鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究

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学校代码：学号：２０５２３３０５０１４士学位论文ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶ（专业学位）鞘内注射慢病毒ＬＶ－ＳＯＣＳ３过表达ＳＯＣＳ３缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究ＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌＶ－ＳＯＣＳＳ３ｉｎｅｃｔｉｏｎｏｎａｉｎｂｅｈａｖｉｏｒｓｉｎａｒａｔｍｏｄｅｌｏｆｂｏｎｅｃａｎｃｅｒＬｊｐ研究生姓名王迪煜指导教师姓名蒋国堇勤专业名称普通夕外科学研究方向甲状腺乳腺疾病所在院部苏州大学附属第二医院论文提交日期２０１７年５月 苏州大学学位论文独创性声明，独立本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下进行研宄工作所取得的成果，本论文。除文中己经注明引用的内容外不含其他个人或集体己经发表或撰写过的研宄成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料？对本文的研宄作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明？本人承担本声明的法律贵任。Ｏ，、Ｓ■＾被日期论文作者签名：Ｉ：＞丫＇） 苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集，、保存和使用学位论文的规定即：学位论文著作权归属苏州大学Ｄ本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心）、、中国科学技术信息研宂所（含万方数据电子出版社中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被査阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文□本学位论文属在年＿月解密后适用本规定。非涉密论文口：曰期．９论文作者签名：Ｗ、导师签名“ｆｉ日期：名ｊｊ 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究中文摘要目的探索鞘内注射慢病毒（LV-SOCS3)过表达细胞因子信号转导抑制蛋白3（suppressorofcytokinesignaling3，SOCS3）对骨癌痛大鼠疼痛行为的影响及分子机制。方法1.骨癌痛模型的建立：采用180-220gSD雌性大鼠，胫骨内注射大鼠乳腺癌Walker256细胞建立骨癌痛大鼠模型（CIP），另以等体积生理盐水注射于大鼠胫骨内同期建立骨癌痛大鼠模型对照组。2.过表达SOCS3：造模1周骨癌痛大鼠，取6只鞘内注射LV-SOCS3，另外6只鞘内注射慢病毒LV-SOCS3以增加SOCS3的表达；运用WesternBlotting方法验证大鼠DRG（背根神经节）中SOCS3过表达效果。3.过表达SOCS3的研究：行为学方法分别检测对照组、模型组、LV-SOCS3组及LV-NC组大鼠的机械性缩足反射阈值(PWT)、热刺激后爪退缩潜伏期(PWL)。蛋白质印迹法分别检测4组大鼠L2-L5背根神经节（dorsalrootganglion,DRG）中SOCS3、核转录因子（NF）-κB及P2X3受体的表达。结果1.骨癌大鼠表现出明显的机械痛敏和热痛敏，PWT和PWL显著降低；L2～L5DRG中SOCS3蛋白表达降低；2.鞘内注射LV-SOCS3后1周，骨癌大鼠的PWT和PWL值无明显变化，2周时PWT和PWL值明显升高（均P＜0.05）。3.鞘内注射LV-SOCS3后1周，可上调SOCS3在L2-L5DRG中的表达，同时降低NF-κB的蛋白表达，但P2X3受体表达无明显改变；鞘内注射LV-SOCS3后2周，可使NF-κB的表达维持低水平，同时降低了P2X3受体的表达。I 结论骨癌痛大鼠鞘内注射LV-SOCS3可通过调节NF-κB与P2X3受体的表达缓解骨癌痛。关键词：骨癌痛；细胞因子信号转导抑制蛋白3；P2X3受体；核因子-κB作者：王迪煜指导教师：蒋国勤II MolecularmechanismsunderlyingtheeffectofintrathecalLV-SOCS3injectiononpainbehaviorsinaratmodelofbonecancerAbstractObjective：Toinvestigatetheeffectsofsuppressorofcytokinesignaling3(SOCS3)overexpressionbyintrathecalinjectionlentiviral(LV)-SOCS3onthepainbehaviorsandmechanismresearchinaratmodelofbonecancerpaininducedbybreastcancercells.Methods:Ratswereinjectedwithbreastcancercellstoestablishthemodelsofbonecancerpainandcontrolratswereinjectedwithequalvolumeofnormalsaline(NS).SixmodelratsweretreatedbyintrathecalLV-SOCS3injection,andtheothersixratsweretreatedbyintrathecalinjectionofLV-NCafteroneweekofcancercellsinjection.Thepawwithdrawallatency(PWL)tothermalstimulationandpawwithdrawalthreshold(PWT)tovonFreyfilamentstimulationwerecarriedoutoncontrolgroup,bonecancergroup,LV-SOCS3groupandLV-NCgroup.WesternblottingwasperformedtodetectchangesofSOCS3,NF-κBandP2X3receptors(P2X3R)atproteinlevelsinL2-L5dorsalrootganglion(DRGs)indifferentgroups.Results:Allratspresentedevidentmechanicalandthermalhyperalgesiaafterintra-tibialinjectionofbreastcancercells,whosePWTandPWLwerelowerthanthoseofcontrolgroup.TheproteinlevelofSOCS3wasobviouslyreducedinbonecancergroup.ThePWTandPWLwerehigherthanthoseofLV-NCgroupattwoweeksafterintrathecalinjectionofLV-SOCS3butnotatthetimeofoneweekafterinjection.SOCS3couldbesignificantlyincreasedandNF-κBreducedinL2-L5DRGsatoneweekafterintrathecalLV-SOCS3injection,butnochangeinP2X3Rproteinlevelwasobserved.AttwoweeksafterintrathecalinjectionofLV-SOCS3,theproteinlevelofNF-κBwasmaintainedatlowlevelandP2X3Rproteinlevelwasalsosignificantlyreduced.Conclusion:IntrathecalinjectionofLV-SOCS3couldmodulatetheexpressionofNF-κBandP2X3Rinbonecancerpainrats,andthealleviationofbonecancerpainmaybeachievedbyregulatingtheexpressionofP2X3R.III 