma-DUL4.0003.948±0.18-12.0～5.33.229.79plasma-FLU4.0003.916±0.28-11.5～7.33.7917.7plasma-AGO0.50000.4914±0.022-6.8～9.04.325.27PBS-DUL0.40000.3943±0.033-13.9～10.96.6716.1PBS-FLU0.40000.4055±0.027-9.7～11.25.9311.1PBS-AGO0.050000.05078±0.0028-9.7～11.63.6112.93.4精密度与准确度血浆样本和PBS样本的精密度和准确度考察结果见表3-8，结果表明：血浆和PBS的低、中、和高3种质量浓度质控样本的RE在±15%以内，RSD＜15%。3.5基质效应血浆样本和PBS样本的基质效应考察结果见表3-8。结果所示，三种待测物在血浆和PBS中的内标归一化基质效应均满足RSD＜15%，说明血浆基质和PBS基质均不影响待测物的定量测定。3.6提取回收率在血浆样本和PBS样本中，待测物的提取回收率结果见表3-8。在血浆样本中，内标的提取回收率为(109.5±7.0)%，RSD为6.4%。结果表明：在血浆和PBS中，待测物和内标的提取回收率均满足RSD小于15%，考察结果精密且可重现。61 第三章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因表3-8血浆和PBS样本的准确度、精密度、基质效应、提取回收率考察结果加入浓度准确度精密度RSD(%)内标归提取回收率一化基待测物-1(ng·mL)RE(%)批內批间REC(%)质效应RSD(%)RSD(%)10.00-9.0～7.13.8312.66.9989.16±5.916.63plasma-DUL200.0-8.7～5.31.8112.45.4785.89±4.054.711000-8.9～6.22.4810.13.1886.77±4.545.2310.00-8.7～7.92.6713.06.2196.44±5.225.41plasma-FLU200.0-8.9～6.12.3411.93.4091.16±4.244.651000-3.8～8.53.264.712.2590.81±4.835.311.000-8.3～5.42.8310.54.74105.13±7.737.36plasma-AGO100.0-9.5～8.53.5513.53.7698.00±3.653.721000-9.1～2.22.099.113.1295.11±4.775.010.8000-11.6～3.54.097.637.3693.26±3.663.92PBS-DUL4.000-11.3～7.64.4714.45.2594.29±5.285.6016.00-9.3～9.73.5912.67.9696.63±5.115.280.8000-8.2～10.15.1812.28.80103.20±4.984.82PBS-FLU4.000-9.1～13.65.127.785.07102.81±4.454.3316.00-6.0～10.44.207.235.28106.86±2.252.340.10000.1～10.62.791.638.17106.21±4.504.23PBS-AGO2.0000.5～10.52.750.465.17106.67±3.643.4225.00-1.8～9.32.536.032.31100.43±1.941.933.7稳定性3.7.1储备液稳定性DUL，FLU，AGO储备液稳定性考察结果见表3-9-1，3-9-2，3-9-3结果表明：DUL，FLU，AGO储备液于室温下放置2天、冷藏柜中放置22天后均稳定。62 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章表3-9-1度洛西汀储备液稳定性考察结果储备液浓度峰面积DULMeanSD(%)RSD(%)RE(%)-1(mg·mL)实测校正后3.059E+063.077E+060.9943.106E+063.125E+063.075E+063.093E+06对照3.162E+067.643E+042.42-3.248E+063.245E+061.0013.176E+063.173E+063.260E+063.257E+062.948E+062.939E+061.0032.976E+062.967E+06室温，2.930E+062.921E+063.056E+061.258E+054.12-3.332天3.177E+063.164E+061.0043.197E+063.184E+063.175E+063.162E+063.006E+062.986E+061.0073.007E+062.986E+064℃，3.041E+063.020E+063.043E+065.580E+041.83-3.7522天3.090E+063.074E+061.0053.142E+063.126E+063.083E+063.067E+06表3-9-2氟西汀储备液稳定性考察结果储备液浓度峰面积FLUMeanSD(%)RSD(%)RE(%)-1(mg·mL)实测校正后1.037E+061.034E+061.0031.056E+061.053E+061.063E+061.060E+06对照1.068E+062.322E+042.17-1.110E+061.097E+061.0121.095E+061.082E+061.095E+061.082E+061.008E+061.007E+061.0011.028E+061.027E+06室温，21.001E+061.000E+061.046E+063.893E+043.72-2.06天1.086E+061.080E+061.0061.092E+061.085E+061.082E+061.076E+061.059E+061.059E+061.0001.031E+061.031E+064℃，221.059E+061.059E+061.062E+061.789E+041.69-0.59天1.068E+061.066E+061.0021.088E+061.086E+061.070E+061.068E+0663 