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ＨＵＡＺＨＯＮＧＡＢＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文ＭＡＳＴＥＲ’ＳＤＥＧＲＥＥＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因ＯｓＤ／Ｒ１０的功能分析Ｒｏｎｅｓｉｎｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｒｉｃｅａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｅｆｅｎｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅＯ０ＤＥＦＥＮＳＥ－ＲＥＳＰＯＮＳＩＶＥＧＥＮＥ０５／）及川研究生：李昱ＣＡＮＤＩＤＡＴＥ：ＬＩＹＵ导师：王石平教授ＳＵＰＥＲＶＩＳＯＲ：ＰＲＯＦＥＳＳＯＲＷＡＮＧＳｆＨＩＰＩＮＧ专业：生物化学与分子生物学ＭＡＪＯＲ：ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ研究方向：水稻分子生物学ＦＩＥＬＤ：ＲＩＣＥＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ中国武汉ＷＵＨＡＮ，ＣＨＩＮＡ二○一六年七月ＪＵＬＹ２０１６， 分类号密级华中农业大学硕士学位论文激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析Roleofhormonesintheinteractionbetweenriceandpathogen&functionalanalysisofdefense-responsivegeneOsDR10研究生:李昱学号:07304110148指导教师:王石平教授指导小组:张启发教授熊立仲教授罗杰教授吴昌银教授练兴明副教授专业：生物化学与分子生物学研究方向：水稻分子生物学获得学位名称：理学硕士获得学位时间：2016年7月华中农业大学生命科学技术学院二○一六年七月 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析目录中文摘要..............................................................................................................................iAbstract...............................................................................................................................iii缩略词表.............................................................................................................................v1前言.................................................................................................................................11.1我国水稻的主要病害...........................................................................................11.2水稻抗病基因和抗病相关基因的研究现状.......................................................21.2.1水稻抗病基因研究进展.............................................................................31.2.2水稻抗病相关基因研究进展.....................................................................31.3植物与病原的互作...............................................................................................41.3.1植物免疫系统.............................................................................................51.3.2植物获得性抗性.........................................................................................71.4植物的抗病信号路径...........................................................................................81.4.1水杨酸抗病信号路径.................................................................................81.4.2茉莉酸抗病信号路径.................................................................................91.5生长素与植物-病原互作.....................................................................................101.5.1生长素的合成途径...................................................................................101.5.2生长素的信号路径...................................................................................121.5.3生长素在植物抗病反应中的作用...........................................................131.6植物中的GH3基因家族...................................................................................151.6.1GH3家族基因的分类...............................................................................151.6.2GH3基因家族蛋白的生化功能...............................................................161.6.3GH3基因家族的生理功能.......................................................................181.7研究的目的与意义.............................................................................................192材料与方法...................................................................................................................212.1水稻材料与来源.................................................................................................212.2菌株及用途.........................................................................................................212.3病原菌培养、水稻材料接种及病情调查.........................................................22I 华中农业大学2016届硕士学位论文2.3.1白叶枯病菌的培养、接种、病情调查及细菌菌体计数........................222.3.2细条病菌的培养及细菌菌体计数............................................................222.4病原菌激素的抽提及定量分析..........................................................................222.5β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色............................................................................232.6OsDR10免疫组织化学分析................................................................................232.6.1OsDR10蛋白抗体制备..............................................................................232.6.2水稻总蛋白抽提........................................................................................242.6.3WesternBlot杂交分析..............................................................................242.6.4免疫组织化学检测....................................................................................252.7种子萌发能力检测..............................................................................................252.8OsDR10蛋白筛选酵母双杂交文库....................................................................262.8.1酵母双杂交载体构建................................................................................262.8.2酵母双杂交................................................................................................262.9载体构建及农杆菌介导的遗传转化..................................................................272.9.1OsGH3.9基因结构分析.............................................................................272.9.2OsGH3.9超量表达载体构建.....................................................................272.9.3OsGH3.9抑制表达载体构建.....................................................................292.9.4农杆菌介导的遗传转化............................................................................292.10外源激素处理水稻材料....................................................................................302.10.1离体水稻叶片的处理..............................................................................302.10.2活体水稻叶片的处理..............................................................................302.11DNA抽提与阳性检测.......................................................................................302.12基因表达量分析................................................................................................312.12.1RNA抽提及反转录.................................................................................312.12.2反转录PCR（RT-PCR)...........................................................................312.12.3实时定量PCR（Real-timeQuantitativePCR).......................................312.12.4水稻抗感病品种接种病原菌的cDNA材料及来源.............................323结果与分析....................................................................................................................343.1OsGH3家族基因响应激素的功能分析..............................................................34II 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析3.1.1OsGH3家族基因在外源激素处理后的表达变化...................................343.1.2OsGH3家族基因在病原菌侵染的水稻材料中的表达变化...................403.1.3OsGH3.9超量和抑制表达材料表型分析................................................423.2病原菌激素合成与分泌检测.............................................................................513.3抗病相关基因OsDR10基因的功能分析.........................................................533.3.1OsDR10基因的GUS染色结果与分析...................................................533.3.2免疫组织化学检测结果与分析...............................................................543.3.3OsDR10超量和抑制表达植株的种子休眠检测.....................................583.3.4OsDR10蛋白的酵母双杂交文库筛选.....................................................614讨论...............................................................................................................................634.1OsGH3.9可能不参与水稻对白叶枯病菌的防卫反应......................................634.2OsGH3家族的抗病相资源发掘方向.................................................................644.3干扰病原菌生长素的合成可以降低其毒性......................................................654.4OsDR10可能通过与抗病基因xa5的等位基因互作参与水稻防卫反应........655参考文献.......................................................................................................................68附录...............................................................................................................................89附录1：部分实验的详细操作程序.........................................................................89Protocol1:小样法抽提植物DNA....................................................................89Protocol2:病原菌分泌的激素抽提..................................................................89附录2：在读期间发表论文.....................................................................................90致谢...............................................................................................................................91III 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析中文摘要水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在我国农业生产中占有不可动摇的地位。病害一直是影响水稻产量和品质的重要因素，传统施用农药对抗病害的方法已经日渐不能满足我国水稻生产的需求。因此，不断寻找和开发新的水稻抗病种质资源、培育更多优良的水稻抗病品种，具有十分重要的意义和广阔的应用前景。本研究从参与植物抗病反应的重要调控因子——激素入手，旨在更全面地了解水稻与病原菌互作的生理生化过程，以期得到更好的抗病思路和发现更优秀的抗病资源。另外本研究也对负调控水稻抗病反应的抗病相关基因OsDR10进行功能分析鉴定，以期能更全面地了解该基因，为合理有效地利用该基因资源打下基础。我们利用外源激素去处理水稻，检测早期对生长素响应的OsGH3基因家族成员表达量的具体变化，了解这些基因对激素的响应情况。另外我们还检测了水稻抗病材料和感病材料中该家族部分基因在接种白叶枯病菌后表达量的变化情况，结果表明OsGH3.4和OsGH3.5可能参与正向调控水稻对白叶枯病菌的抗性。将OsGH3家族其中一个基因OsGH3.9构建超量和抑制表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法导入中度感病的粳稻材料中花11。通过对转基因植株的OsGH3.9表达量进行检测，证实我们确实得到了超量表达和抑制表达的植株。但我们对这些转基因植株进行白叶枯病菌接种后发现，与野生型中花11相比，转基因植株的接种白叶枯病菌后的表型与OsGH3.9的表达量并没有直接相关的共分离关系。我们使用液体培养基培养水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌，抽提处于稳定期的培养液上清中的激素并进行检测，结果显示这些病原菌均能够向胞外分泌生长素、茉莉酸、脱落酸等激素。在培养基中加入L-色氨酸，能够提高白叶枯病菌菌株PXO99培养液上清中的生长素含量，说明该菌株具有依赖色氨酸的生长素合成途径。通过转化启动子连接β-葡萄糖苷酸酶报告基因的植株、以及免疫组织化学的方法，我们对OsDR10的表达模式有了一个更直观的认识。OsDR10是一个在种子发育、萌发和愈伤组织中特异性高表达的基因，实验表明，抑制其表达的转基因植株种子跟野生型相比更难以打破休眠、正常萌发。通过筛选明恢63成株期接种白叶枯病菌PXO61的cDNA酵母双杂交文库，发现OsDR10可能通过与水稻白叶枯病主效抗病基因xa5的等位基因互作来参与水稻的防卫反应。