【Keywords】bonecancerpain;suppressorofcytokinesignaling3;P2X3receptors;NF-κBWrittenbyDiyuWangSupervisedbyGuo-QinJangIV 目录第一章引言.........................................................................................................................1第二章材料与方法...........................................................................................................3一、实验对象....................................................................................................................3二、主要试剂....................................................................................................................3三、动物麻醉用试剂........................................................................................................4四、主要仪器....................................................................................................................4五、实验方法....................................................................................................................55.1骨癌痛模型的建立..................................................................................................55.2行为学实验...............................................................................................................65.3背根神经节相关蛋白表达测定..............................................................................75.4统计学处理..............................................................................................................9第三章实验结果.............................................................................................................103.1骨癌痛模型大鼠PWT和PWL明显降低，L2-L5DRG组织中SOCS3的表达降低。..........................................................................................................................................103.2鞘内注射慢病毒对骨癌痛大鼠PWT和PWL的影响...........................................113.3鞘内注射LV-SOCS3一周后可以在DRG水平上调SOCS3的表达，降低NF-ΚB的蛋白水平，而对P2X3R的表达无明显影响。........................................................133.4鞘内注射LV-SOCS3后2周时可降低NF-ΚB及P2X3R表达.............................13第四章讨论.....................................................................................................................15参考文献.............................................................................................................................17第五章结论与展望.........................................................................................................21综述.................................................................................................................................22参考文献..........................................................................................................................27攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文.........................................................29致谢.................................................................................................................................30 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究第一章引言第一章引言乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤[1]，全世界每年约140万新发病例[2]。鉴于乳腺癌的恶性生物学行为特征，其转移具有器官选择性，约70%会发生骨转移[3]。早在1889年Paget[4]就提出了骨病变与乳腺癌之间可能存在联系，并观察到“乳腺癌的骨病变具有特殊性，不能用任何栓塞理论解释”。乳腺癌骨转移的机制非常复杂，与乳腺癌细胞及发生骨转移的骨骼都有关联。有文献资料[5-7]表明，肿瘤细胞可直接破坏或合成骨，在晚期肿瘤中，肿瘤细胞的直接浸润作用可能是引起骨病变的主要原因。骨转移的进展可干扰骨重塑，包括破骨细胞的数量过度增多和过度的破骨细胞活动导致骨破坏[8]。红骨髓内血流量高，血液中大量黏附分子黏附在乳腺癌细胞上，同许多细胞因子共同促进骨转移的发生。此外，各种生长因子亦参与骨转移的发生[9]。核因子κB（NF-κB）受体激活剂配体诱导破骨细胞生成，它是肿瘤坏死因子家族中的成员之一，由骨髓基质细胞和成骨细胞产生[8,10]。破骨细胞及其前体上具有NF-κB受体，随着NF-κB与受体结合破骨细胞生成增加，同时破骨细胞的活性也得到增强[11]。导致乳腺癌发生骨转移的相关因子的机制，尚不完全清楚，但目前是一个活跃的研究领域[12]。总而言之，乳腺癌的骨转移是一个极其复杂精细的多步骤过程。骨是乳腺癌最常见的转移部位[13]。研究发现，有50%以上的晚期乳腺癌的首发转移部位为骨[14]。大约有50%以上的乳腺癌骨转移患者会发生骨相关事件，其严重影响了患者的生活质量，甚至导致截瘫和死亡[14,15]。就目前诊疗情况而言，乳腺癌患者由于有一个较长的中位生存期，因此，骨转移发生率可达70%[1]。