第三章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因表3-9-3阿戈美拉汀储备液稳定性考察结果储备液浓度峰面积AGOMeanSD(%)RSD(%)RE(%)-1(mg·mL)实测校正后4.555E+064.501E+061.0124.543E+064.489E+064.537E+064.483E+06对照4.545E+067.358E+041.62-4.723E+064.644E+061.0174.712E+064.633E+064.596E+064.519E+064.274E+064.313E+060.9914.281E+064.320E+06室温，24.261E+064.300E+064.392E+069.047E+042.06-3.36天4.472E+064.485E+060.9974.438E+064.451E+064.471E+064.485E+064.287E+064.339E+060.9884.294E+064.346E+064℃，224.279E+064.331E+064.368E+063.999E+040.92-3.89天4.348E+064.437E+060.9804.277E+064.364E+064.304E+064.392E+063.7.2待测样本的稳定性考察DUL，FLU，AGO的血浆和PBS样本的稳定性考察结果见表3-10。在血浆和PBS样本中，分别于-30℃保存至10天、-30℃保存并反复冻融3次、室温下放置1天、4℃保存4天的所有稳定性考察低、中、高质控样本的实测浓度均满足RE在±15%以内，RSD＜15%。64 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章表3-10血浆和PBS样本的稳定性考察结果加入浓度-30℃保存10天-30℃反复冻融3次室温放置1天4℃放置4天-1(ng·mL)实测浓度RSD(%)RE(%)实测浓度RSD(%)RE(%)实测浓度RSD(%)RE(%)实测浓度RSD(%)RE(%)10.0010.59±0.272.573.4～8.811.09±0.2602.358.0～13.110.44±0.100.963.8～5.611.12±0.1411.279.7～12.5plasma200.0209.8±8.784.181.4～9.8212.5±11.45.35-0.1～10.9213.2±12.25.701.1～13.2222.6±4.922.218.9～13.8-DUL1000967.5±58.26.02-9.8～1.2994.8±32.43.25-3.2～3.11001±61.76.16-6.7～5.31014±17.11.68-0.3～3.110.0010.18±0.313.04-1.6～4.410.87±0.080.728.0～9.610.31±0.141.382.0～4.710.89±0.181.686.8～10.1plasma200.0200.6±7.593.79-2.9～4.5202.7±12.36.07-5.2～7.0205.6±10.24.94-1.6～8.4211.4±6.22.922.4～8.6-FLU1000979.3±65.26.65-9.3～3.31020±38.03.72-0.7～6.31033±53.25.15-2.7～7.51042±13.01.253.3～5.71.0001.008±0.0060.640.1～1.41.017±0.0131.320.3～3.01.019±0.0201.940.0～4.01.039±0.0302.880.8～6.7plasma100.0103.8±3.513.380.8～7.7103.0±4.684.54-2.1～7.1103.2±4.554.41-0.5～8.3105.9±2.051.944.3～8.2-AGO1000926.4±54.75.90-11.2～-0.2970.9±28.12.89-5.4～0.2954.3±46.34.85-9.2～0.0947.7±9.861.04-6.3～-4.40.80000.7748±0.0364.63-8.3～-0.20.8047±0.0445.47-3.0～6.90.8428±0.09110.77-7.7～13.00.8364±0.0758.92-6.1～11.1PBS4.0004.103±0.0360.871.6～3.34.285±0.1794.173.8～12.24.403±0.0451.029.2～11.34.433±0.0551.239.3～12.0-DUL16.0016.11±0.825.08-2.9～6.516.99±0.5793.412.0～8.517.70±0.402.287.7～12.417.71±0.532.986.9～13.10.80000.7182±0.0385.33-14.8～-5.30.7397±0.0395.32-10.7～-1.90.8329±0.0738.82-6.5～10.00.8341±0.0698.33-5.6～10.6PBS4.0003.696±0.0581.57-9.2～-6.43.843±0.1223.17-5.9～-0.44.544±0.0130.2913.2～13.84.320±0.2114.892.0～11.8-FLU16.0014.55±0.674.58-12.2～-4.315.42±0.754.88-9.0～-0.117.73±0.502.807.3～13.017.56±0.663.785.3～13.50.10000.1117±0.00221.999.3～13.70.1117±0.00090.7611.0～12.70.1095±0.00211.947.8～11.90.1071±0.00716.67-1.1～11.8PBS2.0002.181±0.0281.277.4～10.02.184±0.0020.079.1～9.32.275±0.0110.5013.2～14.32.183±0.0642.935.7～12.0-AGO25.0024.74±0.883.54-3.9～2.924.40±1.184.83-7.8～0.827.05±0.511.906.6～10.527.60±0.301.099.2～11.665 第三章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第二节度洛西汀的血浆蛋白结合率及其相互作用1平衡透析法测定药物的血浆蛋白结合率1.1透析用含药血浆的制备吸取一定浓度待测药物的甲醇溶液10μL于塑料离心管中，30℃20min挥干溶剂，再加入1mL人空白血浆，涡旋混匀，即得透析用含药血浆。