i 华中农业大学2016届硕士学位论文关键词：水稻；抗病相关基因；生长素；OsGH3；白叶枯病菌；OsDR10；种子萌发ii 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析AbstractRiceisoneofthemostimportantfoodcropsintheworld,holdanunshakablestatusinagriculturalproduction.Diseaseisanimportantfactorwhichleadstoyieldreductionandqualitylossesofrice.TraditionalmethodssuchasapplyingpesticideagainstdiseasehasbecomeincreasinglyunabletomeetthedemandofriceproductioninChina.Therefore,itisofgreatsignificanceandbroadapplicationprospectstofindanddevelopnewdiseaseresistantgermplasmresourcesandtocultivatemoreandmoreexcellentvarietiesofrice.Thisstudystartedwiththeimportantregulatorofplantdiseaseresistancereactions,hormones,andaimedatamorecomprehensiveunderstandingofthephysiologicalandbiochemicalprocessofriceandpathogeninteraction,inordertogetbetterdiseaseresistancewaysandfindmoreexcellentresistantresources.Inaddition,functionalanalysisandidentificationofdefense-responsivegeneOsDR10,whichisanegativeregulatorofdiseaseresistance,mayhelpustobetterunderstandthisgene,andtolaythefoundationforrationalandeffectiveuseofthegeneresources.Weusedexogenoushormonestotreatrice,todetectthespecificchangesintheexpressionofOsGH3genefamilymembers,whichareresponsivetoauxinintheveryearlystage,andtounderstandtheresponseofthesegenestohormones.Inaddition,wealsoexaminedtheexpressionoftwoOsGH3genes,inricediseaseresistancematerialsandsusceptiblematerialsafterinoculationwithXanthomonasoryzaepv.Oryzae(Xoo).ResultsshowthatOsGH3.4andOsGH3.5maybeinvolvedinthepositiveregulationofricebacterialblightresistance.OsGH3.9,onememberofOsGH3family,wereconstructedover-expressandsuppressvectors.WeusethemethodofagrobacteriummediatedgenetictransformationtotransformthetwovectorsintothemiddlesusceptiblediseasericematerialsZhonghua11.ThroughOsGH3.9expressionintheplantswasdetectedthatwedogettheover-expressedandsuppressedtransgenicplants.ButtheresultsofXooinoculationstothetransgenicplants,comparedwithwildtypeZhonghua11,werenotassociatedwiththeexpressionofOsGH3.9.Weusedliquidculturemediumtoculturethepathogensofricebacterialleafblightandbacterialstreakdisease,thenextractedhormonesfromtheculturesupernatantofhormoneatmid-stationaryphaseanddetected.Theresultsshowedthatthesepathogensiii 华中农业大学2016届硕士学位论文areabletosecreteauxin,jasmonicacid,abscisicacid.TheadditionofL-TrptotheculturemediumcouldimprovetheauxincontentinthesupernatantofPXO99culturemedium,whichindicatedthatthestraincouldsynthesizeauxinthroughTrp-dependentindole-3-aceticacidbiosynthesispathway.WehaveamoreintuitiveunderstandingoftheexpressionpatternofOsDR10byusingβ-glucuronidasereportergenelinkedtotheOsDR10promoterthattransformedintoZhonghua11,aswellastheimmunohistochemistryanalysis.OsDR10isahighlyexpressedgeneinseeddevelopment,germinationandcallus.TheexperimentalresultsshowthattheseedsofOsDR10-suppressedplantsaremoredifficulttobreakthedormancyandnormallygerminatethanthewildtype.ByscreeningMinghui63cDNAyeastdoublehybridlibrary,wefindthatOsDR10mayinvolveindefenseresponsesbyinteractingwiththealleleofxa5,whichisadiseaseresistantgeneofbacterialleafblight.Keyword:Oryzasativa;defense-responsivegene;Auxin;OsGH3;Xanthomonasoryzaepv.Oryzae;OsDR10;seedgerminationiv 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析缩略词表缩略词中文名称英文名称2，4-D2，4-二氯苯氧乙酸2,4-dichlorophenoxyaceticacidABA脱落酸abscisicacidARF生长素反应因子auxin-responsefactorAuxRE生长素响应元件auxin-responseelementAvr无毒基因avirulencegeneETI效应因子引发的免疫effector-triggeredimmunityETS效应因子引发的感病effector-triggeredsusceptibilityGUSβ-葡萄糖苷酸酶β-glucuronidaseIAA吲哚乙酸(生长素)indole-3-aceticacidiaaH色氨酸单加氧酶tryptophanmonooxygenaseiaaM吲哚乙酰胺水解酶indole-3-acetamidehydrolaseISR诱导性系统抗性inducedsystemresistanceJA茉莉酸jasmonicacidMAMP/PAMPs微生物/病原体相关分子模式microbe-associatedmolecularpatterns/pathogen-associatedmolecularpatternsNahG水杨酸羟化酶bacterialsalicylatehydroxylasegeneNBS核结合位点nucleotidebingdingsiteNIT腈水解酶nitrilasePCD细胞程序性死亡programedcelldeathPGPRs植物促生根围细菌Plantgrowth-promotingrhizobacteriaPR病程相关蛋白pathogenesis-relatedproteinPRRs模式识别受体pattern-recognitionreceptorsPTI病原相关分子模式引发的免PAMP-triggeredimmunity疫反应Rgene抗病基因diseaseresistantgeneRNAiRNAi干扰RNAinterferingSA水杨酸salicylicacidSAR系统获得性抗性systemicacquiredresistanceTMV烟草花叶病毒tobaccomosaicvirusXoo水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzaev 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析1前言近年来，粮食安全问题日益成为我国农业生产发展中必须要面对和解决的重要问题。水稻是我国主要的粮食作物之一，2014年全国稻谷播种面积达到30309.87×32410hm，占当年全国粮食作物播种总面积的26.89%；稻谷产量达到20650.74×10t，占当年全国粮食总产量的34.02%。然而统观近十年来的数据，我国水稻产量徘徊不前，单位面积产量与总产量都增长缓慢，甚至出现负增长（中华人民共和国国家统计局，http://data.stats.gov.cn/easyquery.htm?cn=C01&zb=A0D0G&sj=2014）。究其原因，一方面产量受到自然环境条件制约严重，另一方面单纯依靠化肥农药保产增产的方法已经日渐失效。从根本上说，是因为水稻增产的基础不牢固，水稻的品种资源与遗传改良需要重大突破。据此，培育使水稻生产能“少打农药、少施化肥、节水抗旱、优质高产”的“绿色超级稻”，成为水稻遗传改良的新目标（张启发2009）。水稻病害作为影响水稻产量的重要因素之一，近年来其危害性日益突出。特别是一些传统的高质高产水稻品种，对病原物的侵染更加敏感，大大制约了潜在产量优势的发挥（胡珂鸣和王石平2009）。寻找优秀的抗病种质资源，分离克隆、鉴定运用能够提高水稻抗病性的基因，对于提高水稻产量、解决我国的粮食安全问题无疑具有不可替代的重要意义。1.1我国水稻的主要病害稻瘟病、白叶枯病和纹枯病是我国水稻生产栽培过程中影响最严重的3种病害，在发病严重时，都可以使水稻减产30%以上，甚至颗粒无收，对水稻产量造成极大影响。稻瘟病由真菌病原稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）侵染引起，根据受侵染时期和部位的不同分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟、谷粒瘟。稻瘟病菌的侵染期贯穿水稻的整个生育期，并可以通过种子感染下一代。病菌主要以分生孢子和菌丝体的形式越冬和传染，可借助风雨传播。稻瘟菌的分生孢子侵染水稻时，先萌发芽管，通过特化形成的附着胞结构紧密粘附到植株表面。然后在附着胞内产生膨压，通过命名为侵入栓的特殊结构刺穿水稻的表面进入细胞。在植株细胞内，侵入结构分化为具有感染能力的菌丝吸取寄主细胞的营养，进行增殖和扩散，形成坏死性病斑（Heath1 华中农业大学2016届硕士学位论文etal1990;Howardetal1991;Heathetal1992;DeJongetal1997;TuckerandTalbot2001）。稻瘟病菌菌丝生长适宜温度为26℃-28℃，分生孢子的形成需要潮湿的环境，孢子在有水存在的条件下才能萌发。因此，在适温高湿，光照不足，伴有雨、雾、露等天气存在的条件下，稻瘟病易于发病。白叶枯病由细菌病原稻黄单胞菌稻致病变种（Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo）侵染引起，主要感染水稻叶片并形成枯白色病斑（中国农业技术网，http://www.chinanyjs.com/news/14395104.html）。病菌可从水稻的气孔、伤口等部位侵入植株，先在局部增殖，然后通过维管束进行在植株体内传播。白叶枯病菌的适宜生长温度为26℃-30℃，温度过高或过低都会抑制病害的发生和发展。多风雨天气、植株存在机械损伤，均有利于白叶枯病的发病和传播。纹枯病由真菌病原瓜亡革菌（Thanatephoruscucumeris）侵染引起，苗期至穗期均可以发生病害（中国农业技术网，http://www.chinanyjs.com/news/14392659.html）。该病主要通过漂浮在稻田水面的菌核粘附到水稻茎秆上进行侵染，菌核在适宜条件下生出菌丝侵入叶鞘组织，逐步形成云纹形病斑。水稻进入抽穗期后，菌丝向叶片、穗颈部蔓延。水稻纹枯病菌菌丝的适宜生长温度是28℃-32℃，在高温高湿条件下易于发生和流行。除了以上3种主要病害，近些年来，水稻细菌性条斑病、稻曲病、以及由病毒引起的水稻矮缩病等病害对水稻生产的影响逐渐增大，日益受到水稻病害研究者的重视。1.2水稻抗病基因和抗病相关基因的研究现状在长期进化过程中，植物本身具有了一定的对病原物侵染的抵御能力。这种能力称之为抗病性（diseaseresistance）。当植物遭受病原物攻击时，自身会发生一系列复杂的反应，这个过程由多个基因参与完成。根据Flor的基因对基因（gene-for-gene）假说，植物的抗病基因（resistancegene，R基因）是能特异地识别非亲和病原物表达的无毒基因（avirulencegene,Avr）产物，使植株表现出抗病性的一类主效基因(Flor1971)。除了抗病基因以外，其他参与抗病反应的基因，则统称为抗病相关基因，又叫作防卫反应基因（defense-responsivegenes）。抗病相关基因与环境及遗传背景存在广泛的相互作用，机制复杂，在植物体内往往具有多种功能。2 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析1.2.1水稻抗病基因研究进展自上个世纪60年代中期以来，人们已经发现了至少84个抗稻瘟病主效基因，位于水稻染色体的69个位点上。其中有23个显性基因（Pi）、1个隐性基因（pi）已被成功克隆（国家水稻数据中心，2012）。到目前为止，已经被注册和报道的水稻抗白叶枯病主效基因有41个（Zhang2007;Cheemaetal2008;Ruanetal2008;Korinsaketal2009;Wangetal2009;Guoetal2010;Miaoetal2010;Verdieretal2012;Zhangetal.2014;Kimetal2015)。其中Xa1、Xa3/Xa26、xa5、Xa10、xa13、Xa21、Xa23、xa25、Xa27和Xa41等10个基因已经被分离克隆（Songetal1995;Yoshimuraetal1998;Sunetal2004;Xiangetal2006;Guetal2005;IyerandMcCouch2004;Jiangetal2006;Chuetal2006;Liuetal2011;Tianetal2014;Wangetal2014;Hutinetal2015）。主效抗病基因介导的植物质量（垂直或完全）抗性，具有产生抗病反应非常快速高效的特点，但同时也存在病原小种特异性，抗谱相对狭窄。质量抗性的遗传表现相对简单，基本不受或者较少受到环境影响，因此受到广泛关注，得到较为深入的研究。但是由于主效抗病基因对病原物施加的选择压较大，加速了病原物中致病因子变异的选择，促使了病原物群体的进化，从而易于导致植物抗性丧失（McDonaldandLinde2002）。另外，主效抗病基因的资源非常有限，竞争激烈，也限制了这类基因在育种改良中的应用。1.2.2水稻抗病相关基因研究进展抗病相关基因通常与抗病数量性状位点（Quantitativetraitlocus,QTL）相对应，介导植物的数量（水平或部分）抗性。研究表明数量抗性往往是非特异性的，具有广谱抗性，能够作用于多种病原物或者同一病原物的不同生理小种（Johnson1981;Polandetal2009;Wisseretal2005）。与主效抗病基因相比，单独的抗病相关基因一般对抗性的贡献率很小，但也因此避免了施加给病原物较大的选择压力，不易被病原物通过选择进化而攻克。故而抗病相关基因介导的抗性通常可能具有持久性（KliebensteinandRowe2009）。抗病相关基因的类型非常丰富，目前水稻中已经进行过功能验证的基因主要通过表达量的改变或者对蛋白质的修饰来参与抗病反应，涉及WRKY家族、MAPK家族、GH3基因家族及一些编码其他蛋白的基因。3 华中农业大学2016届硕士学位论文WRKY家族基因成员编码植物特有的一类转录因子。水稻中的OsWRKY13超量表达后可以提高对白叶枯病和稻瘟病的抗性，并且参与由主效抗病基因Xa3/Xa26介导的抗病反应（Qiuetal2007）。OsWRKY31的表达被稻瘟病菌所诱导，能够增强植株对稻瘟病的抗性，并且影响根的生长和参与对生长素的响应（Zhangetal2008）。OsWRKY45的一对等位基因OsWRKY45-1和OsWRKY45-2，在对白叶枯病和细菌性条斑病的抗病反应中表现出截然相反的调控效果（Taoetal2009）。OsWRKY62与编码类受体蛋白激酶（receptor-likekinase）的抗病基因Xa21互作。经鉴定在转基因植株中超量表达该基因的一个转录本OsWRKY62.1，会减弱植株的基础抗性和由Xa21介导的对白叶枯病菌的抗性，并且与病原互作过程中防卫相关基因的激活会受到抑制（Pengetal2008）。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化和去磷酸化的级联反应，调控植物体内多条信号转导路径。抑制水稻中的OsMAPK5的表达和激酶活性，可以促进病程相关基因（pathogenesis-relatedgenes,PRgenes）如PR1和PR10的表达，并且增强对稻瘟病和水稻细菌性谷枯病（Burkholderiaglumae）的抗性（XiongandYang2003）。OsMPK6在水稻对白叶枯病菌的抗性中表现出正向和负向的相反的调控作用，并且超量表达后能引起植株产生假病斑（lesionmimic）（Yuanetal2007a;Shenetal2010）。除了以上两大基因家族，目前已经研究证实与水稻激素响应与平衡密切相关的GH3基因家族成员如OsGH3.1、OsGH3.8等超量表达后均可以改变水稻表型，并显著提高水稻的抗病性（Dingetal2008;Domingoetal2009）。另外，一个与硫胺素（thiamine，维生素B1）前体合成酶高度同源的基因OsDR8，抑制其表达后的转基因植株对白叶枯病和稻瘟病表现得更加易感（Wangetal2006）。1.3植物与病原的互作植物在整个生长发育过程中，与周围的环境和其他生物时时刻刻存在着相互作用关系。而对植物不利的互作关系中，生物逆境一直有举足轻重的地位。病原物为了能够入侵感染植物、完成自身的生长繁衍，进化出了一系列的传播侵害手段；与之相对应，植物为了保障自身的健康成长发育，也形成了一套精密有效的防御系统。当一种病原物想要侵染植物时，它首先需要突破植物的物理防御，即植物的外表皮。4 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析有些植物的外表皮还具有蜡被、绒毛等细微结构以阻止病原物到达角质层；有些植物具有坚厚的角质层能阻止病原物侵入组织。而病原物也可以依靠机械压力、以及分泌的酶、毒素或者激素等影响和改变植物的表皮结构，突破第一道物理屏障，成功入侵到植株内部（Aleel2006）。1.3.1植物免疫系统植物受到外界病原物的入侵以后，自身的免疫系统就会启动，以控制和阻止病原物对植株造成进一步感染和损害。经过长期的进化和自然选择，植物的免疫系统形成了一套相对成熟的生理生化反应机制（图1）。现在的研究观点，结合植物对病原物抗性的进化过程，将该套机制描述为四个阶段的拉链模式（JonesandDangl2006;BentandMackey2007）。图1植物免疫系统原理图（Dangletal2013）Fig.1Schematicoftheplantimmunesystem（Dangletal2013）第一阶段，位于植物细胞外表面的模式识别受体（patternrecognitionreceptor,PRRs），识别进化保守的微生物/病原相关分子模式（microbe/pathogen-associated5 华中农业大学2016届硕士学位论文molecularpatterns,MAMPs/PAMPs），并激活细胞内的信号传递，诱导免疫相关基因的转录表达，合成响应复合物分泌到细胞外，限制病原物的入侵。这一过程称为病原相关分子模式引发的免疫反应（PAMPs-triggeredimmunity,PTI）（图1，第1步）（MonaghanandZipfel2012）。第二阶段，某些进化成功的病原物通过自身分泌的毒性效应因子来抑制PTI过程，以达到摄取营养、在植株体内进一步增殖扩散的目的。细菌通过III型分泌系统（typeIIIsecretionsystem,TTSS）、卵菌和真菌通过专门输送营养的“吸器”将效应因子注入植物细胞内，而蚜虫和线虫通过摄食将唾液中的蛋白送进细胞之中（Bos2010;Raffaele2010;Baltrusetal2011;BlockandAlfano2011;Koeck2011）（图1，第2步）。这些毒力因子被传送到细胞内的特定位置，干扰病原相关分子模式引发的免疫反应发挥作用，从而产生效应因子激活的感病性（effector-triggeredsusceptibility,ETS）（图1，第3步）。第三阶段，植物通过长期进化选择产生与病原物的毒力因子相对应的抗病基因，其编码产物大多具有能结合核苷酸的富亮氨酸重复（nucleotide-bindingleucine-richrepeat,NLR）结构，可以直接或间接地识别效应因子，启动效应因子激活的免疫反应（effector-triggeredimmunity,ETI）（Chisholmetal2006;DoddsandRathjen2010;Maekawaetal2011）。抗病基因表达蛋白的激活具有专一特异性，主要通过三种方式与效应因子相互作用：第一种，直接作为受体连接效应因子（图1，第4a步）；第二种，识别经效应因子修饰过的诱饵蛋白，这种蛋白通常与效应因子的目标蛋白结构类似，但在植物体内不具备其他功能（图1，第4b步）；第三种，识别已经修饰的寄主胞内效应因子靶标，例如模式识别受体的胞内结构（图1，第4c步）（DanglandJones2001;Doddsetal2006;HoomandKamoun2008）。目前为止，对于以上三种激活方式是否通过同样的分子机制尚不清楚，但它们均可以触发快速高效的效应因子激活的免疫反应，加速和放大由病原相关分子模式引发的免疫反应，限制病原物的增殖，从而使植物表现出抗病性（图1，第5步）。第四阶段，迫于自然选择的压力，病原物被植物抗病基因针对的效应因子丢失或者修饰改变，进化出新的效应因子来抑制ETI反应，使植物变得感病。而植物受到此压力，则将与之对应地进化出新的R基因以保证ETI的正常进行，维持自身的生存。这就是植物对病原物抗性进化的基本模式（BentandMackey2007）。6 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析1.3.2植物获得性抗性早在上个世纪，人们就已发现兰花在经受住一种致病力较弱的真菌感染后，会增强对随后侵染它的其他高毒致病菌株的抗性。科学家将这种现象命名为交叉保护（crossprotection），专指某个部位受过病原物侵染后，整个植株对该病原物和其他病原物的抗性都发生增强的现象（Chester1933;Deverall1977）。这种后天形成的对病原物的抗性被称为获得性抗性，也叫后天免疫。能够诱导产生获得性抗性的因子是多种多样的，除了病原物和它们的代谢产物外，在植物根部定殖的某些促生根围菌（plantgrowth-rhizobacteria,PGPR）也能使植株产生抗性。前者通常依赖于水杨酸（salicylicacid,SA）的积累，并且伴随着病程相关蛋白（pathogensis-relatedprotein,PR）的表达，被称为系统获得性抗性（systemicacquiredresistance,SAR）；后者则通过茉莉酸（jasmonicacid,JA）和乙烯（ethylene,Et）介导，被称为诱导获得性抗性（inducedsystemresistance,ISR）（Pieterseetal1998;LoakeandGrant2007）。系统获得性抗性在植物中广泛存在。用烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus，TMV）接种过的烟草植株，其未感染病毒的叶片对二次接种TMV的抗性明显增强（Ross1961）。接种过丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonassyringaepv.syringae）的水稻，能大幅减少之后感染稻瘟病菌孢子产生的病斑数量和面积（SmithandMetraux,1991）。系统获得性抗性是在二次或多次感染时表现出的更广谱、更强的抗性，是一种非特异性的、长期有效的免疫机制，可以提高植物对多种病原物的抵抗能力（Ryalsetal1996）。诱导获得性抗性相对较为少见。研究显示，在拟南芥中非致病性的根际荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）能够触发诱导获得性抗性，提高对细菌性叶片病原荧光假单胞菌土豆致病变种（Pseudomonasfluorescenspvtomato）的抗性（Pieterseetal1998）。与传统的系统获得性抗性相区别的是，诱导获得性抗性不依赖于水杨酸的积累和病程相关蛋白的表达。通过使用茉莉酸应答突变体jar1和乙烯应答突变体etr1进行实验，证明诱导获得性抗性的产生需要茉莉酸和乙烯参与信号转导。有意思的是，位于系统获得性抗性信号传导路径上游的一个重要调控基因NPR1，其拟南芥突变体npr1中病程相关蛋白不表达、系统获得性抗性抗性丧失，而诱导获得性抗7 华中农业大学2016届硕士学位论文性同样受到影响。说明NPR1也位于诱导获得性抗性的信号传导路径的上游，其下游路径的分歧决定于抗性诱导过程中所引发信号的不同。1.4植物的抗病信号路径为了对抗病原物的侵染，植物的免疫系统启动后，会引起一系列生理生化反应。这些反应包括：植物凝集素（lectins）与某些细菌多糖结合以识别病原物，并使某些种类病原细胞凝集以杀死病原菌；植物体内积累的酚类化合物氧化成对病原物毒性更强的醌类物质；寄主细胞壁成分修饰和强化；氧化酶活性增强；植物保卫素类物质和病程相关蛋白合成；同时还伴有蛋白质的磷酸化，离子流的变化和超敏反应（hypersensitiveresponse,HR）（Lametal2001）。植物抗病反应的启动和调节离不开抗病信号分子介导的信号传导，目前研究较多的是水杨酸和茉莉酸的抗病信号路径（Wanetal2002;LoakeandGrant2007;BalbiandDevoto2008）。1.4.1水杨酸抗病信号路径水杨酸即邻羟基苯甲酸，它参与和影响植物的许多生理过程，涉及植物生长发育、光合作用、蒸腾作用、离子吸收和转运等各个方面，是植物重要的内源激素之一。在植物对抗生物逆境的过程中，水杨酸介导的防卫反应起到了至关重要的作用。