《基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单克隆抗体的制备及鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
EstablishmentofChikungunyavirusnucleicaciddetectionmethodandidentificationofmonoclonalantibodiesagainststructuralproteinE2AthesissubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesinpartialfulfillmentoftherequirementforthedegreeofMasterofNaturalScienceinMicrobiologyByLiXiaoSupervisor：ProfessorZhangBoWuhanInstituteofVirology,ChineseAcademyofSciencesJune2018 中国科学院大学研究生学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明或致谢。作者签名：日期：中国科学院大学学位论文授权使用声明本人完全了解并同意遵守中国科学院有关保存和使用学位论文的规定，即中国科学院有权保留送交学位论文的副本，允许该论文被查阅，可以按照学术研究公开原则和保护知识产权的原则公布该论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。涉密及延迟公开的学位论文在解密或延迟期后适用本声明。作者签名：导师签名：日期：日期：I 摘要摘要基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus，CHIKV）是包被囊膜的单股正链RNA病毒，是披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)中的一员，蚊虫叮咬是其主要传播途径，人被感染后会引起发热、头痛、斑丘疹及全身性关节炎等症状，极少数患者可能会出现脑膜炎、心肌炎、肝功能损伤及皮肤黏膜出血，给人类生命健康带来极大威胁。随着全球气候变暖，各国交流日加频繁，此病毒的传播范围也在随之扩大。2008年，我国发现首例CHIKV的输入性病例，之后每年都有输入性病例报道。我国分布有可传染CHIKV的蚊虫种类，因此存在大范围爆发的可能性。然而，目前对此病毒的研究并不透彻，尚无有效的预防和治疗手段，所以前期对于病毒的检测诊断显得尤为重要。本文针对CHIKV检测诊断方法的建立做了以下两部分工作：（1）CHIKV和寨卡病毒（Zikavirus，ZIKV）双重荧光定量RT-PCR方法的建立；（2）针对CHIKV结构蛋白E2单克隆抗体的制备与鉴定。（1）CHIKV和ZIKV双重荧光定量RT-PCR方法的建立由于CHIKV和ZIKV在发病初期的症状十分相似（发热，头痛，全身肌肉痛等），很难单靠临床症状确诊病毒感染类型，需要依靠灵敏度高的核酸诊断检测技术进行检测。而荧光定量PCR方法（Real-timePCR）就是其中一种快速且灵敏度很高的核酸检测技术。为了同时检测并能区分上述两种病毒，我们建立了一步法双重荧光定量RT-PCR检测方法（one-stepmultiplexreal-timeRT-PCRassay）。该方法可有效检测病人体内CHIKV和/或ZIKV的病毒RNA含量，具有高灵敏度和高特异性等特点，为后期及时采取相应治疗措施提供有效诊断依据。首先我们分别设计合成了针对CHIKVnsP1和ZIKVNS5的最佳引物和TaqMan探针，按照荧光定量RT-PCR体系配制了能同时检测两种病毒的反应体系，通过对该体系建立标准曲线检测其扩增效率和相关性，并对其特异性和灵敏度等进行了检测，最后应用于临床样本检测。结果表明我们所建立的检测体系对CHIKV和ZIKV的扩增效率分别是：97.99%，99.98%；相关性分别是：R2=0.9977，R2=0.9994；灵敏度分别是：1PFU，0.5PFU；与同种属的其他甲病毒（辛德毕II 摘要斯病毒和塞姆利基森林病毒等）和黄病毒（日本脑炎病毒和西尼罗病毒等）无交叉反应；对疑似感染病人样本的检测结果与同期医院临床检测结果一致。由此可见，我们已经成功建立了能同时检测CHIKV和ZIKV的快速核酸检测方法，为以后这两种病毒的检测诊断提供了有效的技术储备。（2）CHIKV结构蛋白E2(CHIKV-E2)单克隆抗体的制备与鉴定使用原核表达、割胶纯化方法获得的CHIKV结构蛋白E2作为免疫原免疫小鼠获得多克隆抗体，使用间接免疫荧光（Indirectimmunofluorescen,IFA）和免疫印迹（westernblot,WB）对多克隆抗体特异性进行验证。结果表明，以原核表达的CHIKV-E2蛋白作为免疫原免疫小鼠产生的E2抗体能够检测到病毒感染真核细胞中E2蛋白的表达。通过ELISA检测表明经过四次免疫后小鼠血清抗体效价达到1:300,000–1:1,000,000，达到制备单克隆抗体的条件。然后，将免疫小鼠的脾细胞和活化的骨髓瘤细胞（SP2/0）融合获得杂交瘤细胞，使用真核表达E2蛋白的细胞裂解液作为包被抗原，通过ELISA初筛获得15株阳性克隆，并通过IFA验证其中9株能够识别病毒感染细胞内E2蛋白，对这些IFA阳性的细胞进行四轮亚克隆化，最终得到了9株单克隆细胞系。对这些细胞系进行验证，成功制备了高滴度、高特异性的腹水抗体。我们分别对纯化的腹水抗体的中和活性、特异性、抗体亚型及识别抗原表位等特性进行了鉴定。结果表明在制备的这9株抗体中，（a）有5株具有中和病毒的活性；（b）9株抗体中除了6E2外，其他8株都能很好的用于IFA检测；（c）上述9株抗体都可以用于Westernblot检测；（d）抗原表位鉴定发现9株亚克隆分别识别E2蛋白的三个不同的domain区；（e）这9株抗体中有两株（4C4，7B7）不仅能检测CHIKV，还和其同属的塞姆利基森林病毒（Semlikiforestvirus，SFV）有交叉反应，而其余的7株都只能特异性的检测到CHIKV，所以这些单抗可能成为潜在的检测诊断和抗病毒药物试剂，也为研究结构蛋白E2的功能提供了良好的实验材料。关键词：基孔肯雅病毒，寨卡病毒，一步法双重荧光定量RT-PCR，结构蛋白E2，单克隆抗体III AbstractAbstractChikungunyavirus(Chikungunyavirus,CHIKV)isanenveloped,single-strandedpositivesenseRNAvirus.ItisamemberoftheAlphavirusgenusoftheTogaviridaefamily.ThemosquitoisthemainvectorofCHIKVtransmission.CHIKVinfectionismainlyresponsibleforfever,headache,rash,systemicarthritisandothersymptoms,withafewcasespresentingmeningealencephalitis,myocarditis,liverfunctiondamage,skinandmucousmembranehemorrhage.Withglobalwarmingandincreasingcommunicationamongcountries,CHIKVisspreadingworldwide.Since2008whenthefirstimportedcasewasdiscoveredinChina,afewimportedcaseshavebeenreportedeveryyearinChina.GiventhatthewidelydistributionofmosquitospeciescapableoftransmittingCHIKVinChina,localtransmissionofCHIKVmighttakeplaceinChina.Currently,therearenoeffectivetherapeuticsagainstCHIKVinfection.Therefore,theearlydetectionofCHIKVwasparticularlyimportant.ThisstudymainlyfocusedontheestablishmentoftheChikungunyavirusdiagnostictestmethods,including(1)Developmentandevaluationofone-stepmultiplexreal-timeRT-PCRassayforsimultaneousdetectionofCHIKVandZikavirus(ZIKV);(2)PreparationandidentificationofmonoclonalantibodiesagainstCHIKVE2protein.(1)Developmentandevaluationofone-stepmultiplexreal-timeRT-PCRassayforsimultaneousdetectionofCHIKVandZIKV.ThesymptomsofCHIKVandZIKVareverysimilarintheearlystageofinfections,suchasfever,headache,fullBodymusclepain.Itisdifficulttodeterminewhichvirushasinfectedapatientthroughsolelyrelyingonclinicalsymptoms.Insuchacase,toestablishahighlysensitivenucleicaciddiagnosticmethodismostnecessary,forexampleareal-timePCRmethod.InordertosimultaneouslydetectCHIKVandZIKV,weestablishedaone-stepmultiplexreal-timeRT-PCRassay.ThisassayishighlysensitiveandspecificfordetectingeitherCHIKVorZIKV,andcouldbeusedforclinicaldiagnostics,whichisimportantformakingtheappropriatetreatmenttherapyforpatients.(1)WedesignedandsynthesizedtheprimersandTaqManprobesofCHIKVandZIKV.TheprimersandprobesarelocatedintheregionsofCHIKVnsP1andZIKVNS5,respectively.Theamplificationefficiencyofthereactionsystemwascalculatedbyestablishingastandardcurve.ThesensitivityandspecificityofthisassaywereIV Abstractevaluated.Theresultsshowedthat(a)theamplificationefficienciesofthisassayforCHIKVandZIKVwere97.99%and99.98%,respectively.(b)thecorrelationcoefficientsR2were0.9977and0.9994,respectively;(c)thedetectionlimitswere1PFUand0.5PFU,respectively;(d)therewasnocross-reactionwithotherspeciesofalphavirusandflavivirus,suchasSindbisvirusandSemlikiforestencephalitisvirusintheAlphavirusgenus,aswellasJapaneseencephalitisvirus,WestNilevirusintheFlavivirusgenus.Furthermore,thismethodwasassessedusingclinicalsamples.Itindicatedthattheresultsusingitwereconsistentwiththosedetectedinhospital.Therefore,thisnewlydevelopedassaycouldbeusedtorapidlydetectCHIKVandZIKVwithhighsensitivityandspecificity,providinganeffectivedetectionmethodforbothviruses.(2)PreparationandidentificationofmonoclonalantibodiesagainststructuralproteinE2(CHIKV-E2)ofCHIKV.Firstly,thepolyclonalantibodieswereobtainedbyimmunizingmicewithCHIKV-E2proteinasanimmunogenthatwasobtainedthroughprokaryoticexpressionandpurification.Theefficiencyoftheserumantibodieswasverifiedbyindirectimmunofluorescenceassay(IFA)andWesternblottingassay.Secondly,theexpressionofE2proteinineukaryoticcellsinfectedwithCHIKVcanbedetectedbytheE2antibodies.TheresultsofELISAassayindicatedthatthemiceserumantibodieswithdilutionsfrom1:300,000to1:1,000,000stillhadneutralizingactivitiesafterfourroundsofimmunizations.Thirdly,hybridomacellswereobtainedbyfusingspleencellsfromanimmunizedmousewithactivatedmyelomacells(SP2/0).UsingCHIKV-E2expressingcelllysatescoatedplates,15strainswereinitiallyobtainedbyELISAscreening.Furthermore,ninepositivecloneswereidentifiedbyIFAthatcouldreactwithvirus-infectedcells.CellsoftheseIFA-positiveclonesweresubjectedtofourroundsofsubcloning,andthenninemonoclonalcelllineswereobtained.Finally,high-titerandhighlyspecificascitesantibodiesweresuccessfullyprepared,andthepurifiedascitesantibodywascharacterizedbytestsofneutralizingactivity,specificity,andepitoperegions.Theresultsshowedthatfivepurifiedantibodieshadtheactivityofneutralizingthevirus,and9antibodiescanbeusedinIFAtest.Inadditiontoa6E2fluorescencedetected,theother8canbeusedfordetection,Westernblotindicatesthattheabove9cellscanbeusedfordetection,andwealsoconductedaneutralizationassay,9epitopesidentified.ThesubclonesbelongtothreedifferentdomainregionsofE2protein.Specificdetectionrevealedthattwoofthe9antibodies(4C4,7B7)notonlydetectedV AbstractCHIKVbutalsocross-reactedwithitssubgenusSemlikiforestencephalitisvirus(SFV).WhiletheremainingsevenstrainscanonlyspecificallydetectCHIKV,thesemonoclonalantibodiesmaybecomepotentialdiagnosticandpotentialantiviralagents,andalsoprovideagoodbasisforstudyingthefunctionsofstructuralproteinE2duringvirusneutralization.Keywords:Chikungunyavirus,Zikavirus,one-stepmultiplexreal-timeRT-PCR,Chikungunyavirusenvelopeprotein2,monoclonalantibodyVI 