1.2平衡透析装置将透析袋剪成每段10cm，加入含药血浆1mL，两端夹紧后悬于19mLPBS中，使内外液面相平且透析袋不贴壁，于4℃放置，待透析平衡后，分别取透析内液和透析外液样本于-30℃保存待测。同时取透析外液1mL于塑料管中，加入10%高氯酸溶液1mL混匀，若无白色沉淀，则该样本可用；若有白色沉淀产生，则说明血浆泄漏，该样本不可用。1.3透析平衡时间的考察-1按“1.1”项操作，制备1000ng·mL的DUL含药血浆，然后按“1.2”项操作进行平衡透析，分别于3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h和96h吸取透析外液250μL待测，并补充等量的空白PBS，平行做3份。以测得透析外液的药物浓度作为纵坐标，透析时间作为横坐标，进行曲线拟合，考察到达透析平衡所用的时间。FLU与AGO的透析平衡时间考察同样按照上述方法操作。1.4血浆蛋白结合率的测定方法按照“1.1”与“1.2”项操作，待透析平衡之后，分别取透析内液与透析外液，用第一章建立的LC-MS/MS法测定待测物的浓度。透析内液药物浓度记为C1，透析外液[43]药物浓度记为C2，按下列公式计算药物的血浆蛋白结合率：血浆蛋白结合率（PPB）=(C1-C2)/C1×100%2药物的血浆蛋白结合相互作用-1-1按照“1.1”项操作，分别制备含DUL浓度为72.00ng·mL、200.0ng·mL、1000-1-1-1ng·mL的单一药物血浆样本（DUL对照），含FLU浓度为72.00ng·mL、200.0ng·mL、-1-11000ng·mL的单一药物血浆样本（FLU对照），含AGO浓度为9.000ng·mL、200.0-1-1ng·mL、1000ng·mL的单一药物血浆样本（AGO对照），和同时含有DUL和FLU-1-1两种药物的血浆样本（DUL72.00ng·mL+FLU72.00ng·mL；DUL200.066 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章-1-1-1-1ng·mL+FLU200.0ng·mL；DUL1000ng·mL+FLU1000ng·mL），同时含有DUL-1-1和AGO两种药物的血浆样本（DUL72.00ng·mL+AGO9.000ng·mL、DUL200.0-1-1-1-1ng·mL+AGO200.0ng·mL、DUL1000ng·mL+AGO1000ng·mL），每种样本平行做3份。分别测定上述样本的药物血浆蛋白结合率，并将同时含有两种药物时的血浆蛋白结合率与同浓度下仅含单一药物的血浆蛋白结合率进行独立样本的t检验（α=0.05）。另考察正常和糖尿病大鼠的度洛西汀血浆蛋白结合率，每组选药物浓度相近的3个样本。3实验结果3.1透析平衡时间DUL，FLU，AGO的透析平衡时间考察结果见图3-3。由图3-3可知，DUL与AGO的透析外液的药物浓度在48h趋于平衡；FLU的透析外液浓度在72h处达到稳定，浓度不再变化。选择72h作为DUL、FLU、AGO三种药物血浆的透析平衡时间。图3-3透析平衡时间考察3.2FLU或AGO对DUL的血浆蛋白结合率的影响DUL对照样本的血浆蛋白结合率，以及加入FLU或AGO后DUL的血浆蛋白结合率的测定结果见表3-1167 第三章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因结果显示：DUL对照样本的血浆蛋白结合率不存在浓度依赖性，测定结果为(96.59±0.47)%；加入FLU或AGO后，DUL的血浆蛋白结合率同对照样本相比，没有显著性差异（P>0.05）。表3-11度洛西汀的血浆蛋白结合率及其相互作用对照加入FLU加入AGODUL浓度(ng·mL-1)FLU浓度.AGO浓度PPB-DUL(%)-1PPB-DUL(%)-1PPB-DUL(%)(ng·mL)(ng·mL)72.0096.96±0.3872.0097.04±0.219.00096.95±0.31200.096.51±0.61200.095.83±0.37200.095.99±0.04100096.32±0.24100096.42±0.34100096.56±0.11*表示P＜0.053.3DUL对FLU的血浆蛋白结合率的影响FLU对照样本的血浆蛋白结合率，以及加入DUL后FLU的血浆蛋白结合率的测定结果见表3-12。结果显示：FLU对照样本的血浆蛋白结合率不存在浓度依赖性，测定结果为(94.54±0.22)%；加入DUL后，FLU的血浆蛋白结合率同对照样本相比，没有显著性差异（P>0.05）。表3-12氟西汀的血浆蛋白结合率及其相互作用-1对照加入DULFLU浓度(ng·mL)-1PPB-FLU(%)DUL浓度.(ng·mL)PPB-FLU(%)72.0094.68±0.3072.0094.74±0.60200.094.42±0.13200.094.55±0.25100094.52±0.18100094.12±0.30*表示P＜0.053.4DUL对AGO的血浆蛋白结合率的影响AGO对照样本的血浆蛋白结合率，以及加入DUL后AGO的血浆蛋白结合率的测定结果见表3-13。结果显示：AGO对照样本的血浆蛋白结合率不存在浓度依赖性，测定结果为(95.61±1.11)%；加入DUL后，AGO的血浆蛋白结合率同对照样本相比，没有显著性差异（P>0.05）。68 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章表3-13阿戈美拉汀的血浆蛋白结合率及其相互作用-1对照加入DULAGO浓度(ng·mL)-1PPB-AGO(%)DUL浓度.