研究表明，对植物施用外源的水杨酸或者水杨酸类似物，能够诱导植物体内病程相关蛋白的表达，使植物表现出对病原物的抗性（Muradovetal1993;Kogeletal1994;Gorlachetal1996;Morrisetal1998;Schweizeretal1999;Anandetal2003;Hwangetal2008）。而在烟草等多种作物的抗病品种植株上接种病原物后，均出现水杨酸快速大量积累、病程相关蛋白表达水平相应提高的现象，引发下游一系列的免疫反应（Malamyetal1990）。如果水杨酸的合成、积累或信号识别受阻，比如转化了水杨酸羟化酶基因（NahG）的烟草和拟南芥植株中无法大量积累水杨酸，则植株对病原物的亲和性大大增加，无法产生系统获得性抗性，病程相关蛋白的表达也受到影响（ShahandKlessig1999;Dempseyetal2007;LoakeandGrant2007）。而超量表达水杨酸合成相关基因，提高烟草体内的水杨酸水平，可以使病程相关蛋白组成型表达，对病原物的抗性也显著提高（Verberneetal2000）。以上结果充分说明水杨酸是传递抗病信号、引起病程相关蛋白表达响应的信号转导分子。8 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析作为单子叶植物，水杨酸在水稻中作用机制与双子叶植物有所不同。接种一些病原物，如稻瘟病菌、丁香假单胞菌或根腐菌后，水稻植株体内的水杨酸水平并没有显著升高（Sivermanetal1995）。转化了水杨酸羟化酶基因的水稻株系对稻瘟病的感病性增强，但病程相关蛋白的表达却没有受到影响（Yangetal2004）。外源使用水杨酸或者类似物如苯并噻重氮（benzothiadiazole,BTH），水稻体内的多种WRKY类转录因子会被诱导表达，对稻瘟病的抗性明显提高（Liuetal2007;Shimonoetal2007）。拟南芥的NPR1蛋白是系统获得性抗性的一个关键调节子（DurrantandDong2004）。在水稻中超量表达与拟南芥NPR1同源的NH1基因，植株对白叶枯病的抗性明显增强（Chernetal2001;Chernetal2005;Yuanetal2007b）。水稻的OsWRKY45-1缺失突变体中水杨酸和茉莉酸含量上升，而超量表达该基因的植株中水杨酸和茉莉酸的含量均下降。前者对白叶枯病的抗性增强，后者对白叶枯病的抗性减弱（Taoetal2009）。水稻的OsMPK6缺失突变体中水杨酸含量升高，表现为对白叶枯病和细条病的抗性增强（Shenetal2010）。1.4.2茉莉酸抗病信号路径1971年，人们从真菌Botryodiploidiatheobromae培养液中分离鉴定得到茉莉酸，并作为一种植物生长抑制剂。之后的研究发现茉莉酸及其化合物遍布植物界。茉莉酸以α-亚麻酸（α-linolenicacid）为前体合成而来，其合成途径称为脂氧酶途径（lipoxygenasepathway）,多种酶参与此过程（FeussnerandWasternack2002）。茉莉酸可以转化为茉莉酸甲酯（methyljasmonate,MeJA），后者具有可挥发性，能够作为气态信号分子在植株间交流信息。茉莉酸广泛参与了植物生长、萌发、衰老、胁迫响应等生理过程，在植物生长调节和逆境抗性调控中起着非常重要的作用（CreelmanandMullet1997;ReymondandFarmer1998;Vijayanetal1998;Lietal2001）。人们在拟南芥中筛选得到多个与茉莉酸信号传导路径相关的突变体，如影响茉莉酸合成的三突变体（fad3-2fad7fad8），该突变体在脂氧酶途径中的3个脂肪酸脱饱和酶基因上存在缺陷，不能合成足够的茉莉酸。使茉莉酸应答受阻突变体coi1，无法表达茉莉酸信号路径的核心组成部分COI1（coronatine-insensitive1），使得茉莉酸信号路径下游基因不能被激活表达。突变体jar1无法表达酰胺合成酶JAR1，使游离的茉莉酸无法与异亮氨酸结合9 华中农业大学2016届硕士学位论文形成茉莉酸-异亮氨酸复合物，而在茉莉酸信号路径中，该复合物会结合到COI1上，促进信号传导路径中下游基因转录阻遏物JAZ的泛素化降解（Katsiretal2008）。实验结果表明以上这些位于茉莉酸信号传导路径上下游元件缺陷的突变体，阻碍了茉莉酸信号的正常传导，植株表现为对多种坏死营养型病原物的抗性明显减弱（Thommaetal1998;Staswicketal1998;Stintzietal2001）。与阻碍茉莉酸信号传导路径的突变体相对应，在拟南芥中超量表达合成茉莉酸甲酯所必需的茉莉酸甲基转移酶（jasmonicacidcarboxylmethyltransferase）基因JMT，植株内源茉莉酸甲酯含量会提高3倍，而茉莉酸含量不受影响。该转基因植株能组成型表达茉莉酸信号路径中的下游应答基因，例如VSP和PDF1.2，且增强了对真菌性病害灰霉病菌Botrytiscinerea的抗性（Seoetal2001）。1.5生长素与植物-病原互作1880年，CharlesDarwin发现了生长素（auxin）的存在，并记录了它在植物胚芽鞘向光性生长中的作用。作为最早发现的植物激素，生长素的调节功能涉及面非常广。早期研究主要集中在促进植物生长发育方面，包括细胞的分裂伸长和分化、茎的伸长和生长、维管系统的分化、植物的向性、顶端优势、根的伸长和发育、叶的衰老和脱落、花和果实的发育等（WoodwardandBartel2005)。现在人们对生长素的研究，逐步将视野延伸到其对植物逆境胁迫的应答与调控上面。1.5.1生长素的合成途径高等植物体内最主要的生长素活性形式是吲哚乙酸(indole-3-aceticacid,IAA)。植物主要通过两条途径合成吲哚乙酸：依赖色氨酸（tryptophan,Trp）途径（Trp-dependent,TD）和不依赖色氨酸途径（Trp-independent,TI）（Cohenetal2003）。目前知道的4条依赖色氨酸的吲哚乙酸合成途径是：吲哚乙醛肟(indole3-acetaldoxime,IAOx)途径、吲哚乙酰胺(indole-3-acetamide,IAM)途径、吲哚丙酮酸(indole-3-pyruvicacid,IPyA)途径和色胺(tryptamine,TAM)途径(WoodwardandBartel2005)。植物体内几种天然存在的吲哚衍生物，如吲哚丙酮酸、吲哚乙酰胺和吲哚乙腈(indole-3-acetonitrile,IAN)，它们均是合成吲哚乙酸的前体物质，可以不经由色氨酸而直接由吲哚转化而来，再进一步转化为吲哚乙酸而发挥作用（图2）（Dietal2015）。有研究表明在玉米种子内，吲哚乙酸可由邻氨基苯甲酸（anthranilicacid）10 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析经中间产物吲哚甘油磷酸（indole-3-glycerolphosphate）而合成，说明非吲哚前体也能合成吲哚乙酸（Wrightetal1991）。图2拟南芥中吲哚乙酸的合成途径（Dietal2015）Fig.2TheproposedIAAbiosynthesispathwaysinArabidopsis（Dietal2015）不光植物具有合成生长素的能力，一些微生物也具有与植物类似的生长素合成途径（PattenandGlick1996;Normanlyetal2004）。目前在微生物中发现的依赖色氨酸的生长素合成途径有5条，分别是吲哚乙酰胺(IAM)途径，吲哚丙酮酸(IPyA)途径，色胺(TAM)途径，吲哚乙腈(IAN)途径和色氨酸侧链氧化（Trpsidechainoxidase,TSCO）途径（Dietal2015）。除此之外还有不依赖于色氨酸的生长素合成途径存在（图3）。吲哚乙酰胺途径最早被发现是在假单胞菌（Pseudomonas）中，后来在土壤农杆菌（Agrobacterium）、固氮螺菌（Azospirillum）和链霉菌（Streptomyces）这些与植物伴生的微生物中也相继被发现（Magieetal1963;WeilerandSchroder1987;Barand11 华中农业大学2016届硕士学位论文Okon1993;Manulisetal1994）。该途径中，色氨酸先被色氨酸单加氧酶（tryptophanmonooxygenase）催化生成吲哚乙酰胺，然后吲哚乙酰胺再被吲哚乙酰胺水解酶（indoleacetamidehydrolase）催化生成吲哚乙酸。微生物中，色氨酸单加氧酶由aux1/iaaM基因编码，而吲哚乙酰胺水解酶由aux2/iaaH基因编码（Casanovaetal2005;GaudinandJouanin1995）。吲哚丙酮酸途径在细菌中广泛存在，比如根际细菌巴西固氮螺菌（Azospirillumbrasilense）（Costacurtaetal1994）。吲哚乙腈途径中最重要的酶腈水解酶（nitrilase,NIT），能够催化吲哚乙腈水解成吲哚乙酸，编码该酶的基因属于腈水解酶超家族（PaceandBrenner2001）。图3细菌中吲哚乙酸的合成途径（Dietal2015）Fig.3TheproposedIAAbiosynthesispathwaysinbacteria（Dietal2015）1.5.2生长素的信号路径生长素作为一种重要的植物激素，能快速且瞬时地诱导植物体内应答基因作出反应。目前的研究发现，植物中主要存在3类生长素早期应答基因，包括生长素/吲12 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析哚乙酸家族（Aux/IAA）、小的生长素上调RNA(smallauxin-upRNA,SAUR)和GH3家族（AbelandTheologist1996）。这些应答基因的上游启动子区域往往含有生长素响应元件（auxinresponseelement,AuxRE），通常是一个到几个重复的保守序列TGTCTC（Hagenetal1991;Lietal1994;Liuetal1994;Ulmasovetal1995;Guilfoyle1999）。生长素反应因子ARF(auxin-responsefactor)通过自身的DNA结合结构域结合到生长素响应元件上，调控生长素应答基因的表达（Kimetal1997;Ulmasovetal1997;Tiwarietal2003）。Aux/IAA家族基因大部分受到生长素的诱导，在低浓度生长素环境中Aux/IAA能与转录因子ARF蛋白结合形成异二聚体,抑制ARF发挥功能，从而负调控其他响应生长素基因的表达(Ulmasovetal1997;Tiwarietal2001)。当生长素浓度升高时，植物体内的多个受体基因家族，如TIR（TransportInhibitorResponse）、AFB（AuxinSignalingF-Box）等开始表达，其蛋白能够识别AUX/IAA蛋白，将后者经泛素化修饰后进入26S蛋白酶体降解，解放ARF蛋白，让其正常发挥功能，调节下游基因表达（Dharmasirietal2005;KepinskiandLeyser2005）。SAUR家族基因最早在大豆中被分离，之后在多种高等植物中相继发现其家族成员的存在（Hagenetal1984;Yamamotoetal1992;Giletal1994）。SAUR家族基因能迅速受生长素诱导，编码一系列不稳定的转录本。在水稻中，超量表达SAUR39使得植株表现出缺乏生长素的表型，许多推测的生长素合成和转运相关的基因也下调表达。说明SAUR39是生长素合成及转运的负调控子（Kantetal2009）。GH3基因家族是近年来研究较多的一个生长素响应基因家族，结构分析表明其大部分成员都具有腺苷酸形成酶的活性（Staswicketal2002）。虽然被称为生长素响应基因家族，但只有部分GH3基因能对生长素产生反应，催化生长素与氨基酸相结合，调控游离生长素的含量平衡。具体的情况将在后文进行详述。1.5.3生长素在植物抗病反应中的作用早在上个世纪，研究者就认识到某些植物病原菌的侵染会引起植物生长素含量的上升（Sequeiraetal1962）。近年来研究者发现细菌侵染拟南芥可以提高侵染部位IAA的含量，外源使用生长素类似物2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyaceticacid,2,4-D）处理拟南芥会加重植株感染病原物的症状（O’Donnelletal2003;Navarro13 华中农业大学2016届硕士学位论文etal2006）。在水稻中也观察到类似的情况，对抗病品种植株使用外源生长素处理后再接种病原菌，显著促进了病原菌在植株体内的增殖速度，使本来的抗病品种表现出对病原菌的感病性（Dingetal2008）。生长素在植株体内的积累，可以引起一系列的信号路径和生理变化。除了影响植株正常的生长发育以外，当病原物侵染植株时，大量游离的生长素可能改变细胞膜的渗透性，促进气孔的开放，使病原物能更容易地获取胞内营养、入侵植株，加速病原物的增殖和传播。早期对生长素的研究显示，在促使细胞伸长的过程中，吲哚乙酸可以增加植物细胞壁的机械延展性，使细胞壁的结构变得松散，这一改变可能使得这道物理屏障更易遭到病原物分泌的胞外酶的破坏，从而促进病原物的侵染（Agrios1988）。随着对细胞壁研究的深入，人们发现细胞壁结构的严谨性主要由组成细胞壁的果胶质（pection）、半纤维素（hemicellulose）、纤维素微纤丝（cellulosemicrofibril）及结构蛋白等物质的交联程度决定，而细胞伸展蛋白（extensin）和细胞壁松弛蛋白（expansin）与之密切相关（CarpitaandGibeaut1993;McCannetal1994）。由吲哚乙酸诱导的细胞伸长的假说主要有“基因激活”假说和“酸生长”理论，后者认为吲哚乙酸刺激细胞向外分泌氢离子，引起细胞壁环境酸化，进而激活多种适宜低pH的壁水解酶。细胞壁松弛蛋白正是一类参与酸性条件下细胞伸长的蛋白酶（McQueen-Masonetal1992）。对拟南芥的离体胚轴分别外源施加细胞壁松弛蛋白和适当浓度的吲哚乙酸，均能达到刺激胚轴伸长的效果，且单独施用其中一种和同时施加二者的效果一样，说明细胞壁松弛蛋白和生长素通过同一条的调控细胞的伸长（Cosgroveetal2002）。对水稻抗病品种和感病品种分别接种病原菌，在感病材料接种后的亲和反应中，细胞壁松弛蛋白基因的表达都显著被诱导，而在抗病品种中细胞壁松弛蛋白基因的表达普遍被抑制，表达水平也显著低于感病品种。施用外源生长素后，水稻叶片中的细胞壁松弛蛋白表达量明显被诱导上升，而超量表达细胞壁松弛蛋白的水稻材料感病性增强，说明细胞壁松弛蛋白的诱导表达是生长素促使水稻对病原物敏感性增强的一个重要原因（Dingetal2008）。14 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析1.6植物中的GH3基因家族上个世界80年代，Hagen等人在用生长素类似物2，4-二氯苯氧乙酸处理大豆时，发现了一个能被小剂量的外源生长素类似物迅速特异地诱导表达的cDNA克隆，这就是第一个被描述的GH3基因家族成员（Hagenetal1984）。后来人们又在多种双子叶植物、单子叶植物甚至裸子植物和苔藓植物中相继发现该家族基因成员的存在（Guilfoyleetal1993;RouxandPerrot-Rechenmann1997;Staswicketal2002;Nishiyamaetal2003;Bierfreundetal2004;Laheyetal2004;Liuetal2005;Teroletal2006;Reddyetal2006）。1.6.1GH3家族基因的分类虽然GH3家族基因最初作为生长素早期响应基因被鉴定，但后续研究中发现，该基因家族成员并非全都对生长素作出响应。与Aux/IAA家族基因和SAUR家族基因相似，能响应生长素的GH3家族基因成员，其启动子上游区域也具有生长素响应元件AuxRE，一般是保守序列TGTCTC或与之类似的序列（Hagenetal1991;Liuetal1994;Ulmasovetal1995;Guilfoyle1999）。Staswick等人从拟南芥的茉莉酸钝感突变体jar1中鉴定得到基因JAR1（AtGH3.11），序列分析发现该基因属于一个多基因家族，家族成员包括大豆中的GH3基因。其编码的蛋白质JAR1在结构上与萤火虫荧光素酶超家族（fireflyluciferasesuperfamily）基因成员有较高同源性，后者具有腺苷酸形成酶（adenylate-formingenzyme）功能（Staswicketal2002）。通过序列比对找到拟南芥中与JAR1高度同源的基因，这些基因构成拟南芥的GH3基因家族，包括JAR1在内，目前一共有19个基因成员。对这些成员进行以激素为底物的腺苷酰化反应检测，根据其作用的特异性底物，结合序列的同源性进行归类，将拟南芥的GH3基因家族分为3个亚家族，称为第一组（GroupⅠ）、第二组（GroupⅡ）和第三组（GroupⅢ）。JAR1被归入第一组基因，具有将茉莉酸作为底物将其腺苷酸化的能力。另一个被归入第一组的基因是AtGH3.10。第二组基因包括AtGH3.1、AtGH3.2、AtGH3.3、AtGH3.4、AtGH3.5、AtGH3.6、AtGH3.9和AtGH3.17，主要催化吲哚乙酸与氨基酸的结合。其中AtGH3.5蛋白还能以水杨酸为底物。第三组基因包括余下的AtGH3.7、AtGH3.8、AtGH3.12、AtGH3.13、AtGH3.14、AtGH3.15、AtGH3.16、AtGH3.18和AtGH3.19，，目前对该组15 华中农业大学2016届硕士学位论文成员的腺苷酸化底物了解尚不多，仅检测到AtGH3.12蛋白能催化4-羟基苯甲酸和4-氨基苯甲酸与氨基酸形成结合物(Staswicketal2002;StaswickandTiryaki2004;Okrentetal2009)。根据拟南芥GH3基因家族成员的分类方法，通过蛋白质的同源性比对，将水稻中的13个GH3基因分别归入第一组和第二组，没有第三组成员的存在(Teroletal2006;Jainetal2006)。其中，OsGH3.3，OsGH3.5，OsGH3.6和OsGH3.12这4个基因属于第一组，余下的9个基因OsGH3.1，OsGH3.2，OsGH3.4，OsGH3.7，OsGH3.8，OsGH3.9，OsGH3.10，OsGH3.11和OsGH3.13属于第二组（图4）。图4水稻GH3家族基因分类（Jainetal2006）Fig.4ThesystematizationofGH3familyinrice（Jainetal2006）1.6.2GH3基因家族蛋白的生化功能拟南芥GH3基因家族第一组蛋白AtGH3.11(JAR1)是在体外最先被证实具有酰胺合成酶活性的GH3蛋白，它能使茉莉酸与多种氨基酸通过酰胺键结合形成复合物。定量检测野生型拟南芥与JAR1突变体jar1中的茉莉酸氨基酸复合物含量，发现仅有茉莉酸与异亮氨酸的结合物在二者间存在显著差异，说明JAR1在拟南芥体内主要催化茉莉酸与异亮氨酸的结合。此外JAR1还能催化乙烯的前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid,ACC）与茉莉酸形成结合物（Staswicketal2002;StaswickandTiryaki2004）。16 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析体外酶活实验显示，拟南芥GH3基因家族第二组蛋白中，AtGH3.2、AtGH3.3、AtGH3.4、AtGH3.5、AtGH3.6、AtGH3.9和AtGH3.17都能够催化生长素与氨基酸相结合（Staswicketal2002）。其中AtGH3.5还能用水杨酸作为底物催化反应。近年来，人们在多种植物中发现了生长素吲哚乙酸（IAA）与一些氨基酸的结合物，如IAA-Asp、IAA-Glu、IAA-Ala、IAA-Leu以及IAA-Trp（Seideletal2006;Staswick2009）。其中IAA-Asp和IAA-Glu在植物体内会被分解异化，而IAA-Ala和IAA-Leu可以作为IAA的储存形式，通过水解作用与氨基酸分开，就能再次生成具有活性的游离生长素（Rampeyetal2004）。最初划分拟南芥GH3基因亚家族的时候，在常见的激素及其前体物质中没有找到第三组基因成员编码蛋白的底物（Staswicketal2002）。直到2009年，Okrent等运用高通量的腺苷酸分析方法，才找到第三组基因成员AtGH3.12编码蛋白质的酰基化底物。实验结果显示，AtGH3.12蛋白与第4位被取代的苯甲酸比如4-氨基苯甲酸（4-aminobenzoate）和4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoate）亲和性最高，而对原始的苯甲酸只表现出中等活性，对第2位被取代的苯甲酸，比如2-羟基苯甲酸（即水杨酸）则检测不到活性（Okrentetal2009）。与拟南芥类似，水稻GH3基因家族第一组基因编码的OsGH3.3与OsGH3.5蛋白也已经在体外实验中被证明具有酰胺合成酶活性，能够催化茉莉酸与异亮氨酸结合，形成茉莉酸-异亮氨酸复合物（Shinjietal2011）。水稻GH3家族第二组基因OsGH3.8超量表达植株中游离生长素含量降低，而结合态的IAA-Asp的含量升高，说明在水稻体内，OsGH3.8能够促使IAA向IAA-Asp转化。体外酶活实验也证实了OsGH3.8蛋白具有酰胺合成酶活性，可以催化吲哚乙酸与氨基酸结合，形成吲哚乙酸-氨基酸复合物。除了吲哚乙酸，OsGH3.8对一些生长素类似物，如苯乙酸（phenylaceticacid,PAA）和萘乙酸（napthalenaceticacid,NAA）也具有催化能力（Dingetal2008;Chenetal2010）。通过液相色谱-质谱联用（liquidchromatography-massspectrometry,LC-MS）分析，同属于第二组的OsGH3.13蛋白也具有酰胺合成酶活性，能够将多种氨基酸连接到吲哚乙酸上。其中活性最高的是催化吲哚乙酸和谷氨酸的结合，不过天冬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和丙氨酸都是OsGH3.13的底物（Zhangetal2009;Westfalletal2010）。17 华中农业大学2016届硕士学位论文1.6.3GH3基因家族的生理功能在拟南芥中，GH3家族蛋白参与了植株的生长发育，光形态发生，光与生长素信号路径以及生长素的体内平衡等多个生理过程（Hsiehetal2000;Nakazawaetal2001;Teppermanetal2001;Tanakaetal2002;Takaseetal2004;Staswicketal2005）。AtGH3.11属于拟南芥GH3家族第一组基因，它的功能失活突变体jar1表现出对激素茉莉酸和茉莉酸甲酯钝感的表型，在受到腐霉属病原菌Pythiumirregulare侵染后感病性增强（Staswicketal1998）。另一个第一组基因成员AtGH3.10受红光诱导，参与苗的光形态建成。虽然其启动子区域也有生长素响应元件，但目前尚没有其表达受生长素诱导的报道（Takaseetal2003）。拟南芥的一个矮化突变体ydk1-D，在黑暗和光照条件下均表现出胚轴变短的现象，检测发现突变体内GH3家族第二组基因AtGH3.2基因超量表达。外源生长素能诱导AtGH3.2的表达，并受到生长反应因子ARF7的调控，而蓝光和远红光能够上调AtGH3.2的表达。在根和花中，AtGH3.2启动子活性较强（Takaseetal2004）。体外实验中，AtGH3.5蛋白既能以吲哚乙酸为底物，又能以水杨酸为底物，催化腺苷酰化反应（Staswicketal2002）。而拟南芥中，AtGH3.5蛋白在水杨酸和生长素介导的抗病信号路径中行使双重调节功能。gh3.5-1D是AtGH3.5的功能获得性突变体，该材料叶片卷曲变小，侧根减少。该突变体内病程相关基因PR-1表达量和水杨酸水平均有所上升，对病原菌PstDC3000的抗性提高。而在病原菌侵染过程中，突变体内游离生长素水平明显上升，说明AtGH3.5也是引起植株感病的原因之一。进一步研究发现，当非亲和病原菌感染突变体gh3.5-1D时，水杨酸和生长素信号路径同时受到影响。水杨酸应答基因和基础抗性元件被AtGH3.5所诱导表达，激活水杨酸抗病路径；而生长素合成基因被诱导，生长素抑制基因被下调表达，使生长素介导的抗病反应被阻遏（Zhangetal2007)。目前对拟南芥GH3家族第三组基因的功能研究还很有限。已有研究表明，AtGH3.12参与水杨酸的代谢和信号转导，外源水杨酸和非亲和病原菌能诱导植株体内AtGH3.12的表达。AtGH3.12的两个功能缺失型突变体pbs3-1和gdg1-1，在病原侵染过程中表现得更加感病(Jagadeeswaranetal2007;Nobutaetal2007)。OsGH3.3与OsGH3.5均是属于水稻GH3家族第一组的基因，能够催化合成茉莉酸-异亮氨酸复合物。在水稻中，创伤能够短暂地诱导这两个基因的表达，并且使内源18 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析茉莉酸和茉莉酸-异亮氨酸的水平上升。接种稻瘟病菌后，OsGH3.5被诱导表达，而OsGH3.3的表达水平变化不明显。同时茉莉酸水平从接种0h开始到72h逐渐地上升，而茉莉酸-异亮氨酸的内源水平从接种后24h开始才有了明显上升，并且在接种72h时达到最高值（Shinjietal2011）。