目录目录第1章前言........................................................................................................11.1基孔肯雅病毒概述.....................................................................................11.1.1基孔肯雅病毒分类.............................................................................11.1.2基孔肯雅病毒的流行病学和病原特征.............................................21.1.3基孔肯雅病毒粒子形态结构.............................................................31.1.4基孔肯雅病毒的基因组结构特点及生命周期.................................31.1.5基孔肯雅病毒的结构蛋白功能.........................................................41.1.6基孔肯雅病毒非结构蛋白的功能.....................................................51.1.7基孔肯雅病毒诊断检测方法.............................................................51.1.8基孔肯雅病毒疫苗研制及治疗策略.................................................81.1.9单克隆抗体概述及应用.....................................................................91.2本研究的目的和意义...............................................................................101.2.1基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR研究的意义...101.2.2基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备意义....................11第2章基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR建立..................132.1实验材料...................................................................................................132.1.1实验仪器...........................................................................................132.1.2细胞系、病毒...................................................................................132.1.3化学试剂和试剂盒...........................................................................142.2实验方法...................................................................................................142.2.1基孔肯雅病毒和寨卡病毒病毒RNA提取....................................142.2.2基孔肯雅病毒和寨卡病毒感染细胞总RNA提取........................152.2.3双重实时荧光定量RT-PCR引物和探针的设计..........................152.2.4双重实时荧光定量RT-PCR体系的配制......................................162.2.5双重实时荧光定量RT-PCR标准曲线建立..................................162.2.6双重实时荧光定量RT-PCR法灵敏度和特异性检测...................172.2.7双重实时荧光定量RT-PCR法检测不同株的CHIKV和ZIKV.17VII 目录2.2.8双重实时荧光定量RT-PCR法检测ZIKV生长曲线...................182.2.9双重实时荧光定量RT-PCR法检测临床样本...............................192.3实验结果...................................................................................................192.3.1双重实时荧光定量RT-PCR标准曲线...........................................192.3.2双重实时荧光定量RT-PCR灵敏度检测.......................................202.3.3双重实时荧光定量RT-PCR特异性检测......................................202.3.4双重实时荧光定量RT-PCR检测不同毒株的CHIKV和ZIKV212.3.5双重实时荧光定量RT-PCR检测临床样本..................................222.3.6双重荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒（ZIKV）生长曲线.........232.4讨论..........................................................................................................24第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定........................253.1实验材料...................................................................................................253.1.1仪器及设备.......................................................................................253.1.2材料菌株、细胞、病毒、小鼠.......................................................253.1.3质粒、酶、器材...............................................................................263.1.4试剂盒及相关试剂...........................................................................263.2实验方法...................................................................................................263.2.1基孔肯雅病毒结构蛋白E2的表达纯化........................................263.2.2基孔肯雅病毒E2蛋白原核表达....................................................303.2.3基孔肯雅病毒E2蛋白纯化............................................................303.2.4单克隆抗体的制备和鉴定...............................................................323.3.1基孔肯雅病毒E2蛋白原核表达质粒构建....................................423.3.2基孔肯雅病毒E2蛋白原核表达纯化............................................433.3.3目的蛋白割胶纯化...........................................................................443.3.4ELISA筛选方法的建立...................................................................453.3.5免疫后鼠源多抗效价测定及验证...................................................463.3.6间接ELISA初筛阳性杂交瘤细胞.................................................483.3.7阳性杂交瘤细胞系的IFA检测......................................................483.3.8阳性杂交瘤细胞系的Westernblot检测.........................................493.3.9其他性质鉴定...................................................................................50VIII 目录3.3.10阳性杂交瘤细胞系的表位鉴定.....................................................513.3.11阳性杂交瘤细胞系的中和活性检测.............................................533.3.12腹水抗体制备、纯化及SDS-PAGE检测...................................543.3.13腹水纯化抗体的IFA检测............................................................543.3.14腹水纯化抗体的Westernblot检测..............................................553.3.15腹水纯化抗体特异性鉴定.............................................................553.3.16腹水纯化抗体中和活性检测.........................................................563.3.17腹水纯化抗体效价检测.................................................................57第4章总结与展望............................................................................................594.1总结..........................................................................................................594.2展望..........................................................................................................60参考文献..............................................................................................................61附录A常用缩写................................................................................................69附录B常用试剂配方........................................................................................71作者简历..............................................................................................................76IX 第1章前言第1章前言自1952年在坦桑尼亚南部尼瓦拉州暴发基孔肯雅热（Chikungunyafever）疫情以来，此病毒在世界各地散播开来，随后传入美洲大陆，在全球范围内开始流行，特别是我国临近的东南亚地区一直是基孔肯雅热的主要流行地区之一[1]。1986年我国首次分离出基孔肯雅病毒，2008年我国发现首例输入性病例[2]。病毒传播主要通过伊蚊等吸血昆虫叮咬，人感染后一般会引起发热，皮疹、长年关节疼痛等症状，虽然患者死亡率较低，发热和皮疹也可在一定时间内痊愈，但全身性的关节炎往往持续存在数年，严重影响人们生活和健康，少数患者可能还会并发脑炎等危及生命的重症[3]。目前为止，还没有专门针对基孔肯雅病毒的疫苗、抗病毒药物和特异性治疗方法，所以建立快速检测诊断方法对及早确诊、降低发病率和死亡率至关重要，本文重点为建立能够快速准确检测基孔肯雅病毒的方法（核酸检测和血清学检测）提供相应储备材料，对及早确认患者是否感染基孔肯雅病毒并采取相应治疗手段具有重要意义。本章从基孔肯雅病毒概述、基孔肯雅病毒诊断检测方法，单克隆抗体概述及应用三个方面进行介绍。1.1基孔肯雅病毒概述1.1.1基孔肯雅病毒分类基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus，CHIKV）是不分节段的单股正链RNA病毒[4-5]，属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)中的一员，同属的病毒还包括辛德毕斯病毒（Sindbisvirus）、塞姆利基森林病毒（Semlikiforestvirus，SFV）、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒（Venezuelanequineencephalomyelitisvirus）等[6]，其与罗斯河病毒（RossRivervirus，RRV）、欧尼永尼永病毒（O’nyong-nyongvirus，ONNV）、塞姆利基森林病毒（SemlikiForestvirus，SFV）属于同一复合群，在很多研究中，该复合群被认为在进化上可能有同源性[7-8]。目前，在进化树分析中，基孔肯雅病毒有3种基因亚型：亚洲型、中/东非型和西非型[9]。其中西非型基本由塞内加尔及尼日利亚分离株构成；中/东非型及亚洲型由其他基孔肯雅病毒分离株组成。西非型与另两型的基因的同源性可能只有78%到85%相同。所以学者认为CHIKV极可能起源于非洲热带区域，随后传入南亚地区[7-8]。1 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定1.1.2基孔肯雅病毒的流行病学和病原特征在1953年，基孔肯雅病毒引起了坦桑尼亚地区基孔肯雅热大爆发，此病主要以持续性关节炎为主要症状，后来在病人血清及伊蚊和库蚊中分离到基孔肯雅病毒[10]。在2004年前，基孔肯雅病毒主要分布在非洲和亚洲，之后扩散到了包括欧洲南部，印度洋沿岸等全球大部分地区并引起了数百万人的感染[11]。我国于1986和1987年先后在云南地区的棕果蝙蝠脑组织和西双版纳人体中分离得到基孔肯雅病毒[12-14]。2008年我国确诊第一例输入性基孔肯雅热患者[13-15]，2010年我国东莞地区首次暴发本地基孔肯雅热流行，在253例报告病例中确诊了65例[13-15]，此后我国再无大规模的暴发流行。直至2017年世界卫生组织统计，目前基孔肯雅病毒主要流行于非洲、南美洲、北美洲和亚洲等地区（图1.1），并引发严重的疾病[14]。图1.1基孔肯雅病毒流行的地理分布[14]Figure1.1ThegeographicaldistributionoftheChikungunyavirusepidemic[14]基孔肯雅病毒属于虫媒病毒，在脊椎动物宿主中扩增，经由蚊虫传播，人和一些野生动物或许是病毒的宿主[16]。基孔肯雅病毒感染潜伏期(从感染至发病)为2～12天。主要症状为发热、头痛、畏光、皮疹和严重的关节肌肉痛，皮疹一般持续１周，而关节痛可持续数月乃至数年[17-18]。这些临床症状类似登革热和最近流行的寨卡病毒感染，可能会将登革热或寨卡病毒感染误诊为基孔肯雅病毒感染。目前还没有与基孔肯雅病毒感染相关的死亡、对神经侵袭性或者出血的记2 第1章前言载[19]。基孔肯雅病毒导致关节痛的机制尚不完全清楚，但人及动物实验表明关节痛的形成与宿主炎症反应有关[20]。基孔肯雅病毒在关节组织中具有较高浓度，病毒复制导致炎症细胞聚集，单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞构成主要的炎症细胞类型[21]。近年来随着基孔肯雅病毒的不断爆发，逐渐引起人们对该病毒的广泛关注。1.1.3基孔肯雅病毒粒子形态结构基孔肯雅病毒是一类有包膜的小型球状病毒，病毒粒子呈对称二十面体结构[22]（图1-2），直径约60～70nm。内层是病毒衣壳蛋白（Capsid）和病毒基因组的单股正链RNA组成的核衣壳结构，外层由3种囊膜蛋白（E1、E2、E3）与脂质双分子膜包裹。在中性pH条件下，E1、E2在病毒粒子表面形成稳定的异源二聚体，这些二聚体又聚合形成三聚体，三聚体插入到囊膜表面形成病毒粒子表面34.5nm的刺突，是病毒粒子表面最主要的抗原[23]。图1.2基孔肯雅病毒粒子结构及剖面结构[22]Figure1.2ParticlestructureandsectionstructureofChikungunyavirus[22]1.1.4基孔肯雅病毒的基因组结构特点及生命周期基孔肯雅病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，长约为12kb，5'端是由76个核苷酸组成的5’非编码区，帽子结构，中间是两个开放阅读框（openreadingframe,ORF），分别编码结构蛋白和非结构蛋白。3’非编码区不保守，含有polyA尾巴[24]（图1-3）。基因组第一个ORF编码病毒的4种非结构蛋白（nsP1、nsP2、nsP3和nsP4），主要是病毒的复制酶和转录酶[25]。第二个ORF编码病毒的4种结构蛋白（C、E3、E2、和E1），即核衣壳蛋白和囊膜蛋白。3 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定病毒粒子通过其表面的囊膜蛋白E2与宿主细胞膜融合，在低pH诱发下通过胞吞作用进入宿主细胞内，随后病毒进行脱壳释放出正链RNA，并以此为模板首先进行翻译，编码出的4种非结构蛋白（nsP1、nsP2、nsP3和nsP4）及宿主蛋白形成复制复合体[27-28]，以正链RNA为模板复制生成负链RNA，而后以负链RNA为模板形成一条正链RNA和一条26S亚基因组RNA，26SRNA翻译形成病毒的结构蛋白前体C-E3-E2-6K-E1，随后被切割形成成熟的结构蛋白，和正链RNA包装形成完整的成熟病毒粒子，这些病毒粒子通过出芽方式释放到细胞外[28]。图1.3基孔肯雅病毒基因组结构及生命周期[28]Figure1.3Chikungunyavirusgenomestructureandlifecycle[28]1.1.5基孔肯雅病毒的结构蛋白功能基孔肯雅病毒的结构蛋白主要包括衣壳蛋白（Capsid）和囊膜蛋白（E1和E2）。其中E1和E2形成异二聚体，分布在病毒粒子表面，形成病毒粒子的刺突，使病毒容易黏附在细胞表面和侵入细胞，两者的相互作用维持病毒体的完整性[29]。其中E1蛋白含有融合肽，E2蛋白含有推测的受体结合区域，可识别和结合宿主细胞表面的受体。在病毒进入细胞后，溶酶体内酸性环境诱发E1/E2异二聚体结构重排，暴露出融合肽，使得病毒囊膜（主要是E2蛋白）与宿主细胞膜融合，病毒基因组释放到胞浆内[33-35]。病毒的中和抗体识别表位大部分也都4 第1章前言位于E2蛋白上[32]。核衣壳蛋白（Capsid）能够与核糖体亚单位结合，进而促进核衣壳与基因组解聚，起始基因组转录和翻译[30-31]。E3蛋白介导E2与E1结合。6K是一个包含55～60个氨基酸的小蛋白，具有两个结构域，一个与离子通道功能有关，另一个为E1的信号肽[36]。1.1.6基孔肯雅病毒非结构蛋白的功能基孔肯雅病毒的非结构蛋白包括nsP1-nsP4[37]。