(ng·mL)PPB-AGO(%)9.00096.96±0.4372.0096.65±0.16200.095.33±0.05200.095.20±0.22100094.54±0.37100095.13±0.17*表示P＜0.053.5正常和糖尿病大鼠的DUL血浆蛋白结合率比较正常大鼠和糖尿病大鼠灌胃给药后DUL的血浆蛋白结合率，测定结果见表3-14。结果显示：正常和糖尿病大鼠体内的度洛西汀血浆蛋白结合率没有显著性差异（P>0.05）。表3-14正常和糖尿病大鼠的DUL血浆蛋白结合率正常大鼠糖尿病大鼠DUL浓度DUL浓度-1PPB(%)-1PPB(%)(ng·mL)(ng·mL)730.497.04809.697.53899.897.46904.798.91119098.01126498.83Mean97.5098.43SD0.490.78*表示P＜0.0569 第三章基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三节讨论与结论文献报道的人血浆中DUL，FLU，AGO的单一药物浓度的测定方法有HPLC法[39,44,45]和LC-MS/MS等等。相比HPLC法，LC-MS/MS法具有灵敏度高、专属性强、方便快速等优点，且LC-MS/MS法更适合多种药物浓度的同时测定。本实验建立了可以同时测定DUL，FLU，AGO三种药物浓度的LC-MS/MS法，处理血浆（透析内液）样本时，采用甲醇直接沉淀蛋白法；处理PBS（透析外液）样本则采用取样后直接加内标测定法，操作简便高效。平衡透析法是测定药物血浆蛋白结合率的经典方法。本实验在建立方法时，试验过超滤法，超滤法相比平衡透析法具有方便省时等优点。但是经过初步试验，发现超TM滤管（Omega滤膜，10kDa，Pall）对3种药物的非特异性吸附较大。且超滤法的[46]分离结果溶于受离心力和离心时间的影响而改变。相比超滤法，在本实验中平衡透析法的吸附效应较小，并且由于存在透析膜内外长时间的平衡作用，少量的吸附并不会影响血浆蛋白结合率的测定。综合以上原因，本实验选择平衡透析法进行血浆蛋白结合率的测定。血浆蛋白结合率的细微变化，对于高血浆蛋白结合率的药物来说至关重要。度洛西汀在正常和糖尿病大鼠的药代动力学比较研究表明，糖尿病状态下度洛西汀在血浆中的暴露量显著增大。但本实验的结果表明，高浓度条件下以及糖尿病状态下，度洛西汀的血浆蛋白结合率没有显著的改变。该结果提示，糖尿病状态下度洛西汀的高暴露量，并不会对其血浆蛋白结合率产生影响。当几种高血浆蛋白结合率的药物联合用药时，可能存在游离药物量变化的现象[34,36]。度洛西汀、氟西汀、阿戈美拉汀均是高血浆蛋白结合率药物，但是当它们联合用药时的血浆蛋白结合率却未见报道。氟西汀、阿戈美拉汀分别和度洛西汀相互作用体外实验的初步结果表明，它们在血浆中相互作用的血浆蛋白结合率，和单独作用时的相比没有显著性差异（P>0.05）。尽管它们都主要结合于血浆白蛋白和α1-酸性糖蛋白，药物间未发生血浆蛋白结合的相互作用可能是由于药物的结合未达到饱和或结合位点不同，因而没有出现明显的结合型药物被置换出来的现象。本研究结果提示，度洛西汀在与氟西汀或阿戈美拉汀在临床联合用药过程中，不存在血浆蛋白结合的相互作用，故临床联合用药过程中产生的不良反应并不是源于血70 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因第三章浆蛋白结合率的变化。已有的文献研究表明，度洛西汀与氟西汀、阿戈美拉汀不存在[26]药动学相互作用，故在今后的临床研究中，对联合用药时不良反应发生原因，需更多的从药理学作用机制上做进一步探索。71 总结与展望基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因总结与展望本文建立了测定大鼠血浆中DUL浓度的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法，并进行了方法学考察。采用腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，将正常组与糖-1尿病模型组大鼠分别进行单、多次给药，剂量为40mg·kg灌胃，于眼眶静脉丛采血测定血药浓度，用DAS3.2.3软件计算药动学参数，用SPSS22软件进行统计分析。结果显示，在单、多次给药试验中，糖尿病组的DUL暴露量（Cmax与AUC）均显著高于正常组，提示糖尿病状态会使DUL的生物利用度提高，吸收增强，暴露量增大。然后采用大鼠血浆的LC-MS/MS分析条件，改变样本预处理过程，对大鼠组织（包括大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、大肠、睾丸、肌肉、脂肪）-1匀浆液进行方法学考察。比较DUL单次给药(40mg·kg)后，正常组与糖尿病模型组大鼠的组织分布情况，发现两组的组织分布情况基本类似，除胃肠道以外，主要分布在肝脏、肺、脾脏、肾脏这些血液流动或体液交换较丰富的组织中。给药后2h，糖-1尿病组大脑中的药物含量是正常组的2倍（15.71±6.82vs8.431±4.786μg·g），但是无显著性差异，提示在糖尿病状态下DUL在大脑中的含量有增高的趋势。本文第二部分建立了同时测定血浆和PBS中DUL、FLU、AGO浓度的LC-MS/MS法，同时建立了测定药物的血浆蛋白结合率的平衡透析法。比较正常大鼠和糖尿病大鼠的DUL血浆蛋白结合率，没有发现两组有显著性差异。FLU、AGO分别和DUL相互作用的体外实验结果表明，它们在血浆中相互作用的蛋白结合率，和单独作用时的相比没有显著性差异。因此，DUL应用于糖尿病患者时的不良反应发生率增多，可能和其血浆和脑组织的暴露量增大有关。临床上，DUL应用于糖尿病患者时，需关注其体内的暴露量，如果暴露量增大，可以考虑在不影响疗效的情况下，减少给药剂量。而糖尿病状态下，以及联用FLU或AGO时，DUL的血浆蛋白结合率并不会发生显著改变，因此不良反应的发生可能和血浆蛋白结合率的变化无关。