OsGH3.1基因属于水稻GH3家族第二组。超量表达该基因的植株变得矮小，植株体内游离生长素的含量明显降低，细胞长度变短。表达量检测显示与细胞形态建成相关的基因受到明显抑制，而许多防御相关基因表达量升高。接种病原后发现超表达植株对稻瘟病的抗性显著增强（Domingoetal2009）。实验证实OsGH3.8蛋白具有IAA酰胺合成酶活性，能够催化水稻体内的游离IAA与天冬氨酸结合形成IAA-Asp，以此调控水稻体内生长素的动态平衡。超量表达OsGH3.8会使植株变得矮小、发育迟缓、结实困难，但对白叶枯病抗性显著增强（Dingetal2008）。OsGH3.13基因同样证实编码IAA酰胺合成酶，其功能获得性突变体tld1-D表现为分蘖数增加、叶夹角变大和植株矮化。该基因的激活使水稻内源生长素水平受到抑制，但对干旱的抗性大大增强。在野生型植株中，干旱胁迫能迅速诱导OsGH3.13的表达（Zhangetal2009）。1.7研究的目的与意义一直以来，水稻的生产都受到各种病害的威胁。病害不仅影响水稻的产量，也增加了水稻生产过程中的负担。传统施用农药防治病害的方法已经不能满足生产的需要，而在自然环境亟需保护的今天，培育具有抗病能力的水稻品种是解决这一问题最为经济有效且环保的方法。虽然目前科研工作者已经在水稻中鉴定克隆出一批能够抗稻瘟病和白叶枯病的主效基因，并且应用到品种培育中，但是由于抗病主效基因抗谱狭窄、特异性强的特点，在实际应用过程中容易因为病原物的变异而失去对病害的抗性，具有局限性。而抗病相关基因具有介导持久的非特异的抗性的特点，开发抗病相关基因资源就有可能培育出更为广谱和持久的抗性材料，对抗病育种有着重大意义。因此对抗病相关基因进行深入全面的功能研究，分析其参与抗病的相关机理，能够帮助我们更好地利用这些抗病资源，并且发掘更多参与抗病反应的基因。19 华中农业大学2016届硕士学位论文本研究的目的主要有两个。一个是通过分别对水稻和病原菌体内生长素等激素的合成、代谢和调控进行探索，了解植物与病原互作时激素所起到的多面作用，为更系统全面地掌握OsGH3家族成员的抗病机理奠定基础。另一个是对本室肖文斐博士分离克隆得到的抗病相关基因OsDR10（Orazysativadefenseresponsegene10）进行功能分析，了解它在负调控水稻的抗病反应之外的其他作用，为更好地应用该基因资源打下基础。20 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析2材料与方法2.1水稻材料与来源本实验中所使用的水稻品种有籼稻（Oryzasativassp.indica）明恢63（Minghui63）和珍汕97（Zhenshan97）；粳稻（Oryzasativassp.japonica）牡丹江8（Mudanjiang8）和中花11（Zhonghua11）。以上水稻材料均为本室收藏。水稻品种明恢63携带抗白叶枯病的主效抗病基因Xa3/Xa26和xa25以及抗稻瘟病的主效数量性状位点（quantitativetraitlocus,QTL）rbr2，对白叶枯病菌菲律宾生理小种PXO61表现出中等抗性（Sunetal2004;Yangetal2008;Liuetal2011）。珍汕97不携带任何已报道的主效抗病基因，对PXO61表现为感病（Chenetal2003;Yangetal2003）。中花11对白叶枯病菌菲律宾生理小种PXO347表现为中感，是本研究中超量和抑制表达目标基因OsGH3.9的遗传转化受体材料。本研究中所使用的OsDR10转基因水稻材料均由肖文斐博士提供（肖文斐2009）。其中，OsDR10基因的超量表达材料是将OsDR10基因全长cDNA克隆EI87G08用限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ酶切后连接到由玉米泛素（ubiquitin）启动子驱动表达的pU1301载体上，获得的阳性质粒克隆命名为D93U，并转化入水稻品种明恢63中，转基因材料命名为D93UMH。后文为了记述方便，将该材料用OsDR10-oe表示。OsDR10基因的抑制表达材料是将OsDR10基因的cDNA克隆BI71N2用限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ酶切后连接到烟草花叶病毒（CaMV）35S启动子驱动转录的RNAi抑制表达载体pDS1301上，获得的阳性质粒克隆命名为D27R，并转化入水稻品种明恢63中，转基因材料命名为D27RMH。后文为了记述方便，将该材料用OsDR10-RNAi表示。OsDR10表达模式研究的转基因材料是将OsDR10翻译起始位置上游494bp到下游300bp的启动子及编码区序列连接到携带有β-葡萄糖苷酸酶（GUS）报告基因的载体pCAMBIA1381上，转化入水稻品种中花11中，材料命名为87P800。后文为了记述方便，将该材料用OsDR10-GUS表示。2.2菌株及用途本实验构建载体所用大肠杆菌菌株为Escherichiacoli（E.coli）DH10B，遗传转化用农杆菌菌株为EHA105。酵母双杂交菌株为AH109和Y187。21 华中农业大学2016届硕士学位论文使用的白叶枯病菌菌株为菲律宾生理小种PXO61、PXO99和PXO347。使用的细条病菌菌株为RH3。2.3病原菌培养、水稻材料接种及病情调查2.3.1白叶枯病菌的培养、接种、病情调查及细菌菌体计数培养白叶枯病菌菌株使用马铃薯培养基。通常在28℃恒温箱中，固体培养基培养2-3d，液体培养基培养1-2d即可满足接种和激素提取的需要。马铃薯培养基的配方为：300g去皮马铃薯切片煮沸，纱布过滤后加入0.5gCa(NO3)2，2gNaH2PO4，15g蔗糖，5g蛋白胨，20g琼脂粉，加蒸馏水（dH2O）至1L后调pH值至6.8-7.0。121℃高压蒸汽灭菌15-20min。9准备接种时，将用于接种的白叶枯病菌菌液用无菌水稀释浓度到约9×10个/mL的浓度（比浊法），孕穗期采用剪叶法(Sunetal2004)接种白叶枯病菌，每株接种5片以上完全伸展的叶子，取剪口下3-5cm的叶片用作RNA抽提（Lin1996）。接种14d或21d后调查病斑长度，依据病斑面积（病斑长度/病叶长度）衡量病情，并进行显著性分析。用于激素抽提的白叶枯病菌菌液有两种方法进行菌体数量计数。一种方法为使用DU-640型分光光度计（Beckman，美国）测定菌液在波长600nm的可见光处的吸光度值（OD600）。一般抽提激素使用的菌液吸光度值约为OD600=2。另一种方法为平板计数法，通过稀释菌液涂布平板统计菌落数量的方法计算菌落形成单位（CFU，Colony-FormingUnits）。该方法只计算活的菌体数量。2.3.2细条病菌的培养及细菌菌体计数细条病菌的培养方法及菌体计数方法与白叶枯病菌相同。2.4病原菌激素的抽提及定量分析将活化好的待测病原菌菌种接种到对应的液体培养基中扩大培养。每种菌株分为2个处理，其中1个处理培养基中加入终浓度为20mg/L的L-色氨酸（L-Trp）。待菌液吸光度值约为OD600=2时，取菌液少量进行平板计数，剩下的菌液于1200022 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析r/min离心10min，取上清于－20℃冰箱中保存备用。具体抽提方法见附录1中Protocol2，每个样品设3个实验重复。利用UltraFastLiquidChromatograph/ElectroSprayIonization/tandemMassSpectrometrysystem（UFLC/ESI-MS/MS）系统进行激素的定量分析。生长素吲哚乙酸和其内标氘化吲哚乙酸（D2-IAA）的前体离子峰分别为173.9和176，产物离子峰分别为129.9和131.9；茉莉酸和其内标二氢茉莉酸（DHJA）的前体离子峰分2别为209和211，产物离子峰均为59.0；脱落酸和其内标氘化脱落酸（H6ABA）的前体离子峰分别为263和269，产物离子峰分别为153.0和159.1；水杨酸和其内标萘乙酸(NAA)的前体离子峰分别为136.9和185，产物离子峰分别为92.9和141.0（Liuetal2012）。2.5β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色取OsDR10-GUS转基因植株T1代种子，用蒸馏水于37℃浸发72h。然后小心剥去外壳，将部分种子的可能表达部位如胚、胚乳等处用双面刀片进行纵切或横切。种子切片处理完成后置于1.5mL的离心管中，加入适量β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染液至完全浸没种子。染色液成分为：0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）20mL，0.5mol/LEDTA溶液1mL，TritonX-1000.5mL，亚铁氰化钾（Pataxiumferrocyamide）42.5mg，铁氰化钾（pataxiumferricyamide）33mg，氯霉素（chloramphenicol）5mg，5-溴-4-氯-3-吲哚葡聚糖醛酸苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide，X-Gluc）50mg，甲醇（Methanol）溶液10mL，加水至50mL。加入GUS染液后，封闭离心管，37℃温浴12-36h。显色后样品用灭菌水保存，体式显微镜（LeicaMZFLIII，Germany)观察摄像。2.6OsDR10免疫组织化学分析2.6.1OsDR10蛋白抗体制备选取OsDR10蛋白序列中紧挨着核定位序列（N’-RRDGDSCCPMRRRHRRC-C’）的一段序列（N’-CRRRHDDDDQLVDGDG-C’）作为目标序列，人工合成肽链并作为抗原注射免疫家兔，制备多克隆抗体并纯化（由武汉纽斯特生物公司完成）。该抗体命名为ADR10。23 华中农业大学2016届硕士学位论文2.6.2水稻总蛋白抽提取实验材料的新鲜叶片，用液氮冷冻研磨成粉末，加入提取缓冲液。提取缓冲液成分：终浓度为50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5），150mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA，0.1%TritonX-100，10mmol/LDTT，1mmol/LPMSF和1×蛋白酶抑制剂（ProteaseInhibitorCocktail）的混合物。冰浴，震荡萃取约20min，然后4℃、13000r/min冷冻离心10min，吸取上清液，重复离心一次。最后吸取的上清液为总蛋白，保存于－20℃。2.6.3WesternBlot杂交分析使用Brad-Ford法测定水稻总蛋白浓度。取同等量的蛋白作为样品进行SDS-PAGE凝胶电泳。查询蛋白分子量网站（http://www.bio-soft.net/sms/prot_mw.htmL）得到OsDR10蛋白大小约为11.21kD，因此使用15%浓度的SDS-PAGE分离胶，便于目标条带分离检测。配方如下：双蒸水（ddH2O）1.1mL，30%（w/v）聚丙烯酰胺溶液（Acrylamide）2.5mL，1.5mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.8）1.3mL，10%SDS0.05mL，10%过硫酸铵0.05mL，N,N,N',N'-四甲基二乙胺（TEMED，sigma）0.002mL。浓缩胶浓度为5%，配方为：ddH2O1.4mL，30%（w/v）聚丙烯酰胺溶液（Acrylamide）0.33mL，1.0mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8）0.25mL，10%SDS0.02mL，10%过硫酸铵0.02mL，N,N,N',N'-四甲基二乙胺（TEMED，sigma）0.002mL。电泳完成后使用PVDF膜转移蛋白。由于OsDR10蛋白分子量较小，以200mA电流转膜1h即可。转膜完成的PVDF膜用丽春红染液染色确认蛋白质转移情况，染液配方为：丽春红S2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，加dH2O至100mL，使用时稀释10倍。然后用dH2O冲洗干净染液，于PBST缓冲液中4℃震荡封闭过夜。PBST缓冲液为PBS缓冲液中加入终浓度为0.05%的Tween-20和2%的小牛血清白蛋白（BSA）。PBS缓冲液配方为：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O3.628g，KH2PO40.24g，加ddH2O至1L。用NaCl或HCl调节pH值至7.4。将膜转移至含第一抗体的PBST溶液（1:200）中，室温震荡孵育3h。使用PBS缓冲液洗去游离的第一抗体，将膜转移至含过氧化物酶标记的第二抗体（GoatAnti-RabbitIgG-HRP，Southernbiotech）的PBST溶液（1:2000）中，室温震荡孵育1h。之后洗去多余的24 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析游离抗体，用SuperSignal™WestPicoChemiluminescentSubstrate（ThermoFisher）试剂盒进行显色，压制X光片（FUJIX-rayFILM,日本），显影、观察、扫描。2.6.4免疫组织化学检测取新鲜实验材料，通过固定、乙醇逐级脱水、二甲苯透明、石蜡浸蜡与包埋、切片、粘片与烤片等步骤获得供免疫反应的样品。使用二甲苯将切片脱蜡，然后用乙醇逐级复水，梯度为无水乙醇——95%乙醇——80%乙醇——70%乙醇——50%乙醇——30%乙醇——15%乙醇——dH2O——dH2O，每步2min。37℃烤片2h以上。在避光条件下，用3%的H2O2孵育样品15min，以灭活内源性过氧化物酶活性。使用VECTASTAINEliteABCkit（Vectorlabs）进行免疫组化反应，按照说明书步骤操作。使用纯化后的OsDR10蛋白抗体作为一抗，浓度1:50。反应完成后使用DAB显色试剂盒（博士德公司，武汉）进行显色。显色完成后用dH2O洗去浮色，再用固绿进行染色。之后用乙醇逐级脱水（与复水过程相反），二甲苯透明，树胶封片，显微镜观察、摄像。2.7种子萌发能力检测从大田中收获刚成熟的饱满种子，进行发芽试验。每个家系选择3株阳性植株收获种子。自然条件下干燥1天，马上脱粒。不同家系收获300到400粒种子不等，每系种子分出300粒，平均分装在3个纸袋中，作为3个处理。处理1于脱粒后马上浸种，泡种72h后，将种子转移到垫有滤纸的培养皿中室温下萌发。处理2于脱粒后放在－20℃冰箱中，冰冻72h后取出泡种，经过72h后，放置在垫有滤纸的培养皿中室温萌发。处理3于脱粒后放在37℃温箱中烘烤72h后取出置于－20℃冰箱中，冰冻72h。之后再取出泡种，同样经过72h后，放置在垫有滤纸的培养皿中，室温25±1℃，相对湿度100%条件下萌发。以露白作为萌发的标准，连续记录7d的萌发数据。发芽率=7d萌发种子数／所有种子数×100%，发芽势＝前3d萌发的种子数／所有种子数×100%。25 华中农业大学2016届硕士学位论文2.8OsDR10蛋白筛选酵母双杂交文库2.8.1酵母双杂交载体构建由于OsDR10的基因序列不存在内含子，所以利用携带酶切位点EcoRⅠ的引物DR10HF1（5’-GAGAATTCATGGCGTTCTACAA-3’，下划线示意EcoRⅠ酶切位点）和携带酶切位点BamHⅠ的引物87G8R1（5’-ACGGATCCTTCATCATCGTCATCCTC-3’，下划线示意BamHⅠ酶切位点），直接以明恢63总DNA为模板，扩增OsDR10的编码区序列。然后利用上述引物的酶切位点接头连接到酵母双杂交系统中含有GAL4转录因子的DNA结合结构域（DNAbindingdomain,DNA-BD）的pGBKT7载体上，GAL4的DNA结合结构域序列在OsDR10序列的5’端，二者按照正确的读码框表达融合蛋白。阳性克隆命名为OsDR10-Y2D。2.8.2酵母双杂交以构建好的OsDR10-pGBKT7载体作为诱饵（bait），采用Clontech（BiosciencesClontech，美国）的酵母双杂交系统（MatchmakerLibraryConstruction&ScreeningKit）筛选水稻中与OsDR10互作的蛋白。酵母操作按照标准手册进行（ClontechYeastProtocolsHandbook）。用OsDR10-pGBKT7和仅携带GAL4AD编码系列的文库载体pGADT7-Rec共转化至酵母菌株AH109中，在双缺培养基（SD-Leu-Trp）上生长后，然后挑取生长克隆在三缺培养基（SD-Leu-Trp-His）和不同浓度（0,10mmol/L，20mmol/L，30mmol/L和50mmol/L）的三氨基三唑（3-amino-1,2,4-triazole,3-AT）条件下生长，确定在该体系中可以抑制本底组氨酸合成的条件。后续实验中的三缺培养基中均含有10mmol/L的3-AT。用OsDR10-pGBKT7单独转化至酵母菌株AH109中，并使用已知有自激活活性的pGBKT7-OsbZIP23载体和不含有外源片段的空载体pGBKT7各自转化酵母菌株作为阳性和阴性对照，检测OsDR10蛋白是否具有自激活活性(Xiangetal2008)。转化后的菌株先在一缺培养基（SD-Trp）上生长后，然后挑取生长克隆在二缺培养基（SD-Trp-His）上生长，确定OsDR10蛋白是否具有自激活活性。26 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析采用文库构建和筛选操作手册中的方法，以明恢63成株期剑叶接种白叶枯病菌生理小种PXO61后不同时间点（0h,1h,2h,4h,8h,12h,24h,48h）的mRNA为模板通过反转录和LD-PCR扩增，得到双链cDNA。纯化双链cDNA，将其与载体pGADT7-Rec共转化入酵母菌株Y187中进行重组为完整载体，收集阳性克隆菌体构建成酵母双杂交文库。将诱饵（Bait）质粒OsDR10-pGBKT7转化至酵母菌株AH109中，涂布于一缺培养基（SD-Trp）上，3d后挑取直径大于1mm的克隆10-20个至50mL一缺液体培养基（SD-Trp）中扩大培养，收集菌体后与酵母文库菌液进行接合（mating）培养，接合完成后将混合菌液涂布到四缺培养基（SD-Leu-Trp-His-Ura）上生长。抽提阳性酵母克隆质粒，转化至大肠杆菌DH10B中，涂布在50mg/L的氨苄青霉素培养皿上，挑取阳性克隆抽提质粒后用T7引物测序，测序结果在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）通过BLAST对序列进行检索和蛋白功能注释。2.9载体构建及农杆菌介导的遗传转化2.9.1OsGH3.9基因结构分析用“OsGH3.9”作为关键词检索NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Gene数据库，得到OsGH3.9的基因位点编号“LOC_Os07g38890”。用该编号检索水稻全基因组序列数据库MSU（http://rice.plantbiology.msu.edu/），发现OsGH3.9只有一个转录本，并且没有内含子，在蛋白质编码区序列（codingsequence,CDS）的5’端和3’端有非翻译区（untranslatedregion,UTR）。使用PrimerPremier5.0软件分析该基因的DNA序列，发现在它的蛋白质编码区序列中含有1个KpnⅠ酶切位点和2个BamHⅠ酶切位点（图5A）。2.9.2OsGH3.9超量表达载体构建使用PrimerPremier5.0软件设计携带KpnI酶切位点的超量表达引物GH39F2（5’-AGGTACCTGCTGCAGTTTTATA-3’，下划线示意KpnⅠ酶切位点）和GH39R2（5’-TTGAGGTACCTTCGGTGTACG-3’，下划线示意KpnⅠ酶切位点）来扩增OsGH3.9的全长基因组序列，用于构建超量表达载体。以牡丹江8的总DNA作为模板进行PCR扩增得到目标片段，用pGEMT-Easy载体（Promega，美国）做T/A27 华中农业大学2016届硕士学位论文克隆，并使用载体引物T7，SP6，及内部引物GH39F1（5’-TCTACCATATGTTCGTCAAGTCAGA-3’）和GH39R1（5’-GCAAAGCTTGTCGGATCGTG-3’）进行测序。与日本晴的DNA序列比对结果显示，扩增得到的DNA片段仅在转录成cDNA5’-UTR的序列处有一个碱基突变，不影响蛋白质编码序列，决定使用该克隆进行超量表达。使用限制性内切酶KpnⅠ酶切含有OsGH3.9基因片段的阳性pGEMT-Easy质粒以及超量表达载体pU1301。pU1301载体以玉米泛素（ubiquitin）启动子启动，选择标记为潮霉素，报告基因为GUS。(Qiuetal2007)。OsGH3.9基因组片段由于自身带有KpnⅠ酶切位点，需要进行部分酶切，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，并对目标大小片段进行切胶回收。使用T4-DNA连接酶对完整的OsGH3.9基因片段以及pU1301空载体进行连接，并电转入大肠杆菌感受态DH10B中。抽提质粒并酶切检测阳性，得到OsGH3.9超量表达载体，并将此载体阳性克隆命名为D128U（图5A）。AOsGH3.9ATGTAG643132662434240355713BamHⅠKpnⅠBamHⅠFragment(2014bp)fortransformationKpnⅠKpnⅠRBGUSUbiTEVLOsGH3.9NOSHptLBCloneD218UinvectorpU1301BBEcoRⅠKpnⅠBamHⅠSacⅠSpeⅠHindⅢLBHpt35SAdhI557bpWaxy-a557bpOCSGUSLBOsGH3.9OsGH3.9CDSCDSCloneD219RinvectorpDS1301图5OsGH3.9基因结构图及转化载体和T-DNA插入突变体示意图Fig.5SchematicdiagramsofOsGH3.9geneanditstransformationconstructsRB和LB为T-DNA的左右边界；GUS，-葡萄糖苷酶基因；Hpt，潮酶素磷酸转移酶基因；Ubi，玉米泛素启28 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析动子；35S，烟草花叶病毒35S启动子；TEVL，烟草刻蚀病毒5'-非翻译区；NOS，napoline合成酶终止子；OCS，octopine合成酶终止子。(A)OsGH3.9基因结构图（上部）和超量表达载体D218U（下部）。OsGH3.9基因的编码区用黑色盒子表示，前后的5'-和3'-非翻译区用白色盒子表示。ATG，翻译起始密码子；TAG，翻译终止密码子。数字表示每个序列片段含有的碱基对数。(B)OsGH3.9-RNAi抑制表达载体。Waxy-a表示水稻waxy-a基因的第一个内含子。RBandLB,rightandleftT-DNAborder;GUS,-glucuronidasegene;Hpt,hygromycinphosphotransferasegene;Ubi,maizeubiquitingenepromoter;35S,cauliflowermosaicvirus35Spromoter;TEVL,5’-nontranslatedregionofthetobaccoetchvirus;NOS,napolinesynthasepolyadenylationsignal;OCS,octopinesynthasepolyadenylationsignal.(A)OsGH3.9gene(upperpart)andoverexpressionconstructofOsGH3.9,D218U(lowerpart).BlackboxindicatesthecodingregionofOsGH3.9,whilewhiteboxesindicatethe5’-and3’-untranslatedregions.ATG,translationstartcodon;TAG,translationstopcodon.Thenumbersindicatethebasepairsofeachsubstructure.(B)RNAinterferenceconstructD219RofOsGH3.9.Waxy-aindicatestheintronⅠofricewaxy-agene.2.9.3OsGH3.9抑制表达载体构建由于OsGH3.9基因本身不含有内含子，且蛋白编码序列区内自带KpnⅠ酶切位点和BamHⅠ酶切位点，可以直接用这两个酶部分酶切OsGH3.9的基因序列，得到KpnⅠ酶切位点在5’端、BamHⅠ酶切位点在3’端的长557bp片段，用于构建抑制表达载体。用KpnⅠ和BamHⅠ酶切含有OsGH3.9基因片段的T/A克隆质粒，将得到的目标大小的片段切胶回收，并连接到RNAi抑制表达载体pDS1301上作为第一链，以及中间载体pGEM-GZ（Promega，美国）上。