其中nsP1（535aa）参与合成病毒负链RNA，同时具有甲基转移酶活性，参与基因组5’端甲基化；nsP2（798aa）具有蛋白酶活性和解螺旋酶活性，病毒复制和多聚蛋白前体的切割均受到nsP2蛋白的调控，同时还具有三磷酸酶活性可关闭宿主细胞转录；nsP3（530aa）是复制酶单元的一部分，有文献报道nsP3可能参与到病毒感染早期负链RNA的转录过程，目前对nsP3的功能所知较少，其高度变异且高度糖基化的C端能在大片段缺失后而不影响产毒，所以很有必要进一步研究该蛋白的功能[38]；nsP4（611aa）含有RNA依赖的RNA聚合酶GDD基序，是主要的RNA聚合酶，虽然在病毒感染的细胞内表达量极低[39]，但在整个转录过程中发挥着重要作用。1.1.7基孔肯雅病毒诊断检测方法目前针对基孔肯雅病毒的检测方法主要包括临床检测及实验室的检测。每种检测方法都有其优点也有局限性，临床检测就是根据典型的临床症状判断但是灵敏度不够且时效性差。实验室检测技术主要是病毒分离培养、血清学检测和分子生物学检测等[40-42]。这些检测方法快速且准确，灵敏度和特异性较好，是诊断检测中常用的技术手段。1.1.7.1基孔肯雅病毒临床综合诊断人感染基孔肯雅病毒后一般会突然发热，伴有头疼，全身性斑丘疹和多个关节剧烈的疼痛[45]，有些病人发病迅速在数分钟或数小时内丧失关节功能，不能活动，有些患者可能出现轻度结膜炎，这些都是基孔肯雅病毒发病急性期的症状。一般发热症状在7天左右即可消失，约3天后可能再次出现较轻微发热，一般持续3~5天即可恢复正常。有些病人在患病后会一直伴随着关节炎和肌肉疼痛，这就是病毒感染后的慢性期主要症状[44]（图1-4）。如果病人居住或者造访过病5 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定毒感染区，可根据这些症状初步判断是基孔肯雅病毒感染疑似病例；随后在实验室对病毒基因组的检测、病毒分离、抗体反应检测等才能够确诊是基孔肯雅病毒感染[25]。图1.4基孔肯雅病毒感染时间轴[44]Figure1.4TimelaneofChikungunyavirusinfection[44]1.1.7.2基孔肯雅病毒实验室诊断对于实验室诊断检测，一般要根据病毒感染后的病毒血症动力学以及人感染病毒后的免疫反应确定最佳的检测方法。基孔肯雅病毒感染潜伏期的临床症状不明显，需要采取快速、特异、灵敏度高的核酸检测技术进行检测，例如反转录PCR（RT-PCR）、实时荧光PCR（q-PCR）、半巢式RT-PCR、环介导等温扩增（LAMP）、核酸快速等温放大检测（RIDA）和依赖核酸序列的扩增（NASBA)技术等[46-48]。在病毒血症期间可利用血清学诊断检测方法检测病毒抗原或抗体；IgM一般出现在感染早期，可持续1-3个月，通常可在出现症状3-8天内对病毒特异性IgM进行检测，而IgG产生可持续数月乃至数年[49]。通常在感染后期采用包括间接免疫荧光法（IFA）、间接IgGELISA、免疫印迹法、血凝抑制试验、中和试验及病毒分离培养等进行检测[50]。(1)细胞培养病毒分离基孔肯雅病毒可在蚊虫细胞（C6/36），幼仓鼠肾细胞（BHK-21），非洲绿猴肾（VeroE6）及原代地鼠肾细胞中增殖[51-52]，也可用乳鼠、蚊虫等活体进行增殖[53]。Lakshmi等将32例经RT-PCR检测为基孔肯雅病毒阳性的患者血清用C6/36细胞进行培养，20例培养阳性[54]。虽然病毒分离培养目前是病毒实验室诊断的金标准，特异性高，不仅可以对所分离毒株进行来源、特征等方面的6 第1章前言鉴定，还可用于疾病的诊断。但该方法所需时间长，灵敏度相对较低，限制了其应用范围。(2)RT-PCRRT-PCR是以RNA为模板进行逆转录并扩增，适合RNA病毒的检测，由于其很高的灵敏度，特别适合于感染早期的检测。蔡绪禹等[55]将JEV、TBEV、EEEV、WEEV、CHIKV等5种病毒的基因保守区域同时作为引物，建立了多重RT-PCR，可简单快速的同时检测这5种病毒，具有良好的特异性和敏感性[56]。(3)实时荧光定量RT-PCR实时荧光PCR与普通PCR相比，具有快速、直观、灵敏度和准确度高、特异性好等特点。即使感染初期极少的核酸都可检测出，适用于早期和急性期的诊断[59]。实时荧光定量RT-PCR技术特别适合用于检测RNA病毒，不用体外逆转录，所收集的病毒样本都可以作为模板直接检测，简单方便[60]。目前常用的主要是染料法和TaqMan探针法，特别是探针法中，我们在一个体系中设定几个不同的探针即可实现多个病毒的同时检测且将这几个病毒区分开来[61]。Chen等[62]建立了用DNAP的发夹引物扩增基孔肯雅病毒的nsP2基因，该方法特异性强，敏感性高，与登革病毒无交叉反应，检出结果和临床诊断感染者检测结果几乎一致。(4)LAMP技术环介导等温扩增（LAMP）是新开发的一种在63℃左右恒温条件下利用链置换DNA聚合酶，即可完成基因扩增的恒温核酸扩增技术。这个技术不需大型仪器，操作简单，在恒温条件下，短时间内即可检测出结果，特别适合基层医疗单位[63-64]。李小波等[65]建立的基孔肯雅病毒LAMP法对6份入境患者及5份基孔肯雅病毒样本的检测结果均为阳性，而对登革病毒和乙脑病毒等的检测结果均为阴性，说明该方法特异性和灵敏度都很好。(5)间接免疫荧光间接免疫荧光法是抗原抗体直接反应，方法简便、特异性高，但是敏感性低，比如在病毒感染初期病人体内产生的抗体较少，这时候病人样本用作抗体检测，很可能检测不出结果。而且每检查一种抗原必须对应特定抗体，还需要荧光显微镜，观察结果需特殊培训，较为耗时耗力[66]。(6)间接ELISA检测方法7 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定ELISA常用于检测病毒特异性抗原或者抗体，特异性和灵敏度较高[67]。但是对于检测同一血清学组的病毒可能会存在交叉反应，任瑞文[68]等建立了检测基孔肯雅病毒的ELISA方法，对54份经实时荧光PCR检测的基孔肯雅病毒患者血清标本进行检测，结果均为阳性，并且与登革热患者和健康体检人群无交叉反应。(7)中和试验中和试验是用抗体使相应抗原（毒素或病毒）的毒性或传染性消失的试验。该方法特异性高，敏感性强，可作为基孔肯雅病毒的确诊试验，但实验需要活病毒，实验操作具有一定的危险性，且目前我国规定基孔肯雅病毒的培养需在BSL-3实验室内进行，因此限制了该方法的推广及应用[69]。(8)免疫印迹法免疫印迹法（Immunoblottingtest，IBT）是凝胶电泳与抗原抗体反应相结合的一项检测技术，用于一次分析大容量样本且分辨率高、特异性强等(43)。样品中相应的抗体或抗原即与已知特定抗体特异性结合，再通过显色实现特异性的免疫诊断。该方法快速、操作简单、适用于快速筛查。Kowalzik等[74]用该方法对30例基孔肯雅病毒阳性患者进行检测，22例阳性。目前该方法的临床应用较少。与传统的病毒分离法相比，分子生物学和血清学检测方法的敏感性和特异性更高。随着分子生物学技术的飞速发展，以上这些常用的技术等都可作为有效监测手段用于病毒的检测，为及早确诊病情采取相应的治疗措施提供了重要的依据[75]。1.1.8基孔肯雅病毒疫苗研制及治疗策略基孔肯雅病毒可以引起严重的慢性多发性关节炎和多关节疼痛，目前尚无有效的治疗手段，虽然目前已有一些药物，如利巴韦林、氯奎宁（疟疾特效药）和一些特异性的抗体正在进行测试，但是效果不理想。相比于治疗性药物，疫苗（包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒（virallikeparticles,VLP）、DNA疫苗、嵌合疫苗等）可能是更有效、更经济的保护措施[76]。同时，目前越来越多的药物开发把目标放在一些特定靶点上，例如最近，澳大利亚的研究人员在研究基孔肯雅病毒的动物模型中发现颗粒酶A可能会加8 第1章前言重被基孔肯雅病毒感染的小鼠关节炎症状[77]，这就表明颗粒酶A可能成为治疗该疾病的潜在靶点。1.1.9单克隆抗体概述及应用1.1.9.1单克隆抗体技术的产生及发展自然界中有机体可以通过免疫系统对抗原应答而产生抗体。针对多个抗原决定簇产生多样混合抗体即为多克隆抗体。仅针对某一特定抗原表位并由单个B淋巴细胞克隆产生的高度均一的抗体，称为单克隆抗体（monoclonal-antibody,mAb）。传统体外产生单抗的杂交瘤技术是由Kohler和Milstein在1975年首先建立的[78]。这种技术主要是在体外将无限增殖的骨髓瘤细胞和免疫后可分泌抗体的B淋巴细胞融合，再经相应筛选及单克隆化得到大量能稳定分泌特异性抗体的单克隆细胞株。这一技术为血清学诊断检测和治疗性单克隆抗体的发展奠定了基础[79-81]。1.1.9.2单抗隆抗体的研究现状单克隆抗体具有高特异性、高纯度、高效价、低血清交叉反应、易于大量生产等优点，所以在80年代末开始应用于临床，但是目前制备的单克隆抗体多为鼠源性，在人体内可引起较强的人抗鼠反应[79]，包括过敏反应、诱导形成人抗鼠抗抗体、半衰期短及与人Fc受体结合弱，抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）相对较弱等[80]。从而严重地限制了单克隆抗体在临床上尤其是抗病毒治疗的应用[81]。随着噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术、转基因/转染色体小鼠技术，单细胞抗体克隆技术以及和重组DNA技术的发展，改良抗体人鼠嵌合体单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源化单克隆抗体应运而生。这些嵌合单克隆抗体不仅免疫原性较低，在人体内也具有更长的半衰期，极大的地提高了单克隆抗体效用[82]，这就有效解决鼠源抗体无法应用于临床的难题，为单克隆抗体的应用提供更广阔的空间，并在疾病治疗和临床实践中具有极大的应用潜力，势必给人类的健康带来福音[83]。（1）嵌合型抗体抗体的可变区可以特异性结合抗原，而其恒定区的免疫原性最强，我们目前制备的抗体大部分是鼠源性的，恒定区的鼠源免疫性很强，严重影响了我们的应用。将鼠源性单抗的恒定区的鼠源片段用人源化片断替代，尽可能的减少单抗的9 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定异源性，同时还不影响抗体特异性结合抗原的能力[84-86]。常用的方法就是将杂交瘤细胞中的功能性可变区基因分离出来，与人Ig恒定区的基因连接，表达出人-鼠嵌合抗体，但是这种抗体仍保留了部分的鼠源性（约30%）[87]。（2）人源化抗体由于嵌合抗体仍然保留了部分鼠源性，应用于临床治疗还是不可行，还需要对鼠源片段进行完全人源化改造，人源化的方法很多,主要是抗体重构和表面重塑技术[88]。抗体重构就是在人IgG的相应部位插入鼠抗体的互补决定区（CDR），人源化程度很高，是目前最常用、最基本的方法。而表面重塑技术，即将鼠源抗体表面与人抗体表面差别明显区域的氨基酸的残基进行人源化改造，在维持抗体活性并减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换[89-90]。（3）中和抗体产生及功能感染基孔肯雅病毒数周后，就会有特异性的抗体产生，一般针对包膜糖蛋白产生的抗体可能具有中和活性，能够中和或防止病毒感染，常被用于病毒感染的体外诊断检测[91]。中和抗体既可以中和游离的病毒颗粒，发挥抗病毒作用，又可以作用于被病毒感染的细胞，发挥保护性作用进而使感染得到控制[92]。在病毒感染的急性期，一般中和抗体缺乏，细胞免疫反应则更为关键，发挥主导作用[93-95]。然而，在病毒感染的慢性期，中和抗体大量产生发挥着中和病毒颗粒、防止病毒在细胞间传播的重要作用[95]。1.1.9.3单克隆抗体的应用单克隆抗体具有特异性强，灵敏度高，易于体外大量制备的特点，常可以用作体外诊断检测试剂，特别是应用于血清学诊断检测。例如可以利用病毒结构蛋白抗体建立相应的ELISA方法，可以检测病人血清中特异性的病毒抗原或抗体。如果单克隆抗体有中和活性，这些抗体就可以用于抗病毒治疗。同时研究中和抗体中和机制及作用表位，可以为疫苗研制提供良好的依据。随着现代分子生物学技术的发展，越来越多的改良抗体应运而生，不断扩充着单克隆抗体的种类和使用范围，使克隆抗体的应用越来越广泛[97]。1.2本研究的目的和意义1.2.1基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR研究的意义10 第1章前言前面提到目前针对基孔肯雅病毒没有良好的治疗药物和措施，前期的检测诊断就显得尤为重要，而且基孔肯雅病毒与近几年流行开来的寨卡病毒在发病初期的临床症状很相似，很难通过症状确诊病人是否感染基孔肯雅病毒，我们需要建立一种快速，特异性和灵敏度高的检测手段，而核酸检测诊断中的荧光定量PCR放法就是其中一种[95]。本研究中，我们建立了一种可以同时检测又能区分两种病毒的荧光定量RT-PCR方法，在短时间内较为准确的检测出病毒，为实验室和临床应用提供了有效的检测手段。1.2.2基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备意义E2蛋白是基孔肯雅病毒粒子表面的主要糖蛋白，也是抗原表位主要区域，这些表位和病毒的中和活性，血凝抑制活性和抗感染活性有关(何竞等，2002)E2蛋白主要分为三个区域（domainA，domainB和domainC）[97]，是病毒的受体结合蛋白，全长423aa，其中胞外区为1-364aa，跨膜区为365-390aa，胞内区为391-423aa，其病毒表面覆盖了胞外区段大部分，含有中和活性抗原决定簇，参与宿主细胞识别，在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用[98]。迄今为止，细胞表面参与基孔肯雅病毒识别黏附及入胞的分子机制还不完全清楚，所以研究E2蛋白的结构及功能对于研究病毒感染机制具有重要意义。图1.5基孔肯雅病毒E2蛋白结构域和三维结构[98]Figure1.5SchematicdiagramoftheE2proteinshowingthepositionsofthedomains,withasterisksindifferentcolourscorrespondingtothemappedepitopes[98]基孔肯雅病毒中和表位大部分都位于E2蛋白上，如果后期我们筛选到有中和活性的单抗，就可以用于抗病毒治疗，Levine(79)等研究证实小鼠感染甲病毒11 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定后，如果使用3株不同E2蛋白表位的单克隆抗体进行治疗，可以有效清除小鼠体内已侵入机体神经组织的病毒。Grosfeld(81)等将塞姆利基森林病毒（SFV）的E2蛋白截短表达为相互重叠的6条短肽，用这6条短肽免疫小鼠后攻毒发现其中3条短肽对小鼠有50%以上的保护率(Grosfeldetal.,1989)。我们推测产生保护作用很可能是E2蛋白上的中和表位发挥了重要作用，这些位点在甲病毒中可能很保守，能够参与病毒表面与细胞受体的结合(82-84)，但是目前发挥作用的抗原表位还不明确，所以本文旨在制备基孔肯雅病毒E2蛋白的单克隆抗体，一部分用于诊断检测材料，一部分用于抗病毒研究，并进一步鉴定E2蛋白的相关抗原表位及特异性，对于基孔肯雅病毒的检测和治疗具有重要意义。12 第2章基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR建立第2章基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR建立目前对于基孔肯雅病毒的常用实验室检测方法主要有3种：病毒分离、血清学检测和多聚酶链式反应(PolymeraseChainReactionPCR)等分子生物学技术。虽然敏感细胞培养或动物分离病毒仍然是诊断的“金标准”，但这种方法周期长，且很多实验室缺少开展病毒分离所必备的条件。用ELISA法检测血清中的病毒特异性抗原或抗体是目前常用的诊断方法，但血清学方法对发病早期或者急性发作期的诊断效果不佳，而早期准确诊断病人是否感染病毒是救治病人和控制疫情的关键，这就需要有一种快速、灵敏、准确的检测手段。目前检测患者样本中病毒核酸的分子生物学方法是较为合适的方法。本章我们基于目前常用的TaqMan探针实时荧光RT-PCR技术，建立了一种在同一反应体系内同时检测基孔肯雅病毒和寨卡病毒的双重实时荧光RT-PCR方法。2.1实验材料2.1.1实验仪器超净工作台，（哈东联公司）；9BHC-1360IIA/B3生物安全柜，(东联电子)；荧光正置显微镜，(Nikon)；细胞培养箱，(HeraCell,Thermo)；荧光定量PCR仪，(ABI公司)；超低温冰箱，(Thermo公司)；台式离心机，（Thermo，PICO21）高性能通用离心机，（Thermo）；干式恒温器，（奥赛仪器有限公司）；分光光度计（Nanodrop2000,Thermo）；电热恒温水槽，(DK-8D)；微型涡旋振荡仪，(MS2)；pH计，(Orion818)；常量天平，(TE601-L,Sartorius)；冷藏和冷冻两用冰箱，(Midea公司)；全自动灭菌锅，(HVE-50,HIRAYAMA)2.1.2细胞系、病毒（1）细胞系：BHK-21细胞，由武汉病毒所王汉中研究员惠赠；Vero细胞，由本实验室保存；（2）病毒：基孔肯雅病毒（CHIKV）和寨卡病毒（ZIKV）为本实验室构建的感染性克隆体外转录后转染细胞所拯救的病毒；其他黄病毒：日本脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus,JEV，SA14strain)，II型登革病毒(DENV2,TSV01strain)，西尼罗病毒(WNV,3356strain)，蜱传脑炎13 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定病毒(TBEV,WH2012strain)，鄂木斯克出血热病毒(OHFV,Gurievstrain)，黄热病毒(YFV,17Dstrain)，寨卡病毒（ZIKVstrainsH/PF/2013andMRS_OPY_Martinigue_PaRi_2015）由中国科学院武汉病毒研究所微生物和病毒保藏中心惠赠；ZIKVGZ01/FSS13025，由军事医学科学院秦成峰老师惠赠；WIV-SZ01ofZIKV(GenBankaccessionnumber:KU963796)，由本实验室邓成林老师分离。（3）其他实验材料：35mm细胞培养皿（Corning），6孔板（Corning）2.1.3化学试剂和试剂盒（1）化学试剂：Trizol，购自TAKARA公司；氯仿，购自国药集团化学试剂有限公司；异丙醇，购自国药集团化学试剂有限公司；70%乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司；RNAasefreeH2O，购买于国药集团化学试剂有限公司；氨苄青霉素（Amp）和卡那霉素（Kan）购自华美生物工程公司；DMEM培养基，购自Hyclone公司；胎牛血清，购自GIBCO公司；PBS缓冲液：0.2gKCl,0.2gKH2PO4,8.0gNaCl,3.14gNa2HPO4·12H2O;（2）试剂盒：QIAampViralRNAMinikit(Qiagen)；OneStepSYBR®PrimeScript™PLUSRT-PCRKit（CodeNo.:RR064A）2.2实验方法2.2.1基孔肯雅病毒和寨卡病毒病毒RNA提取(1)取500μLAVLbuffer于进口EP管中。(2)取140μL病毒液于上述EP管中，涡旋震荡15s，室温放置10min，瞬离。(3)向上述离心管中加入560μL无水乙醇，涡旋15s，瞬离。(4)向Spin柱子中加入630μL上述步骤3中的溶液，6000g，离心1min，将柱子放在新的收集管中加入剩余的630μL，6000g，离心1min。