基于上述研究结果，可以从以下几个方面进一步对DUL展开研究：1、探讨DUL的高暴露量是否源于糖尿病状态下胃肠道中吸收相关的转运体变化致其吸收增强；2、研究糖尿病患者体内，尤其是血浆和脑组织中度洛西汀的药代动力学和药效动力学行72 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因总结与展望为，建立PK-PD模型，探讨糖尿病患者体内DUL的吸收是否增强，药效作用是否增强，以及不良反应是否因此增加；3、从药理学作用机制上，对DUL和FLU、DUL和AGO的相互作用做进一步研究，以揭示药物之间是否存在协同作用，不良反应的增加是否源于药物间的协同作用。73 参考文献基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因参考文献[1]KnadlerMP,LoboE,ChappellJ,etal.Duloxetine:clinicalpharmacokineticsanddruginteractions[J].ClinPharmacokinet,2011,50:281-294[2]ChappellJC,EisenhoferG,OwensMJ,etal.Effectsofduloxetineonnorepinephrineandserotonintransporteractivityinhealthysubjects[J].JClinPsychopharmacol,2014,34:9-16[3]BymasterFP,LeeTC,KnadlerMP,etal.Thedualtransporterinhibitorduloxetine:Areviewofitspreclinicalpharmacology,pharmacokineticprofile,andclinicalresultsindepression[J].CurrPharmDes,2005,11:1475-1493[4]U.S.FoodandDrugAdministration,highlightsofprescribinginformation,Cymbalta(duloxetinehydrochloride)Delayed-ReleaseCapsulesforOralUse,ReferenceID:3009610[EB/OL].2011-09-07[2016-10-15]..http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2011/021427s039lbl.pdf[5]MyersJ,WielageRC,HanB,etal.Theefficacyofduloxetine,non-steroidalanti-inflammatorydrugs,andopioidsinosteoarthritis:asystematicliteraturereviewandmeta-analysis[J].BMCMusculoskeletDisord,2014,15:76[6]PergolizziJV,Jr.,RaffaRB,TaylorR,Jr.,etal.Areviewofduloxetine60mgonce-dailydosingforthemanagementofdiabeticperipheralneuropathicpain,fibromyalgia,andchronicmusculoskeletalpainduetochronicosteoarthritispainandlowbackpain[J].PainPract,2013,13:239-252[7]WangG,BiL,LiX,etal.EfficacyandsafetyofduloxetineinChinesepatientswithchronicpainduetoosteoarthritis:arandomized,double-blind,placebo-controlledstudy[J].OsteoarthritisCartilage,2017.http://dx.doi.org/10.1016/j.joca.2016.12.025.[8]SchukroRP,OehmkeMJ,GeroldingerA,etal.Efficacyofduloxetineinchroniclowbackpainwithaneuropathiccomponent:arandomized,double-blind,placebo-controlledcrossovertrial[J].Anesthesiology,2016,124:150-158[9]ZhaoRK,ChengG,TangJ,etal.Pharmacokineticsofduloxetinehydrochlorideenteric-coatedtabletsinhealthyChinesevolunteers:arandomized,open-label,single-andmultiple-dosestudy[J].ClinTher,2009,31:1022-1036[10]ChaeJW,BaekHM,KimSK,etal.QuantitativedeterminationofduloxetineanditsmetaboliteinratplasmabyHPLC-MS/MS[J].BiomedChromatogr,2013,27:953-95574 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综述基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因综述选择性5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂度洛西汀的研究进展摘要：度洛西汀是5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）再摄取双重抑制剂，主要通过抑制中枢神经系统中的5-HT和NE转运体的活性，来提高5-HT和NE的浓度，从而发挥调控情感和抑制对疼痛的敏感程度等的药效。