腺癌患者面临居高不下的骨相关事件风险，即难控性骨癌痛、病理性骨折、脊髓压迫、恶性高钙血症等并发症[1]。特别是骨癌痛，骨癌痛是乳腺癌骨转移最常见、也可以是最早出现的临床症状。癌症疼痛从生理、心理、精神及社会等方面不同程度降低肿瘤患者的生活质量。因此，降低骨相关事件发生率在乳腺癌骨转移预防及治疗中尤为重要。同时，在评估乳腺癌长骨（肱骨、股骨及胫骨）转移患者的治疗时机时，鉴别疼痛是否与负重有关、休息时是否缓解是非常重要的，这可以作为发生病理性骨折可能性的预测指标[16]。虽然近年来有一些靶向治疗的手段逐渐涌现，但是总体来说这些治疗手段都未能使患者得到总生存的获益且疗效也较为有限。从乳腺癌骨疼痛的分子机制1 第一章引言鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究入手，寻找有效的预防、诊断、治疗及预后预测的新的分子靶点已然成为如今的当务之急。嘌呤类受体P2X3R是一类对胞外腺嘌呤核苷酸敏感的受体[17]，主要选择性地表达在中、小型背根神经节（dorsalrootganglion,DRG）和三叉神经节神经元[18]，广泛参与炎性痛、神经病理性疼痛以及内脏痛敏的发生[19,20]。Wu等[21]报道了P2X3R在骨癌痛模型DRG组织中表达升高，且腹腔注射P2X3R高效拮抗剂可以缓解骨癌大鼠的痛觉过敏。NF-κB是NF-κB/Rel蛋白家族成员之一，是细胞核内重要的转录调节因子，不仅参与机体免疫、炎症、组织损伤修复和胚胎发育等过程，还可以调节凋亡相关基因的表达，更有文献报道NF-κB与疼痛的发生发展有密切关联[22-24]。近来有研究表明，NF-κB在骨癌痛模型胫骨特异性DRG中表达明显上调[25]，应用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)能明显减轻骨癌引起的痛觉高敏[26,27]。而NF-κB参与癌痛的发生发展可能与调控P2X3R表达有关，抑制NF-κB相关信号通路可显著降低P2X3R蛋白表达水平同时升高骨癌痛模型中大鼠的疼痛阈[28]。细胞因子信号转导抑制蛋白（suppressorofcytokinesignaling3，SOCS3）是一类被活化的细胞因子招募的胞内蛋白，亦为细胞因子信号传导负调控蛋白家族的成员之一。目前研究发现，SOCS3表达缺失或减少可能是导致恶性肿瘤发生的重要原因之一[29]。SOCS3也被报导参与多种炎性痛，参与多种疼痛的调控，如关节炎性痛[30]、神经病理性痛[31]，是疼痛发生发展过程中重要的调控分子。而骨癌痛这一复杂慢性痛既包含了炎性痛又包含了病理性痛，所以我们推断：SOCS3在骨癌痛这一癌性痛的发生发展中起着相关作用。同时，近年来，SOCS3在肿瘤发生发展中的研究也有相关报导，如BecerrilJ等发现SOCS3在乳癌组织中低表达[32],YenMC等发现升高的SOCS3可以促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡[33]。此类证据表明SOCS3与乳腺癌的发生与进展有一定的关系，加之SOCS3又参与了炎性痛及病理性疼痛发生发展的调控，综合上述文献报道，我们猜想SOCS3可能参与了乳腺癌骨转移引起的骨癌痛的调控，并且是一个很重要的调节分子。但其对骨癌痛发生、发展的影响及作用机制尚未阐明，有待进一步明确。因此，本研究主要观察过表达SOCS3对骨癌痛大鼠疼痛行为反应的影响，并初步探讨其是否通过调控NF-κB-P2X3R该信号通路而实现调控作用。2 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究第二章材料与方法第二章材料与方法一、实验对象成年雌性Sprague-Dawley大鼠，6~8周龄，体重180~200g，由苏州大学实验动物中心提供。4只/笼饲养，通风良好，湿度50-60％，室温22℃，12小时光照循环（7:00-19:00），自由摄取水和食物。实验前，动物在饲养环境中提前适应三天。二、主要试剂1)LV-SOCS3慢病毒（慢病毒序列：5-ggtaagcctatcctaaccctctcctcggtctcgattctacg-3）及对照组LV-NC慢病毒（慢病毒序列：5-ttctccgaacgtcacgtttc-3）（上海吉玛制药技术有限公司合成并验证）2)裂解缓冲液：裂解液（LysisBuffer），100×蛋白酶抑制剂（ProteaseInhibitorcocktail）（上海博彩生物科技有限公司）。3)0.5mol/LTris-HClBufferpH6.8：称取Tris3.01g加入40mL水中溶解，用浓HCl调pH至6.8，双蒸水定容至50mL，4℃冰箱保存。4)1.5mol/LTris-HClBufferpH8.8：称取Tris9.03g加入到40mL水中溶解，全部溶解后调pH至8.8，用双蒸水定容至50mL，4℃冰箱保存。5)30%储备胶溶液：丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺1g，加ddH2O至100ml，滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。6)APS(10%)：取0.1g过硫酸铵加双蒸水1mL，震荡溶解，置于Ep管中，4℃保存。7)SDS-PAGE的凝胶配制30％储备胶溶液：丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺1g，加ddH2O至100ml，滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。8)SDS-PAGE的凝胶配制溶液10%分离胶4%分离胶去离子水(mL)4.13.030％Acr/Bis溶液(mL)3.30.710%SDS(mL)0.10.1pH6.8Tris-HClBuffer(mL)01.25pH8.8Tris-HClBuffer(mL)1.25010%APS(μL)6025TEMED(μL)13203 第二章材料与方法鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究9)Tris-Gly电泳缓冲液：母液：取Gly144g，Tris30.3g，10gSDS，双蒸水溶解，定容至1000mL，调pH至8.3；工作液：取母液100mL，加双蒸水定容至1000mL。10)转膜缓冲液：Tris5.8g，Gly2.9g，SDS0.37g，甲醇200mL，加双蒸水定容至1000ml。11)丽春红S染料溶液：丽春红S2g，磺基水杨酸30g；三氯乙酸30g，加双蒸水水定容至100mL。12)洗涤缓冲液(TBST)：Tris3g，NaCl8g，KCl0.2g，0.5%Tween，双蒸水定容至1000mL，调pH至7.2~7.3。13)封闭液：称取5g脱脂奶粉，溶于100mL的TBS中，搅拌混匀14)抗体稀释液：1g脱脂奶粉溶加到100mL的TBS中，溶解混匀，过滤。15)BCA蛋白测定试剂盒：购自于碧云天公司。16)一抗：anti-SOCS3（SantaCruzBiotechnology）1:500；NF-κB抗体（SantaCruzBiotechnology）1:100；P2X3R抗体（美国Neuromics公司）1:1000；β-肌动蛋白（Sigma公司）1:1000，二抗：山羊抗兔IgG，1:4000（联科生物）；山羊抗小鼠IgG，1:4000（联科生物）。17)PVDF膜：购自Millipore公司。18)TEMED：购自USB公司。19)PBS缓冲液（pH7.2―7.4）2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH6.0,1000ml）。20)标准分子量蛋白marker：购自Fermentas公司。21)StrippingBuffer(一、二抗去除液)：购于Beyotime公司。三、动物麻醉用试剂3.6%水合氯醛：用超微量天平称取3.6g水合氯醛(批号：P8765,SigmaAldrich)，加100mL生理盐水，溶解。成年大鼠注射剂量为1mL/100g，腹腔注射。