(5)将柱子放在新的收集管中，加入500μLbufferAW1，6000g离心1min，换新的收集管，加入500μLbufferAW2，13.3g离心3min。(6)将柱子放入进口EP管中，最高转速离心1min。(7)将柱子放入新的进口EP管中，加入60μLbufferAVE室温放置1min，6000g(8)离心1min，分装两管，10μL/管，-20℃保存。14 第2章基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR建立2.2.2基孔肯雅病毒和寨卡病毒感染细胞总RNA提取(1)在长满细胞的小皿中，弃旧的培养基，加入2mLPBS洗涤细胞一次，加入1mLTrizol裂解细胞,室温放置5min后，用枪轻轻吹打细胞直至裂解液不再粘稠。(2)将细胞裂解液转移至EP管中，加入200μL氯仿，盖紧盖子涡旋振荡至充分乳化，室温静置2-3min出现分相后，于4℃,13,3000r/min离心15min。(3)小心吸取上层透明液体至新的进口EP管中，加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，-30℃沉淀至少30min。(4)4℃,13,3000r/min离心15min，弃上清。(5)加入1mL70%乙醇洗涤，4℃,13,3000r/min离心15min，小心吸除上清，使用100μLNuclease-free去离子水溶解RNA。(6)取1μLRNA用Nanodrop2000分光光度计检测浓度。2.2.3双重实时荧光定量RT-PCR引物和探针的设计表2.1双重实时荧光定量RT-PCR引物和探针Table2.1SequencesofprimersandprobesusedinthemultiplexRT-PCRassayPrimerNucleotideVirusSequence（5’-3’）Location/Probeposition*ZIKVF1CGCAGGATCATAGGTGATGAAGNS510284-10305R1CCTGACAACACTAAAATTGGTGC3’UTR10402-10380Probe1VIC-ACAGCACTCCAGGTGTAGACCCTTC-BHQ1NS510377-10353CHIKVF2ACGTGGATATAGACGCTGACAGnsP190-111R2GCATGGTCATTTGATGTGACCnsP1189-169Probe2FAM-CGTGCGTACCCCATGTTTGAGG-BHQ1nsP1134-155引物与探针的设计从GenBank中收集了103株寨卡病毒和333株基孔肯雅病毒的基因组核苷酸序列，分析每种病毒的基因保守区，选择了CHIKVnsP1和ZIKVNS5两段序列（两者序列存在特异性）应用生物软件Premier5software15 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定PrimerExpression2.0（PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA）在保守序列内设计特异性引物和探针，所有引物的Tm值都在58～62℃之间，所有探针的Tm值均比引物高8～10℃；设计好的引物和探针序列进行验证并分析其扩增效率和特异性。2.2.4双重实时荧光定量RT-PCR体系的配制按照OneStepSYBR®PrimeScript™PLUSRT-PCRKit（CodeNo.RR064A）试剂盒的说明书，我们配制了同时含有CHIKV和ZIKV的引物和探针的体系，并按照AppliedBiosystems,AppliedBiosystems,（FosterCity,CA,USA）仪器设置了相应的扩增条件；表2.2双重实时荧光定量RT-PCR体系Table2.2SequencesofprimersandprobesusedinthemultiplexRT-PCRassay（1）反应体系如下：试剂体积RNasefreeH2O5.8μL2×onestepRT-PCRbufferIII10μLCHIKV-F/R各0.4μLZIKV-F/R各0.4μLCHIKV-Probe/ZIKV-Probe各0.2μLTaKaRaEX-TaqMix0.4μLPrimescriptRTEnzyme0.4μLROX0.4μLRNAtemplate各2μL总体积20μL（2）反应条件：Step1：42°C逆转录5min；Step2：95°C预变性10s；Step3：95°C变性10s；Step4：60°C退火和延伸34s（40个循环）；2.2.5双重实时荧光定量RT-PCR标准曲线建立16 第2章基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR建立我们用实验室构建的CHIKV和ZIKV全长感染性克隆体外转录的RNA做模板，用上述体系在体外建立CHIKV和ZIKV的标准曲线。以CHIKV标准曲线建立为例，RNA模板进行如下稀释：先将RNA稀释为1ng/μL，再进行10倍进行系列稀释，最后用10-3-10-8倍稀释的RNA作为模板，用上述体系进行RT-PCR实验，以扩增所得到的CT值为Y轴，以获得的病毒RNA拷贝数的对数值为X轴分别建立两种病毒的标准曲线；2.2.6双重实时荧光定量RT-PCR法灵敏度和特异性检测（1）灵敏度检测为了检测上述体系在病毒含量很低的情况下是否还能准确够检测到，我们对上述RT-PCR体系进行了灵敏度检测，以CHIKV为例进行详细叙述，首先我们将已知滴度的CHIKV（7×106PFU/ml）先稀释至106PFU/ml，再进行10倍系列稀释至105PFU/ml，104PFU/ml，103PFU/ml，102PFU/ml，100PFU/ml，10PFU/ml，5PFU/ml，再分别从上述稀释好的病毒液中取100μL即为105PFU，104PFU，103PFU，102PFU，10PFU，1PFU，0.5PFU；将这些病毒液用病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA，提取的病毒RNA用作模板做RT-PCR灵敏度检测；反应体系和反应条件和2.4相同。（2）特异性检测为了检验所建立的RT-PCR体系是否特异性检测CHIKV和ZIKV，而与其他虫媒病毒没有交叉反应，我们进行了特异性试验，我们选择了JEV(SA14),DENV2(TSV01),WNV(3356),YFV(WH2012),TBEV(Guriev),和OHFV(17D)这6株虫媒病毒，提取各个病毒RNA作为模板，用上述建立的RT-PCR体系进行检测，反应体系和反应条件和2.4相同。2.2.7双重实时荧光定量RT-PCR法检测不同株的CHIKV和ZIKV由于CHIKV和ZIKV的不同毒株存在差异，为了验证建立的上述体系是否适用于CHIKV和ZIKV的不同毒株检测，我们进行了广泛性实验，我们选择了CHIKV和ZIKV不同株的病毒，CHIKV（CHIKV-JC2012）/（Pakistan-03）；ZIKV（H/PF/2013）（MRS_OPY_Martinigue_PaRi_2015）（/GZ01）（/FSS13025）/（SZ-WIV01），提取这些病毒的RNA，作为模板进行RT-PCR检测，反应体系和反应条件和2.4相同。17 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定2.2.8双重实时荧光定量RT-PCR法检测ZIKV生长曲线为了验证所建立的上述方法是否可以用于检测到处于不同生命周期的病毒，我们用上述方法对ZIKV的生长曲线进行了检测，具体步骤如下：（1）病毒培养1于感染前一天分Vero细胞2×105于35mm小皿中。2细胞按照感染复数=0.1（MOI=0.1）进行感染，37℃，5%CO2培养1h。31h后弃掉上清液，补加1ml2%DMEM。4在感染24h，36h，48h和60h后分别进行收毒。5上述收的不同时间点的毒一部分用于单层噬斑检测病毒滴度，一部分用6上述方法检测病毒RNA含量。（2）使用单层噬斑检测病毒的滴度，绘制病毒生长曲线，具体的实验步骤如下：1于噬斑实验的前一天以每孔1×105BHK-21细胞量接种至24孔板中，37℃培养箱培养过夜。2第二天观察细胞汇合度为90-100%时，可进行单层噬斑实验。3按照10倍系列稀释方法稀释病毒。4将长满细胞的24孔板细胞培养基弃掉，按照稀释度由高到低分别加入稀释好的病毒(100μL)，37℃培养箱孵育1h，每15min轻轻晃一次24孔板，使病毒均匀分布。5将每孔中的病毒液按照稀释度由高到低吸出，向每孔中加入1mL上层覆盖物(200mL4%甲基纤维素+200mL“4%FBS+2×DMEM”)，37℃培养3-4天。6肉眼可见病毒形成噬斑后，吸弃孔中的上层覆盖物，加入1mL固定染色液(3.7%甲醛+1%结晶紫)，室温处理至少30min。7用流水将固定染色液冲干净并烘干后，计数病毒噬斑数目。8选取噬斑清楚数目在10-100之间的孔计算病毒滴度(PFU/mL)。（3）RT-PCR方法检测ZIKV生长曲线上述收集的不同时间点的ZIKV，先按照OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit(PerfectRealTime,TaKaRa)试剂盒提取病毒RNA，用这些RNA作为模板进行荧18 第2章基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR建立光定量RT-PCR检测，反应体系和反应条件和2.4相同。以不同收毒时间为X轴，不同时间点病毒RNA拷贝数的对数为Y轴，建立ZIKV生长曲线。2.2.9双重实时荧光定量RT-PCR法检测临床样本上述建立的同时检测CHIKV和ZIKV的双重荧光定量RT-PCR方法可以实现在实验室的准确，特异和快速检测，但是这仅仅是在细胞培养病毒的基础上，此方法是否适用于真实临床样本的检测，检测效果是否一样准确，我们将疑似感染CHIKV的病人血清作为临床样本，用此方法进行检测，具体步骤如下：(1)疑似感染CHIKV的病人血清用OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit(PerfectRealTime,TaKaRa)试剂盒按照上述方法提取病毒RNA。(2)提取的血清中病毒RNA作为模板，用上述建立的检测体系进行检测。(3)同时将病人血清接种细胞进行病毒分离。(4)检测结果与病毒分离结果，医院的检出率进行比较，评价本方法的准确性。2.3实验结果2.3.1双重实时荧光定量RT-PCR标准曲线通过建立CHIKV和ZIKV的标准曲线发现，用不同浓度的RNA标准品为模板进行寨卡病毒与基孔肯雅病毒扩增，扩增结果均呈现典型的荧光定量S型扩增曲线（阴性对照未出现扩增曲线），检测不同稀释度的含有CHIKV和ZIKV目的基因片段的RNA标准品的CT值，用CT值和对应的标准品拷贝数的对数建立标准曲线。图2.1基孔肯雅病毒和寨卡病毒标准曲线Figure2.1StandardcurvesforZikavirus(ZIKV)andchikungunyavirus(CHIKV)19 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定由上述结果可以看出，其中寨卡病毒标准曲线为Y=-3.6242X+46.671，R2=0.9977（图2.2.A）。基孔肯雅病毒标准曲线为Y=-3.6304X+42.709，R2=0.9994（图2.2.B）[因为本文主要强调的是CHIKV，所以所有的结果都是CHIKV放在前面，相应图A和B的顺序也做以调整]。结果表明RNA标准品CT值与核酸拷贝数之间均具有良好的线性关系。2.3.2双重实时荧光定量RT-PCR灵敏度检测为了评价此体系是否可以很灵敏的检测出样本中含量较低的病毒RNA，我们进行了灵敏性检测，从检测结果看出，此体系检测CHIKV的检测极限为1PFU病毒粒子，检测ZIKV的检测极限为0.5PFU病毒粒子，根据前期建立的标准曲线计算得到，1PFU病毒粒子是约10copies，0.5PFU病毒粒子是约3.16copies，而此时阴性对照未出现扩增曲线（CT值大于等于35即可认为是阴性），说明此体系在检测样本中很低含量的CHIKV和ZIKV时很灵敏，在样本中含有1PFU（CHIKV）或者0.5PFU（ZIKV）病毒粒子时都可以检测到（结果如图2-2所示）。但是我们建立的体系主要是检测样本中病毒核酸的含量，对于检测到的病毒粒子的完整性无法确定。图2.2基孔肯雅病毒和寨卡病毒灵敏度检测曲线Figure2.2Amplificationplotsofthemultiplexreal-timeRT-PCRassayfordetectionlimit2.3.3双重实时荧光定量RT-PCR特异性检测为了检测我们建立的检测体系是否只能同时CHIKV和ZIKV而与其他虫媒病毒没有交叉反应，我们又选择了其他的虫媒病毒的RNA做模板进行RT-PCR检测，结果发现，此体系只可以检测到CHIKV和ZIKV，而检测其他虫媒病毒都呈阴性（CT值都在36左右，我们将CT值35作为Cut-off值，没有扩增曲线20 第2章基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR建立（结果如表2-3所示）。说明我们建立的检测体系的特异性很好，在很低的病毒含量情况下仍能很好的检测到CHIKV和ZIKV，而与其他的虫媒病毒不存在交叉反应。表2.3双重实时荧光定量RT-PCR特异性检测Table2.3Assessmentofspecificityofreal-timeRT-PCRusingotherstrainsofarbovirusOtherArbovirusesVirusStrainGenbankIDMeanCTJEVSA14U1416336.22DENV-2TSV01AY03711635.67WNV3356AF40475637.02TBEVWH2012KJ75518637.65OHFVGurieuAB5078036.98YFV17D——36.10Negative————36.982.3.4双重实时荧光定量RT-PCR检测不同毒株的CHIKV和ZIKV前面我们检测此体系的特异性时发现，此体系只能特异性检测出CHIKV和ZIKV而检测不到其他虫媒病毒RNA。但是目前CHIKV和ZIKV在世界范围内分布流行着很多不同的毒株，每株毒株的序列存在不同差异，前述我们用的是ZIKV(strainMR_766)和CHIKV(JC2012)，为了验证我们建立的检测体系是否可以检测到很多不同的毒株，我们对CHIKV和ZIKV很多不同毒株也进行了测试。结果发现，此体系在检测CHIKV和ZIKV的许多不同毒株的CT值都在16左右，与我们之前检测检测的结果接近，这就说明我们建立的体系对于CHIKV和ZIKV的不同毒株也能很灵敏的检测到，扩大了其检测范围。21 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定表2.4双重实时荧光定量RT-PCR广泛性检测Table2.4Broadactivityofmultiplexreal-timeRT-PCRassayfordifferentisolatesofCHIKVandZIKVfromVerocellsinfectedbyvirusesZIKV/CHIKVVirusStrainGenbankIDMeanCTZIKVH/PF/2013KJ77679116.91MRS_OPY_MartiueKU64767617.14_PaRi_2015GZ01KU82089814.17FSS13025KU95559313.34SZ-WIV01KU96379616.37CHIKVCHIKV-JC2012KC48865013.37Pakistan-03MF74087416.05Negative————36.982.3.5双重实时荧光定量RT-PCR检测临床样本上述检测都是以实验室培养的病毒提取RNA作为模板的，其特异性还是很高的，为了测试此体系能否用于临床样本的检测，我们用此体系检测了10例来自巴基斯坦疑似感染CHIKV的病人血清样本，并同时将血清感染细胞进行病毒分离，也同时用SYBR单重荧光定量RT-PCR方法进行检测，检测结果发现10例病人样本中有8例是呈阳性的，这与我用SYBR单重荧光定量RT-PCR检测结果一致，与医院检出结果相一致，也与我们后期分离病毒的结果一致（结果如图2-5所示），这也就说明，我们建立的检测体系不仅可以很好的用于实验室检测，也可以用于临床样本检测，有很大的实用价值。22 第2章基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR建立表2.5双重实时荧光定量RT-PCR检测临床样本Table2.5DiagnosticsofthemultiplexRT-PCRassaycomparedtovirusisolationforthedetectionofCHIKVinclinicalserumsamplesResultMultiplexTaqmanSampleSYBRGreenVirusRT-PCRinthisstudyRT-PCRisolationFAMsignalVICsignalforCHIKVforZIKV#1+++−#2−−−−#3+++−#4+++−#5+++−#6+++−#7+++−#8−−−−#9+++−#10+++−2.3.6双重荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒（ZIKV）生长曲线由于我们建立的上述检测方法是只检测病毒RNA的，病毒在不同的生命周期处于不同的形态，我们希望此方法可以检测到处于任何生命周期的病毒，所以我们用此检测体系绘制了ZIKV的生长曲线，同时也用单层噬斑法检测了病毒生长曲线，将两者进行比较，结果表明两者的趋势一致，结果由图2.4所示。而且由两曲线可以建立起病毒滴度和病毒RNA含量的线性关系，今后可通过检测样本中病毒RNA的含量获得病毒的滴度。23 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定图2.4双重荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒生长曲线Figure2.4MeasurementofmultiplicationofZIKVinVerocellsusingtheone-stepmultiplexreal-timeRT-PCRassay2.4讨论基孔肯雅病毒和寨卡病毒都是虫媒病毒且有着相同的传播途径，流行地域具有交叉性、并且感染早期，临床症状极为相似。此外，传统血清学检测方法诊断易发生交叉反应且灵敏性、特异性较低，故分子生物学诊断方法在早期病毒感染诊断中起着重要的作用。基于此，本实验建立了针对基孔肯雅病毒和寨卡病毒的双重实时荧光定量检测方法。该方法组合了两种病毒的引物探针，适当引入简并碱基以确保检测的保守性和特异性，并对反应体系及循环程序进行了优化，可实现从单种病毒检测到同时进行两种病毒检测，节省了样品用量以及实验资源和时间，为基孔肯雅病毒和寨卡病毒的鉴别诊断提供了新的技术策略。我们利用基孔肯雅病毒和寨卡病毒的各自体外转录标准品对建立的双重实时荧光定量PCR方法进行评价，结果显示该方法对两种病毒体外转录RNA最低检测限在0.5-1拷贝/PCR，病毒培养物最低检出限均低于10PFU/ml，与其他虫媒病毒等无交叉反应。此外，我们利用基孔肯亚病人临床标本对该方法进行了验证，检测的结果与单重RT-PCR方法检测结果大致相同。本研究所建立的双重实时定量荧光RT-PCR具有良好的特异性、灵敏性和稳定性。与单重实时荧光定量PCR相比，灵敏度上无明显差异，此外本方法不仅能简化实验步骤，减少样本用量，节约实验成本，为快速排查疑似感染人群提供参考信息，为相关疾病的鉴别诊断提供技术支持，为控制疫情争取宝贵时间。