本文主要对度洛西汀的药代动力学特征和最新的临床应用进行综述。关键词：度洛西汀；药代动力学；临床应用度洛西汀（商品名：欣百达），化学名是（S）-（+）-N,N-二甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩)-丙胺盐酸盐，是一种选择性5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取双重抑制剂。它可以有效治疗重度抑郁症，广泛焦虑障碍，糖尿病周围神经性疼痛，应力性尿失禁和纤[1]维肌疼痛。1作用机制度洛西汀（duloxetine，DUL）是第二代选择性5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，[1,2]5-HT）和去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）再摄取双重抑制剂。此外，DUL可以较弱的抑制多巴胺的再摄取，还与其他的一些神经递质受体有较低的亲和力，包括肾上腺素能受体，毒蕈碱受体（非选择性），组胺H1受体，多巴胺D2受体，5-HT1A，[3]5-HT1D，5-HT2C受体，阿片受体。它主要通过抑制中枢神经系统中的5-HT和NE转运体的活性，来提高5-HT和NE的浓度，从而发挥调控情感和抑制对疼痛的敏感[4]程度等的药效。2药代动力学2.1吸收DUL经口服给药后，吸收较好，平均血药浓度达峰时间（tmax）为6h。一项60mg[4]的单次给药试验显示，DUL的平均绝对生物利用度为50%（30%-80%）。另一项[5]试验则显示平均绝对生物利用度为43%（19%-71%）。患者的群体药动学结果表明，-1一旦药物在小肠中溶解，它的吸收速率是很快的，吸收速速常数为0.168h。DUL的78 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因综述消除半衰期（t1/2）大约为10-12h，因此稳态发生在3天之内。由于剂量和给药方案-1[6]的不同，血药浓度通常介于24.6-110ng·mL。一项60mg单次给药试验显示，DUL-1[4]的血药浓度-时间曲线下面积平均为591ng·h·mL。食物和时辰会对DUL的吸收有所影响，餐后和睡前服用会使tmax推迟4个小时。这是由于在睡前或有食物存在时胃排空减慢，进而延长药物在消化道内的暴露，使人体的新陈代谢减慢，因此会减少吸收的程度。然而，食物对DUL的最大血药浓度（Cmax）没有显著影响，但会轻微的减小AUC与t1/2。睡前服药对t1/2没有影响，但会减小DUL的AUC和Cmax。由于餐后和睡前服药的影响相当小，而且没有明显的临床意义，因此并没有必要根据餐后和睡前给药来调整给药剂量。2.2分布经吸收后，DUL广泛的分布在人体之中，它的平均表观分布容积较大[7]（1620-1800L）。蛋白结合率可能为影响DUL分布的因素之一。在一项体外实验中，DUL的人血浆蛋白结合率高达90%以上，这种结合主要发生在白蛋白和α1酸性[4]糖蛋白上。在治疗浓度范围内，该结合率不具有浓度依赖性。理论上，当两种蛋白[8]结合率高的药物联合用药时，结合位点上药物的相互取代可能会影响药物的分布。-1在人类和大鼠的大脑中，给药后都被发现有DUL的存在。给予大鼠20mg·kg[4]剂量的DUL后，大脑皮层内的药物浓度高于血浆中的药物浓度。大鼠血浆的蛋白结合率和人类的一样，都很高。在一项健康男性的DUL试验研究中，单次给药5-60mg不等，或连续给药60mg每天，应用了正电子放射断层成像术对丘脑内占据的5-HT转运体进行了研究，数据显示给予40mg以上剂量的DUL的研究对象中，有80%的[9]5-HT转运体占据着丘脑。这足以证明有DUL分布在大脑中。但也有研究表明，与文拉法辛、米氮平和西酞普兰这些脑脊液较高的抗精神病药相比，DUL的在脑脊液中的浓度较低。可能是由于与其他抗精神病药相比，DUL透过血液-脑脊液屏障进入大脑的能力较差；或者由于药物在血液和脑脊液之间相互交换的主动运输机制，导致[10]脑脊液中药物的停留时间较短。2.3代谢DUL在体内会经历广泛的代谢，代谢成一系列复杂的代谢产物。DUL的生物转化途径主要是萘基环的氧化及其产物的进一步氧化，甲基化，结合反应。在一项79 综述基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因14C-DUL的单次口服给药研究中，母药的AUC得出循环放射性约为3%，基于Cmax的放射性约为9%。DUL的两个主要的代谢产物是与葡萄糖醛酸结合的4-羟基度洛西汀（4-OHduloxetine）和与硫酸共轭的4-羟基-5-甲氧基度洛西汀（4-OH-5-CH3Oduloxetinee），代谢率（代谢物浓度/DUL浓度）分别为3.2-6.9和2.0-3.8。这两种代谢物对5-HT和去甲肾上腺素的亲和力都很低，说明这两种物质都是无药理学活性的[1]代谢物。研究表明，CYP450酶系负责DUL两种代谢物的生物转化。CYP2D6和CYP1A2参与4-OHDUL的形成，CYP2D6、CYP1A2和CYP2C9（速率相对较慢）参与5-OHDUL的形成，并且在这两种代谢物形成过程中，CYP2D6是DUL的一种低亲和力的[5,11]酶，CYP1A2是对DUL亲和力较高且代谢极其重要的酶。2.4排泄DUL60mg给药的口服清除率(CL/F)为101L/h，在60mg一天两次给药时下降为57L/h，而40mg一天两次给药时清除率为97.1L/h。在另一项对女性受试者每次[12]20-40mg的多剂量给药研究中，清除率为114L/h。14C标记的DUL在给药后，大约72%的放射性物质以葡萄糖醛酸或硫酸盐结合氧化代谢物的形式经尿液排出，直到给药后96小时之后从粪便中检测到少量的DUL（小于给药剂量的5%）。这些结果反映了DUL经口服给药后吸收完全。但是值得注意的是，粪便排出主要放射性物质的时间超出了它的简单的胃肠道运输时间，这提示[13]DUL有胆汁排泄现象。3新的临床应用临床上DUL主要用于治疗抑郁症、广泛焦虑症、应力性尿失禁、糖尿病周围神[14]经痛、纤维肌痛等。但近期的一些研究表明，DUL在一些新的临床应用中，表现出较好的疗效。