四、主要仪器⑴双足平衡仪批号：PH-200,泰盟vonFrey纤维丝测痛仪Stoelting,UAS热辐射测定仪IITC390,IITClifescience,USA电热恒温水浴锅批号：DK-S22，上海精宏数字式PH酸度剂Sartorius赛多利斯公司4 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究第二章材料与方法Centrifuge5417R高速冷冻离心机德国Eppendorp公司蛋白电泳及转移仪美国Bio-Rad公司超纯水系统美国MilliporeDY-B1型脱色摇床江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司封口膜机温州市兴业机械设备有限公司五、实验方法5.1骨癌痛模型的建立5.1.1.实验准备：器材与溶液：细胞计数板、显微镜、冰盒、无菌手术刀及刀片、大鼠剃刀、微型血管钳、有齿镊、5ml注射器、10uL微量注射器2支、离心机、8号注射器针头2支、1.5mlEp管若干、医用纱布、去离子水、冻存的肿瘤腹水、细胞培养用PBS、3.6%水合氯醛。5.1.2．腹水肿瘤细胞的扩增与传代：大鼠Walker256乳腺癌细胞由苏州大学神经科学研究所免费提供。从液氮中拿出7肿瘤腹水细胞，在37℃水浴锅里复苏3-5min后，用5ml注射器取1mL（约1×10肿瘤细胞）注射于60-80g左右SD雌性大鼠的腹腔内，正常饲养。约七日后，可见大鼠腹部膨隆，选择腹水性状良好的大鼠（细胞生长情况良好的细胞株的腹水颜色为清亮色，且无血性腹水），无菌操作抽取腹水0.5ml，将抽取好的腹水放置在冰面上，备骨癌痛模型的建造；取剩余腹水，继续注射于60-80g左右SD雌性健康正常大鼠的腹腔内以传代。5.1.3.造模用肿瘤细胞的制备：以1：2的比例将抽取的腹水肿瘤细胞和1×PBS在冰上稀释并混匀，洗涤肿瘤细胞：离心机1000rpm下离心5min，弃上清，PBS液定容至5mL，充分混合均匀，取出0.5ml细胞悬液，加入到4.5mlPBS中，混匀至5ml(稀释至10倍);再从中取出2.5ml悬液，加2.5PBS，至5ml混匀(稀释20倍);吸1滴至细胞计数板上，吸取少许肿瘤细胞悬液在显微镜下计数。计数过程：将计数专用的盖玻片放置在细胞计数板中央；用玻璃虹吸管吸取细胞，在盖玻片上或下侧的计数板凹槽处注入悬液，直至盖玻片被液体均匀充满；置于5 第二章材料与方法鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在下线和右线者，对于小4的细胞团按单个细胞计数；细胞密度=（4个大格细胞总数/4）×10×20个/ml，8计数结束后，1000rpm离心去上清；加入适量的PBS液稀释，使细胞密度达到1×10个/mL，冰上备用。5.1.4建立大鼠骨癌痛模型：根据文献报道方法建立骨癌痛大鼠模型[34]，用3.6％水合氯醛按1mL/100g剂量腹腔注射麻醉实验组大鼠，麻醉成功后，将膝关节处毛剃掉备皮；弯曲大鼠膝关节，可见胫骨端白色的膑韧带；用酒精棉球消毒膝关节，将5mL注射器针头沿与胫骨平行方向从膑韧带下方的胫骨干骺端刺入胫骨骨髓腔;吸取1µL空气+1µL明胶溶液+1µL空气+4µL肿瘤细胞+1µL空气,共计8µL；循前面已穿刺好的孔插入胫骨骨髓腔，深约1.5-2cm，缓慢将微量注射器中的肿瘤细胞注入，以眼睛看到液面下降为准，待注射至明胶溶液时边缓慢注射边缓慢拨针，对照组按上述方法注入4µLNS。待针完全拔出后，用酒精棉球搽拭穿刺口处进行消毒，外涂红霉素眼膏防止感染。待大鼠完全苏醒后送回动物房，所有操作均遵循无菌操作规范。5.1.5.药物鞘内注射取造模后１周的大鼠，水合氯醛麻醉大鼠成功后，剃除背部腰椎处毛备皮。用10ul9微量注射器分别吸取LVSOCS3或LVNC10µL（1×10），吸取LV-SOCS3或LV-NC,于L4-5椎间隙进针，当大鼠出现甩尾动作时，将病毒推至脊髓腔内。5.2行为学实验5.2.1机械性缩足反射阈值（PawWithdrawalThreshold,PWT）的检测用vonFrey（0.4g-15.0g）细丝针测定大鼠的机械性缩足反射阈值（pawwithdrawalthreshold,PWT）来评价大鼠机械性诱发痛。用vonFrey细丝以up-and-down法推算50%缩足阈值：22cm×12cm×22cm有机玻璃箱置于金属筛网上，大鼠在此有机玻璃箱内适应30min后用VonFrey细丝垂直刺激大鼠后肢手术侧足底皮肤凹陷处，细丝弯曲一半并持续时间不低于5s，当大鼠出现抬足或舔足行为时则为阳性反应，反之为阴性反应。从6g开始测定，当某一大小力度的刺激不能引起阳性反应时，则给予相邻的大一6 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究第二章材料与方法级力度的机械刺激；反之，如出现阳性反应则给予相邻的小一级力度的机械刺激，如此连续进行，直至出现第1次阳性反应和阴性反应的交界值，再连续测定4次，每次间隔3min。最终，将在五次连续针刺中三次以上阳性反应的最低强度定为该只大鼠的PWT的阈值。为了避免实验中对受测试大鼠的足底造成损伤性刺激，设定15g为最大强度。用公式Logthreshold=Xf+k×d换算出痛阈（见表一）。所有的行为学实验均在双盲的条件下测定。表一、VonFreyfilament机械痛阈换算表（单位：g）FreyfilamentForce(g)Logthreshold(g)81.01.6191.41.98102.02.74114.04.87126.07.37138.011.42141015.76151520.00162626.005.2.2热缩足反射潜伏期(pawwithdrawallatency,PWL)的检测热辐射法通过测定大鼠的热缩足反射潜伏期（pawwithdrawallatency,PWL）来测定模型大鼠的热痛阈。将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，受测定的大鼠提前在玻璃箱中适应30min，按Hargreaves法用热刺激仪照射大鼠足底。从照射开始至出现抬足回避时为热缩足反射潜伏期（PWL）。为防止组织损伤，将自动切断时间设置为20s。每只大鼠重复测定5次，每次间隔最少3min，PWL值为后3次平均值。所有的行为学实验均在双盲的条件下进行5.3背根神经节相关蛋白表达测定5.3.1.胫骨特异性DRG组织的急性分离大鼠(n=8)断头处死后，迅速用剪刀分离腰段L2至L5脊椎，立即于冰冻解剖液中冲洗2～3遍，置于氧饱和的解剖液冰水中。沿脊椎中间上下切开，轻轻剥去脊髓，从椎骨间隙中轻轻挑出完整的L2-L5段DRG，修剪，除去DRG上的纤维及覆盖的被膜。放于冻存管内保存于-80℃冰箱内以备用。5.3.2蛋白质印迹法检测DRG内相关蛋白（SOCS3、NF-κB、P2X3R）的表达7 第二章材料与方法鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究1)蛋白提取及浓度测定：从-80℃冰箱中取出标本，放在冰上融化，将组织放入研磨器中，加入裂解液（1g组织加入10ml的细胞裂解液和100ul的蛋白酶抑制剂），后装入离心管，放入离心机，4℃15000rpm离心30min，然后取上清，存放于-20C冰箱备用。用BCA蛋白测定试剂盒测蛋白浓度（参照试剂盒说明书）：在96孔板中加入已提取的蛋白样本，并按照浓度梯度加入标准蛋白。而后将96孔板封盖放入烘箱（37°C）静止反应30min。取出96孔板，放入酶标仪测量吸光度值，波长选择562nm。根据测得的吸光度值的计算蛋白浓度。2)蛋白变性：在EP管中加入20g蛋白和蛋白上样缓冲液（根据蛋白浓度算出加样的蛋白体积：缓冲液体积=4:1），放入水浴锅中，水温75°C，时间10min。ultrapure10ml30%Acy:BisGelbuffer10%SDS10%APSTEMEDwater4%6.11.3(pH6.8)2.50.10.10.00512%3.44.0(pH8.8)2.50.10.10.0053)制胶和电泳：根据需要配置12%分离胶，用超纯水压线，凝固大约30分钟待分离胶凝固后，倒掉超纯水，并用滤纸吸净超纯水后将4%积层胶加满整个gelcassette，绿色梳子斜插入。待积层胶凝固后取下，放入电泳槽后倒入Runningbuffer并拔出绿色梳子，开始加入样本，记录加样的顺序。加入样本结束后，接好电极开始跑电泳，电压初始设定为80V。Maker分层后即恒压110V维持，待样本全部进入Runningbuffer后电泳结束。4)转膜：将Transbuffer放入-80°C冰箱，以出现冰花为标准。适当大小的PVDF膜放入无水甲醇中浸泡。取出Transbuffer倒入解剖盘中，放入架子，白色板在下，依次铺上海绵—滤纸—PVDF膜—胶—滤纸—海绵，扣好夹子制成“三明治”。