24 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定目前针对基孔肯雅病毒的检测诊断方法主要是核酸检测和血清学（抗原或抗体）检测。在建立基孔肯雅病毒和寨卡病毒双重荧光定量RT-PCR检测法（第二章）的基础上，我们希望筛选出针对基孔肯雅病毒结构蛋白E2的特异性强且效价高的单克隆抗体，E2蛋白是基孔肯雅病毒主要的抗原表位所在区且含有中和表位，因此针对E2蛋白的单克隆抗体既可以作为良好的血清学诊断检测实验材料，也具有潜在的中和活性，在病毒检测、感染防治以及病毒蛋白的功能研究等方面均具有良好的应用价值。3.1实验材料3.1.1仪器及设备高性能离心机，（Thermo公司）；恒温摇床，（ZHWY-211C,上海智诚）；超低温冰箱，（Thermo公司）；9BHC-1360IIA/B3生物安全柜，（东联电子）；PCR基因扩增仪，（广东晶格公司）；超净工作台，（哈东联公司）；常量天平，（TE601-L,Sartorius）；台式离心机，（Thermo,PICO21）；干式恒温器，（奥赛仪器有限公司）；冷藏和冷冻两用冰箱，（Midea公司）；全自动灭菌锅，(HVE-50,HIRAYAMA)；多功能酶标仪，（Thermo公司）；分光光度计，（Nanodrop2000,Thermo）；细胞培养箱，（HeraCell,Thermo）；荧光正置显微镜，（蔡司）液氮储存罐（35L）；电热恒温水槽（DK-8D）；垂直电泳槽（DYY-Ⅲ）微型振荡仪（MS2）；pH计，（Orion818）；凝胶成像系统，（Tanon）；高速离心机，（J-26XP,BECKMAN）；化学发光仪，（Thermo公司）；自动封膜机，（KS-200,HONGZHAN）；Trans-BlotTurbosystem,（Bio-RAD）；高压破碎仪，（ATSEngineeringmc;MOEDE：AH2010）3.1.2材料菌株、细胞、病毒、小鼠（1）菌株：扩增菌株DH5α，表达菌株BL21、Rosetta由本实验室保存。（2）细胞：非洲绿猴肾细胞(Africangreenmonkeykidney,Vero)；乳仓鼠肾细胞（BabyHamsterSyrianKidney,BHK-21）由本实验室存；SP2/0骨髓瘤细胞系由鄢慧民老师实验室馈赠。25 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定（3）病毒：基孔肯雅病毒由本实验室从感染性克隆拯救扩增所得（CHIKV-FL-pACYC）。（4）小鼠：6-8周龄BALB/c雌鼠（购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心）。3.1.3质粒、酶、器材（1）质粒：pET15b（+）原核表达质粒由本实验室保存，PCAGGS-CHIKV-E2真核表达质粒由本实验室保存。（2）酶：限制性内切核酸酶均购自Fermentas公司；高保真聚合酶PrimeStarHSDNA购买于Takara公司；T4DNAligase购自NEB公司。（4）手术器材剪刀、镊子、研磨器、3ml无菌巴氏滴管(Corning)、96孔细胞培养板(Corning)、24孔细胞培养板(Corning)、T25细胞培养瓶(Corning)。3.1.4试剂盒及相关试剂DNA分子量marker和蛋白质分子量marker购自Fermentas公司；IPTG购自Bio-Tec公司；HRP标记和FITC标记的山羊抗鼠二抗购自Proteintech公司；氨苄青霉素（Amp）和卡那霉素（Kan）购自洁洋盛生物公司；NisepharoseFastFlow购自GE公司；质粒小提试剂盒和DNA纯化回收试剂盒购自天根生物公司；HATsupplement(SIGMA,H0262)、HTsupplement（SIGMA,H0137）；50%PEG（SIGMA,P7181,25322-68-3）；FBS（Gibco）购自sigma公司，淋巴细胞分离液购自深圳达科为公司，75%医用酒精，TMB双组份显色试剂盒（B200051,proteintech），RPMI1640(Gibco)；蛋白裂解溶液：20mM蛋白洗脱溶液；弗氏完全佐剂（sigma,F5881-10ml,lot#SLBL9743V），弗氏不完全佐剂（sigma,F5506-10ml,lot#SLBV7908V），抗体亚型试剂盒（SouthernBiotech,SBAClonotypingSystem-HRP,Cat.No:5300-05），ProteinGsepharoseFastFlow购自GE公司（Cat.No:15920-010），1640培养基（Gbico）。3.2实验方法3.2.1基孔肯雅病毒结构蛋白E2的表达纯化3.2.1.1pET15b-CHIKV-E2原核表达质粒构建26 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定图3.1基孔肯雅病毒E2蛋白原核表达克隆构建示意图Figure3.1ConstructionofthecloneofchikungunyavirusE2protein3.2.1.2引物设计根据本实验建立的基孔肯雅病毒全长感染性克隆（CHIKV-FL-pACYC）为模板，合成特异性扩增E2基因片段的上下游引物（引物序列见表3-1）。预扩增片段长约1269bp，上下游引物均由武汉擎科创新生物有限公司合成。表3.1PCR扩增所用引物Table3.1PrimersforthePCRNameSequence（5′-3′）NcoI-E2-FCATGCCATGGGCAGTATTAAGGACCACTTCAABamHI-E2-RCGCGGATCCTTAATGATGATGATGATGGTGCGCTTTAGCTGTTCTAATGCAG3.2.1.3PCR扩增基孔肯雅病毒的E2基因片段表3.2PCR的反应体系Table3.2ThereactionsystemofPCR体系体积H2O补足至50μL10×PrimScriptbuffer5μLdNTPmix2-3μgPrimScript酶20U模板10ng上游引物/下游引物各1μLPCR反应体系为：94℃2min；(94℃20s、55℃10s、72℃1min)35个循环；72℃5min；16℃1min。27 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定PCR结束后跑0.8%琼脂糖核酸电泳，染色后在核酸凝胶成像仪下观察目的条带，并回收目的基因片段。按照核酸回收试剂盒（TIANGEN,UniversalDNApurificationkit,#DP241-03）说明书回收PCR扩增的目的片段。3.2.1.4回收PCR产物和原核表达载体双酶切回收目的基因片段E2和原核载体pET-15b(+)用NcoI/BamHI在37℃水浴锅中酶切2h。双酶切后，按照核酸回收试剂盒（TIANGEN,UniversalDNApurificationkit,#DP241-03）说明书回收酶切目的片段。表3.3目的基因的酶切体系Table3.3Thereactionsystemofdoubledigestion体系体积H2O补足至50μL10×enzymebuffer-Tango5μL回收PCR片段或载体2-3μgNcoI20UBamHI20U3.2.1.5回收的目的片段和载体连接切胶回收酶切后的目的片段和载体，酶切回收后的目的基因和按照摩尔比6：1的比例连接，连接体系总体积为15μL，22℃连接2h。表3.4酶切产物与pET-15b的连接反应体系Table3.4ThereactionsystemforligationofenzymedigestionproductandpET-15bvector体系体积H2O补足至15μL10×T4DNAligationbuffer1μL回收的酶切载体20-30ng回收的酶切片段YμLT4DNAligaseenzyme1μL28 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定3.2.1.6连接产物转化，鉴定及提取阳性克隆质粒1.转化实验如下：(1)先将100μLDH5α感受态细胞放在冰上融化，取5μL上述连接产物加到其中，轻轻吹打混匀后，冰上静置20min。(2)将上述含有连接产物的感受态细胞于42℃水浴热击90s。(3)迅速将上述热击完成的细胞放至冰上3min。(4)每管细胞中加入800μL37℃预热的SOC培养基，将转入连接产物的细胞在37℃，180rpm复苏45-60min，同时将含有卡那抗性（Kan+）的LB平板放置于37℃细菌培养箱中开盖预热烘干。(5)取上述复苏产物400μL混匀后涂布上述平板上，在细菌培养箱中倒置培养14-16h，直至出现肉眼可见菌落方可停止培养。2.菌落PCR初步鉴定阳性克隆：(1)使用菌落PCR筛选阳性克隆，即将平板上长出的单个菌落作为模板，PCR的引物与E2目的基因扩增引物相同。(2)挑出的阳性克隆进一步测序验证（测序时使用T7通用正向引物T7terminal通用反向引物。3.阳性质粒提取：我们通常使用TIANPrepMiniPlasmidKit(TIANGEN，#DP103-03)质粒小提试剂盒进行质粒提取。(1)挑取阳性单菌落于15mlLB培养基（Kan+）中，37℃220rpm摇菌14-16h。(2)菌液摇好后取700μL，加入300μL50%灭菌甘油，-80℃冻存保种。(3)将剩下的菌液以3000rpm离心15min，弃掉上层LB培养基。(4)将剩下的菌体中加入250μL溶液P1，震荡重悬，转移至1mlEP管中。(5)上述菌液中快速加入250μL溶液P2，上下颠倒混匀后立即加入350μL溶液P3，轻轻颠倒混匀直至白色絮状沉淀生成，注意不要剧烈震荡，防止基因组DNA断裂，于37℃放置15min以充分降解RNA。(6)室温最大转速离心20min。(7)离心的同时平衡离心柱：向质粒提取吸附柱中加入500μL平衡液，最大转速离心1min，并弃掉平衡液。(8)将离心后的上清加入到上述平衡好的吸附柱中，最大转速离心1min，弃掉29 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定离心废液。(9)所有上清液过完柱子后，向柱中加入500μL去蛋白液去除菌体蛋白，室温放置2min，最大转速离心1min。(10)弃掉去蛋白液，向吸附柱中加入600μL漂洗液（已加入无水乙醇），最大转速离心1min后，弃掉漂洗液，离心2min。(11)将吸附柱转移至新的EP管中，于超净工作台中晾干无水乙醇，加入60μL55℃预热的无菌水，55℃放置2min以溶解质粒，最大转速离心2min，收集DNA，Nanodrop2000测量质粒浓度，-20℃冻存。3.2.2基孔肯雅病毒E2蛋白原核表达构建完成正确的原核表达质粒pET15b（+）-CHIKV-E2，我们对此质粒是否可以正确表达目的蛋白及蛋白以何种形式存在进行验证，具体实验步骤如下：（1）转化：取1μL上述测序正确的原核表达质粒转化于100μLBL21（DE3）原核表达宿主菌中，37℃，180rpm复苏后，取10μL加入到800μL预热的SOC培养基中混匀，涂卡那霉素（Kan+）抗性平板，37℃细菌培养箱培养过夜（12h）。（2）检测目的蛋白是否表达：挑取单菌落，接种到5mlkan+抗性LB培养基中，37℃，220rpm摇至OD600值约0.6-0.8，取出菌液放置冰上降温15min（低于诱导温度），按终浓度1mM加入IPTG（IPTG原液浓度为500mM），16℃，180rpm诱导过夜。诱导前诱导后分别取样1ml，测菌液OD600。检测目的蛋白表达形式：取2ml诱导后的菌夜，浓缩10倍后，超声破碎菌体，13000rpm4℃离心后，分离上清和沉淀，沉淀使用等体积裂解液重悬，并制备SDS-PAGE样品。所有样品均经过95℃煮沸10min，而后跑SDS-PAGE蛋白胶，检测表达与否及表达形式。3.2.3基孔肯雅病毒E2蛋白纯化1.目的蛋白镍柱亲和层析纯化由于前期我们SDS-PAGE蛋白胶时发现，在上清中检测到少量可溶目的蛋白，于是我们大量诱导表达菌体以期获得更多的可溶性目的蛋白，后期我们将菌体破碎收集上清后过镍柱亲和层析进行纯化，纯化步骤具体如下：(1)样品准备：收集的菌体经高压破碎，压力在800-1000之内。破碎完成后，按30 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定0.1%添加NP40，4℃摇20min。130000rpm4℃离心40min取上清；上清先用0.4μM微孔滤膜过滤，再用0.22μM滤膜过滤。沉淀用等体积的蛋白裂解液（lysisbuffer）重悬后进行SDS-PAGE。(2)镍柱预处理：移液器吸取0.5mlNisepheraseFASTFLOW柱材料（保存于20%乙醇中，）加入到柱管中，约0.25ml柱料（1ml柱材料动态结合40mghis-tagprotein）。待乙醇自然滴干后，ddH2O洗2m（l>2cv），lysisbuffer平衡2m（l>2cv）(3)过柱：取15-17ml上清上样，流速小于1ml/min，管子下方放置一个干净50ml离心管，用于收集流穿液和梯度浓度咪唑洗脱液。(4)洗脱未结合蛋白：Lysisbuffer（含10mM咪唑）洗3ml（>6-8cv尽量多洗几个柱体积），尽量洗脱未结合蛋白，留1ml洗脱液用于检测洗脱效果。(5)梯度咪唑洗脱：20mM、30mM、50mM、90mM、150mM、250mM、300mM、350mM、500mM咪唑每个浓度洗脱1ml，摸索最佳咪唑洗脱浓度。按每管1ml收集洗脱液，并做好标记；同时，留33μL样品，1μL用于测A280，32μL用于SDS-PAGE。(6)镍柱使用后处理：洗脱液洗柱子，洗2ml（>2cv），lysisbuffer平衡柱子2ml（>2cv），ddH2O洗2ml（>2cv），4℃保存于20%酒精中。(7)检测蛋白纯化效果：洗脱液每管1ml，收集后，测A280估算蛋白产量，同时检测核酸的量；然后SDS-PAGE鉴定纯化效果。2.目的蛋白割胶纯化前期用镍柱纯化获得的可溶性目的蛋白很少，优化条件后，蛋白还是主要以包涵体形式存在，就使用割胶纯化蛋白，蛋白变性后使用切胶对蛋白进行纯化。蛋白的浓缩胶和分离胶配置方法相同，用透明胶封住梳子，留一个孔加蛋白Marker，剩下的一个大孔用来加蛋白样，一次约可以加600μL-800μL，割胶法纯化步骤具体如下：(1)将加入5×Buffer的蛋白样品95℃煮沸10min后进行SDS-PAGE电泳，结束后用250mMKCl染色10min，可见白色蛋白条带。(2)染色完毕后用刀片切下目的条带，放入盛有灭菌蒸馏水的容器中晃动洗10min直到目的条带变成透明色。31 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定(3)将目的条带放入盛有少量1×PBS的研钵中，用研锤细细研磨成乳浊液，是否研磨成乳浊液的标准是用1ml的注射器轻轻吸吹，直至乳浊液可以很畅通的流入，流出注射器。(4)将研磨好的乳浊液转移到1.5ml的EP管中，-40℃冻存备用。3.纯化蛋白浓度测定可溶性蛋白浓度的测定一般可以用Nanodrop或者BCA试剂盒进行测定，而我们上述的蛋白是包涵体且用割胶进行纯化，所以后期对于包涵体纯化的蛋白检测我们使用BSA为标准品进行对比，大致确定蛋白浓度。即将BSA标准品按照不同浓度进行稀释，割胶纯化的蛋白按照不同的体积进行稀释，将样品跑SDS-PAGE，将大小一致的条带进行比较对应，即可得出目的蛋白的浓度。3.2.4单克隆抗体的制备和鉴定3.2.4.1动物免疫我们对6-8周龄小鼠采用腹腔和背部皮下多点注射的方式进行免疫，两次免疫一般间隔2周，三免后检测特异性多克隆抗体的产生和效价，达到要求后，融合前三天腹腔加强免疫，迅速刺激免疫系统，加强后第4d做细胞融合，如果三次免疫后抗体效价较低即可进行四次免疫，大致免疫流程如图3-2所示。图3.2小鼠免疫流程图Figure3.2Flowchartofmouseimmunization由于我们本次的抗原是割胶纯化的包涵体蛋白，可以直接免疫而不用和佐剂混匀，SDS-PAGE胶可以作为佐剂用，具体步骤如下所示：1.6-8周雌性BALB/c小鼠3只，初次免疫每只小鼠免疫70μg蛋白（割胶的蛋白用PBS将体积调至200μl混匀）采用腹腔加背部和腹部皮下多点免疫相结合。2.免疫方式：一般初次免疫2周后进行二次免疫，免疫剂量、免疫方式、免疫间隔同初次免疫同上。32 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定3.二免2周后进行三次免疫并在三免1周后检测抗体效价，原则上ELISA效价达到1：1000以上即可用于单克隆制备，但是一般抗体效价越高越好，ELISA效价在1：10万以上最适合。如果三免滴度不够，进行四免。免疫完成后，小鼠休息两周，连续三天加强免疫，ELISA测效价符合标准后即可进行细胞融合，筛选单抗。3.2.4.2ELISA筛选方法建立及鼠源多抗验证1.ELISA筛选方法建立本实验采用真核表达质粒pCAGGS-CHIKV-E2转染BHK细胞的裂解液作为筛选抗原，抗原包被量5μg/ml，每孔100μL；使用pH9.6ELISA碳酸盐包被液稀释抗原，建立ELISA实验方法以区分产生目的抗体和无关抗体的细胞系。（1）细胞裂解液的制备1于转染前一天，接2×105cells于小皿中，使细胞在转染当天达到约80%。2转染时，先弃小皿中培养基，用PBS洗两次，然后加1mlOpti-MEM（使细胞处于浸润状态）。3于1.5mlEP管中加入250μLOpti-MEM，加5μLLipofectamine-2000(Invitrogen)后上下颠倒混匀。4于1.5mlEP管中加入250μLOpti-MEM，加2μg目的质粒后上下颠倒混匀。5将步骤3和4的样品混匀，室温放置20min，然后将该混合物转入步骤处理含有细胞的小皿中（动作要轻，勿对着细胞吹打）。6于37℃二氧化碳培养箱中培养4-6h后，弃小皿中培养基，加2mLDMEM+2%FBS继续培养48h收集细胞。7收集的细胞加入300μL的Lysisbuffer反复吹打，并于-80℃保存。8使用前4℃，1000rpm离心10min，取上清用于实验。（2）BCA试剂盒测细胞裂解液中的总蛋白浓度1按照BCA蛋白定量试剂盒（碧云天，编号：P0010S-1）将其中的BSA标准品（25mg/ml）按照说明书进行稀释，即取0μL，1μL，2μL，4μL，8μL，12μL，16μL，20μL加到96孔板中，并补加1×PBS至20μL，相当于浓度为0mg/ml，0.025mg/ml，0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml，0.4mg/ml，33 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定0.5mg/ml。细胞裂解液CHIKV-E2-BHK和BHK按照10倍，20倍，40倍进行稀释，20μl/孔BCA试剂A和BCA试剂B按照50：1混合后配制成BCA工作液，每孔加200μL，37℃孵育30min。2每隔10min观察颜色变化，如果蛋白浓度过高则会出现浅紫色；在562nm波长下发光测OD值。3将测得的OD值和蛋白浓度作图，建立标准曲线。（3）ELISA实验具体步骤如下：1包被抗原：抗原（细胞裂解液）用pH9.6抗原包被液稀释至5μg/ml，加入到96孔板中，100μl/孔，4℃包被过夜，包被完成后，用250μL/孔PBST洗涤液洗板三次。2封闭：封闭液（5%脱脂奶粉溶于PBS），250μL/孔37℃封闭3h或4℃过夜。用250μL/孔PBST洗涤液洗板一次即可。3待测抗血清孵育：加入抗体稀释液（2%脱脂奶粉溶于PBS）梯度稀释的三免抗血清，100μL/孔，37℃孵育1h。