3.1疼痛在一项治疗慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的观察性研究中，与单用多沙唑嗪组及多沙唑嗪合用舍曲林组相比，多沙唑嗪联合DUL组表现出良好的安全性和有[15]效性。在一项DUL用于治疗治疗慢性腰痛的随机、双盲、安慰剂对照的交叉试验[16]中，相较于安慰剂组，患者服用120mg/天的DUL，表现出了良好的疗效。在另一项DUL用于中国人骨关节炎慢性疼痛的随机、双盲、安慰剂对照试验中，DUL按照80 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因综述[17]60mg/天的剂量服用，表现出良好的有效性与安全性。[18]DUL还可以用于化疗药物诱发的周围神经病变疼痛。在一项治疗奥沙利铂引[19]起的疼痛的试验中，DUL组相较于安慰剂组有较好的疗效。3.2文拉法辛的戒断症状一位43岁的女性患者，使用75mg/24h文拉法辛治疗慢性颈椎痛和腰痛，连续用药2个月后，患者在医生的建议下试图停药。在停药后48小时，出现了胸痛，恶心，头晕，烦躁不安和尿频等严重的戒断症状。因没有办法忍受戒断症状，该患者无法将文拉法辛的剂量降低至37.5mg/48h以下。但是在文拉法辛停药48小时后，转而每天使用30mgDUL代替，戒断症状的程度减轻了50%。该患者在连续使用DUL[20]的1周后停药，戒断症状没有再发生。该案例提示，在缩减剂量的情况下，仍无法缓解文拉法辛的戒断症状，可以在一周内使用低剂量DUL来代替。3.3重度抑郁症/广泛焦虑症并发的肠易激综合征重度抑郁症或广泛焦虑症通常会并发肠易激综合征，表现为持续性或间歇性的腹[21]痛、腹胀、排便频率或大便性状的改变。虽然低剂量的三环类抗抑郁药对肠易激综合征有效，但重度抑郁症的治疗往往需要的剂量较高，而高剂量下三环类抗抑郁药的[22]耐受性饱受诟病，而选择性5-羟色胺再摄取抑制剂对肠易激综合征疗效不显著。在一项DUL用于重度抑郁症伴随的肠易激综合征的开放试验中，DUL疗效较好，平均剂量为60mg/天，连续用药12周后，肠易激综合征和重度抑郁症的改善率分别为[23]71.4％和64.3％，腹痛严重程度下降56％。在一项DUL用于肠易激综合征伴随广泛性焦虑症患者的非盲试验中，患者在常规剂量下服用DUL，肠易激综合征的症状[24]得到了改善。3.4在帕金森病中的应用在一项帕金森病的非盲试验中，晚期帕金森患者在联合使用DUL后，运动症状得到了改善，减少部分患者的“关闭”时间，因此DUL可能对帕金森患者的情绪改[25]善和运动症状的缓解具有效果。3.5精神分裂的阴性症状在一项利培酮添加使用DUL用于治疗稳定型精神分裂症患者的阴性症状的随机、双盲、安慰剂对照试验中，与利培酮加安慰剂组相比，利培酮联用DUL（60mg/天）组患者的阴性症状的到改善（P<0.001），而对阳性症状的影响无统计学意义（P=0.13）。81 综述基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因[26]两种治疗方案的不良反应特征差异无统计学意义。对于精神分裂症的原发性阴性症状，使用利培酮的同时，添加DUL可能是一种可耐受的有效治疗方案。3.6强迫症一项添加使用DUL治疗顽固性强迫症的双盲对照临床试验中，在患者连续12周以上服用的选择性5-HT再摄取抑制剂（氟西汀，西酞普兰或氟伏沙明）无效的基础上，增加联用平均剂量44.4mg/天(20-60mg/天)DUL或舍曲林，两组在8周研究期间均有改善。在其原来用药的基础上加服DUL的患者，在Y-BOCS评分中平均下降了33.0％，在其原来用药的基础上加服舍曲林的患者，Y-BOCS评分平均下降了34.5％[27]。添加联用DUL或舍曲林，对顽固性强迫症的改善同样有效。3.7青少年的注意力缺陷/多动障碍在一项案例报道中，一名患有注意力缺陷/多动障碍的14岁科威特男孩，在接受36mg/天的哌甲酯后，遗尿症状并未改善，并且产生针对药品的焦虑症状。添加服用30mg/天的DUL至24周后，他的烦躁不安和遗尿得到很好的改善，并且认知反应能[28]力增强。4小结作为第二代选择性5-HT和NE再摄取抑制剂，DUL主要用于治疗抑郁症、广泛[14]焦虑症、应力性尿失禁、糖尿病周围神经痛、纤维肌痛等。DUL经口服给药后吸收良好，食物和睡眠对其影响不大，广泛分布在包括大脑的全身各组织中，血浆蛋白结合率高于90%，主要经CYP1A2代谢，代谢物无药理活性，大部分经尿液排出。最近一些研究表明，DUL在多种慢性疼痛（例如慢性腰痛、慢性背痛、慢性关节炎痛等等）和化疗药物引起的周围神经病变疼痛的治疗中，表现出良好的有效性和安全性；并且可以用于治疗文拉法辛的戒断症和重度抑郁症/广泛焦虑症并发的肠易激综合征；联合用药时，对帕金森病、精神分裂的阴性症状、强迫症和青少年的注意力缺陷/多动障碍具有良好的改善效果。82 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因综述参考文献[1]KnadlerMP,LoboE,ChappellJ,etal.Duloxetine:clinicalpharmacokineticsanddruginteractions[J].ClinPharmacokinet,2011,50:281-294[2]ChappellJC,EisenhoferG,OwensMJ,etal.Effectsofduloxetineonnorepinephrineandserotonintransporteractivityinhealthysubjects[J].JClinPsychopharmacol,2014,34:9-16[3]GahimerJ,WernickeJ,YalcinI,etal.Aretrospectivepooledanalysisofduloxetinesafetyin23,983subjects[J].CurrMedResOpin,2007,23:175-184[4]BymasterFP,LeeTC,KnadlerMP,etal.Thedualtransporterinhibitorduloxetine:areviewofitspreclinicalpharmacology,pharmacokineticprofile,andclinicalresultsindepression[J].CurrPharmDes,2005,11:1475-1493[5]LoboED,BergstromRF,ReddyS,etal.InvitroandinvivoevaluationsofcytochromeP4501A2interactionswithduloxetine[J].ClinPharmacokinet,2008,47:191-202[6]ChanC,YeoKP,PanAX,etal.DuloxetinepharmacokineticsaresimilarinJapaneseandCaucasiansubjects[J].BrJClinPharmacol,2007,63:310-314[7]SharmaA,GoldbergMJ,CerimeleBJ.Pharmacokineticsandsafetyofduloxetine,adual-serotoninandnorepinephrinereuptakeinhibitor[J].JClinPharmacol,2000,40:161-167[8]BenetLZ,HoenerBA.Changesinplasmaproteinbindinghavelittleclinicalrelevance[J].ClinPharmacolTher,2002,71:115-121[9]TakanoA,SuzukiK,KosakaJ,etal.Adose-findingstudyofduloxetinebasedonserotonintransporteroccupancy[J].Psychopharmacology(Berl),2006,185:395-399[10]PaulzenM,GrunderG,VeselinovicT,etal.Duloxetineentersthebrain-Butwhyisitnotfoundinthecerebrospinalfluid[J].JAffectDisord,2016,189:159-163[11]SkinnerMH,KuanHY,PanA,etal.DuloxetineisbothaninhibitorandasubstrateofcytochromeP4502D6inhealthyvolunteers[J].ClinPharmacolTher,2003,73:170-177[12]LoboED,QuinlanT,O'BrienL,etal.Populationpharmacokineticsoforallyadministeredduloxetineinpatients:implicationsfordosingrecommendation[J].ClinPharmacokinet,2009,48:189-19783 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缩写词表基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因缩写词表英文缩写英文全称中文全称5-HT5-hydroxytryptamine5-羟色胺AGOagomelatine阿戈美拉汀BKblank空白基质加入内标工作液样本DBdoubleblank空白基质样本DULduloxetine度洛西汀FLUfluoxetine氟西汀LLOQlowerlimitofquantification定量下限NDnotdetectable无法定量NEnorepinephrine去甲肾上腺素PPBplasmaproteinbinding血浆蛋白结合率QCHqualitycontrolhigh高浓度质控QCLqualitycontrollow低浓度质控QCMqualitycontrolmedian中浓度质控STZstreptozocin链脲佐菌素86 基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因发表的文章攻读硕士期间发表的文章[1]牛广豪，张全英，王猛猛，等.度洛西汀在正常大鼠和糖尿病大鼠体内的药代动力学比较研究[J].药学学报,2017,52(5):790-794.[2]王猛猛，张全英，牛广豪，等.平衡透析结合HPLC-MS/MS法同时测定度洛西汀、氟西汀和阿戈美拉汀的人血浆蛋白结合率及其应用[J].安徽医药,2017,已录用.87 致谢基于糖尿病状态的体内暴露量和血浆蛋白结合相互作用探讨度洛西汀不良反应发生的可能原因致谢首先，特别感谢我的导师张全英主任这三年来给予我的悉心指导和热心帮助，使我在未来的道路上具备了独立开展科研思维的能力，同时老师的严谨细致，一丝不苟的治学态度，力求完美的工作作风，忘我的科研热情给予我无穷的启迪，从这里学到的这些品格将成为我人生旅途中最为珍贵的财富。衷心感谢王猛猛老师以及俞蕴莉博士在理论学习、实验操作以及论文撰写中给予的无私帮助和全力指导。两位老师扎实的理论功底、良好的科研素养以及严谨的治学态度都是我学习的榜样，并且由衷感谢在学习和生活上对我的帮助和关怀。感谢苏大附二院临床药理实验室的王蒙老师，周文佳老师，黄明老师，宗顺麟老师，朱艺芳老师，华雯妍老师对我的指导，他们的敬业精神、高尚的道德情操和积极的人生态度让我受益匪浅。感谢毛娇娇师姐，施柳茜师姐和屈煜晨师弟在我攻读硕士期间对我实验和生活的帮助。感谢谢梅林教授及其课题组对我的帮助，在你们无私的帮助下我的课题才得以顺利完成。感谢我的女朋友王峰，在我的生活中和学习实验中给予的陪伴、鼓励与帮助。感谢我的爸爸妈妈，你们的无私付出，对我的养育和教导之恩让我无以为报，你们健康快乐是我最大的心愿。值此论文完成之际，谨向所有给予我帮助和关心的老师、同学、朋友致以诚挚的谢意。最后，特别感谢百忙中对我的论文细心评阅的专家，并感谢答辩委员会各位老师的批评指导。88 撕…ｆ苏州大学研ｍ印制＾１
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