将其放入转膜槽中，倒入Transbuffer，接好电极，开始转膜。转膜槽放在有冰水混合物的水盆中，恒流200mA维持3小时。5)封闭抗体：转膜结束后从三明治中取出，放入5%脱脂牛奶封闭液中，放在摇床上，速度70转/分，时间为2小时。6)剪膜和洗膜：将封闭好的膜取出，根据目的蛋白的分子量将膜剪开，分开放置后用配好的TBST清洗。清洗3次，每次15分钟。7)孵育一抗：洗膜结束后，放入备好的自封袋中，加入anti-SOCS3（SantaCruzBiotechnology）；NF-κB抗体（SantaCruzBiotechnology）；P2X3R抗体（美8 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究第二章材料与方法国Neuromics公司）；β-肌动蛋白（Sigma公司），封口机封口。正面朝上平放于摇床上，转速60转/分，时间2小时。随后放入4°C冰箱过夜。次日从冰箱中取出，TBST洗膜，方法同上。8)孵育二抗：将洗好的膜放入备好的自封袋中，加入适量山羊抗兔二抗稀释溶液（1:5000）封口机封口。正面朝上平放于摇床上，转速60转/分，时间2小时，TBST洗膜，方法同上。9)发光：孵育过二抗的膜放入凝胶成像系统的载物台上，加入适量按ECLA液：ECLB液=1:1的比例准备的ECL发光液，以不溢出膜表面为宜，运用凝胶系统软件自动拍摄照片。10)图像分析：运用凝胶图像ImageJ软件（NationalInstitutesofHealth,USA）分析目标条带的净光密度值，即目的蛋白表达量需要与相应的内参GAPDH进行标准化。5.4统计学处理行为学和分子学检测结果以mean±SD表示，应用OriginPro8(OriginLab,US)和SPSS17.0软件进行数据分析，两样本统计用Student’st检验，弗里德曼方差分析或沃利斯方差分析和Tukey的回顾性检验用于多样本间的比较分析，所有数据统计前先行正态分布检验，P<0.05被认为具有统计学差异。9 第三章实验结果鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究第三章实验结果3.1骨癌痛模型大鼠PWT和PWL明显降低，L2-L5DRG组织中SOCS3的表达降低。建模后1周时骨癌大鼠PWT值和PWL值均明显下降（均P＜0.05）。见图1。蛋白质印迹检测结果显示，建模后两周，在L2-5DRG组织中，骨癌组SOCS3蛋白表达水平明显低于正常对照组（p＜0.05）。n=6；*：P<0.05图1骨癌痛模型大鼠PWT、PWL显著降低10 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究第三章实验结果n=4；*：P<0.05图2骨癌痛模型大鼠在建模后2周时腰椎背根神经节SOCS3的表达3.2鞘内注射慢病毒对骨癌痛大鼠PWT和PWL的影响对造模后一周的骨癌大鼠鞘内注射LV-SOCS3，一周后，PWT在LV-NC组为3.84±2.76g,LV-SOCS3组为4.39±2.54g；PWL在LV-NC组为9.56±1.61s,在LV-SOCS3组为11.41±2.2s,两组的PWT及PWL值无显著差异（图2A、B,p>0.05,n=6,弗里德曼方差分析）。二周后，PWT在LV-NC组为1.67±0.64g,在LV-SOCS3组升高为13.57±3.28g;PWL在LV-NC组为9.49±3.52s，在LV-SOCS3组升高为16.22±3.44s（图2C、D,p<0.05,n=6,弗里德曼方差），即鞘内注射LV-SOCS3后两周时，可以明显升高骨癌大鼠的PWT及PWL值，显著缓解骨癌痛，而一周时作用效果不明显。11 第三章实验结果鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究表1骨癌痛模型建立后不同时段大鼠PWT和PWLn=6，x±s分组1周2周PWT（g）PWL（s）PWT（g）PWL（s）LV-NC组3.84±2.769.56±1.611.67±0.649.49±3.52LV-SOCS3组4.39±2.5411.41±2.213.57±3.2816.22±3.44t值0.271.494.133.50P值0.780.160.0040.007n=6；*：P<0.05图3A、B鞘内注射LV-SOCS3及LV-NC后1周，两组的PWT及PWL值无显著差异C、D鞘内注射后二周，PWT与PWL在LV-SOCS3组明显升高12 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究第三章实验结果3.3鞘内注射LV-SOCS3一周后可以在DRG水平上调SOCS3的表达，降低NF-κB的蛋白水平，而对P2X3R的表达无明显影响。鞘内注射LV-SOCS3后一周，蛋白电泳检测L2-5DRG组织中的SOCS3蛋白表达水平。由图3A可以看出，SOCS3在LV-SOCS3组表达水平为：0.47±0.10，明显高于对照组LV-NC表达水平：0.12±0.02（图3A，*p<0.05,n=4,student’sttest），说明鞘内注射LV-SOCS3可以有效上调SOCS3的表达。检测NF-κB及P2X3R蛋白水平，发现鞘内注射LV-SOCS3后一周时能显著降低骨癌痛大鼠L2-L5DRG组织的NF-κB水平，LV-SOCS3组的NF-κB蛋白水平为1.50±0.30，而LV-NC组为2.80±0.24（图3B，*p<0.05,n=4,student’sttest）。检测LV-NC组的P2X3R为1.14±0.08，LV-SOCS3组为1.07±0.09，差别无统计学意义（图3C,p>0.05,n=4,student’sttest）。3.4鞘内注射LV-SOCS3后2周时可降低NF-κB及P2X3R表达鞘内注射LV-SOCS3后2周时，蛋白质印迹检测结果显示，NF-κB在LV-SOCS3组的蛋白水平为0.12±0.03，显著低于LV-NC组0.71±0.19(图4A,p<0.05,n=4,student’sttest)。P2X3R在LV-SOCS3组为0.15±0.076，显著低于LV-NC组的0.45±0.07(图4B,p<0.05,n=4,student’sttest)。n=4；*：P<0.05，与LV-NC组比较图4鞘内注射LV-SOCS3后1周大鼠脊髓背根神经节中3种蛋白的表达13 第三章实验结果鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究n=4，*：P<0.05，与LV-NC组比较图5鞘内注射LV-SOCS32周大鼠脊髓背根神经节中NF-κB和P2X3R的表达14 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究第四章讨论第四章讨论外周初级感觉神经元是外周疼痛信号整合、传导的第一站神经元，在疼痛的发生发展中占有重要地位。骨癌痛是多种因素综合作用的结果，包括肿瘤细胞侵犯神经及压迫神经、局部缺血所导致的神经病理性疼痛，或对神经纤维的直接破坏、肿瘤细胞及基质细胞中释放的致痛因子、酸中毒等对神经元的影响及间接地使神经元发生敏化作用[35-37]。这些研究结果表明了与炎性疼痛和神经病理性疼痛比较，骨癌痛的机制更为复杂。临床和基础研究也显示，支配肿瘤及肿瘤周围组织的初级感觉神经元的敏化是导致机械痛敏、热痛敏的主要原因[38]，所以在DRG水平研究骨癌痛发生及发展机制可能对在早期抑制、缓解疼痛的进展具有重要意义。近年来,研究人员已通过动物模型成功模仿了临床上患者的骨癌痛，为研究骨癌痛的发病机理提供了很好的研究平台。乳腺癌细胞致骨癌痛的动物模型通常作为乳腺癌的骨转移模型，此类模型构建的动物通常选用雌性，致骨癌痛的乳腺癌细胞国外学者通常选择MRMT—l乳腺癌细胞，而该类细胞在国内不易获取，故国内学者主要采用Walker256乳腺癌细胞，我们选择的癌细胞注射位置主要集中于大鼠胫骨。造模一周后，我们通过测定机械痛、热痛阈值来测定癌细胞诱导的痛行为反应，发现癌细胞能明显降低大鼠的机械痛阈值，热痛阈值，这些结果证明了我们已成功诱导了骨癌痛大鼠模型，这与之前的报导是一致的[39,40]。SOCS3是一类被活化的细胞因子招募的胞内蛋白，有研究报道称其主要在多种细胞中作为JAK/STAT3通路的负反馈抑制剂，负向调节细胞因子从而激活下游通路[41]。但是对于其治疗骨癌痛的作用及机制还未曾有报导。本文是在骨癌模型建立1周后鞘内注射LV-SOCS3以研究SOCS3对骨癌痛的治疗作用，并探索SOCS3发挥作用的时间点及可能的下游调控靶点。