用250μL/孔PBST洗涤液洗板三次。4酶标二抗孵育：HRP羊抗鼠二抗，1：8000抗体稀释液稀释，100μL/孔，37℃孵育一定不要超过40min，孵育完成后洗板4-8次，消除非特异性信号。5显色：MB双组分显色试剂盒：B200051，proteintech。A液和B液按1：100混合成工作液，每孔加入100μL，37℃显色15min后，加入100μL1M稀硫酸终止反应，用酶标仪检测OD450读数。2.鼠源多抗多抗IFA验证1细胞玻片制备Day1：在30mm小皿中放置4块玻片，接25万BHK-21细胞，37℃培养24h后，细胞密度达到60-80%时使用。Day2：基孔肯雅病毒按照MOI=0.01感染细胞。感染后36h后收玻片：2用干净的镊子小心的将玻片夹起，放置到预先加入2mlPBS的六孔板中洗涤，弃去PBS，加入预冷的5%丙酮（溶于甲醛）固定液1ml，固定15min，弃去固定液，PBS洗一次，加入2mlPBS，将玻片放置于4℃保存备用。3抗血清孵育：先将20μL1:100稀释的抗血清滴加到封口膜上，将玻片从4℃取出，卷纸擦干玻片上残余PBS，放在稀释好的抗血清上，室温孵育1h。34 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定4二抗孵育：抗血清孵育完成后，先用PBS冲洗非细胞面，再在三联PBS烧杯中洗涤，每个烧杯洗10次以上，孵育FITC标记的羊抗鼠二抗20μL（1：125PBS稀释），酶标二抗室温孵育1h，不要超过1h，孵育太久背景值增高。5DAPI染色：洗玻片上酶标二抗，操作同抗血清洗涤，20μLDAPI室温孵育5min使细胞核染色。6制片：洗去DAPI染色液，擦干玻片上残留的PBS；在载玻片上滴加1.5μL95%甘油，将盖玻片细胞面朝下，覆盖甘油滴，并在荧光显微镜下观察绿色阳性细胞。3．鼠源多抗Westernblot验证1按照前述2.3方法感染细胞，感染后36h收细胞样品：于生物安全柜中操作，弃掉培养基，每个皿加入200μLRIPA细胞裂解液，冰上裂解5min，使用200μL黄枪头刮细胞样品，将细胞样品转移至EP管中，使用1ml注射器反复吹吸样品数次至看不到明显细胞块状沉淀为止，加入50μL5×SDSloading混匀后95℃煮样10min后，样品分装成22μL/管小份-80℃冻存。2样品进行SDS-PAGE（12%胶）垂直电泳，转膜（半干转）。3剥胶及平衡：剥胶后浸泡于转膜缓冲液中平衡10min，剥胶时注意胶的完整性，可将浓缩胶切除。4PVDF膜活化和平衡：取出0.2μmPVDF膜，浸泡于甲醇中15s后转入转膜缓冲液中平衡10min。5滤纸块的平衡：一张PVDF膜使用两张滤纸，滤纸浸泡于转膜缓冲液中平衡10min。先在转膜仪槽内滴加1-2ml转膜缓冲液润湿槽子底部，然后铺第一张滤纸，赶气泡后滴加1-2ml转膜缓冲液润湿第一张滤纸；铺PVDF膜，注意要铺整齐，赶气泡后滴加1-2ml转膜缓冲液润湿PVDF膜；铺SDSPAGE胶赶气泡后加1-2ml转膜缓冲液；铺第二张滤纸，赶气泡至此完成全部准备工作。625V，0.3A恒定电压限制电流，转膜30min。7封闭：转膜完成后，取出PVDF膜，将膜转移至自封袋中不要有气泡，加5ml封闭液（5%脱脂奶粉溶于PBST），室温摇床封闭1h或4℃过夜。洗膜：取出封闭后的PVDF膜，TBS中摇床漂洗一次即可。8抗血清孵育：1:2000稀释的抗血清室温摇床孵育1h，洗膜，回收抗血清，取出抗血清孵育后的PVDF膜，浸泡于TBST中摇床漂洗3次，每次10-15min。35 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定9二抗孵育：二抗孵育，1：2000稀释二抗HRPgoatantimouse4-5ml，将膜转移至自封袋中，加入二抗不要有气泡室温摇床孵育1h，洗膜，弃二抗，取出二抗孵育后的PVDF膜，浸泡于TBST中摇床漂洗3次，每次10-15min。10显色：BIO-RAD凝胶成像仪化学发光，取出A、B液按1：1混匀成工作液，，将工作液滴加到PVDF膜上，摇动PVDF膜使工作液覆盖整张膜。然后运行实验，自动曝光或手动曝光。3.2.4.3骨髓瘤细胞活化1.SP2/0骨髓瘤细胞复苏1取出冻存的SP2/0细胞，迅速放入37℃水浴中，待细胞悬液融化后，取出细胞，1000rpm、4℃离心10min，弃上清，使用预热的10%FBSRPMI1640培养基重悬细胞后，将细胞转移至T25培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱培养。2SP2/0细胞复苏后，体外培养3-4d左右，使细胞处于对数生长期。基本上第一天按照1：5传代，第二天长至60-80%，可认为是处于对数生长期。2.SP2/0骨髓瘤细胞活化1SP2/0细胞生长状态良好时，收集SP2/0细胞：用移液管轻轻吹下细胞，将细胞收集至50ml离心管中，1000rpm/min离心5min，弃上清培养基，使用0.2-0.3ml1640基础液重悬细胞，细胞计数后将3-5×106个SP2/0细胞（约0.2ml，体积不能太大）注射到6周龄左右的BALB/c小鼠颈部皮下，约8-10d实体瘤长出后用于细胞融合。小鼠周龄过大或者SP2/0细胞密度太小，可能导致实体瘤生长失败。3.2.4.4细胞融合1.活化的SP2/0骨髓瘤细胞制备1从BALB/c小鼠实体瘤中制备SP2/0骨髓瘤细胞的方法如下：小鼠摘眼球取血后分离血清，小鼠颈椎脱臼致死后，75％酒精浸泡5min。在超净台中取出浸泡的小鼠，在实体瘤附近皮肤剪开小口，直接撕开小鼠皮肤，暴露实体瘤，注意防止小鼠毛发污染实体瘤。2在超净台中无菌状态下取出匀浆器，剪开实体瘤包被的组织，取拇指肚大小的实体瘤，置于匀浆器中，加入3mlRPMI1640基础培养基，充分挤压研磨，使骨髓瘤细胞释放。再补加RPMI1640基础液至10ml，静止5min后，取36 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定上清细胞悬液5ml于一干净离心管中，再补加5mlRPMI1640培养基于匀浆器中，重复两次，约获得15ml细胞悬液。使用RPMI1640基础液洗涤细胞一次，再使用15mlRPMI1640基础液重悬细胞。3于另一50ml离心管加入15ml小鼠淋巴细胞分离液，将重悬的骨髓瘤细胞悬液逐滴滴加到淋巴细胞分离液之上，注意不要打破交界面，2000rpm/min离心10min（离心机升降速系数设置为1，升降速度太快，难以分离出SP2/0细胞），使用1ml移液器吸取位于界面的白色细胞层，用50mlRPMI1640基础液洗涤细胞2次，充分洗涤残留的淋巴细胞分离液，计数后备用。2.饲养细胞制备1取空白6-8周龄BALB/c小鼠一只，摘眼球放血后，颈椎脱臼致死。将小鼠腹部向上四肢伸展放置，并于腹部皮肤剪开小口撕开皮肤，露出腹膜，更换一套灭菌的剪刀镊子，在腹膜上剪开小口(在腹部稍靠上)，然后用1ml移液器吸取1-2mlRPMI1640基础液从腹腔小口注入小鼠腹腔，吹打数次后，将腹腔细胞悬液吸出，并转移至干净离心管中。重复以上操作2-3次，取出的培养基中富含腹腔巨噬细胞，细胞使用RPMI1640基础液洗涤2次后，使用HAT选择培养基重悬后，37℃放置备用。2将小鼠侧身放置（四肢朝向左手边），换一套镊子和剪刀，剪开脾脏外腹膜，再换一套无菌的剪刀镊子，用镊子夹取脾脏，用剪刀剥离粘连的组织，剪碎脾脏后，置于无菌的匀浆器中。3匀浆器中加入3mlRPMI1640基础液研磨(动作要轻，匀浆棒尽量不要扭转)，挤压出脾细胞，取出匀浆棒，补加RPMI1640基础液至10ml，于无菌状态下静置5min，吸取5ml细胞悬液转移至另一个50mL离心管中。重复上述操作两次，共计获得15ml淋巴细胞悬液。41000rpm/min离心10min去上清，细胞用50mlRPMI1640重悬，再洗涤细胞一次后，用HAT选择培养基重悬，计数，放置到37℃培养箱中备用。3.免疫脾细胞制备1免疫脾脏细胞制备方法同饲养脾脏细胞制备，为了最大程度保证免疫脾脏细胞的活力，免疫脾脏细胞要最后制备，制备完成后立即进行细胞融合。37 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定4.细胞融合1将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾脏细胞按照1:5混匀于50ml离心管混匀，1640基础液补至50ml1500rpm/min，离心10min。2弃掉上清培养基，用灭菌的滤纸条吸干管壁残余培养基（残存培养基会降低PEG的有效浓度，影响融合效率），轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动，以细胞将要顺管壁流下为标准，保证细胞充分混匀。3将细胞混合物放置于37℃水浴中。然后在1min内慢慢加入预热至37℃的50%PEG0.8ml(Sigma)，边加边用枪头轻轻搅拌，尽量搅拌充分均匀。41min内加完PEG后，继续搅拌30sec后静置1min。然后慢慢加入37℃预温的RPMI1640基础液10ml。具体方法如下：第一分钟内逐滴滴入1mL。第二分钟加1ml，第3~4分钟加3ml，第5分钟加完其余的5ml，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后用移液管缓慢加入30ml预热的培养基，以稀释PEG。51000r/min离心5min，弃掉上清于37℃放置5~8min，同时准备96孔板。使用37℃预热的HAT培养基重悬细胞，同时将饲养脾细胞与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约250μL/孔。一次融合可接种约10块96孔板。于37℃、5%CO2培养箱中培养。6融合后第二天观察有无污染，直至融合后第3-4天补加80-100μL预热的HAT培养基，第6-7天左右半换液成HT培养基。视细胞生长状态及速度，待细胞长至数百，显微镜下占1/3视野时，即可进行ELISA检测。一般在第9~11天左右。检测前一天，尽可能吸尽96孔板中残存的培养基，补加250μLHT培养基，细胞生长12-24h后，待抗体在培养基中富集后，进行ELISA检测。3.2.4.5单抗筛选及杂交瘤细胞建系1.间接ELISA初筛间接ELISA方法参照：3.2.4.4ELISA筛选方法建立。2.间接免疫荧光鉴定间接免疫荧光实验方法参照：3.2.4.4多抗IFA验证。3.Westernblot鉴定Westernblot实验方法参照：3.2.4.4多抗Westernblot验证。38 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定3.2.4.5杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）ELISA筛选出的阳性细胞孔，立即转移细胞至24孔中培养，细胞在24孔板中生长1-2d取细胞上清进行IFA检测，IFA鉴定阳性的细胞一方面要立即进行亚克隆，亚克隆进行的越早越好；本实验采用操作简单的有限稀释法进行亚克隆，进行亚克隆时，每株细胞铺两块96孔板，每块板子1cell/well。1饲养细胞制备取空白小鼠腹腔巨噬细胞和脾脏细胞，试验方法参考细胞融合脾脏细胞和腹腔巨噬细胞制备，制备好的饲养细胞计数后，稀释至20万饲养细胞悬于150μlHT培养基，每孔加入150μL细胞悬液（即每孔20万饲养细胞），饲养细胞提前一天铺到96孔板中，一方面检测是否发生污染，另一方面使饲养细胞分泌的生长因子在培养基中富集。2杂交瘤细胞的稀释一般在细胞扩大至24孔板时即开始进行亚克隆，取24孔板中的细胞，计数，一般24孔板中的细胞数目在1E4个/ml左右，梯度稀释至1E3个/ml、1E2个/ml。在剩下的10ml细胞悬液中加入10ml新鲜培养基，按每孔100μL加入细胞悬液，铺第二块96孔板，即为1cell/well。细胞计数及稀释要尽可能准确。3阳性克隆扩大培养观察ELISA筛选出的阳性克隆，是否由一个细胞生长而成。如果是，则可初步认定为是单克隆细胞系。如果阳性细胞孔没有由单一细胞生长而成的情况下，则必须再进行下一轮亚克隆，直至挑出单个阳性细胞克隆。4阳性细胞克隆先转移至24孔板中生长，再逐步转移至T25培养瓶中扩大培养。生长到一定数量后，即可冻存。3.2.4.6杂交瘤细胞的冻存和复苏(1)杂交瘤细胞的冻存取出生长旺盛的杂交瘤细胞，轻轻吹吸细胞，收集细胞到50ml离心管中，1000rpm4℃离心10min，收集杂交瘤细胞培养上清，即为培养基抗体，细胞沉淀用含有7%DMSO（二甲基亚砜）的血清1ml重悬，转移细胞悬液至冻存管中，细胞放置到提前恢复至室温的冻存盒中，-80℃过夜冻存后，转移到液氮中长期保存。39 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定(2)杂交瘤细胞的复苏从液氮中取出冻存的细胞，立即置于37℃水浴融化，待冰块融化后，4℃1000rpm/min离心5min，弃掉瘤细胞冻存液，加入新鲜的预热的HT培养基，将细胞复苏到24孔板中或者T25小瓶中。3.2.4.7小鼠腹水抗体的生产及鉴定1.腹水抗体制备8-10周龄雌性BALB/c小鼠，在制备腹水前，每只腹腔注射300-500μl石蜡油。复苏杂交瘤细胞，调至状态较好后1000rpm离心5min，以冷的PBS重悬，细胞计数调整浓度至3-5×105个/ml（一般稀释至4×105个/ml）。8-14天后，小鼠腹腔变大，等其长到最大，小鼠表现为活力下降，垂死的时候，从动物房取出准备收取腹水，具体步骤如下所示：1小鼠脱颈椎处死，如需收取腹腔内细胞继续使用则需泡酒精后在超净台内解剖，否则在普通实验台解剖即可。2自胸骨附近剪开皮，剥皮（背部最好留有相连的皮肤，防腹水从背部漏出）。剪开胸廓，用镊子提起胸骨与横隔膜相连段，玻璃胶头吸管自横隔膜刺入腹腔，来回搅动，吸取腹水。3视小鼠个体差异而定，约可取得3-10ml腹水，亦可剪开腹腔吸取最后的少量残余。42000rpm20min离心分离细胞和腹水，注意不要溶血。细胞可以-80℃冻存待用或丢弃，腹水-20℃冻存待用。2.小鼠腹水抗体纯化预处理腹水除脂：2000g离心20min后收集淡黄色腹水（不要吸到油脂和底层细胞），每ml腹水中加8mgSiO2粉末，如腹水较混浊，表示含脂较多，可酌量多加SiO2。混匀后室温孵育30min，摇床上摇动。2000g20min离心收上清。取2倍于SiO2体积的PBS重悬沉淀，重复2、3步操作，所收上清合并。合并上清过0.22μm滤膜后可以上proteinG柱子。3.腹水抗体纯化1从包装瓶中取出2ml混匀的琼脂糖悬液（含琼脂糖50%），装到3-5ml40 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定的小柱子里，流速定为0.5-1.0ml/min。用10个柱床体积（即10ml）的BindingBuffer平衡至读数稳定，pH7.0。2上样，可将样品用BindingBuffer稀释后循环上样，至流穿液在A280读数稳定，大概要6-12个柱床体积。BindingBuffer洗柱至读数稳定（读数1-3最好，至少10以下）。所有读数10以上流穿液留存待检。3用6个柱床体积的洗脱Buffer洗脱，收取所有读数10以上洗脱液，立刻用1.0M的TrisBase调pH至7.0-8.0（前后洗脱下来的洗脱液的PH值不同加的碱的剂量也不同）；PBS4℃透析蛋白过夜。4用4个柱床体积的BindingBuffer重新平衡柱子至读数稳定，pH7.0。6清洗处理：用5个柱体积清洗Buffer清洗柱上残留的杂蛋白至读数平衡。如要继续纯化，可用BindingBuffer平衡柱子至读数稳定，pH7.0。如要保存，可将柱子用5个柱床体积的储存Buffer平衡柱子至读数稳定，pH7.0，储存于2-8°C。4.中和活性检测将纯化的上述抗体进行中和活性检测，具体步骤如下：1提前一天分Vero细胞于96孔板，104cells/孔于37度培养箱培养过夜；2接毒：弃96孔板中的培养液；CHIKV-eGFP（#1426）以MOI=0.1感染Vero向接过毒的板子中加入稀释好的腹水纯化抗体，（接毒与加抗体之间间隔不超过5分钟）；阳性对照：终药物浓度3μM的6-AzUrd药物100μl/孔；阴性对照：用含10%的FBS的1640培养基100μl/孔加入。3于接毒加抗体后36h进行观察。5.亚型鉴定上述纯化的抗体用抗体亚型试剂盒（SouthernBiotech,SBAClonotypingSystem-HRP，Cat.No:5300-05）试剂盒检测其亚型，具体实验操作参照第二章2.3ELISA筛选方法建立及多抗验证，纯化的腹水抗体作为一抗，按照试剂盒说明书，含有HRP标记的不同亚型的抗体作为二抗，后期显色后，按照不同亚型显色确定抗体的亚型。6.抗原表位鉴定为了鉴定所筛选的单抗确实是针对病毒的结构蛋白E2，我们先将病毒感染BHK细胞的裂解液作为抗原，纯化的腹水抗体作为一抗进行Westernblot验证。经过Westernblot检测后发现，筛选得到的抗体都可以检测一条约55KD的蛋白41 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定带，这个蛋白与基孔肯尼亚病毒结构蛋白E2大小符合，为了进一步确定是针对E2蛋白的哪个抗原表位，随后我们将E2蛋白进行不同截短，原核表达了E2蛋白的domainA、domainB和domainC区蛋白，以这些多肽为抗原进行Westernblot鉴定。7.特异性检测由于基孔肯雅病毒和塞姆利基森林病毒（SemlikiForestencephalitisvirus,SFV），辛德比斯病毒（Sindbisvirus,SIV）属于同一血清学组，为了验证我们筛选得到的E2蛋白单抗的特异性，我们将上述三种病毒分别感染BHK细胞，收集细胞裂解液作为抗原，纯化的腹水抗体作为一抗做Westernblot鉴定。实验方法参照2.2多抗Westernblot验证。8.腹水抗体效价检测前述制备纯化的腹水抗体目的是为了获得高滴度纯化单抗，为了验证纯化后的腹水抗体的效价，我们使用前述建立的ELISA检测方法进行检测，实验方法参照3.2.4.4ELISA筛选方法建立。3.3实验结果3.3.1基孔肯雅病毒E2蛋白原核表达质粒构建基孔肯雅病毒E2基因共编码423个氨基酸，在本实验室建立的基孔肯雅病毒全长感染性克隆基础上设计针对E2蛋白特异性引物，并在上游引物前设计NcoI酶切位点、下游引物设计BamHI酶切位点便于目的基因插入到原核表达载体中。以基孔肯雅病毒全长感染性克隆为模板，扩增CHIKV-E2片段后进行琼脂糖凝胶电泳，如图所示，我们获得了约1300bp片段，与E2（1269bp）基因大小相符（图3.3A）；双酶切目的片段和原核表达载体pET-15b后进行切胶纯化，酶切结果表明pET-15b载体与未酶切的质粒大小有明显区别，表明载体酶切正常（图3-3B）；双酶切纯化后的片段和载体进行体外连接、转化，待菌落长出，使用E2扩增引物挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，结果显示获得到三株阳性克隆（图3-3C）。获得的阳性菌落提质粒后送测序，测序结果显示目的基因正确插入，未发生碱基突变或移码，证明原核表达载体构建正确。