pGEM-GZ载体在KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点的外侧分别有SpeⅠ、SacⅠ酶切位点，用这两个酶将目标片段酶切下来，可以得到构建RNAi抑制表达载体所需的第二链。将第二链再连接到pDS1301，即得到完整的OsGH3.9抑制表达载体（Yuanetal2007a）。测序验证后的阳性克隆命名为D219R（图5B）。2.9.4农杆菌介导的遗传转化采用电转化方法将构建好的载体转至农杆菌EHA105（Agrobacteriumtumefaciens）中，遗传转化程序主要根据本室建立的水稻遗传转化体系（LinandZhang,2005）。OsGH3.9超量表达载体和抑制表达载体均转化入受体材料中花11中。其中超量表达载体D218U转化后得到的转基因材料命名为D218UZH，后文为了方29 华中农业大学2016届硕士学位论文便记述，用OsGH3.9-oe表示；RNAi抑制表达载体D219R转化后得到的转基因材料命名为D219RZH，后文为了方便记述，用OsGH3.9-RNAi表示。2.10外源激素处理水稻材料2.10.1离体水稻叶片的处理明恢63在温室中（25℃，75%相对湿度，12小时光照）生长至21d，挑选长势一致的植株，取完全展开的叶片，将叶片剪成约2cm长的片段，置于dH2O内备用（30min-60min）。待叶片片段准备完成后，将叶片从dH2O内取出并用吸水纸吸干表面水分，再浸泡于含有一定浓度测试激素和0.1%的吐温-20的水溶液中，同时设置不加测试激素的水溶液对照。处理后依据不同时间点收集叶片，立即放入液氮中，于－70℃下保存备用。处理激素包括吲哚乙酸和茉莉酸甲酯（Sigma,美国），所有化学试剂均为分析纯。母液配方参照前人文献（Agrawaletal2000;Kimetal2003），工作浓度为100mol/L。2.10.2活体水稻叶片的处理明恢63在温室中（25℃，75%相对湿度，12小时光照）生长至5-6叶期，用100mol/L的测试激素和0.1%的吐温-20的水溶液喷施后立即用透明塑料薄膜封住，同时用不含有测试激素的水溶液处理对照材料。处理后依据不同时间点收集叶片，立即放入液氮中，于－70℃下保存备用。处理激素包括茉莉酸甲酯和水杨酸（Sigma,美国），所有化学试剂均为分析纯。2.11DNA抽提与阳性检测采用CTAB小样法（附录1的protocol1）快速抽提水稻总DNA，用于植株的PCR法阳性鉴定。对OsGH3.9超量表达植株使用GUS2F（5’-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3’）和GUS2R（5’-GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACC-3’）进行PCR扩增检测。对OsGH3.9抑制表达植株使用pMCGF（5’-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3’）和pMCGR（5’-CTGAGCTACATGCTCAGGTT-3’）进行PCR扩增检测。30 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析2.12基因表达量分析2.12.1RNA抽提及反转录用Transzol（Trangene）进行水稻总RNA采抽提，操作步骤详见产品说明书。反转录方法参考M-MLV（Promega）反转录酶说明书，具体为将抽提的总RNA测浓度，取5µg加入DNaseI（Promega），37℃水浴15min以除去DNA，加1µL的25mmol/LEDTA（Promega）灭活DNaseI，静置1min后加入1µL的100ng/µLoligo(dT)15（Promega），75℃反应10min去除RNA二级结构，然后加入含有1µL的0.1mmol/LDTT，2µL的10mmol/LdNTP，1µL的M-MLV以及4µL的5×First-strandBuffer的混合物，37℃反应1h以上。然后在75℃水浴10min灭活反转录酶，加入180µLddH2O稀释反转录产物。取5µL稀释后的反转录产物扩增肌动蛋白基因检测引物ActinF/ActinR检测反转录效果。2.12.2反转录PCR（RT-PCR)取5µL稀释后的反转录产物作为模板，加入2µL的2mmol/LdNTP，2µL的10×PCRbuffer（Takara），扩增正反引物各0.2µL以及0.2µLrTaq酶（Takara），加ddH2O至20µL。使用三步法PCR程序扩增，反应程序如下：94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，26-32个循环；72℃5min。根据目的片段大小用1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。2.12.3实时定量PCR（Real-timeQuantitativePCR)使用ABI7500Real-TimePCRsystem（AppliedBiosystems，美国）进行定量PCR分析。选用EvaGreen染料作为荧光指示剂，反应体系为：稀释后的反转录产物5µL，基因检测正反引物各0.25µL，EvaGreenDye1.25µL，2.5µL的2mmol/LdNTP，2.5µL的10×PCRbuffer（Takara）以及0.2µLrTaq酶（Takara），加ddH2O至25µL。反应程序为95℃10min，然后进入循环95℃15sec，60℃30sec，72℃60sec，40-45个循环，其中72℃步骤为荧光收集步骤。每个样品设置一个内参，内参为水稻内源肌动蛋白基因Actin，每个待检测基因和内参基因设置3个技术重复。按照AppliedBiosystems的定量PCR分析方法使用Excel处理数据。使用的引物见表1。31 华中农业大学2016届硕士学位论文2.12.4水稻抗感病品种接种病原菌的cDNA材料及来源水稻品种明恢63携带抗白叶枯病的主效抗病基因Xa3/Xa26，对白叶枯病菌菲律宾生理小种PXO61表现出中等抗性（Sunetal2004）。珍汕97不携带任何已报道的主效抗病基因，对PXO61表现为感病（Chenetal2003;Yangetal2003）。本室刘红波博士为本实验提供了一套PXO61接种抗病材料明恢63和感病材料珍汕97分时间点取样的cDNA材料。该套材料是夏天在武汉大田使用白叶枯病菌PXO61对孕穗期水稻剑叶进行剪叶法接种，分时间点（接种前、30min、1h、2h、12h、1d、3d、7d）取得剑叶RNA样，抽提水稻总RNA后再反转录成cDNA的样品。32 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析表1用于实时定量PCR的基因特异引物Table1Gene-specificprimersforReal-timeQuantitativePCRGenesAccessionnumberPrimernameForwardprimer(5'-3')Reverseprimer(5'-3')OsGH3.3AK072125G3RTF1/G3RTR1GGTGTGAAACTGACAGACCAAAATTAAGACAAGAGCAAACGTACCAAAGGOsGH3.4AK101932G4RTF1/G4RTR1GAGCTAATTAAGCATGGATGGTTGACAAAAGCCCAATAGCTAGATGATCAOsGH3.5AK071721G5RTF1/G5RTR1CGGGCTCGAGGAAGATCAACACCACCAAGGCTTAGGAAATGOsGH3.6AK106538G6RTF1/G6RTR1TCACTAGCATCTGTCTCATTGTGTCACCTCCCCAGTGCTGAAAATTCOsGH3.9AK106839G9RTF3/G9RTR3CGCGTCGTGTCTAGCCAATTTTTCCTAAAATAAAGATGCCAAACAGActinX15865ActinF/ActinRTGTATGCCAGTGGTCGTACCACTGAGCTACACATGCTCAGGTT33 华中农业大学2016届硕士学位论文3结果与分析3.1OsGH3家族基因响应激素的功能分析OsGH3家族是水稻中一类早期响应生长素的基因。根据与拟南芥GH3家族成员的蛋白序列同源性比对结果，水稻中的13个GH3基因分别归入第一组（GroupⅠ）亚家族和第二组（GroupⅡ）亚家族，没有属于第三组（GroupⅢ）亚家族的成员(Teroletal2006;Jainetal2006)。拟南芥GH3基因家族第一组基因AtGH3.11编码的蛋白质具有酰胺合成酶活性，能够催化底物茉莉酸和氨基酸结合形成酰胺复合物。而水稻GH3基因家族第一组基因OsGH3.3与OsGH3.5编码的蛋白质也具有同样的催化形成茉莉酸-氨基酸复合物的功能（Staswicketal2002;StaswickandTiryaki2004;Shinjietal2011）。类似的，拟南芥GH3基因家族第二组大多数基因编码能够以生长素为底物催化形成酰胺结合物的蛋白，而水稻GH3基因家族第二组基因OsGH3.8和OsGH3.13也被证实是以生长素为底物的酰胺合成酶（Staswicketal2002;Staswicketal2005;Dingetal2008;Zhangetal2009;Westfalletal2010）。因此，我们推测水稻OsGH3家族中尚未报道功能的其他成员可能也具有类似的响应激素的功能，并据此展开实验。3.1.1OsGH3家族基因在外源激素处理后的表达变化已经有许多报道证实，在用外源激素如生长素、茉莉酸、水杨酸等处理植株后，拟南芥和水稻的GH3基因家族的一些成员表达量会发生改变（Hsiehetal2000;Takaseetal2004;WoodwardandBartel2005;Jainetal2006;Parketal2007a;Parketal2007b;Zhangetal2007;Dingetal2008）。因此我们使用外源激素处理水稻，并检测部分OsGH3家族基因表达量的变化情况，据此探索它们在植物体内发挥的功能。水稻品种明恢63携带抗白叶枯病的主效抗病基因Xa3/Xa26和xa25以及抗稻瘟病的主效数量性状位点（quantitativetraitlocus,QTL）rbr2，是一种常用的抗病材料（Sunetal2004;Yangetal2008;Liuetal2011）。本实验使用100μmol/L的吲哚乙酸（IAA）浸泡处理苗期的明恢63的离体叶片，并检测处理前到120min时叶片中OsGH3家族部分基因的表达量变化情况（图6）。属于GH3家族第二组的OsGH3.4基因在外源生长素处理15min时就明显被诱导表达，在45min时与水处理对照的表34 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析达量出现极显著差异，在120min时表达量达到最高值，与处理前的材料相比升高了74.7倍，与同时期的水处理对照相比高了18.5倍（图6A）。说明OsGH3.4能够迅速响应外源生长素，并大幅上调表达。而属于GH3家族第一组的OsGH3.5和OsGH3.6两个基因的表达量升高远没有这么显著，在120min其表达量达到最高值时，仅比处理前的材料升高了4.1倍和8.3倍，与同时期的水处理对照相比仅高了2.7倍和3.3倍。特别需要指出的是，在90min这个时间点，OsGH3.5和OsGH3.6的表达量都出现了一个相对低谷值，虽然仍旧比处理前的材料升高了1.5倍和3.1倍，与同时期的水处理对照相比高了0.9倍和3.1倍。到120min的时候，两个基因的表达量再度上升到新的峰值，意味着外源生长素对OsGH3.5和OsGH3.6的表达诱导可能存在周期性（图6B，图6C）。H2O(control)100μmol/LIAA图6OsGH3家族基因在外源生长素处理后的苗期明恢63离体叶片中的表达变化Fig.6ExpressionofOsGH3familygenesinMinghui63leavesatseedlingstageafterexogenousIAAtreatmentinvitro(A)OsGH3.4在IAA或水处理后的表达变化。(B)OsGH3.5在IAA或水处理后的表达变化。(C)OsGH3.6在IAA或水处理后的表达变化。35 华中农业大学2016届硕士学位论文ck，处理前。每个时间点的表达数据来自三个重复。15，30，45，60，90，120，处理后的分钟数。一个“*”或两个“**”分别表示在IAA处理和水处理的同一个时间点，OsGH3家族基因的表达水平在P<0.05或P<0.01的显著水平上存在差异。(A)ExpressionofOsGH3.4afterIAAorH2Otreatment.(B)ExpressionofOsGH3.5afterIAAorH2Otreatment.(C)ExpressionofOsGH3.6afterIAAorH2Otreatment.ck,beforetreatment.Barsrepresentmean(3replicates)±Standarddeviation.15,30,45,60,90,120,minutesafterhormonetreatment.One“*”ortwo“**”asterisksindicateasignificantdifferencewasdetectedbetweencontrolandIAAtreatmentofthesametimeatP<0.05orP<0.01,respectively.使用100μmol/L的茉莉酸甲酯溶液浸泡处理苗期的明恢63的离体叶片，并检测处理前到120min时叶片中OsGH3家族部分基因的表达量变化情况（图7A）。叶片中属于GH3家族第一组的OsGH3.3基因在15min时就已经快速反应，被诱导表达。接着表达量持续升高，在30min和45min两个时间点比同时期水处理对照高了1.4倍和1.0倍，之后表达量迅速下降，在60min时比前一个时间点下降了34.9%。随后与同时期的水处理对照的表达量几乎一致地再次升高。同属于第一组的OsGH3.5基因的表达量同样出现了迅速升高、快速下降然后再继续升高的趋势，在120min处达到最大值，与未处理材料相比升高了2.2倍，与同时期的水处理对照相比高了1.3倍。而水处理对照的表达量则在迅速升高、快速下降后回到处理前的水平不再变化，说明外源茉莉酸甲酯的作用能够持续地诱导它的表达，使表达量的变化呈现周期性。值得一提的是，OsGH3.6基因的表达量虽然出现了起伏波动，并且在45min和90min时候与未处理对照存在统计学意义上的显著差异，分别比未处理对照高了0.5和1.4倍，但是与同时期的水处理对照相比，除了在60min和120min处显著低于水处理对照、仅有对照的32.1%和31.0%以外，其他时间点均没有统计学意义上的差异。这就意味着，茉莉酸甲酯的存在可能反而抑制了的由水处理引起的OsGH3.6的上调表达。我们还使用茉莉酸甲酯处理了明恢63的活体叶片。用浓度为100μmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷雾处理5-6叶期的明恢63幼苗，再用透明薄膜封住植株后分时间点取叶片的RNA样，检测OsGH3家族基因的表达量变化情况（图7B）。结果显示，与离体实验的结果一致，OsGH3.3的表达受到外源茉莉酸甲酯的强烈诱导。虽然水处理对照中的该基因表达量也有所上升，但激素处理的材料中基因的诱导表达更强烈。在360min的时间点处，激素处理的水稻叶片中OsGH3.3表达量与未处理的对照相比具有统计学意义上的显著差异，比后者高了26.7倍；与水处理对照相比具有统计学意义上的极显著差异，比后者高1.3倍。480min处，激素处理的OsGH3.336 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析H2O(control)100μmol/Lmethyljasmonate图7OsGH3家族基因在外源茉莉酸甲酯处理后的苗期明恢63离体和活体叶片中的表达变化Fig.7ExpressionofOsGH3familygenesinMinghui63leavesatseedlingstageafterexogenousmethyljasmonatetreatmentinvitroandvivo37 华中农业大学2016届硕士学位论文(A)OsGH3家族基因在茉莉酸甲酯或水处理后的水稻离体叶片中的表达变化。(B)OsGH3家族基因在茉莉酸甲酯或水处理后的水稻活体叶片中的表达变化。ck，处理前。每个时间点的表达数据来自三个重复。15，30，45，60，90，120，360，480，处理后的分钟数。“a”或“b”分别表示在茉莉酸甲酯处理后的某个时间点与处理前相比，OsGH3家族基因的表达水平在P<0.05或P<0.01的显著水平上存在差异。一个“*”或两个“**”分别表示在茉莉酸甲酯处理和水处理的同一个时间点，OsGH3家族基因的表达水平在P<0.05或P<0.01的显著水平上存在差异。(A)ExpressionofOsGH3familygenesaftermethyljasmonateorH2Otreatmentinvitro.(B)ExpressionofOsGH3familygenesaftermethyljasmonateorH2Otreatmentinvivo.ck,beforetreatment.Barsrepresentmean(3replicates)±Standarddeviation.15,30,45,60,90,120,360,480,minutesafterhormonetreatment.The“a”or“b”indicatesasignificantdifferencewasdetectedbetweenckandthetimingaftermethyljasmonatetreatmentatP<0.05orP<0.01,respectively.One“*”ortwo“**”asterisksindicateasignificantdifferencewasdetectedbetweencontrolandmethyljasmonatetreatmentofthesametimeatP<0.05orP<0.01,respectively.的表达量达到本次检测的峰值，与未处理的对照相比升高了74.1倍，与同时期的水处理对照相比高了0.7倍，均具有统计学意义上的显著差异。OsGH3.5在激素处理后45min时表达量达到峰值，比处理前的材料升高了8.3倍，与同时期的水处理对照相比仅高了1.4倍，均存在统计学意义上的显著差异。之后激素处理材料中OsGH3.5的表达量下降，与水处理对照再无显著差异。OsGH3.6在茉莉酸甲酯处理后出现上升表达，在360min处出现峰值，比未处理对照高出11.5倍。但与同时期的水处理对照相比，茉莉酸甲酯处理后的样品OsGH3.6的表达量在45min和60min处极显著和显著地低于对照，仅有对照中的约72.3%和10.3%。之后水处理对照中的表达量下降，与经激素处理的材料趋于一致。说明该实验中水处理方法能够诱导OsGH3.6的表达，而茉莉酸甲酯可能抑制该表达。属于GH3家族第二组的OsGH3.4基因在茉莉酸甲酯处理后，于30min、45min和360min处出现与未处理对照相比统计学意义上的表达量显著差异，分别比未处理样品高了1.9倍、7.0倍和4.5倍，但与同时期的水处理对照相比仅在30min时存在高1.1倍的显著差异，之后差异不显著。我们同样使用了100μmol/L水杨酸处理明恢63的活体植株叶片，分时间点取叶片的RNA样，检测OsGH3家族基因的表达量变化情况（图8）。结果显示，属于GH3家族第一组的OsGH3.3、OsGH3.5和OsGH3.6基因在经过水杨酸处理后，除个别时间点无显著变化外，其它时间点表达量相对比未处理前都有所上升。其中OsGH3.3在360min处与未处理对照相比表达量升高了12.2倍，差异极显著。虽然38 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析H2O(control)100μmol/Lsalicylicacid图8OsGH3家族基因在外源水杨酸处理后的苗期明恢63活体叶片中的表达变化Fig.8ExpressionofOsGH3familygenesinMinghui63leavesatseedlingstageafterexogenoussalicylicacidtreatmentinvivock，处理前。每个时间点的表达数据来自三个重复。30，45，60，90，360，480，处理后的分钟数。“a”或“b”分别表示在水杨酸处理后的某个时间点与处理前相比，OsGH3家族基因的表达水平在P<0.05或P<0.01的显著水平上存在差异。一个“*”或两个“**”分别表示在水杨酸处理和水处理的同一个时间点，OsGH3家族基因的表达水平在P<0.05或P<0.01的显著水平上存在差异。ck,beforetreatment.Barsrepresentmean(3replicates)±Standarddeviation.30,45,60,90,360,480,minutesafterhormonetreatment.The“a”or“b”indicatesasignificantdifferencewasdetectedbetweenckandthetimingaftersalicylicacidtreatmentatP<0.05orP<0.01,respectively.One“*”ortwo“**”asterisksindicateasignificantdifferencewasdetectedbetweencontrolandsalicylicacidtreatmentofthesametimeatP<0.05orP<0.01,respectively.该基因在480min处的表达量平均值更高，比未处理对照高了16.6倍，但由于实验重复间的方差过大，使用t-测验检验后差异无统计学意义。OsGH3.5在水杨酸处理后，于90min处达到最高值，比未处理对照高了1.9倍，差异极显著。OsGH3.6在水杨酸处理后，于480min处达到最高值，比未处理对照高了7.1倍，差异极显著。尽管如此，水杨酸处理后的OsGH3.3和OsGH3.5的表达量始终不高于同时期的水处39 华中农业大学2016届硕士学位论文理对照。其中OsGH3.3激素处理后的表达量在30min和480min处显著地低于水处理对照，仅有对照的59.0%和39.5%；在45min处极显著地低于水处理对照，仅有对照的21.0%。OsGH3.5激素处理后的表达量在30min和45min处显著地低于水处理对照，仅有对照的44.0%和66.3%；在480min处极显著地低于水处理对照，仅有对照的55.8%。OsGH3.6激素处理后的表达量在30min，45min和60min处显著地低于水处理对照，仅有对照的40.5%、65.8%和15.3%；但在480min处显著地高于水处理对照，高了约0.3倍。属于GH3家族第二组的OsGH3.4基因在水杨酸处理后，于45min处表达量与未处理对照相比具有极显著差异，比对照高了5.2倍；于60min和90min处表达量与未处理对照相比具有显著差异，比对照高了3.1倍和4.0倍。但与同时期的水处理对照相比，仅在45min处其表达量存在极显著差异，比水处理对照高了0.8倍。其他时间点二者间的差异不具有统计学意义。3.1.2OsGH3家族基因在病原菌侵染的水稻材料中的表达变化许多抗病相关基因的表达会受病原菌侵染的影响，这种表达变化往往在抗病材料和感病材料之间存在差异。已经有报道证实，拟南芥和水稻受到病原菌侵染时，体内的某些参与抗病反应GH3家族基因表达量会发生改变，并且在抗病品种和感病品种之间存在差异（Wenetal2003;Zhangetal2007）。因此，我们可以通过检测抗病材料与感病材料在受到病原菌侵染后GH3家族基因表达量的变化情况，来判断该基因是否参与抗病反应，以及其可能起到的调控作用。由本实验室刘红波博士提供了一套抗病品种明恢63和感病品种珍汕97接种白叶枯病菌菌株PXO61的分时间点取样cDNA材料，我们使用这份材料检测了GH3基因家族第二组成员OsGH3.4和第一组成员OsGH3.5两个基因受病原菌影响的表达情况（图9）。接种PXO61后，抗病品种明恢63中的OsGH3.4表达量迅速升高，在30min处就比未接种时升高了13.7倍。之后出现下降-上升的周期性变化，在3d到7d的时候出现爆发式上升，在7d时达到峰值，比未接种时升高了29.5倍。而感病品种珍汕97中OsGH3.4的表达一开始受到抑制，在30min时表达量只有未接种时的25.6%，之后出现上升-下降-上升的变化，在7d时达到最高值，比未接种时升高了12.6倍。显著性分析显示，大多数时间点，感病材料珍汕97中OsGH3.4的表达40 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析量低于抗病材料明恢63，说明OsGH3.4可能正向调控水稻对于白叶枯病的抗性（图9A）。尚未接种时，抗病材料明恢63中OsGH3.5表达量就显著高于感病材料珍汕97，比后者高了约1.0倍。接种PXO61后，明恢63中OsGH3.5表达量迅速升高，在30min处就比未接种时升高了3.0倍，之后出现下降-上升的周期性变化。虽然在2h处表达量的平均值最高，但由于实验重复间方差过大，与未接种时不存在统计学意义上的差异。