我们实验室前期已经证实嘌呤受体P2X3R在炎性痛、神经病理性疼痛和内脏痛及骨癌痛的发生发展中均发挥重要作用[34,42]。而NF-κB作为一种重要核转录因子，广泛参与炎症，疼痛相关基因表达调控，在骨癌痛形成过程中，NF-κB也已被证实参与P2X3R表达调控[42]。所以我们探索SOCS3对骨癌痛的调控是否通过SOCS3调控NF-κB表达从而进一步调控P2X3R实现，换言之，在骨癌痛模型中SOCS3-NF-κB-P2X3R通路是否成立。15 第四章讨论鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究结果证明，SOCS3在早期虽可下调DRG中NF-κB的表达，但并不能减轻骨癌大鼠的疼痛反应，推测可能是由于P2X3R的表达没有下降的原因。而在鞘内注射LV-SOCS3两周后，不但NF-κB维持在低表达状态，而且还降低了P2X3R的表达，同时明显缓解骨癌痛大鼠的痛觉过敏，说明P2X3R可能直接与痛行为反应相关，而SOCS3可能可能参与了NF-κB-P2X3R的表达调控。综上所述，骨癌痛大鼠模型中，过表达SOCS3降低了NF-κB的表达，并且通过NF-κB进一步调控P2X3R蛋白表达，减轻了骨癌大鼠的痛觉过敏，有效地缓解了骨癌痛大鼠的痛觉过敏。因此，我们可以推测，SOCS3可能可以通过下调初级感觉神经元中NF-κB的表达最终抑制P2X3R的表达，从而在外周神经系统水平缓解骨癌痛大鼠的痛觉过敏，这些结果为骨癌痛的临床治疗提供了新的治疗靶点与科学依据。16 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究参考文献参考文献1.Torre,L.A.,etal.,Globalcancerstatistics,2012.CACancerJClin,2015.65(2):p.87-108.2.Paget,G.,RemarksonaCaseofAlternatePartialAnaesthesia.BrMedJ,1889.1(1462):p.1-3.3.Rucci,N.,etal.,Molecularpathogenesisofbonemetastasesinbreastcancer:Provenandemergingtherapeutictargets.WorldJClinOncol,2014.5(3):p.335-47.4.Boxer,D.I.,etal.,Bonesecondariesinbreastcancer:thesolitarymetastasis.JNuclMed,1989.30(8):p.1318-20.5.Eilon,G.andG.R.Mundy,Directresorptionofbonebyhumanbreastcancercellsinvitro.Nature,1978.276(5689):p.726-8.6.Lee,J.,etal.,Amatrixmetalloproteinaseinhibitor,batimastat,retardsthedevelopmentofosteolyticbonemetastasesbyMDA-MB-231humanbreastcancercellsinBalbCnu/numice.EurJCancer,2001.37(1):p.106-13.7.Lin,D.L.,etal.,BonemetastaticLNCaP-derivativeC4-2Bprostatecancercelllinemineralizesinvitro.Prostate,2001.47(3):p.212-21.8.Roodman,G.D.,Mechanismsofbonemetastasis.DiscovMed,2004.4(22):p.144-8.9.Siclari,V.A.,T.A.Guise,andJ.M.Chirgwin,Molecularinteractionsbetweenbreastcancercellsandthebonemicroenvironmentdriveskeletalmetastases.CancerMetastasisRev,2006.25(4):p.621-33.10.Dougall,W.C.andM.Chaisson,TheRANK/RANKL/OPGtriadincancer-inducedbonediseases.CancerMetastasisRev,2006.25(4):p.541-9.11.Roodman,G.D.,Biologyofosteoclastactivationincancer.JClinOncol,2001.19(15):p.3562-71.12.Moreau,J.,etal.,Studiesofosteotropismonbothsidesofthebreastcancer-boneinteraction.AnnNYAcadSci,2007.1117:p.328-44.13.Singletary,S.E.,etal.,Aroleforcurativesurgeryinthetreatmentofselectedpatientswithmetastaticbreastcancer.Oncologist,2003.8(3):p.241-51.14.Sathiakumar,N.,etal.,Mortalityfollowingbonemetastasisandskeletal-related17 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鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究第五章结论与展望第五章结论与展望结论1.骨癌痛模型大鼠机械痛及热痛痛阈明显降低，L2-L5DRG组织中SOCS3的表达显著降低；2.鞘内注射LV-SOCS3一周后可以在DRG水平上调SOCS3的表达，降低NF-κB的蛋白水平，而对P2X3R的表达无明显影响。骨癌痛大鼠的PWT、PWL无明显改变。3.鞘内注射LV-SOCS3后2周时可降低NF-κB及P2X3R表达，PWT、PWL显著下降。因此推测P2X3R参与了对骨癌痛的调节，将成为骨癌痛的治疗靶点。展望近年来乳腺癌骨转移的研究备受关注，但是骨癌痛的机制尚没有完全清楚，目前临床上没有骨癌痛的针对性治疗手段。本研究对骨癌的机制作了初步的研究，发现P2X3R是骨癌痛可能的治疗靶点。而这个靶点对于抑制乳腺癌骨癌灶是不是有效，是不是还有更加有效的治疗靶点，尚需要进一步的研究。上述研究有利于关于乳腺癌骨转移的研究的开展。希望通过研究有利于关于乳腺癌骨转移的研究的开展同时通过展开各种临床试验与不断的总结对比，有望寻找到最佳临床综合治疗手段，以提高乳腺癌骨转移患者的生活质量、延长无进展生存期及总生存，并将相关治疗所带来的不良事件风险降到最低。21 综述鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究综述乳腺癌骨转移机制及其研究进展Abstract:Breastcancerisoneofthemostcommonmalignanttumorsinwomen.Boneiscommonlyaffectedinthecontextofmetastaticbreastcancer.Aseriesofbonerelatedevents(skeletalrelatedevent,SRE)werefoundinpatientswithbreastcancer,suchasbonepain,pathologicalfractureandlimbdysfunction,whichseriouslyaffectedthequalityoflifeandprognosis.Breastcancerbonemetastasisdependsonavarietyofcellfactorsandproteins,whichistheresultofinteractionbetweencancercellsandbonemicroenvironment.Breastcancercellscausethebonedestructionthroughlocalinvasion,infiltrationofbloodvesselsandlymphaticvessels,withthecirculatorysystemtransferredtothebone,theremovalofbloodvesselsandlymphaticvessels,theproliferationofbreastcancercells.Theoccurrenceanddevelopmentofbreastcancerbonemetastasisrelytotheinteractionbetweenbreastcancercellsandthebonemicroenvironment,andfinallythedamageofbonestructureandthedamageoffunction.Understandingthemolecularmechanismofbonemetastasisinbreastcancerishelpfulforthediagnosisandtreatmentofbreastcancerwithbonemetastasis.Inthispaper,therelatedfactorsandmolecularmechanismsinvolvedinbonemetastasisofbreastcancerwerereviewed.Keywords:Breastcancer，Bonemetastases，Tumormicroenvironment，Molecularmechanism.摘要:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，且易发生骨转移。乳腺癌骨转移患者常见骨痛、病理性骨折、功能障碍等一系列骨相关事件(skeletalrelatedevent，SRE)，严重影响患者生活质量及预后。乳腺癌骨转移依赖多种细胞因子及蛋白的参与，是癌细胞与骨微环境相互作用的结果。乳腺癌细胞通过局部浸润、渗入血管和或淋巴管、随循环系统转移到骨、移出血管和或淋巴管、在骨定居并增殖引起溶骨性骨损伤。乳腺癌骨转移的发生发展取决于乳腺癌细胞与骨局部微环境之间相互作用，最后形成骨的结构破坏及功能受损。了解乳腺癌骨转移的分子机制有助于对乳腺癌骨转移患者的诊断及治疗。因此本文就参与乳腺癌骨转移的相关因子及分子机制进行综述。关键词：乳腺癌，骨转移，肿瘤微环境，分子机制22 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究综述乳腺癌是一全身性疾病已是共识，一些乳腺癌患者早期即出现血运转移。乳腺癌患者中，约70%会发生骨转移。临床研究时骨相关事件（SRE）定义为：骨痛加剧或出现新的骨痛、病理性骨折(椎体骨折、非椎体骨折)、椎体压缩或变形、脊髓压迫、骨放疗后症状(因骨痛或防治病理性骨折或脊髓压迫)及高钙血症[43]。主要或仅仅发生骨转移的患者虽然生存期长于发生其他部位转移的患者[43]，但常出现骨痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫等骨相关事件（SRE），产生严重损害，最终导致死亡[44]。乳腺癌骨转移分子机制至今尚未完全明确，目前常用的治疗手段主要为姑息性治疗，包括局部治疗及系统性治疗，但均不能延长生存期[45]。本文通过查阅相关文献，就参与乳腺癌骨转移相关因子及分子机制综述如下。1.乳腺癌骨转移的发生机制1.1早期理论学说1889年，英国Paget提出“种子－土壤”学说，强调了肿瘤细胞和靶组织的相互作用，认为肿瘤的转移不是随机的，乳腺癌细胞就像“种子”，骨微环境就是“土壤”，骨微环境为乳腺癌细胞提供必要的营养支持，乳腺癌细胞与骨微环境有一定的亲和性。现学界仍认为Paget的理论对于目前研究乳腺癌骨转移仍然具有指导意义，骨的微环境为癌细胞的生长提供了适宜的土壤[46]，也已有证据[47,48]支持这一学说，肿瘤转移取决于骨微环境提供的生长支持和癌细胞对这一环境的适应能力。随着分子生物学理论及技术的进步，近年来出现的“克隆进展”学说和“肿瘤干细胞”学说正日益为学术界所接受。1.2细胞分子机制乳腺癌骨转移是一个极其复杂精细的多步骤过程，这个过程包括:乳腺癌原发灶的生长和增殖并获得转移特征;突破基底膜侵入细胞外基质;血管内渗与转运;黏附滞留;迁徙至血管外，形成微转移;最后定植于骨并在其中克隆生长，引起骨质改变[49]。乳腺癌骨转移最常见的转移部位是富含红髓的骨骼干骺端，其原因可能与骨骼内结构复杂，血流缓慢，干骺端红骨髓血供丰富有关，骨髓产生特异的黏附分子能够捕获乳腺癌播散肿瘤细胞（DTCs），DTCs在形成克隆性增殖前，在富血供的微环境中通过适应性“休眠”，逃避化疗杀伤。同时乳腺癌骨转移灶局部微环境内低氧、低pH及高钙，也有利于DTCs的定植与“休眠”[50]。乳腺癌细胞与骨基质细胞在相关基23 综述鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究因的调控下，产生肿瘤生长因子，促进癌细胞的生长与转移，同时，基质细胞接受癌细胞分泌的生长因子的信号，细胞外基质降解，协助癌细胞的迁徙与转移[51]。乳腺癌细胞进入血流循环形成循环肿瘤细胞(CTCs)，通过外分泌等方式与特殊蛋白或者分子的相互作用，转移到达特定的器官，突破血管形成播散肿瘤细胞(DTCs)，定植于特异性器官，在众多基质细胞所构成的局部肿瘤微环境的营养支持下形成转移灶。同时，肿瘤局部微环境也对乳腺癌DTCs通过外分泌等方式进行选择性调控，决定乳腺癌细胞转移是否成功[34]。整合细胞黏附受体已被证实具有促进转移的作用，推测其可能与细胞外基质的结合有关。甲状旁腺素相关蛋白、血管内皮生长因子、转化生长因子-β、白介素-8和白介素-11都参与骨转移的级联作用[52-55]。有研究[55]已经证实，转化生长因子-β受体存在于骨微环境中乳腺癌细胞的表面，骨释放的转化生长因子-β与受体结合后可以促进甲状旁腺素相关蛋白表达的上调，导致溶骨酶活性增加。白介素-8和白介素-11及转化生长因子-α被证实是成骨细胞活化因子[56]。破骨细胞及其前体上具有NF-κB受体，NF-κB与受体结合后，破骨细胞生成增加，同时破骨细胞的活性也得到增强[52]。近来，越来越多的证据表明，miＲNA在正常骨吸收及骨重塑的过程中发挥重要的作用[57]。同样地，miＲNA在乳腺癌转移过程中也发挥着关键作用[58]，侵袭性乳腺癌细胞通过外分泌等方式产生miＲNA调控乳腺癌转移的启动和进程[59]。2.乳腺癌细胞与骨微环境正常的骨稳态的维持依赖于成骨细胞参与的骨形成与破骨细胞参与的骨吸收作用，乳腺癌骨转移的过程就是此稳态逐渐被打破的结果，故而乳腺癌骨转移包括成骨性、溶骨性和混合性骨转移。2.1成骨性转移哺乳动物成骨细胞特异性转录因子(Runx)家族蛋白与肿瘤密切相关，既能促进肿瘤发生又存在一定的抑癌作用，其调控基因的表达异常会导致肿瘤的发生[60]。Runx2是成骨细胞的转录因子，参与成骨细胞的分化与骨组织的发育，其缺乏会导致成骨细胞发育受阻进而影响骨骼的合成[61]。Runx2是乳腺癌骨转移的主要激活因子，其表达越高，癌细胞恶性程度越高。在激素受体均为阴性的乳腺癌患者体内常见其高表达。Runx2与雌激素受体表达呈负相关，雌激素主要调控乳腺癌细胞的增殖，Ｒ24 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究综述unx2主要调控癌细胞的分化与转移，且Runx2在一定程度上抑制雌激素对乳腺癌细胞的调控作用[62]。在乳腺上皮细胞恶性转化过程中，PI3K-Akt信号通路具有重要的作用，而该信号通路在其过程中就是通过下游信号分子Runx2实现的[63]。2.2溶骨性转移乳腺癌细胞转移到骨组织后造成溶骨性破坏，并不是癌细胞对骨细胞的直接作用造成的，而是通过癌细胞分泌的一些细胞因子与骨微环境相互作用，造成破骨细胞的破骨作用加强而致骨质破坏。乳腺癌细胞与骨微环境之间形成恶性循环，造成肿瘤细胞不断增殖生长与骨质的不断被破坏。该恶性循环主要是通过ＲANK/ＲANKL-OPG系统实现[62]。成骨细胞中的细胞核因子κB受体活化因子配基(ＲANKL)是肿瘤坏死因子家族中的一种，表达于成骨细胞、骨基质细胞和激活的T细胞并由其释放，在正常骨髓中低水平存在。甲状旁腺激素相关蛋白(PTH-rP)可刺激成骨细胞分泌ＲANKL，破骨前体细胞分化成破骨细胞时必须的信号分子包括ＲANKL和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。乳腺癌细胞发生骨转移后，绝大多数情况下，骨微环境中的癌细胞受转化生长因子(TGF-β)的刺激产生大量PTH-rP，进而刺激成骨细胞分泌释放ＲANKL。ＲANKL与破骨细胞表面的细胞核因子κB受体活化因子(ＲANK)结合，促进破骨细胞的成熟，破骨作用加强。