42 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定图3.3基孔肯雅病毒E2蛋白表达质粒构建A：PCR扩增E2基因片段M：marker；lane1，2：基孔肯雅病毒E2片段PCR扩增片段；B：双酶切E2片段和载体；B:lane1，2：pET-15b双酶切片段；lane3，4：E2双酶切片段；C:菌落PCR鉴定：lane1：阳性对照；lane2-4：菌落；Figure3.3ConstructionofChikungunyaE2ProkaryoticExpressionPlasmidsA:PCRamplicationM:markerlane1,2:E2gene;B:DoubledigestionofpET15b,lane1,2:doubledigestionofpET-15bgene;lane3.4:doubledigestionofE2gene;C:ColonyPCRofpositiveclone.lane1:positive;lane2-4:differentclone;3.3.2基孔肯雅病毒E2蛋白原核表达纯化首先将测序正确的表达质粒转化BL21(DE3)表达菌株，菌体经过1mMIPTG、16℃、180rpm/min进行诱导表达，SDS-PAGE检测目的蛋白表达量高低，由图3-4可以看出，目的蛋白在BL21(DE3)表达菌株可以良好的表达，且目的蛋白在上清液和包涵体中均有表达，主要是以包涵体形式表达。图3.4基孔肯雅病毒E2蛋白诱导表达SDS-PAGE图M：蛋白marker；lane1，2：诱导前，lane3.4：IPTG诱导后；lane4：超声破碎后离心上清；lane5：超声破碎后离心沉淀；Figure3.4SDS-PAGEanalysisofrecombinantCHIKV-E243 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定M:marker;lane1,2:uninducedsample;lane3:totalproteinofinducedsample；lane4:supernantantofinducedsample;lane5:precipitationofinducedsample;为了获取可溶性目的蛋白，根据摸索的诱导表达条件进行大量诱导（1L），菌体高压破碎收集上清液并通过Ni+柱亲和层析以纯化目的蛋白。初次纯化时，首先使用lysisbuffer洗脱未结合的蛋白，随后用10mM、20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM咪唑洗脱，SDS-PAGE检测显示：10mM浓度咪唑洗脱，有大量杂蛋白未洗脱下来（如图3.5Alane1），在250mM浓度咪唑洗脱下很少量的目的蛋白，lane7所示。因此后续优化洗脱条件：用250mM、300mM、3500mM、400mM、450mM、500mM洗脱目的蛋白，如图3.5B所示，且400mM浓度洗脱下来少量目的蛋白。最后将获取的纯化目的蛋白再次跑胶验证，如图3.5C所示此纯化的蛋白的大小正确。图3.5基孔肯雅病毒E2蛋白镍柱纯化SDS-PAGE鉴定图A：M：marker；lane1：诱导后；lane2-9：梯度咪唑浓度（10mM，20mM，50mM，100mM，150mM，200mM，250mM，300mMimidazoleelution）洗脱蛋白；B：lane1：诱导后；lane2-7梯度咪唑浓度（250mM，300mM，350mM,400mM，450mM，500mMimidazoleelution）洗脱的蛋白；C：lane1：诱导后；lane2:镍柱纯化E2；Figure3.5SDS-PAGEanalysisofpurifiedCHIKV-E2proteinbynickelcolumnA:M:marker;lane1:totalproteinofinducedsample;lane2-9:differentimidazoleconcentrationseluent.B:lane1:totalproteinofinducedsample;lane2-7:differentimidazoleconcentrationseluent.C:lane1:totalproteinofinducedsample;lane2:purifiedproteinbynickelcolumn;3.3.3目的蛋白割胶纯化前述我们利用Ni柱进行部分纯化，结果发现纯化出的可溶性目的蛋白的量很少，随后我们进行各种条件优化，包括更换Rosetta表达菌株，降低温度至16℃，降低至0.1mMIPTG，但是上清中目的蛋白量还是很少，所以后期利用割胶进行纯化以期获得大量目的蛋白。如图3-6A所示，目的蛋白跑胶后250mM氯化钾44 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定显色，白色条带即为目的蛋白，将目的蛋白割取下来进行SDS-PAGE验证，结果表明割胶纯化的蛋白大小与前述纯化蛋白小大一致且纯度很高（如图3-6B所示），最后将割胶获取的目的蛋白进行BSA定量，结果表明5μgBSA条带大小和5μL割胶蛋白条带大小一致，大约估算获取的割胶蛋白的浓度为1mg/ml（如图3-6C所示）。图3.6基孔肯雅病毒E2蛋白割胶纯化后SDS-PAGE鉴定图A：目的蛋白跑胶后用250mM氯化钾染色；B：M：marker；lane1：诱导后；lane2-3梯度咪唑浓度（350mM,400mM）洗脱的蛋白；lane4：割胶纯化蛋白；C：lane1-4:不同浓度的BSA（1μg，3μg，5μg，7μg）；lane5-9:不同体积的割胶纯化的E2（1μl，3μl，5μl，7μl）；Figure3.6SDS-PAGEanalysisofpurifiedCHIKV-E2A:Proteinwasstainedwith250mMKCl.B:M:marker;lane2-3:totalproteinofinducedsample;lane4:8MureadissolvedinclusionbodiesC:lane1-4:differentconcentrationsofBSA（1μg，3μg，5μg，7μg）;lane5-9:differentvolumeofpurifiedsample（1μl，3μl，5μl，7μl）;3.3.4ELISA筛选方法的建立前面使用真核表达质粒转染细胞后收集的细胞裂解液作为包被原进行检测，首先我们使用BCA试剂盒先确定细胞裂解液中总蛋白浓度，确定蛋白浓度后我们设置了三个不同的包被浓度（20μg/ml，10μg/ml和5μg/ml）并同时设置一个单纯细胞裂解液的孔作为阴性对照，确定最佳包被浓度后，我们将建立好的ELISA检测方法应用于小鼠抗血清的检测，结果如图3-7所示：45 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定图3.7ELISA初筛检测方法建立A：细胞裂解液中总蛋白浓度确定；B：ELISA抗原包被量的确定；C：ELISA特异性检测Figure3.7EstablishmentofELISAscreeningmethodA:Totalproteinconcentrationincelllysates;B:DeterminationoftheamountofantigeniccoatingC:Specificdetection由图3.7可以看出BCA试剂盒建立的蛋白浓度标准曲线呈良好的趋势，我们制备的细胞裂解液的蛋白总浓度为3.56mg/ml，我们设置的三个不同包被浓度经检测后发现OD值没有大的差异，所以我们确定使用5μg/ml的包被浓度，这样既可以良好的进行检测又可以节省抗原，后期用此ELISA方法进行小鼠抗血清检测时发现，此体系可以很好的检测到血清中的抗体，而且可以很好的区分阴性对照样本，所以我们成功建立了良好的筛选方法。3.3.5免疫后鼠源多抗效价测定及验证3.3.5.1血清抗体的ELISA检测前期用E2割胶纯化的蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，三次免疫后先用ELISA检测血清多抗的效价，同时用IFA和Westernblot检测血清多抗特异性，检测产生的抗体确实是特异性针对CHIKV-E2蛋白的。从图3.8看出，我们使用上述建立好的ELISA方法检测三免后小鼠血清抗体效价，结果显示血清抗体效价在100万倍稀释度左右，多抗效价已经达到后期筛选单抗的要求（血清抗体效价>5万倍稀释即可），可以进行后续筛选实验。46 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定图3.8ELISA检测鼠源多抗滴度Figure3.8Detectionofmulti-antibodytiterinmiceusingELISAassay3.3.5.2血清抗体的IFA检测同时，我们用IFA和Westernblot检测血清抗体特性的结果也表明，用E2抗原三次免疫小鼠后的血清抗体可以检测到病毒感染真核细胞内表达的E2蛋白且免疫荧光结果表示，E2蛋白主要分布在胞浆内，与文献中的报道相符（图3-9）。图3.9鼠源血清抗体IFA验证Figure3.9MouseserumantibodyIFAvalidation3.3.5.3血清抗体的Westernblot检测westernblot结果显示多抗血清检测病毒感染的细胞样品，仅检测到单一的条带，且大小符合E2全长（约55kD）而检测不到阴性细胞样，因此证明了该血清多抗只能特异性识别E2，特异性良好（图2-7）。图3.10鼠源多抗WB验证Figure3.10Mousemultiple-antibodyWBvalidation47 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定3.3.6间接ELISA初筛阳性杂交瘤细胞用上述建立的ELISA方法，以培养融合细胞所获得的细胞上清液为一抗进行检测，以阴性对照OD450的值的2.5倍作为阳性值，（例如阴性值为0.1则数值在0.25及以上者视为阳性）初筛后获得15株ELISA阳性克隆，后续对ELISA阳性杂交瘤细胞进行IFA验证，获得9株IFA阳性克隆：2A6，3H2，4C4，6E2，6F6，6B12，7F6，7B7，11G4（图3-11所示）。图3.11ELISA初筛阳性杂交瘤细胞Figure3.11ELISAscreeningofpositivehybridomacells我们将检测到的阴性OD450=0.1作为cutoff值，以0.25及以上的值视为阳性，共筛选到了9株阳性克隆；后续立即对上述初筛获得的阳性克隆进行亚克隆化，经过四轮亚克隆化后获得单克隆细胞系，并对细胞系进行验证，保种冻存，并制备腹水抗体。3.3.7阳性杂交瘤细胞系的IFA检测以上述初筛获得的阳性杂交瘤细胞培养上清液为一抗，病毒感染真核细胞为抗原进行IFA验证，以骨髓瘤细胞（SP2/0）上清液作为阴性对照，获得9株IFA阳性克隆：2A6，3H2，4C4，6E2，6F6，6B12，7F6，7B7，11G4（图3-12所示）。48 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定图3.12IFA检测阳性杂交瘤细胞系Figure3.12IFAdetectionofpositivehybridomacells在这9株IFA阳性克隆中，我们发现9株抗体中，6E2的检测活性不是很好，当其作为一抗进行检测时，检测到的阳性细胞荧光不是很亮，怀疑可能是杂交瘤细胞上清中抗体含量太低，但是根据上述的ELISA实验结果表明此抗体的效价不低，所以不是效价低造成的，可能存在其他原因。除此之外，其他8株细胞分泌的抗体都能作为较好的检测材料很好的进行IFA检测。3.3.8阳性杂交瘤细胞系的Westernblot检测我们以真核表达质粒转染BHK细胞获得的裂解液为抗原，以上述初筛获得的阳性融合细胞培养上清液为一抗进行Westernblot检测，以骨髓瘤细胞（SP2/0）上清液作为阴性对照，对获得的9株阳性克隆再次进行WB验证以确定筛选到的单抗细胞系就是针对CHIKV-E2蛋白的。（图3-13所示）。图3.13Westernblot检测阳性杂交瘤细胞系Figure3.13Westernblotdetectionofpositivehybridomacells从上面的WB结果可以看出，上述9株阳性克隆细胞分泌的抗体都可以检测到原核表达的E2蛋白，而原核表达的E1蛋白和阴性对照检测不到任何条带，这就说明我们筛选得到的9株阳性克隆细胞就是针对E2蛋白的特异性抗体。49 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定3.3.9其他性质鉴定前期对9株阳性克隆细胞分泌的抗体进行IFA，Westernblot检测确定筛选得到的单抗确实针对E2蛋白后，我们同时对单抗的中和活性，抗体效价和单抗亚型进行了验证，结果如下各图所示：图3.14-1阳性杂交瘤细胞系中和活性检测Figure3.14-1Neutralizingactivitydetectionofpositivehybridomacells从上述图3.14-1实验结果可以看出，我们筛选出的9株阳性克隆中有5株具有中和活性即2A6，3H2，6B12，4C4和6F6。目前只是用阳性杂交瘤细胞上清进行鉴定，只是确定了抗体是否具有中和活性，中和活性的高低还需要后续进一步的验证。图3.17抗体亚型性检测Figure3.17Antibodysubtypeydetection从上述图3.14-2实验结果可以看出，在单抗亚型鉴定中，我们发现9株克隆中7株克隆是IgG1型（2A6，3H2，6B12，4C4，7F6，7B7和11G4），6F6的50 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定亚型为IgG3，6E2的亚型为IgG2a，这些不同抗体亚型的抗体是为我们后期建立ELISA检测试剂盒提供了良好的依据。3.3.10阳性杂交瘤细胞系的表位鉴定Westernblot鉴定筛选的9株单抗都是针对CHIKV-E2蛋白的，E2蛋白是病毒主要的抗原表位所在区，含有多个抗原决定簇，我们需要进行鉴定这些单抗主要针对E2蛋白的哪个抗原决定簇区域，传统的检测方法就是将E2蛋白进行不同截短，体外原核表达这些肽段作为抗原，上述9株阳性克隆培养的细胞上清液为一抗，进行Westernblot鉴定，但是这只是大致确定抗体针对的抗原表委区，而无法精确得知具体的序列，这就需要我们用目前常用的Overlap技术进行精确定位，但是本实验先大致确定抗原表位区再进行后续研究，体外表达E2蛋白截短多肽的克隆构建图如图3-14所示。图3.14CHIKV-E2蛋白截短多肽克隆构建图Figure3.4ConstructionofCHIKV-E2truncatedpeptideclones如上图所示我们根据文献中E2蛋白的区域划分，我们将E2蛋白分成三段，构建了三段克隆（图3-14所示），第一段是E2蛋白的三个domain体外连接原核表达载体pET32a（+），第二段是E2蛋白的两个domain体外连接原核表达载体pET32a（+），第三段是E2蛋白的domainA区体外连接原核表达载体pET30a（+），将这三段多肽在体外进行诱导表达。我们体外诱导表达上述三段截短的多肽片段，37℃，200rpm，0.5mMIPTG进行体外诱导表达。SDS-PAGE显示三段多肽都能够很好的表达目的蛋白（图3-15所示）。51 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定图3.15体外诱导表达CHIKV-E2蛋白三段不同多肽段M：蛋白markerP1：domainA-C；P2：domainA-B；P3：domainA-：表示未加IPTG诱导；+：表示加0.5mMIPTG诱导表达Figure3.15InvitroexpressionofthreedifferentsegmentsofCHIKV-E2proteinM:marker;P1:domainA-C;P2:domainA-domainB;P3:domainA-:noIPTGinduced；+：0.5mMIPTGinduced上述结果表明CHIKV-E2蛋白的三段不同截短多肽可以很好的表达，其中P1是包含E2蛋白的三个domain，蛋白大小约为47KD；P2是包含E2蛋白的两个domain，蛋白大小约为45KD；P3是只含有E2蛋白的domainA，蛋白大小约为30KD；我们将体外诱导表达的E2蛋白的不同截短多肽段作为抗原，9株单抗细胞杂交瘤细胞上清作为一抗进行Westernblot鉴定，我们发现9株单抗的抗原表位分布在E2蛋白的不同区域，具体结果如图3.16所示。图3.16Westernblot检测抗体的抗原表位Figure3.16DeterminationofantibodyepitopesusingdifferentE2truncatedvectors从上述结果可以看出6F6，3H2，6E2，7B7，6B12和11G4的抗原表位主要位于E2蛋白的domainB区；7F6和2A6的抗原表位主要位于domainC区；4C4抗体主要位于domainA区；根据文献报道，有学者用Overlop技术检测到的抗原52 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定表位区也是针对三个domain都有的，而且目前对于这三个domain的功能研究的还不透彻，本实验只是大致确定了抗体针对的抗原表位的区域，还要进行后续验证确定具体的序列，为研究中和机制和后期建立相应的诊断检测方法提供了丰富的材料储备。3.3.11阳性杂交瘤细胞系的中和活性检测上述我们检测了9株抗体中有5株具有中和活性，后期我们对这些中和抗体的病毒的抑制效果进行检测，我们用阳性克隆杂交瘤细胞上清液进行了病毒抑制实验，杂交瘤细胞上清是由同等数量的杂交瘤细胞生长获得的，所以基本保证上清中的总蛋白浓度一致，对于病毒的抑制率进行了统计以便筛选出中和效果较好的抗体，我们以抑制率大于等于50%为阳性结果进行统计，结果如3.17所示。图3.17阳性杂交瘤细胞中和活性检测Figure3.17Neutralizingactivitiesofpositivehybridomacells从上述结果我们可以看出，5株具有中和活性的抗体中，3H2和6B12对于病毒的抑制效果较好，但是也不排除可能是由于这两株克隆杂交瘤细胞上清的效价较高造成的，后期还需要进一步定量后再检测。上述5株的抑制率大于等于50%，中和活性抗体中和病毒的机制可能是是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；包膜病毒的表面抗原与中和抗体结合后，可通过激活补体导致病毒裂解。53 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定3.3.12腹水抗体制备、纯化及SDS-PAGE检测前述我们获得9株IFA阳性克隆，我们将阳性杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，10-15天收集小鼠腹水并通过IgG纯化柱进行纯化，纯化后的抗体经SDS-PAGE胶来检测腹水纯化抗体的纯度（图3-18所示）。图3.18纯化腹水抗体SDS-PAGE验证M：蛋白Marker；1-10：不同编号洗脱下来的单抗Figure3.18SDS-PAGEanalysisofpurifiedantibodiesinascitesM:Marker;1-10:Differentfractionsofpurifiedantibodyinascites从上述SDS-PAGE电泳结果可以看出纯化的腹水抗体可以检测到两条带，一条为约50KD抗体重链，一条为约25KD抗体轻链。我们纯化的上述9株腹水单抗，一般在第5管洗脱时得到的单抗较纯，后期这些单抗用Nanodrop进行浓度测定，选取浓度较高的单抗后进行后续实验。3.3.13腹水纯化抗体的IFA检测纯化得到的腹水抗体并不是100%纯特异性E2单抗，还包含部分小鼠腹水中本身具有的非特异性IgG，对此我们将纯化后的腹水抗体进行IFA验证，将所有的抗体稀释至0.1μg/ml，取20μl进行IFA检测，结果如图示。