珍汕97中OsGH3.5的表达量在接种后先被抑制，30min处表达量仅有未接种时的67.6%，但不具有统计学意义上的差异；与同时期的明恢63对比，仅有后者的8.3%，差异极显著。之后才出现上升-下降的周期性变化，但只在1d处与未接种时相比存在统计学意义上的差异，比未接种时升高了1.4倍。总体来看，抗病品种明恢63中OsGH3.5的表达量比感病品种珍汕97要高，说明OsGH3.5可能参与正向调控水稻对于白叶枯病菌的抗性（图9B）。图9OsGH3.4和OsGH3.5在感染白叶枯病菌PXO61后的不同抗感病水稻材料中的表达变化Fig.9ExpressionofOsGH3.4andOsGH3.5indifferentricevarietiesafterinoculationofXoostrainPXO61(A)OsGH3.4在不同抗感病水稻材料中接种PXO61后的表达变化。41 华中农业大学2016届硕士学位论文(B)OsGH3.5在不同抗感病水稻材料中接种PXO61后的表达变化。ck，接种前。每个时间点的表达数据来自三个重复。30min，1h，2h，12h，1d，3d，7d，接种后的时间点。“a”或“b”分别表示在同一品种接种PXO61后和未接种的植株中，OsGH3家族基因的表达水平在P<0.05或P<0.01的显著水平上存在差异。一个“*”或两个“**”分别表示在感病材料和抗病材料接种的同一个时间点，OsGH3家族基因的表达水平在P<0.05或P<0.01的显著水平上存在差异。(A)ExpressionofOsGH3.4indifferentricevarietiesafterinoculationofXoostrainPXO61.(B)ExpressionofOsGH3.5indifferentricevarietiesafterinoculationofXoostrainPXO61.ck,beforeinoculation.Barsrepresentmean(3replicates)±Standarddeviation.30min,1h,2h,12h,1d,3d,7d,timeafterinoculation.The“a”or“b”indicatesasignificantdifferencewasdetectedbetweenXoo-inoculatedandnon-inoculatedplantsofthesamericelineatP<0.05orP<0.01,respectively.One“*”ortwo“**”asterisksindicateasignificantdifferencewasdetectedbetweensusceptibleZhenshan97andresistantMinghui63ofthesametimeatP<0.05orP<0.01,respectively.3.1.3OsGH3.9超量和抑制表达材料表型分析OsGH3.9是水稻GH3基因家族第二组的成员，目前尚无关于该基因功能的详细报道。为了鉴定OsGH3.9基因在水稻中的功能，我们构建了OsGH3.9的超量表达载体D218U和抑制表达载体D219R，并且通过农杆菌介导转化到水稻品种中花11中，得到超量表达植株D218UZH和抑制表达植株D219RZH。为了记述方便，超量表达植株用OsGH3.9-oe表示，抑制表达植株用OsGH3.9-RNAi表示。通过遗传转化操作，一共得到52株OsGH3.9-oe转基因植株，其中阳性植株32株。由于部分植株长势较弱，在大田生长过程中夭亡，到孕穗期接种病原菌时仅存活27株，存活的27株中阳性植株共有14株。部分转基因植株表现出矮化、抽穗期延迟、穗数量减少、穗长变短等表型，但与植株是否含有外源转化的农杆菌T-DNA没有对应关系。使用白叶枯病菌菲律宾生理小种PXO99在武汉大田孕穗期接种OsGH3.9-oe转基因植株剑叶，于16d后调查发病情况。由于出现抽穗期延迟、穗数变少的表型，部分植株接种时剑叶较少，调查数据时仅有1片剑叶的发病数据，其余植株均有2-3片剑叶的发病数据（表2）。野生型中花11的病斑面积为15.9%，转基因阳性植株的发病面积在2.6%和33.3%之间，转基因阴性植株的发病面积在3.4%到25.8%之间。根据显著性分析结果，只有转基因阳性植株OsGH3.9-oe-2与野生型中花11对照相比差异极显著，发病面积为5.2%，比野生型对照的15.9%小；只有转基因阴性植株OsGH3.9-oe-22与野生型中花11对照相比差异显著，发病面积为8.0%，同样比野生型对照小。42 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析接种调查后取叶片抽提RNA并反转录成cDNA，用引物G9RTF3和G9RTR3（表1）进行RT-PCR，检测OsGH3.9的表达量，并与接种结果相比对（图10）。结果显示。除OsGH3.9-oe-50外，其余阳性植株扩增OsGH3.9的条带均亮于野生型中花11。但超量表达的植株只有OsGH3.9-oe-2发病面积极显著地低于中花11，其他都没有统计学意义上的差异。表2OsGH3.9超量表达T0代植株（OsGH3.9-oe）接种白叶枯病菌（PXO99）的表型Table2PerformanceofOsGH3.9-oeT0plantsafterpathogen(XoostrainPXO99)inoculationabcRicematerialGUSpositiveLesionarea(%)PvalueZhonghua1115.9±4.1(wildtype)OsGH3.9-oe-2＋5.2±1.70.0034OsGH3.9-oe-5＋25.5±6.80.1096OsGH3.9-oe-9＋15.0±1.00.6212OsGH3.9-oe-11－14.3OsGH3.9-oe-12＋13.5OsGH3.9-oe-15＋19.2OsGH3.9-oe-16＋12.7OsGH3.9-oe-18－15.5OsGH3.9-oe-19＋32.3OsGH3.9-oe-20－14.5±2.70.6116OsGH3.9-oe-21＋13.4OsGH3.9-oe-22－8.0±1.70.0127OsGH3.9-oe-24－12.1±3.00.2986OsGH3.9-oe-28＋10.2OsGH3.9-oe-29－11.6OsGH3.9-oe-31－14.6±9.90.8841OsGH3.9-oe-34＋9.5OsGH3.9-oe-38＋25.5OsGH3.9-oe-39＋4.4OsGH3.9-oe-41－18.4OsGH3.9-oe-42－3.4OsGH3.9-oe-44＋2.6OsGH3.9-oe-45－25.8±12.90.480843 华中农业大学2016届硕士学位论文OsGH3.9-oe-48－14.1±3.00.5680OsGH3.9-oe-50＋33.3OsGH3.9-oe-51－8.1±4.60.1659OsGH3.9-oe-52－7.1±3.20.0884a“＋”表示该植株DNA小样扩增GUS基因结果为阳性，“－”表示该植株DNA小样扩增GUS基因结果为阴性。部分植株只接种了1片剑叶，其他植株接种了2-3片剑叶。b平均病斑面积标准差。cP值结果是通过t-test双样本异方差与野生型中花11比较得到。aThe“＋”indicatesthattheGUSgenedetectionoftransgenicplantwaspositive,and“－”indicatesthatthedetectionwasnegative.Someoftheplantsinoculatedonlyoneflagleaf,whileotherstwoorthree.bEachdatarepresentsaveragelesionareastandarddeviation.cEachPvaluewascalculatedbyt-testincomparisonwithsusceptiblewildtypeZhonghua11.图10OsGH3.9-oeT0代超量表达植株在接种白叶枯病菌PXO99后的表型与OsGH3.9的表达量Fig.10PhenotypeofOsGH3.9–oeT0plantsafterPXO99infectionandexpressionofOsGH3.9WT，野生型中花11。病斑面积=平均值±标准差。一个“*”表示OsGH3.9-oeT0代超量表达植株病斑面积和野生型比较在P<0.05的显著水平上存在差异。WT,wildtypeZhonghua11.Barsrepresentmean±Standarddeviation.One“*”asterisksindicatesasignificantdifferencewasdetectedbetweenOsGH3.9–oeT0plantsandwildtypeZhonghua11atP<0.05.我们在温室对OsGH3.9-oeT1代植株孕穗期剑叶进行白叶枯病菌PXO99的接种鉴定。由于OsGH3.9-oeT0代植株结实率低，T1代种子发芽率也很低，最终我们能用于接种的只有OsGH3.9-oe-12家系。用小样DNA检测GUS阳性的结果显示这个家系存活的植株都是阳性植株。由于冬天温室发病较慢，于接种30d后调查数据，并取样检测OsGH3.9的表达量（表3，图11）。综合表达量检测和发病数据的结果，野生型中花11的病斑面积为11.2%，OsGH3.9-oe-12家系转基因阳性植株的发病面积在6.9%和34.2%之间。虽然44 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析OsGH3.9-oe-12家系植株体内的OsGH3.9表达量与野生型中花11对照相比，升高了40倍到4482倍之多，但其发病情况却与该基因的表达量没有共分离关系。一些超量植株的病斑面积与野生型相比显著减小，但另一些却显著增大，意味着超量OsGH3.9可能并不会增强水稻的抗病性。由于本次接种在温室进行，中感材料野生型中花11对白叶枯病菌株PXO99的亲和反应表现不明显，发病面积偏小，加上接种的样本本身较小，因此该实验结果尚需要再验证。表3OsGH3.9超量表达T1代植株接种白叶枯病菌（PXO99）的表型Table3PerformanceofOsGH3.9-oeT1plantsafterpathogen(XoostrainPXO99)inoculationabcRicematerialGUSpositiveLesionarea(%)PvalueZhonghua1111.2±0.3(wildtype)OsGH3.9-oe-12T1familyOsGH3.9-oe-12-2＋19.7±0.30.0012OsGH3.9-oe-12-4＋10.9±0.50.6780OsGH3.9-oe-12-5＋18.3±7.30.4000OsGH3.9-oe-12-6＋34.2±1.20.0237OsGH3.9-oe-12-7＋7.7±1.50.0646OsGH3.9-oe-12-9＋6.9±1.20.1220OsGH3.9-oe-12-11＋12.1±2.20.6742OsGH3.9-oe-12-12＋13.8±1.90.1389OsGH3.9-oe-12-13＋15.4±1.60.0456OsGH3.9-oe-12-14＋7.2±0.50.0002OsGH3.9-oe-12-15＋16.6±1.40.0237OsGH3.9-oe-12-16＋12.1±10.80.8976OsGH3.9-oe-12-17＋6.6±4.10.1920OsGH3.9-oe-12-18＋22.7±9.80.1793a“＋”表示该植株DNA小样扩增GUS基因结果为阳性，“－”表示该植株DNA小样扩增GUS基因结果为阴性。每株植株接种了2-3片剑叶。b平均病斑面积标准差。cP值结果是通过t-test双样本异方差与野生型中花11比较得到。aThe“＋”indicatesthattheGUSgenedetectionoftransgenicplantwaspositive,and“－”indicatesthatthedetectionwasnegative.Eachplantsinoculatedtwoorthreeleaves.bEachdatarepresentsaveragelesionareastandarddeviation.cEachPvaluewascalculatedbyt-testincomparisonwithsusceptiblewildtypeZhonghua11.45 华中农业大学2016届硕士学位论文图11OsGH3.9-oeT1代超量表达植株在接种白叶枯病菌PXO99后的表型与OsGH3.9的表达量Fig.11PhenotypeofOsGH3.9–oeT1plantsafterPXO99infectionandexpressionofOsGH3.9WT，野生型中花11。病斑面积=平均值±标准差。每个时间点的表达数据来自三个重复。“*”和“**”表示在OsGH3.9超量表达T1转基因家系相比野生型对照中花11在接种PXO99后病斑面积以及目的基因表达量在P<0.05或P<0.01的显著水平上存在差异。WT,wildtypeZhonghua11.Barsrepresentmean±Standarddeviation.One“*”ortwo“**”asterisksindicateasignificantdifferenceinrelativeexpressionlevelandlesionareawasdetectedbetweenOsGH3.9–oeT1plantsandwildtypeZhonghua11atP<0.05orP<0.01,respectively.我们还通过遗传转化得到36株OsGH3.9-RNAi转基因植株，抽提小样DNA用pMCGF/pMCGR引物进行检测，阳性植株有31株。在田间生长过程中，OsGH3.9-RNAi与野生型中花11相比没有明显的表型变化。使用白叶枯病菌菲律宾生理小种PXO99在武汉大田孕穗期接种OsGH3.9-RNAi转基因植株剑叶，于16d后调查发病情况（表4）。野生型中花11的病斑面积为15.9%，转基因阳性植株的发病面积在6.2%和33.7%之间，阴性植株发病面积在10.1%到20.5%之间。根据显著性分析结果，有的阳性植株发病面积比野生型中花11小，有的阳性植株发病面积比中花11大，并没有明确的对应关系。接种调查后取叶片抽提RNA并反转录成cDNA，使用实时定量PCR检测OsGH3.9的表达量，并与接种结果相比对（图12）。结果显示，大部分OsGH3.9-RNAi阳性植株OsGH3.9的表达量低于野生型对照，抑制程度从野生型的10.5%到88.2%不等。但个别阳性植株出现不降反增的超量表达现象，可能是由遗传转化的组织培46 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析养过程或者T-DNA插入位点造成的。联系发病情况，OsGH3.9抑制表达植株有的比野生型对照中花11病斑面积增加，有的比中花11减少，有的不存在统计学意义上的差异，二者之间并没有对应关系。选取OsGH3.9-RNAi-5和OsGH3.9-RNAi-22两个表达量较低的T1代家系，在大田再次进行白叶枯病菌接种鉴定。由于之前使用的白叶枯病菌株PXO99接种中感品种中花11的发病情况不好，病斑面积偏小，因此这次使用本室保存菌株中毒力较强的PXO347菌株对孕穗期剑叶进行接种。中花11对PXO347应当表现为中度感病。接种14d后调查数据，并取样检测OsGH3.9的表达量（表5，图13）。结果显示，野生型中花11的病斑面积为34.1%，符合对该菌株的中度感病表型。OsGH3.9-RNAi-5家系转基因阳性植株的发病面积在48.4%和61.4%之间，阴性植株也有54.7%到60.0%。OsGH3.9-RNAi-22家系转基因阳性植株的发病面积在46.1%和56.7%之间，阴性植株也有44.8%到52.8%。也即是说，转基因植株都表现得更感病。OsGH3.9表达量检测结果显示，与野生型中花11对照相比，表达量显著降低的OsGH3.9-RNAi-5-6只有对照的3.3%，OsGH3.9-RNAi-22-6只有对照的21.5%。前者的病斑面积比野生型显著增加，后者没有显著差异。阴性植株中出现OsGH3.9超量表达的情况，结合T0代的数据，判断这很可能是组织培养过程中产生的变异。综合OsGH3.9超量表达和抑制表达T0代和T1代的表型情况，我们观察到植株株型变化、抽穗期延迟、穗数减少等表型，以及接种白叶枯病菌病斑面积的变化，但这些变化和OsGH3.9的表达量变化没有明确的对应关系，很可能是在遗传转化的组织培养过程中出现的变异。这个推论需要进一步的实验来验证。表4OsGH3.9抑制表达T0代植株（OsGH3.9-RNAi）接种白叶枯病菌PXO99的表型Table4PerformanceofOsGH3.9-RNAiT0plantsafterpathogenXoostrainPXO99inoculationabcRicematerialGUSpositiveLesionarea(%)PvalueZhonghua1115.9±4.1(wildtype)OsGH3.9-RNAi-1＋23.3OsGH3.9-RNAi-2－11.9±4.70.3852OsGH3.9-RNAi-3＋6.2±0.60.0024OsGH3.9-RNAi-4＋11.8OsGH3.9-RNAi-5＋24.4±1.60.009047 华中农业大学2016届硕士学位论文OsGH3.9-RNAi-6＋11.2OsGH3.9-RNAi-7＋7.2±0.40.0038OsGH3.9-RNAi-8－11.2±5.40.2747OsGH3.9-RNAi-9－10.1±2.40.0314OsGH3.9-RNAi-10－20.5OsGH3.9-RNAi-12＋8.4±0.60.0049OsGH3.9-RNAi-14＋8.0±1.70.0081OsGH3.9-RNAi-16＋25.9±2.00.0104OsGH3.9-RNAi-17＋9.8±6.30.4216OsGH3.9-RNAi-18＋10.0±5.40.1886OsGH3.9-RNAi-19＋11.0±8.00.5571OsGH3.9-RNAi-20＋15.4OsGH3.9-RNAi-22＋33.7±5.40.1473OsGH3.9-RNAi-23＋23.0±5.50.3470OsGH3.9-RNAi-24＋15.6±1.10.8644OsGH3.9-RNAi-25－13.2±2.60.2694OsGH3.9-RNAi-26＋14.2±0.80.3748OsGH3.9-RNAi-27＋19.2±1.10.1254OsGH3.9-RNAi-28＋20.2±1.30.0560OsGH3.9-RNAi-29＋18.5±2.40.2554OsGH3.9-RNAi-30＋29.4OsGH3.9-RNAi-32＋21.0±0.80.0288OsGH3.9-RNAi-33＋6.8±1.20.0029OsGH3.9-RNAi-35＋8.5±2.90.0669OsGH3.9-RNAi-36＋17.0±3.10.7257a“＋”表示该植株DNA小样扩增pMCG片段结果为阳性，“－”表示该植株DNA小样扩增GUS基因结果为阴性。部分植株只接种了1片剑叶，其他植株接种了2-4片剑叶。b平均病斑面积标准差。cP值结果是通过t-test双样本异方差与野生型中花11比较得到。aThe“＋”indicatesthatthepMCGdetectionoftransgenicplantwaspositive,and“－”indicatesthatthedetectionwasnegative.Someoftheplantsinoculatedonlyoneflagleaf,whileotherstwoorthree.bEachdatarepresentsaveragelesionareastandarddeviation.cEachPvaluewascalculatedbyt-testincomparisonwithsusceptiblewildtypeZhonghua11.48 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析图12OsGH3.9-RNAiT0代植株在接种白叶枯病菌PXO99后的表型与OsGH3.9的表达量Fig.12PhenotypeofOsGH3.9–RNAiT0plantsafterPXO99infectionandexpressionofOsGH3.9WT，野生型中花11。病斑面积=平均值±标准差。每个时间点的表达数据来自三个重复。“*”和“**”表示在OsGH3.9抑制表达T0转基因家系相比野生型对照中花11在接种PXO99后病斑面积以及目的基因表达量在P<0.05或P<0.01的显著水平上存在差异。WT,wildtypeZhonghua11.Barsrepresentmean±Standarddeviation.One“*”ortwo“**”asterisksindicateasignificantdifferenceinrelativeexpressionlevelandlesionareawasdetectedbetweenOsGH3.9–RNAiT0plantsandwildtypeZhonghua11atP<0.05orP<0.01,respectively.表5OsGH3.9抑制表达T1代植株（OsGH3.9-RNAi）接种白叶枯病菌PXO347的表型Table5PerformanceofOsGH3.9-RNAiT1plantsafterpathogenXoostrainPXO347inoculationabcRicematerialGUSpositiveLesionarea(%)PvalueZhonghua1134.1±7.1(wildtype)OsGH3.9-RNAi-5T1familyOsGH3.9-RNAi-5-1＋48.4±3.60.0069OsGH3.9-RNAi-5-2＋55.7±3.50.0012OsGH3.9-RNAi-5-3＋58.8±9.30.0022OsGH3.9-RNAi-5-4＋50.8±16.90.2448OsGH3.9-RNAi-5-5＋61.4±0.70.0011OsGH3.9-RNAi-5-6＋51.9±11.00.0191OsGH3.9-RNAi-5-7＋60.0±6.20.000349 华中农业大学2016届硕士学位论文OsGH3.9-RNAi-5-8－55.1±4.40.0021OsGH3.9-RNAi-5-9－54.7±12.00.0287OsGH3.9-RNAi-22T1familyOsGH3.9-RNAi-22-1－44.8±5.60.1382OsGH3.9-RNAi-22-2－46.3±4.10.0031OsGH3.9-RNAi-22-3－52.8±3.20.0195OsGH3.9-RNAi-22-4＋56.7±14.20.0869OsGH3.9-RNAi-22-5＋46.1±2.50.0101OsGH3.9-RNAi-22-6＋46.0±4.50.6099a“＋”表示该植株DNA小样扩增pMCG片段结果为阳性，“－”表示该植株DNA小样扩增GUS基因结果为阴性。每株植株接种了3-5片剑叶。b平均病斑面积标准差。cP值结果是通过t-test双样本异方差与野生型中花11比较得到。aThe“＋”indicatesthatthepMCGdetectionoftransgenicplantwaspositive,and“－”indicatesthatthedetectionwasnegative.Eachplantinoculated3-5flagleaf.bEachdatarepresentsaveragelesionareastandarddeviation.cEachPvaluewascalculatedbyt-testincomparisonwithsusceptiblewildtypeZhonghua11.图13OsGH3.9-RNAiT1代抑制表达植株在接种白叶枯病菌PXO347后的表型与OsGH3.9的表达量Fig.13PhenotypeofOsGH3.9–RNAiT1plantsafterPXO347infectionandexpressionofOsGH3.950 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析WT，野生型中花11。病斑面积=平均值±标准差。每个时间点的表达数据来自三个重复。“*”和“**”表示在OsGH3.9抑制表达T1转基因家系相比野生型对照中花11在接种PXO347后病斑面积以及目的基因表达量在P<0.05或P<0.01的显著水平上存在差异。WT,wildtypeZhonghua11.Barsrepresentmean±Standarddeviation.One“*”ortwo“**”asterisksindicateasignificantdifferenceinrelativeexpressionlevelandlesionareawasdetectedbetweenOsGH3.9–RNAiT1plantsandwildtypeZhonghua11atP<0.05orP<0.01,respectively.3.2病原菌激素合成与分泌检测许多微生物都具有合成植物激素的能力。早在上个世纪就有报道，某些病原菌能够合成生长素吲哚乙酸（indole-3-aceticacid,IAA），这些激素能帮助病原菌在侵染植物时增强致病力（ComaiandKosuge1982;Suricoetal1985）。