乳腺癌发生骨转移后，癌细胞可以分泌细胞因子使ＲANKL的表达增强，成骨细胞及其他与肿瘤相关的细胞如成纤维细胞、免疫细胞等OPG的表达被抑制，破骨作用加强，骨质破坏增多素样生长因子(IGFs)、TGF-β、成纤维细胞生长因子(FGFs)等细胞因子释放增多，促进骨转移的发生;Ca2+增多，刺激乳腺上皮细胞分泌PTH-rP增多，又进一步造成破骨细胞活性增高，形成恶性循环，即“溶骨性骨转移－骨吸收恶性循环”。3.乳腺癌骨转移表现骨疼痛是乳腺癌骨转移最常见、也可以是最早出现的临床症状，有的病灶很小即出现疼痛。患者最初的疼痛多表现为间断痛,肿瘤压迫神经可出现相应分布区的剧烈放射痛,随病情发展可转变为持续痛,活动时加剧,但休息后并不缓解[41]。特别晚期患者可发生病理性骨折，尤其是老年乳腺癌骨转移患者以脊柱骨折为首发临床表现时，常被误诊为老年骨质疏松所致的骨折。在评估乳腺癌长骨（肱骨、股骨及胫骨）转移患者的治疗时机时，鉴别疼痛是否与负重有关、休息时是否缓解是非常重要的，这可以作为发生病理性骨折可能性的预测指标[16]。当患者骨内肿瘤负荷足够大时，25 综述鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究可发生骨髓抑制和白细胞减少症。成骨性转移或脊柱骨折可导致脊髓压迫，一旦发生将严重影响患者的生活质量及生存期。骨相关事件在诊断骨转移后1年内的发生率很高，早期诊断和有效的治疗可以延缓骨相关事件的进展[43]。许多晚期骨转移患者出现严重的体重减轻，这种恶病质包括肌肉和脂肪组织减少，这主要因为骨转移患者的食欲减退及营养吸收障碍[64]。研究[65]证实，乳腺癌骨转移患者经常很快出现恶病质，这些结果提示骨转移灶向外周血液循环中释放某些促进机体代谢的相关因子，从而刺激骨骼肌的消耗。4.小结与展望乳腺癌骨转移是一个复杂的过程，由于乳腺癌发生骨转移可产生很多并发症并最终危及患者生命,寻找有效的抑制骨转移发生和进展的治疗方法具有重要的临床意义。同时，乳腺癌易于发生骨转移与骨转移的生物学行为及微环境因素相关，这是一个亟待研究的领域。破骨细胞、成骨细胞和肿瘤细胞之间的关系以及生长因子和细胞因子的作用需要做进一步研究。相信随着乳腺癌骨转移研究的进一步深入，人类对乳腺癌骨转移的分子机制将会有越来越明确的认识，能够及时准确监测乳腺癌骨转移的发生、发展，将会对治疗和预防提供更多的理论依据并且寻找有效的防治方案，减少和控制乳腺癌骨转移的发生，提高生活质量，延长患者生存。26 鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究综述参考文献43.Jensen,A.O.,etal.,Incidenceofbonemetastasesandskeletal-relatedeventsinbreastcancerpatients:apopulation-basedcohortstudyinDenmark.BMCCancer,2011.11:p.2944.Jung,S.Y.,etal.,Factorsassociatedwithmortalityafterbreastcancermetastasis.CancerCausesControl,2012.23(1):p.103-12.45.Guise,T.A.,Breastcancerbonemetastases:it'sallabouttheneighborhood.Cell,2013.154(5):p.957-9.46.Sterling,J.A.andS.A.Guelcher,Bonestructuralcomponentsregulatingsitesoftumormetastasis.CurrOsteoporosRep,2011.9(2):p.89-95.47.Cawthorn,T.R.,etal.,Mechanismsandpathwaysofbonemetastasis:challengesandpitfallsofperformingmolecularresearchonpatientsamples.ClinExpMetastasis,2009.26(8):p.935-43.48.Psaila,B.andD.Lyden,Themetastaticniche:adaptingtheforeignsoil.NatRevCancer,2009.9(4):p.285-93.49.Suva,L.J.,etal.,Bonemetastasis:mechanismsandtherapeuticopportunities.NatRevEndocrinol,2011.7(4):p.208-18.50.Walker,N.D.,etal.,Thebonemarrownicheinsupportofbreastcancerdormancy.CancerLett,2016.380(1):p.263-71.51.Lukanidin,E.andJ.P.Sleeman,Buildingtheniche:theroleoftheS100proteinsinmetastaticgrowth.SeminCancerBiol,2012.22(3):p.216-25.52.Roodman,G.D.,Mechanismsofbonemetastasis.NEnglJMed,2004.350(16):p.1655-64.53.Rose,A.A.andP.M.Siegel,Breastcancer-derivedfactorsfacilitateosteolyticbonemetastasis.BullCancer,2006.93(9):p.931-43.54.Kingsley,L.A.,etal.,Molecularbiologyofbonemetastasis.MolCancerTher,2007.6(10):p.2609-17.55.Buijs,J.T.,K.R.Stayrook,andT.A.Guise,TGF-betaintheBoneMicroenvironment:RoleinBreastCancerMetastases.CancerMicroenviron,2011.4(3):p.261-81.27 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鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文2017年以第一作者身份在TumorBiology上发表题为“ATPcitratelyaseisincreasedinhumanbreastcancer,depletionofwhichpromotesapoptosis”一篇，IF=2.929 致谢鞘内注射慢病毒LV-SOCS3过表达SOCS3缓解骨癌痛大鼠痛行为及机制研究致谢行文至此，三年五味杂陈的研究生生涯即将落下帷幕，此时此刻，千思万绪。回首往昔，虽硕士研究生的学习生活仅短短三年，但它让我成长，让我体验不同的学习方式，探索崭新的知识领域，在我的学习之路上留下新奇而深刻的印记。这一路上充满困难与挑战，但更多的却是收获后的喜悦，其中离不开大家的关心和帮助，在这里请接受我诚挚的谢意。首先要衷心感谢我的导师蒋国勤主任三年来对我的谆谆教诲和悉心教导。在科研方面，从课题的选定到实验中历经坎坷最终顺利结题，无一不凝结着蒋主任的心血；在临床工作中，无论是精益求精的从业态度还是平易近人的待人方式，都让我由衷的敬佩。三年间蒋主任的言传身教让我获益颇深，在点滴汇聚中使我逐渐形成正确、成熟的人生观、价值观、职业观。能有这样的导师是我人生中的一大幸事。同时也要感谢我的师姐殷蕾、魏金荣，师兄浦晨辰、魏海浪、同门孔祥鹏、师妹冷冰晶、伍燕琳、孟甦、师弟徐东、蒋豪杰，还有一直陪伴在我身边的伙伴们感谢你们嬉笑吵闹着陪伴我，给予我帮助。感谢苏大附二院普外科各位主任、上级医师、护士长以及各位护士姐姐们在临床学习中对我的指导和帮助。感谢苏州大学神经研究所，感谢徐广银徐老师给一直以来的关心及对实验的指导。感谢胡老师、肖老师对我的关心和帮助。感谢实验室各位小伙伴在我实验过程中给与我莫大的鼓励、指导和帮助。最后，衷心感谢父母，感谢父母的理解和支持，感谢父母多年来在生活上给予我无微不至的关爱和照顾，使我能全身心投入到我的学习中，感谢父母让我拥有一个如此温馨的家庭，让我所有的不如意在这里得到谅解和分担。再次感谢所有关心我的老师、同学和朋友。愿师长安康，同窗如意。30 ．硕论文（专业学位）■．＇ｓ＇；．ｌ．．．＇■ｖ．苏州大学研究生院统一印制