1971年，茉莉酸（jasmonicacid,JA）从真菌Botryodiploiditheobromae培养液中被分离鉴定，现在人们更是利用造成棉花黑果病的病原菌棉色二孢菌（Diplodiagossypina）生产可以用于食品的茉莉酸和茉莉酸甲酯（methyljasmonate,MeJA）（Farboodetal2001）。葡萄灰霉病菌（Botrytiscinerea）能合成脱落酸（abscisicacid,ABA），是脱落酸大规模发酵生产的理想菌种（Marumoetal1982）。为了检测白叶枯病菌和细条病菌是否也能合成并分泌激素，我们用液体培养基培养病原菌至稳定期，取少量菌液进行CFU平板计数，其余菌液离心去除菌体，收集上清液，再抽提检测上清液中的激素含量，以此了解病原菌合成分泌激素的能力。如前文所述，微生物中有依赖色氨酸的IAA合成途径存在，也有不依赖色氨酸的的IAA合成途径存在（Dietal2015）。为了验证病原菌中生长素的合成是否受色氨酸影响，我们增加了1个处理，在液体培养基中添加外源色氨酸来培养病原菌，将此与不加色氨酸的液体培养基对照进行对比。本检测使用的白叶枯病菌菌株为PXO61和PXO99，细条病菌菌株为RH3。检测结果显示，这3种病原菌菌株均能向胞外分泌IAA、茉莉酸和脱落酸（图8）。根据差异显著性分析结果，白叶枯病菌菲律宾生理小种PXO99在添加了外源色氨酸的培养基中IAA的含量是不添加色氨酸的对照的1.9倍。t-测验得到的P<0.05，二者间差异具有统计意义。而白叶枯病菌PXO61和细条病菌RH3在添加了色氨酸的培养基中培养后IAA分泌量差异无统计意义（图14A）。由此推测，菌株PXO99中很可能具有依赖色氨酸的IAA合成路径。51 华中农业大学2016届硕士学位论文茉莉酸是以α-亚麻酸（α-linolenicacid）为前体合成而来的激素，其合成途径称为脂氧酶途径（lipoxygenasepathway），与色氨酸没有直接关系。检测显示在培养基中添加了色氨酸后，白叶枯病菌PXO61和PXO99分泌的茉莉酸与未添加色氨酸的对照相比没有具统计意义的差异，说明外源色氨酸的存在对这两个菌株茉莉酸的分泌没有明显影响。但意外的是，培养基添加了色氨酸后，细条病菌株RH3分泌的茉莉酸出现了统计意义上的差异，添加了外源色氨酸的菌液，其茉莉酸的分泌量只有对照的77.7%（图14B）。脱落酸是一种倍半萜烯化合物，生物体内主要通过类萜途径（terpenoidpathway）和类胡萝卜素途径（carotenoidpathway）合成，这两种途径都与色氨酸无直接关联。t-检验的结果也显示，有无外源色氨酸的存在，3种病原菌菌株分泌到菌液中的脱落酸含量均无统计意义的差异，说明脱落酸的合成分泌与外源色氨酸的存在无明显关系（图14C）。图14水稻病原菌分泌的激素定量检测Fig.14Quantificationofthehormonesecretedbyricepathgens(A)病原菌分泌的生长素定量。(B)病原菌分泌的茉莉酸定量。(C)病原菌分泌的脱落酸定量。Control，马铃薯培养基；20mg/LL-Trp，马铃薯培养基添加终浓度为20mg/LL-色氨酸。52 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析每个数据以平均值（n=3）±标准差表示。一个“*”表示同一个菌株的对照和培养基加入L-色氨酸后，分泌的激素量之间在P<0.05的显著水平上具有差异。(A)QuantificationoftheIAAsecretedbyricepathgens.(B)Quantificationofthejasmonicacidsecretedbyricepathgens.(C)Quantificationoftheabscisicacidsecretedbyricepathgens.Control,potatomedium;20mg/LL-Trp,potatomediumwithin20mg/LL-Tryptophan.Barsrepresentmean(n=3)±standarddeviation.One“*”asterisksindicateasignificantdifferencewasdetectedbetweencontrolandpotatomediumwithin20mg/LL-TryptophanofthesamebacterialstrainatP<0.05respectively.3.3抗病相关基因OsDR10基因的功能分析本实验室肖文斐博士分离克隆得到的一个水稻抗病相关基因OsDR10，它是稻族特有的新基因，其表达量受到抗病基因和病原物侵染的影响，抑制OsDR10的表达可以使植株对白叶枯病的抗性增强（肖文斐，2009）。为了更好地了解和利用该基因资源，本实验通过对OsDR10进行特异性表达检测和酵母双杂交文库筛选，进一步研究该基因功能。3.3.1OsDR10基因的GUS染色结果与分析在本实验的前期研究工作中，肖文斐博士对OsDR10启动子及编码区序列融合β-葡萄糖苷酸酶（GUS）报告基因的转基因材料OsDR10-GUS的不同组织进行GUS染色检测时，发现只有在萌发的种子种皮能观察到GUS的表达。由于种子具有一定厚度，不便于内部组织染色，为了进一步分析确定OsDR10在种子中的表达模式，本实验中将OsDR10-GUS的T1代种子用蒸馏水浸发72h后再切开进行GUS染色（图15）。检测结果显示在种子的切面上，种皮、糊粉层、胚乳、胚等部位均有染成蓝色的区域，说明在这些地方都有OsDR10启动子驱动的β-葡萄糖苷酸酶表达，但表达较弱。考虑到GUS染色检测的灵敏度问题，决定用更精确的方法定性分析OsDR10的表达位点。图15OsDR10-GUS转基因植株T1代种子GUS活性检测Fig.15TheGUSactivityinT1seedsofPOsDR10::OsDR10:GUStransgenicplants53 华中农业大学2016届硕士学位论文POsDR10::OsDR10:GUS在OsDR10-GUS转基因植株T1代种子中的表达。蓝色区域显示GUS的表达。(A)T1代种子GUS染色结果。黑色箭头示意种皮染色。(B)至(E)T1代种子GUS染色后的横切面。其中(C)是(B)方框中的区域，白色箭头示意种皮染色，黑色箭头示意糊粉层染色；(E)是(D)方框中的区域，黑色箭头示意胚染色。(F)和(G)T1代种子GUS染色后的纵切面。其中(G)是(F)方框中的区域，黑色箭头示意胚乳染色。(H)对照。野生型中花11种子的GUS染色结果。POsDR10::OsDR10:GUSexpressioninT1seedsofOsDR10-GUStransgenicplants.ThebluecolorindicatestheexpressionofGUS.(A)AwholeT1seed.Blackarrowindicatesdyeingareasinepisperm.(B)to(E)TransversesectionsofT1seeds.(C)istheboxedregionin(B),whitearrowindicatesdyeingareasinepispermandblackoneindicatesdyeingareasinaleuronelayer;(E)istheboxedregionin(D),blackarrowindicatesdyeingareasinembryo.(F)and(G)AlongitudinalsectionofT1seed.(G)istheboxedregionin(F),blackarrowindicatesdyeingareasinendosperm.(H)Control.Seedofwildtype,cultivarZhonghua11.3.3.2免疫组织化学检测结果与分析为了更精确地定位OsDR10蛋白在水稻中的表达情况，我们采用石蜡切片结合免疫组织化学的方法进行检测。首先使用OsDR10的cDNA序列检索本实验室Affymetrix水稻全基因组芯片数据库（http://crep.ncpgr.cn），检测OsDR10在水稻品种明恢63中的时空表达情况（Wangetal2010）。得到的结果显示材料明恢63中，OsDR10在种子发育及萌发过程中都有很高的表达水平。尤其是在开花前后的生殖器官中和吸涨72h后种子里的表达量比其他生育期的组织高得多（图16）。考虑到成熟的种子制作石蜡切片较为困难，本实验取用明恢63开花前3d、开花后1d、开花后7d的小穗作为实验材料。600500400300Signalofarray200100012345678910111213141516171819202122232425262728RicetissuesofMinghui63图16利用Affymetrix水稻全基因组芯片检测OsDR10基因在水稻明恢63不同组织中的表达信号54 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析Fig.16ExpressionsignalsofOsDR10detectedindifferenttissuesofricecultivarsMinghui63usingAffymetrixGeneChipRiceGenomeArray1浸种72h后的种子。15抽穗前5d的剑叶。2萌发72h后的胚芽和胚根。16抽穗前5d的茎秆。3光照条件下露白48h后的胚芽。174-5cm幼穗期的叶片。4光照条件下露白48h后的胚根。184-5cm幼穗期的叶鞘。5黑暗条件下露白48h后的胚芽。194-5cm幼穗期的幼穗。6黑暗条件下露白48h后的胚根。.20抽穗期的稻穗。7三叶期的叶片和根。21抽穗期的茎秆。82分蘖幼苗的根。22抽穗14d后的胚乳。92分蘖幼苗的芽。23抽穗14d后的剑叶。10二次枝梗原基分化阶段的叶片。24开花前1d的颖壳。11二次枝梗原基分化阶段的叶鞘。25开花前1d的雄蕊。12二次枝梗原基分化阶段的幼穗。26授粉后3d的小穗。13雌蕊和雄蕊原基分化阶段的幼穗。27授粉后7d的胚乳。14花粉母细胞形成阶段的幼穗。28授粉后21d的胚乳。每个数据以平均值（n=2）±标准差表示。1Seedat72hafterimbibiion.differentiationstage.2Embryoandradicleat72haftergermination.14Panicleatpollen-mothercellformationstage.3Plumuleat48hafteremergenceinlight.15Flagleafat5dbeforeheading.4radicleat48hafteremergenceinlight.16Stemat5dbeforeheading.5Plumuleat48hafteremergenceindark.17Leafat4-5cmyoungpanicle.6radicleat48hafteremergenceindark.18Sheathat4-5cmyoungpanicle.7Leafandrootatthree-leafstage.19Panicleat4-5cmyoungpanicle.8Rootatseedlingwith2tillers.20Panicleatheadingstage.9Shootatseedlingwith2tillers.21Stematheadingstage.10Leafatsecondary-branchprimordiumdifferentiation22Endospermat14dafterheading.stage.23Flagleafat14dafterheading.11Sheathatsecondary-branchprimordium24Hullat1dbeforeflowering.differentiationstage.25Stamenat1dbeforeflowering.12Panicleatsecondary-branchprimordium26Spikeletat3dafterpollination.differentiationstage.27Endospermat7dafterpollination.13Panicleatpistilandstamenprimordium28Endospermat21dafterpollination.Barsrepresentmean(n=2)±standarddeviation.本实验使用的第一抗体ADR10是选取OsDR10蛋白中的一段氨基酸序列，人工合成肽段后作为抗原，多次免疫家兔后得到抗血清并经过纯化的多克隆抗体。为确定抗体的特异性，对ADR10进行WesternBlot检测，实验中使用丽春红染液对转膜后的蛋白进行染色，将核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulosebisphosphatecarboxylaseoxygenase,Rubisco)的蛋白条带作为各个样品蛋白转膜量的内参。检测结55 华中农业大学2016届硕士学位论文果显示，OsDR10超量表达的转基因植株OsDR10-oe的叶片总蛋白与抗体杂交后有与OsDR10蛋白大小相符的目标条带，而OsDR10抑制表达的转基因植株OsDR10-RNAi的叶片总蛋白中则无对应条带（图17）。说明抗体的特异性较好，可以用于免疫组织化学的检测反应。图17OsDR10蛋白抗体ADR10的特异性检测Fig.17Thespecificdetectionofanti-OsDR10antibodyADR10OsDR10-RNAi，OsDR10抑制表达转基因植株叶片总蛋白；OsDR10-oe，OsDR10超量表达转基因植株叶片总蛋白。Rubisco，二磷酸核酮糖羧化酶，作为蛋白质总量的内参。OsDR10-RNAi,thetotalproteinofOsDR10-suppressedtransgenicplants’leaves;OsDR10-oe,thetotalproteinofOsDR10-overexpressingtransgenicplants’leaves.Rubisco,Ribulosebisphosphatecarboxylaseoxygenase,asinternalcontrol.免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项实验技术。本实验通过免疫组织化学的方法，检测到在开花前3d的野生型明恢63的花器官中，外颖、内颖、浆片（图18A1），雄蕊的花丝尤其是维管束（图18A3），成熟花药的花粉囊壁、药隔维管束及花粉囊内的花粉粒（图18A5），雌蕊的柱头和花柱（图18A7）等部位中均有OsDR10蛋白的大量表达。在开花后1d的野生型明恢63的雌蕊花柱部分，可以观察到整个花柱，尤其是花柱道周围细胞质浓厚的通道细胞中，OsDR10蛋白的表达量很高。而花柱道内的花粉管则被固绿染料染成绿色，没有检测到OsDR10蛋白的表达（图18B）。有意思的是，在开花前3d的子房横切面中没有检测到OsDR10蛋白的表达，在开花后1d的子房中表达量却上升到一个可观的水平（图18C）。开花后7d的果实材料制作成切片进行免疫反应后，由于胚乳是游离状态，在操作过程中被冲洗掉了，因此没能得到实验结果。56 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析图18OsDR10蛋白的免疫组织化学分析Fig.18TheimmunohistochemistryanalysisofOsDR10protein57 华中农业大学2016届硕士学位论文明恢63花器官中的免疫组织化学检测。黄棕色显示OsDR10的表达。Control，PBS缓冲液取代一抗作为阴性对照。(A)开花前3d的明恢63花器官中OsDR10蛋白的表达情况。示意颖壳、浆片、花丝、花药和柱头的横切面。MH63-A3，开花前3d的明恢63花器官。Le，外颖；Pa，内颖；Lo，浆片；Vb，维管束；Aw，花药壁；Po，花粉；Sy，花柱；Si，柱头。(B)开花后1d的明恢63花柱的横切面。MH63-B1-1和MH63-B1-2，开花后1d的明恢63花器官。Cc，通道细胞；Pt，花粉管。(C)明恢63子房的横切面。MH63-A3，开花前3d的花器官；MH63-B1，开花后1d的花器官。Ow，子房壁；In，珠被；Es，胚囊。TheimmunohistochemistrydetectionofOsDR10infloralorganofMinghui63.Theyellow-browncolorindicatestheexpressionofOsDR10.Control，substitutionofPBSfortheprimaryantibodyservedasanegativecontrol.(A)TheexpressionofOsDR10infloralorganat3dbeforefloweringofMinghui63.TransversesectionsofHull,lodicule,filament,antherandstigmaareshown.MH63-A3,floralorganat3dbeforefloweringofMinghui63.Le,lemma;Pa,pales;Lo,lodicule;Vb,vascularbundle;Aw,antherwall;Po,pollen;Sy,style;Si,stigma.(B)Transversesectionsofstyleat1dafterflowering.MH63-B1-1andMH63-B1-2,floralorganat1dafterfloweringofMinghui63.Cc,canalcell;Pt,pollentube.(C)Transversesectionsofovary.MH63-A3,floralorganat3dbeforefloweringofMinghui63;MH63-B1,floralorganat1dafterfloweringofMinghui63.Ow,ovarywall;In,integument;Es,embryosac.Bars=200μmin(A1)and(A2);Bars=20μmin(A3),(A4)and(B);Bars=50μmin(A5)to(A8);Bars=100μmin(C).3.3.3OsDR10超量和抑制表达植株的种子休眠检测本室Affymetrix水稻全基因组芯片数据库分析结果和GUS染色的检测结果均显示基因OsDR10在水稻种子萌发过程中大量表达。尤其是萌发初期表达量极高，之后逐渐降低，三叶期的根和叶中OsDR10的表达量仅有浸种72h后种子中的表达量的1/6左右（图16）。由此推测该基因可能和种子的萌发特性有关。OsDR10的超量表达材料OsDR10-oe和抑制表达材料OsDR10-RNAi均为明恢63背景，而明恢63的种子本身具有休眠性，一般情况下种子成熟后尚需要2-3月的时间来度过休眠期。种子休眠是指种子成熟后，即使给予适宜的外界条件仍不能萌发的现象，这种现象可以由外界环境温度和湿度的变化而打破（Bewley1997）。因此，我们尝试通过不同的处理，不同程度地打破种子休眠，并统计分析野生型明恢63及转基因材料OsDR10-oe和OsDR10-RNAi的阳性植株T2代种子萌发情况，以探索基因OsDR10对种子萌发的影响。发芽率是指适宜条件下，正常发芽的种子粒数占供发芽的种子总数的百分数，是衡量种子萌发情况的重要指标，习惯上常以80%种子能正常发芽作为通过休眠的标准（黄明和陈立云，2007）。本实验统计了从浸种开始7d内种子发芽的情况，并58 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析计算出发芽率（图19A）。结果表明，浸种7d，除OsDR10-RNAi家系2的种子以外，浸种前经过－20℃冰箱冷冻处理72h后的种子发芽率均高于同家系脱粒后直接浸种的种子。而在冷冻处理后再用37℃温箱烘烤干燥72h过的种子发芽率比起同家系的前两个处理都有明显升高。其中经过冷冻和烘烤处理的野生型明恢63种子和OsDR10-oe家系1的种子，发芽率均超过了80%，可以认为休眠被完全打破。说明－20℃冷冻处理和37℃烘烤处理可以大大打破种子本身的休眠性，使发芽率明显增长。我们通过比较不同家系间的萌发情况，可以发现：与野生型对照明恢63相比，同处理条件下OsDR10-RNAi家系的种子发芽率均明显偏低，而OsDR10-oe家系的种子则略低于或接近野生型。转基因家系种子间进行比较，可以发现OsDR10-oe家系的种子在不同处理下的发芽率均高于对应的OsDR10-RNAi家系的种子。发芽势是指适宜条件下，规定时间内正常发芽的种子粒数占供发芽的种子总数的百分数，是衡量种子发芽速度和发芽整齐程度的指标，表示种子生命力的强弱。本实验统计了从浸种开始3d的种子发芽情况，并计算出发芽势（图19B）。结果表明，浸种7d，除OsDR10-RNAi家系2的种子以外，浸种前经过－20℃冰箱冷冻处理72h后的种子发芽势均高于同家系脱粒后直接浸种的种子。由于OsDR10-RNAi家系2处理2的种子发芽率和发芽势均弱于处理1，可能是该处理种子自身偶然因素造成的，其结果不再列入分析范畴。除OsDR10-oe家系2的种子以外，冷冻处理后再用37℃温箱烘烤干燥72h过的种子发芽势比起同家系的前两个处理都有明显升高。其中经过冷冻和烘烤处理的野生型明恢63种子和OsDR10-oe家系1的种子，发芽势均超过或接近60%，可以认为种子生命力很强。说明－20℃冷冻处理和37℃烘烤处理可以打破种子休眠性，提升种子活力。我们通过比较不同家系间的萌发情况，可以发现：与野生型对照明恢63相比，同处理条件下OsDR10-RNAi家系的种子发芽势均明显偏低，而OsDR10-oe家系的种子则更接近于甚至高于野生型。转基因家系种子间进行比较，可以发现除个别情况外，OsDR10-oe家系的种子在不同处理下的发芽势均高于对应的OsDR10-RNAi家系的种子。以上结果表明，OsDR10抑制表达材料种子，在未进行后熟处理的情况下，萌发能力极低，而打破休眠后发芽率和发芽势显著提高。尽管如此，OsDR10抑制材料的种子在各种处理下，发芽率与发芽势均弱于对照。超量表达材料的种子，其萌发能力的差异主要是未打破休眠时的发芽势上，比对照略高，而发芽率差异不明显。59 华中农业大学2016届硕士学位论文据此我们可以推论，抑制OsDR10的表达会影响种子的后熟过程，维持种子的休眠性，减弱种子的萌发能力。图19不同处理下OsDR10超量表达和抑制表达植株T2代种子的发芽率和发芽势Fig.19GerminationrateandgerminationenergyofOsDR10-oeandOsDR10-RNAiplantT2seedsindifferenttreatments每个家系收获3株阳性植株的混合种子，每个处理使用100粒种子。Treatment1，种子脱粒后马上浸种，泡种72h后，将种子转移到垫有湿润滤纸的培养皿中室温25±1℃，相对湿度100%条件下萌发；Treatment2，种子脱粒后放在－20℃冰箱中冰冻72h后取出，接下来操作如同Treatment1；Treatment3，种子脱粒后放在37℃温箱中烘烤72h后取出，接下来操作如同Treatment2。OsDR10-RNAi，OsDR10抑制表达植株种子；OsDR10-oe，OsDR10超量表达植株种子；WT，野生型明恢63种子。(A)各处理种子的发芽率。发芽率=7d萌发种子数／所有种子数×100%。(B)各处理种子的发芽势。发芽势=前3d萌发的种子数／所有种子数×100%。Everyfamilyharvestedmixtureseedsfrom3positiveplants,andeverytreatmentused100seeds.Treatment1,soakseedsfor72himmediatelyafterthreshing,andthentransferthemtoplateswithinwetfilterpaperforgerminationatroomtemperature25±1℃,Relativehumidityof100%;Treatment2,freezeseedsin－20℃refrigeratorfor72hafterthreshing,andthendoTreatment1aswell;Treatment3,dryseedsin37℃incubatorfor72hafterthreshing,andthendoTreatment2aswell.OsDR10-RNAi,OsDR10–suppressedplantseeds;OsDR10-oe,OsDR10-overexpressingplantseeds;WT，wildtypeMinghui63seeds.60 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析(A)Germinationratesofdifferenttreaments.Germinationrate=sumofgerminatedseedsin7d／sumofallseeds×100%.(B)germinationenergy=sumofgerminatedseedsinfirst3d／sumofallseeds×100%.3.3.4OsDR10蛋白的酵母双杂交文库筛选为了进一步分析OsDR10的基因功能，本实验构建了OsDR10-pGBKT7酵母双杂交载体，用以筛选明恢63成株期剑叶接种白叶枯病菌菲律宾生理小种PXO61后多个时间点（0h,1h,2h,4h,8h,12h,24h,48h）的cDNA酵母双杂交文库。通过自激活活性检测确定，OsDR10本身不具有自激活活性，说明其不是一个具有独立激活活性的转录因子（图20）。该实验中使用OsDR10-pGBKT7载体筛选酵母双杂交文库，得到3个阳性克隆，分别命名为Y2H1、Y2H2和Y2H3。将阳性酵母克隆抽提质粒后转化大肠杆菌，再抽提质粒进行使用T7启动子引物测序。测序结果用BLAST的方法在NCBI的核苷酸数据库GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和MSU的水稻基因组注释数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/）中进行检索。图20OsDR10的酵母自激活检测Fig.20Self-activationdetectionofOsDR10inyeast3个克隆中，第1个克隆Y2H1去除载体序列后长度为321bp，经过检索GenBank后发现与来源于水稻粳稻品种Ilpumbyeo的、长952bp的mRNA序列（注册号：HQ324815）的蛋白质编码区序列（第237-557bp处）同源性高达99%（E值=6e-161），且读码框一致，说明Y2H1所包含的cDNA序列与该表达基因高度同源，是其在籼稻品种明恢63中的等位基因。将Y2H1包含的外源序列检索MSU后，得到该基因的Locus编号LOC_Os05g01710。该基因位于5号染色体，基因全长6261bp，具有3个转录本。各个转录本的蛋白质编码区序列均相同，长度为321bp，编码蛋白质含61 华中农业大学2016届硕士学位论文106氨基酸残基，该蛋白产物是一个转录因子ⅡA的γ亚基（TranscriptioninitiationfactorⅡAsubunit2,TFⅡAγ）。该基因的等位基因即是已经被克隆的白叶枯病菌隐性抗病基因xa5，近年来研究发现xa5对细菌性条斑病可能也具有抗性（Iyeretal2004;Xieetal2014）。在NCBI使用BLASTX工具将Y2H1包含的外源片段按照标准密码子翻译成氨基酸序列检索蛋白质数据库，发现其与日本晴中TFⅡAγ的蛋白序列XP_015640634同源性（identities）为97%（E值=6e-71），相似性（positives）为99%，仅有3个氨基酸的差别（图21）。说明Y2H1是一个xa5在明恢63背景中的等位基因。图21利用Blastx分析克隆Y2H1与其同源蛋白质序列Fig.21SequencecomparisonofY2H1anditshomologbyBlastx加号“+”表示比对的氨基酸残基性质相似。Plussignindicatessimilaraminoacidresidue.第2个克隆Y2H2，去除载体序列后长度为300bp，检索结果表明该段序列即为OsDR10除去终止密码子外的蛋白质编码区，读码框一致。由于该段cDNA不具有终止密码子，因此表达出的蛋白在C末端多出10个来源于载体的氨基酸残基。第3个克隆Y2H3，去除载体后序列长度为352bp,检索GenBank数据库后发现该外源片段第3-330bp的序列与来源于水稻粳稻品种日本晴的、长23012720bp的基因组DNA序列（注册号：AP014965）的一段序列（第6077-6404bp处）100%同源。在RiceGenomeBrowser（http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/）查询水稻9号染色体1-10000bp区域，发现这段区域内目前只发现有两个基因LOC_Os09g00999和LOC_Os09g01000。前者所在区域为2874-5458bp，后者所在区域为6384-9310bp。通过比对发现Y2H3仅有21bp长度的序列与LOC_Os09g01000的5’UTR重合。因此Y2H3目前尚无可以参考的注释分析，无法判断其是否能表达水稻中存在的蛋白质，并与OsDR10蛋白互作。以上结果说明OsDR10蛋白在酵母中可能与明恢63中的xa5等位基因以及其自身互作。但确切的结果还需要进一步实验来验证。62 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析4讨论4.1OsGH3.9可能不参与水稻对白叶枯病菌的防卫反应OsGH3.9是属于水稻GH3家族第二组的成员。目前为止，尚没有关于该基因确切功能的报道。我们在水稻品种中花11中超量和抑制表达该基因，接种病原白叶枯病菌，结果显示与野生型相比照，转基因植株的病斑面积与OsGH3.9的表达量没有明确的对应关系。考虑到许多植株能调查的剑叶病斑数据有限，我们尝试将所有转基因阳性植株的发病数据做平均值，与转基因阴性植株和野生型相比较（图22）。结果显示，OsGH3.9超量表达T0代植株，阳性植株和阴性植株与野生型中花11两两对照，病斑面积均有统计学意义上的差异。OsGH3.9超量表达T1代家系，阳性植株的病斑面积显著高于野生型对照。由于接种时该家系只有阳性植株，所以我们无法得知转基因阴性植株的发病情况。OsGH3.9抑制表达T0代植株，阳性植株和阴性植株的病斑面积与野生型中花11对照，也没有统计学意义上的差异。而抑制表达的T1代家系，阳性植株和阴性植株的病斑面积极显著地高于对照。也就是说，T1代转基因植株病斑面积普遍比野生型更大。这个结果意味着，影响转基因植株对白叶枯病菌防卫反应的很可能是遗传转化过程中引入的其他变异因素，而不是目标基因OsGH3.9。（T0family）（T1family）（T0family）（T1family）图22OsGH3.9转基因阳性植株和阴性植株病斑面积平均值与野生型比较Fig.22TheaveragelesionareasofOsGH3.9transgenicpositiveplantsandnegativeonescomparedwithZhonghua1163 华中农业大学2016届硕士学位论文(A)OsGH3.9-oe转基因阳性植株和阴性植株病斑面积平均值与野生型比较。(B)OsGH3.9-RNAi转基因阳性植株和阴性植株病斑面积平均值与野生型比较。Wildtype，野生型中花11。病斑面积=平均值±标准差。一个“*”或两个“**”表示OsGH3.9转基因阳性或阴性植株病斑面积和野生型比较在P<0.05或P<0.01的显著水平上存在差异。(A)TheaveragelesionareasofOsGH3.9-oetransgenicpositiveplantsandnegativeonescomparedwithZhonghua11.(B)TheaveragelesionareasofOsGH3.9-RNAitransgenicpositiveplantsandnegativeonescomparedwithZhonghua11.Wildtype,Zhonghua11.Barsrepresentmean±Standarddeviation.One“*”ortwo“**”asterisksindicatesasignificantdifferencewasdetectedbetweenOsGH3.9transgenicpositiveplantsornegativeonesandwildtypeZhonghua11atP<0.05orP<0.01,respectively.关于OsGH3.9的具体功能，目前还处于比较迷惑的阶段。有报道指出OsGH3.9会受到光的诱导表达，但也有报道表明在黑暗条件下OsGH3.9的表达量更高（Teroletal2006;Jainetal2006）。据本实验室Affymetrix水稻全基因组芯片的数据显示，OsGH3.9在水稻的花序和根中的表达量远高于叶片中的表达量，而在发育中的种子胚乳中表达较低（Wangetal2010）。同属于水稻GH3家族属于第二组的基因OsGH3.13通常情况下也主要在水稻的花序和根部表达，然而干旱胁迫会诱导该基因的表达，超量该基因能大大提高耐旱能力（Zhangetal2009）。因此我们也可以从这个方向去鉴别OsGH3.9的功能。4.2OsGH3家族的抗病相资源发掘方向GH3家族许多成员作为生长素响应因子之一，以具有催化激素与氨基酸结合的酰胺合成酶能力而闻名（Chenetal2010）。水稻GH3家族第二组基因中，本底表达量较高的OsGH3.2和OsGH3.8已经被证实能通过酰胺合成反应显著降低水稻体内的生长素水平，在水稻与病原互作的过程提供广谱高效的抗性（Dingetal2008;傅晶2010）。我们通过实验发现另一个属于第二组的基因OsGH3.4，其在经外源生长素处理后被诱导表达的情况，以及在抗病品种中受到病原物侵害时会被迅速持久地诱导表达的情况，与OsGH3.2和OsGH3.8极为相似，很可能是另一个能强力正调控水稻抗性的GH3家族基因。水稻GH3家族的第一组基因已经被证实可以参与水稻的抗病反应，超量该组4个基因均可以使水稻对白叶枯病菌的抗性提高，而抑制表达则没有明显表型（郝梦宇2015）。已经有报道证明OsGH3.3和OsGH3.5蛋白有催化茉莉酸和异亮氨酸结合形成酰胺复合物的能力，并且参与水稻的茉莉酸抗病路径（Shinjietal2011）。而64 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析我们的实验结果，外源茉莉酸甲酯处理能够显著地诱导OsGH3.3和OsGH3.5表达，也与这一功能相吻合。该组的OsGH3.3、OsGH3.5和OsGH3.63个基因在外源水杨酸处理时，与水处理的对照相比，均出现了表达量受到抑制的情况。说明这3个基因可能参与的是不依赖于水杨酸的抗病途径。4.3干扰病原菌生长素的合成可以降低其毒性病原菌分泌的生长素能够诱导水稻内源生长素的积累，使植株变得更加感病，抑制这一过程能够赋予水稻广谱抗性（FuandWang2011）。根据我们的实验结果，白叶枯病菌具有依赖色氨酸的生长素合成路径。为了确认PXO99中的生长素合成路径，我们用丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonassyringaepv.syringae）中的iaaH和iaaM序列检索白叶枯病菌的基因组序列，没有找到同源的基因。依赖色氨酸的生长素合成路径中的另一个关键酶腈水解酶（nitrilase,NIT），催化吲哚乙腈（indole-3-acetonitrile）转变为吲哚乙酸（indole-3-aceticacid，IAA）。检索白叶枯病菌中的NIT基因，得到两条序列，一条表达86个氨基酸的蛋白，另一条表达241个氨基酸的蛋白。因此我们推测在PXO99中有由NIT参与的生长素合成路径。这个推论可以通过敲除PXO99体内的NIT基因观察表型来进行验证。OsGH3家族第二组基因OsGH3.8可以通过催化氨基酸结合到生长素上来降低水稻体内的生长素水平，增强水稻对病原菌的抗性。超量表达该基因可以得到明显的抗病效果，但同时由于内源活性生长素的缺乏，导致水稻植株的生长发育受到严重影响（Dingetal2008）。因此，如果可以直接通过干扰病原菌自身的生长素合成来减少植株受到病原菌侵害时的生长素异常积累，将很可能有效地回避激素水平改变对植株生长发育造成的影响。已经有报道表示，在玉米中使用RNAi技术干扰鞘翅目害虫的看家基因，能够有效地控制该类害虫对植株造成的损害（Baumetal2007）。在水稻中也可以考虑使用类似的方法干扰病原菌的生长素合成，降低其对植株的毒性。4.4OsDR10可能通过与抗病基因xa5的等位基因互作参与水稻防卫反应OsDR10的表达模式具有高度的特异性。根据本实验室Affymetrix水稻全基因组芯片的数据绘制OsDR10在水稻品种明恢63、珍汕97及它们的杂交品种汕优6365 华中农业大学2016届硕士学位论文中的表达量热点图，可以看到该基因不光在水稻种子发育和萌发阶段具有极高的表达量，组织培养的愈伤材料中转录丰度也普遍很高，并且在不同的水稻品种中表达量存在差异（图23）（Wangetal2010）。图23利用Affymetrix水稻全基因组芯片检测OsDR10基因在水稻品种明恢63，珍汕97及其杂交品种汕优63不同组织中的表达信号Fig.23ExpressionsignalsofOsDR10detectedindifferenttissuesofricecultivarsMinghui63,Zhenshan97andtheirhybrid(F1)Shanyou63usingAffymetrixGeneChipRiceGenomeArray统观以上OsDR10大量表达的时空特点，不难发现相应时期这些组织中营养物质积累或分解的相关酶类，比如α-淀粉酶（α-amylase）、脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）等活性均处于较高的状态（汪仁等2008；廖登群等2010）。脂氧合酶能够参与到水稻的抗病反应中，并且是茉莉酸合成的重要酶，同时影响水稻种子的成熟和萌发（Pengetal1994;Meietal2006）。肖文斐博士发现OsDR10抑制表达植株接种66 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析白叶枯病菌后脂氧合酶基因LOX表达量降低，并将OsDR10定位在细胞核中（肖文斐2009）。我们通过实验证明抑制OsDR10的表达会影响种子的后熟过程，维持种子的休眠性，减弱种子的萌发能力。用OsDR10的氨基酸序列检索MotifScan数据库（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan），结果显示，OsDR10中有3个可能的蛋白激酶磷酸化位点。因此，我们推测OsDR10蛋白是一个重要的信号分子，可能通过磷酸化作用调控其下游的酶类比如脂氧合酶发挥作用。我们通过筛选明恢63成株期接种白叶枯病菌PXO61的cDNA酵母双杂交文库，得到一个可能与OsDR10互作的蛋白的DNA序列，该序列与基因LOC_Os05g01710高度同源。基因LOC_Os05g01710的蛋白产物是一个转录因子ⅡA的γ亚基（TranscriptioninitiationfactorⅡAsubunit2,TFⅡAγ），近年来研究发现它是一个水稻细条病主效抗病QTLqBlsr5a最可能的候选基因，该基因的等位基因即是已经被克隆的白叶枯病菌隐性抗病基因xa5（Iyeretal2004;Xieetal2014）。这意味着OsDR10可能通过与xa5等位基因的互作来参与水稻对白叶枯病菌的防卫反应。67 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激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析227.YalpaniN,SilvermanP,WilsonTM,KleierDA,RaskinI.Salicylicacidisasystemicsignalandaninducerofpathogenesis-relatedproteinsinvirus-infectedtobacco.PlantCell,1991,3:809-818228.YamamotoKT,MoriH,ImasekiH.cDNAcloningofindole-3-aceticacidregulatedgenes:Aux22andSAURfrommungbean(Vignaradiata)hypocotylstissue.PlantCellPhysiol,1992,33:93–97229.YangY,QiM,MeiC.Endogenoussalicylicacidprotectsriceplantsfromoxidativedamagecausedbyagingaswellasbioticandabioticstress.PlantJ,2004,40:909-919230.YangZ,SunX,WangS,ZhangQ.GeneticandPhysicalmappingofanewgeneforbacterialblightresistanceinrice.TheorApplGenet,2003,106:1467-1472231.YuanB,ShenX,LiX,XuC,WangS.Mitogen-activatedproteinkinaseOsMPK6negativelyregulatesricediseaseresistancetobacterialpathogens.Planta,2007a,226:953-960232.YuanY,ZhongS,LiQ,ZhuZ,LouY,WangL,WangJ,WangM,LiQ,YangD,HeZ.FunctionalanalysisofriceNPR1-likegenesrevealsthatOsNPR1/NH1isthericeorthologueconferringdiseaseresistancewithenhancedherbivoresusceptibility.PlantBiotechnolJ,2007b,5:313-324233.YoshimuraS,YamanouchiU,KatayoseY,TokiS,WangZX,KonoI,KurutaN,YanoM,IwataN,SasakiT.ExpressionofXa1,abacterialblightresistancegeneinrice,isinducedbybacterialinoculation.ProcNatlAcadSciUSA,1998,95:1663-1668234.ZhangF,ZhuoaDL,ZhangF,HuangLY,WangWS,XuJL,VeraCruzC,LiZK,ZhouYL.Xa39,anoveldominantgeneconferringbroad-spectrumresistancetoXanthomonasoryzaepv.oryzaeinrice.PlantPathol,2014,64:568–575235.ZhangJ,PengY,GuoZ.Constitutiveexpressionofpathogen-inducibleOsWRKY31enhancesdiseaseresistanceandaffectsrootgrowthandauxinresponseintransgenicrice.CellRes,2008,18:508-521236.ZhangQ.Geneticsofqualityresistanceandidentificationofmajorresistancegenestoricebacterialblight.InGeneticsandImprovementofResistancetoBacterialBlightinRice(ed.QZhang),2007,pp.130-177.SciencePress,Beijing237.ZhangSW,LiCH,CaoJ,ZhangYC,ZhangSQ,XiaYF,SunDY,SunY.Alteredarchitectureandenhanceddroughttoleranceinriceviathedown-regulationof87 华中农业大学2016届硕士学位论文indole-3-aceticacidbyTLD1/OsGH3.13activation.PlantPhysiol,2009,151:1889-1901238.ZhangZ,LiQ,LiZ,StaswickPE,WangW,ZhuY,HeZ.DualregulationroleofGH3.5insalicylicacidandauxinsignalingduringArabidopsis-Pseudomonassyringaeinteraction,PlantPhysiol,2007,145:450–464239.ZhengZ,QamarSA,ChenZ,MengisteT.ArabidopsisWRKY33transcriptionfactorisrequiredforresistancetonecrotrophicfungalpathogens.PlantJ,2006,48:592–605240.ZhouB,PengK,ChuZ,WangS.Thedefense-responsivegenesshowingenhancedandrepressedexpressionafterpathogeninfectioninrice(OryzasativaL.).ScienceinChina,SerC,2002,45:449-46888 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析附录附录1：部分实验的详细操作程序Protocol1:小样法抽提植物DNA1.取一小片叶片置于研钵中，加700µL1.5倍的CTAB抽提液，研磨致匀浆。2.匀浆转入1.5mL离心管，置于65C水浴30分钟，每隔几分钟摇匀一次。3.加700µL的氯仿/异戊醇（24：1），盖好盖子，轻轻摇离心管30分钟。4.在室温条件下，10000转/分离心10分钟，取上清转入一新1.5mL离心管。5.加两倍体积冰的无水乙醇，置于-20C放置1小时。6.在室温条件下，10000转/分离心10分钟，弃上清。7.加1mL的75%乙醇放置2分钟，弃上清，离心管置于室温吹干。8.加100µL的ddH2O溶解沉淀即可。Protocol2:病原菌分泌的激素抽提1.将保存在－20℃冰箱中的菌液上清取出解冻。2.加入与样品等体积的0.1mol/LHCl酸化，并加入激素内标IAA、ABA、DHJA、NAA每个样品各20ng。在冰上遮光放置。3.使用Waters的Sep-PakVac6cc(500mg)C18Cartridges进行抽提。抽提过程中使用减压过滤装置调节样品通过柱子的速度。4.加入10mL100%甲醇（进口色谱纯试剂）和10mL70%甲醇活化柱子。5.用甲醇加甲酸混合液（6mL100%甲醇+36.67µL96%甲酸）酸化柱子，依次过5mL甲醇、6mL乙醚，5mL甲醇，7mLddH2O，7mLddH2O。6.把样品过柱子（注意抽滤速度不能过快，以液体成滴状流下为宜）。7.7mL15%甲醇清洗柱子。7mLddH2O清洗柱子。8.用约4mL乙醚洗脱激素两次，用10mL离心管收集。9.加入无水硫酸镁吸水处理约10min。10.15℃，1000g离心5min。转移上清。11.用高纯氮气吹干样品。12.溶于200µL-500µL甲醇。避光保存于－20℃冰箱。89 华中农业大学2016届硕士学位论文附录2：在读期间发表论文1.XiaoW,LiuH,LiY,LiX,XuC,LongM,WangS.Aricegeneofdenovooriginnegativelyregulatespathogen-induceddefenseresponse.PLoSOne,2009,4:e46032.FuJ,LiuH,LiY,YuH,LiX,XiaoJ,andWangS.ManipulatingBroad-SpectrumDiseaseResistancebySuppressingPathogen-InducedAuxinAccumulationinRice.PlantPhysiol,2011,155:589-60290 激素在水稻与病原菌互作中的作用机制探索及抗病相关基因OsDR10的功能分析致谢光阴似箭，岁月峥嵘。今天，我在作物遗传改良国家重点实验室的学习与工作将要画下一个句点。回首漫长而艰辛的研究生生活，我的每一分进步与成长都离不开各位老师、同学和亲友的支持、关心与帮助。请允许我向你们表达发自内心的谢意！首先我要真诚地感谢我的恩师王石平教授。从我进入实验室攻读研究生起，王老师一直给予我亲切的关怀和悉心的指导。她以身作则，用渊博的学术知识、敏锐的科学眼光、严谨的科研精神、执着的科学追求不断激励和感召着我；她爱生如子，用无微不至的嘘寒问暖、始终如一的包容耐心不断鼓舞和温暖着我。在此，我谨致上最诚挚的敬意和最衷心的感谢！感谢课题指导小组的张启发院士、熊立仲教授、罗杰教授、吴昌银教授、练兴明副教授在课题思路进展和实验设计中的指导和帮助；感谢李香花老师、徐才国教授和张庆路老师在引物和试剂订购及田间管理上的指导与帮助；感谢宋华芝老师在测序和荧光显微镜操作上提供的帮助；感谢肖景华老师为论文答辩给予的帮助；感谢刘亚萍、苏欣等师傅在试剂领取和引物订购以及组培上提供的帮助。感谢我的师兄丁新华博士、师姐肖文斐博士在实验技能和实验思路等科研入门的方方面面提供的指导和帮助。感谢师兄张海涛博士在日常实验中无私地为我解答疑难、提供帮助。感谢赵晶、陶增、沈祥陵、叶海燕、袁猛、傅晶、李弘婧、肖俊、袁婷、刘洪波、胡珂鸣、柯应根、段柳、成洪涛、寇艳君、高觉婧、刘沁松、邓勇、郭凯、李伟、李治华、曹剑波、马海港、李娜、刘艳艳、杨泽宇、代喆、毛伟华、赵军伟、洪晗鸣、马羚、程奇、黄仁艳、张标明、陈洁、张杰、夏钒、朱萌萌、惠述刚、谢文亚、康元戎、马福泽、张珍珍、王培伦、艾超仁、唐贵林、张猛等同学在实验与生活中给予我的帮助和启发。我还要感谢我的父母、家人和朋友，你们对我不变的支持、开导和生活上的帮助与慰籍，是我坚持到底的力量源泉。本研究得到国家自然科学基金和国家水稻功能基因组重大专项的资助，在此表示感谢。91
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