图3.19纯化腹水抗体IFA验证Figure3.19AvalabilityofascitesantibodiesforIFA54 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定从上述结果可以看出我们纯化的腹水抗体在0.1μg/ml时也能很好的检测到病毒感染的阳性细胞，阴性对照是检测不到的，说明纯化后的腹水抗体特异性良好可以用于后期的检测实验。3.3.14腹水纯化抗体的Westernblot检测我们以原核表达的E2蛋白和病毒感染细胞裂解液作为抗原，纯化的腹水抗体（0.1μg/ml）作为一抗进行WB检测，结果如图3.20所示。图3.20纯化腹水抗体WB验证Figure3.20Avalabilityofascitesantibodiesforwesternblottingassay上述结果显示9株阳性纯化腹水抗体都能很好的检测到原核表达的E2蛋白和病毒感染细胞裂解液的E2蛋白而检测不到其他杂蛋白，这就说明我们纯化的腹水抗体的特异性良好，可以作为良好的检测试剂。3.3.15腹水纯化抗体特异性鉴定由于基孔肯雅病毒和塞姆利基森林病毒（SFV），辛德比斯病毒（SINV）是同一血清型，很可能存在交叉反应。因此，为了验证我们获得的单抗是否只能特异性的检测基孔肯雅病毒而非其他甲病毒，我们对所获得的腹水抗体进行特异性检测，即用上述三种病毒感染细胞获得裂解液作为抗原，以纯化腹水抗体（0.1μg/ml）为一抗进行Westernblot验证，结果如图3-21所示。图3.21AWesternblot检测腹水抗体特异性Figure3.21AWesternblottingdetectionofthespecificityofascitesantibodies55 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定从上述Westernblot结果表明，筛选得到的9株纯化腹水抗体中，除了7B7和4C4能同时检测到CHIKV和SFV外，其余的7株抗体都只能检测到CHIKV，说明它们特异性很好，但是7B7和4C4到底是存在交叉反应还是由于抗原上样量多造成的，于是，我们对这两株抗体再次进行了IFA实验进行确证。图3.21BIFA检测腹水抗体特异性Figure3.21BIFAdetectionofthespecificityofascitesantibodies从IFA的结果可以看出，Westernblot鉴定出的和SFV有交叉反应的7B7和4C4这两株抗体在进行IFA验证时，也同样能和SFV起反应。由此可见，二者不仅可以检测基孔肯雅病毒，还可以检测SFV，这可能是因为两病毒属于同一血清学型造成的，比较两者E2蛋白氨基酸序列发现，两蛋白氨基酸需要确实存在很大的相似性，但是其他原因还需要进一步研究。这种现象造成了后期的检测CHIKV可能与SFV存在交叉反应，这就需要我们用特异性良好的抗体作为后期诊断检测的材料，同时7B7和4C4这两株抗体可以为SFV的检测提供了有用的检测和治疗（4C4有中和活性）材料，扩大了检测诊断应用范围。3.3.16腹水纯化抗体中和活性检测为了进一步验证所纯化的腹水抗体是否仍具有很好的中和活性，我们利用CHIKV-eGFP报告病毒进行了中和实验检测。我们将纯化的腹水抗体测定浓度后选择0.5μg/ml，0.05μg/ml，0.005μg/ml，0μg/ml的抗体进行实验，通过报告基因eGFP表达水平的抑制情况来判断抗体的中和效果，结果如图3.22所示。前期筛选得到的5株具有中和活性的杂交瘤细胞系，在制备成腹水抗体时仍表现出良好的中和病毒活性，在0.005μg/ml的抗体浓度下即具有很高的中和活性，这就说明我们所纯化的腹水抗体仍然有很好的中和活性。56 第3章基孔肯雅病毒结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定图3.22腹水抗体中和活性验证Figure3.22Verificationofneutralizationactivitiesofpurifiedascitesantibodies上述实验我们只将抗体浓度最低稀释至0.005μg/ml而未再往下稀释，这是实验欠缺的地方，所以后期会在此浓度的基础上继续往下稀释找到最低抑制浓度。3.3.17腹水纯化抗体效价检测为了验证纯化的腹水抗体的效价，我们先将9株纯化的腹水抗体稀释至1mg/ml，然后10倍系列稀释至105倍（即10-5mg/ml），以前述建立的ELISA检测体系进行检测，结果如图3.23所示。图3.23腹水抗体效价检测Figure3.22Verificationofdilutionofpurifiedascitesantibodies57 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定从上述结果可以看出，纯化的9株腹水抗体ELISA检测的效价除了4C4在105倍稀释度（即即10-5mg/ml），其他8株抗体的效价基本都在104倍稀释（即10-4mg/ml），也就是说当这些纯化的腹水抗体稀释105倍稀释（只有4C4）或者104倍稀释时仍然可以较灵敏的检测到抗原，说明纯化的腹水抗体的效价较高。3.4讨论本研究制备和鉴定了基孔肯雅病毒结构蛋白E2的单克隆抗体，在表达基孔肯雅病毒E2蛋白时，主要的问题是蛋白不可溶，我们在后期进行了各种优化包括更换表达菌株，降低诱导温度，降低IPTG诱导剂的浓度，但是蛋白仍然以包涵体的形式存在，后期我们进行割胶纯化，以此为免疫原免疫小鼠后也产生了特异且效价较高的鼠源多抗，可以用于后期的单抗筛选。在细胞融合后ELISA初筛获得15株阳性杂交瘤细胞，可是后期IFA检测发现只有9株杂交瘤细胞分泌的抗体可以用于检测，这就说明产生的单抗可能不都是针对空间表位的，后来对这9株抗体进行四轮亚克隆化，最终获得9株可以稳定分泌抗体的亚克隆细胞系，这里就需要注意细胞融合要注意操作，不可污染，在ELISA初筛及验证后要立即进行亚克隆化，亚克隆进行的越早，获得单克隆细胞系的几率越大。在筛选得到的9株抗体中有5株抗体具有中和活性，这些具有中和活性的抗体可以用于后期抗病毒机制研究和治疗用，结合检测到这些抗体的抗原表位，我们不仅可以用于后期诊断检测方法建立也为揭示病毒的机制提供了良好的依据和实验材料。由于目前对基孔肯雅病毒的研究非常少，随着近年来基孔肯雅病毒的频繁爆发，逐渐引起人们对该病毒的关注。我们筛选到的针对E2蛋白的单克隆抗体既可以作为诊断检测的材料，比如可以针对不同表位的抗体建立双抗夹心ELISA方法用于病人血清的诊断检测。5株具有中和活性的单抗可以用于研究病毒的作用机制和抗病毒的治疗，为后期相应的治疗措施提供了良好的材料。58 第4章总结与展望第4章总结与展望4.1总结基孔肯雅病毒是重要的虫媒病毒。近年来，随着全球气候不断变暖，各国往来日益频繁，基孔肯亚病毒感染病例频繁爆发。然而，目前尚无有效的抗病毒药物和疫苗，一旦感染，病人很难在短时间内彻底治愈。同时，基孔肯亚病毒感染与很多其他重要人类致病病毒如寨卡病毒感染早期临床症状相似，因此，在临床检测诊断方面，很难依靠仅有的病症去确诊病毒感染，所以建立一种快速、灵敏、特异性强的诊断检测方法就显得尤为重要。随着分子生物学的不断发展，越来越多的检测诊断技术层出不穷，其中，常用的核酸检测诊断方法中的荧光定量PCR方法是最为快速准确地一种检测手段。本文第一部分依照传统的荧光定量RT-PCR方法建立了一种能同时检测基孔肯雅病毒和寨卡病毒的检测手段。1.我们分别利用针对这两种病毒的特异性引物和Taqman探针，按照说明配制了相应的反应体系，实现了在一管中同时检测两种病毒又可以区分两种病毒。2.我们对体系的灵敏性，特异性，扩增效率等进行检测发现，这个检测体系的灵敏度可达到约0.5PFU的病毒，利用这个体系进行检测时只能特异性检测到基孔肯雅病毒和寨卡病毒而检测不到其他甲病毒和黄病毒，此体系的扩增效率都约大于100%，说明此检测体系完全可以实现在实验室对基孔肯亚病毒和寨卡病毒这两种病毒的检测。3.随后我们利用此体系对临床样本进行检测，结果表明用此体系的检出率与医院的检出率几乎一致，这也就说明此检测体系可以应用于临床，为基孔肯雅病毒或寨卡病毒感染的检测诊断提供了一种良好的检测方法。本文的第二部分是基孔肯雅病毒结构蛋白E2的单克隆抗体的制备和鉴定，其实这一部分主要也是为血清学诊断检测提供材料储备，希望获得针对不同抗原表位及具有中和活性的单抗，这样就可以为一些血清学检测诊断，如双抗加心、ELISA或胶体金试纸条的制备提供足够的储备材料。59 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定1．首先通过传统筛选单抗的方法经过验证获得9株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞系，并对这些细胞分泌的抗体进行如IFA，Westernblot，中和活性，抗体针对的抗原表位及抗体亚型进行鉴定。结果发现筛选得到的9株抗体都可以用于IFA和Westernblot的检测，这就为实验室的研究提供了良好的实验材料。2．后期制备了高滴度的腹水抗体，对这些纯化的腹水抗体进行进行鉴定，发现纯化的腹水抗体效价较高，IFA，Westernblot检测结果良好，特别是前期初步确定的5株均具有中和活性的单抗，经中和实验检测后发现，仅0.005μg的单抗即可发挥很好的中和病毒的效果，这就为我们后期研究病毒的感染机制或者抗体类抗病毒药物研发提供了重要材料。3．较之于多抗，单克隆抗体具有更好的特异性，结合本实验室的反向遗传学技术平台，必将对阐释病毒复制机制及致病机制具有重要的意义和价值。4.2展望不管是上述建立的核酸检测诊断方法还是制备的单克隆抗体，后期都可以作为实验室的研究材料，检测诊断试剂，以及抗病毒治疗候选药物等。本研究首先建立了灵敏、特异性强的可同时检测并能区分基孔肯雅病毒和寨卡病毒的一步法双重荧光定量RT-PCR检测方法，为临床症状相似的基孔肯亚病毒和寨卡病毒的快速检测提供快速有效工具。对于筛选得到的基孔肯雅病毒结构蛋白E2的单抗，目前只是对其部分属性进行了鉴定，还没有建立相应的血清学检测诊断技术。在后续工作中，我们可利用筛选到的针对不同抗原表位的抗体，建立相应的ELISA检测方法，用于病人血清的检测，为临床检测诊断提供优良的检测手段。另外本研究中所筛选到的5株具有中和活性的抗体可以用于后期的抗病毒药物开发，以及为病毒感染机制研究也提供良好的材料储备。同时，本实验建立了单克隆抗体制备技术平台，为后续开发针对结构蛋白乃至针对病毒的抗体奠定了坚实的基础，并为后续开发具有酶活性或其他活性的抗体提供了技术支持。60 参考文献参考文献1.CagliotiC,LalleE,CastillettiC,CarlettiF,CapobianchiMR,BordiL.2013.Chikungunyavirusinfection:anoverview.NewMicrobiol36:211-227.2.BurtFJ,RolphMS,RulliNE,MahalingamS,HeiseMT.2012.Chikungunya:are-emergingvirus.TheLancet379:662-671.3.VaneyMC,DuquerroyS,ReyFA.2013.Alphavirusstructure:activationforentryatthetargetcellsurface.CurrOpinVirol3:151-158.4.FongRH,BanikSSR,MattiaK,BarnesT,TuckerD,LissN,LuK,SelvarajahS,SrinivasanS,MabilaM,MillerA,MuenchMO,MichaultA,RuckerJB,PaesC,SimmonsG,KahleKM,DoranzBJ.2014.ExposureofEpitopeResiduesontheOuterFaceoftheChikungunyaVirusEnvelopeTrimerDeterminesAntibodyNeutralizingEfficacy.JournalofVirology88:14364-14379.5.PalP,DowdKA,BrienJD,EdelingMA,GorlatovS,JohnsonS,LeeI,AkahataW,NabelGJ,RichterMK,SmitJM,FremontDH,PiersonTC,HeiseMT,DiamondMS.2013.DevelopmentofahighlyprotectivecombinationmonoclonalantibodytherapyagainstChikungunyavirus.PLoSPathog9:e1003312.6.SmithSA,SilvaLA,FoxJM,FlyakAI,KoseN,SapparapuG,KhomandiakS,AshbrookAW,KahleKM,FongRH,SwayneS,DoranzBJ,McGeeCE,HeiseMT,PalP,BrienJD,AustinSK,DiamondMS,DermodyTS,CroweJE,Jr.2015.IsolationandCharacterizationofBroadandUltrapotentHumanMonoclonalAntibodieswithTherapeuticActivityagainstChikungunyaVirus.CellHostMicrobe18:86-95.7.SinghI,HeleniusA.1992.RoleofribosomesinSemlikiForestvirusnucleocapsiduncoating.JournalofVirology66:7049-7058.8.SolignatM,GayB,HiggsS,BriantL,DevauxC.2009.Replicationcycleofchikungunya:are-emergingarbovirus.Virology393:183-197.9.StraussEG,LevinsonR,RiceCM,DalrympleJ,StraussJH.1988.NonstructuralproteinsnsP3andnsP4ofRossRiverandO'Nyong-nyongviruses:sequenceandcomparisonwiththoseofotheralphaviruses.Virology164:265-274.10.ShirakoY,StraussJH.1994.RegulationofSindbisvirusRNAreplication:uncleavedP123andnsP4functioninminus-strandRNAsynthesis,whereascleavedproductsfromP123arerequiredforefficientplus-strandRNAsynthesis.JournalofVirology68:1874-1885.11.BartonDJ,SawickiSG,SawickiDL.1991.Solubilizationandimmunoprecipitationofalphavirusreplicationcomplexes.JournalofVirology65:1496-1506.12.BartonDJ,SawickiSG,SawickiDL.1988.Demonstrationinvitrooftemperature-sensitiveelongationofRNAinSindbisvirusmutantts6.JournalofVirology62:3597-3602.61 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附录A常用缩写附录A常用缩写缩写英文名称中文名称3′UTR3′untranlatedregion3′非翻译区域mAbsmonoclonalantibodies单克隆抗体5′UTR5′untranlatedregion5′非翻译区域AmpAmpicillin氨苄青霉素KanKanamycin卡纳青霉素十二烷基磺SDS-PAGSodiumDodecylSulfonate酸钠聚丙烯酰胺凝电泳EPolyacrylamidegel电泳electrophoresisBpBasepair碱基对TrisTris(hydroxymethyl)-meth三羟甲基氨基甲烷anaminE.coliEscherichiacoli大肠杆菌FBSfetalbovineserum胎牛血清IPTGIsopropyl异丙基硫代半乳糖苷β-D-1-thiogalactopyranosideHHour小时APSAmmoniumpersulfate过硫酸铵IFAimmunofluorescenceassay免疫荧光分析WBwesternblot蛋白质免疫印记TMBTetramethylbenzidine四甲基联苯胺MlMilliliter毫升ELISAEnzymelinkedimmunosorbent酶联免疫吸附剂测定69 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单抗制备及鉴定DMSOassay二甲基亚砜DimethylsulfoxideMOImultiplicityofinfection感染复数HHypoxanthine次黄嘌呤AAminopterin氨基喋呤TThymidine胸腺嘧啶核苷NSnonstructuralprotein非结构蛋白ORFopenreadingframe开放阅读框PBSphosphatebufferedsalane磷酸盐缓冲溶液RdRpRNAdependentRNARNA依赖的RNA聚合酶Polymerase活性rpmrotationperminute转/分ssecond秒µgmicrogram微克µlmicroliter微升VeroAfricangreenmonkeykidney非洲绿猴肾细胞cellsWTWildtype野生型aaAminoacid氨基酸70 附录B常用试剂配方附录B常用试剂配方1、LB液体培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，pH7.0。LB液体培养基中加琼脂粉至终浓度为2-3%，121℃高压灭菌20min后制备LB平板。2、SOC培养基：在0.9L去离水中加入蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl0.5g，1MKCl2.5ml，充分溶解混匀，用水补足体积到1L。分成100ml的小份，高压灭菌，培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭菌的1MMgCl2。3、PBS缓冲液：NaCl8g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO41.15g，加蒸馏水至1000ml，调pH值为7.4。4、10×TBS缓冲液NaCl80g，KCl2g，Tris-base30g，调PH至7.4定容至1L，使用时稀释。5、TBST缓冲液1×TBS添加1%Tween-206、5×SDS-PAGE缓冲液Tris碱15.1g，甘氨酸72g，SDS5g，加ddH2O溶解至1000ml，使用时稀释。7、10×转膜缓冲液甘氨酸29g，Tris-base58g，SDS3.75g，加ddH2O溶解至1000ml，使用时稀释并添加15%甲醇。8、50×TAE：242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)，用双蒸水溶解并定容至1L，使用时稀释50倍。71 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定9、SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶的配制溶液成分分离胶12%10ml浓缩胶4%5mlH2O2.053.51凝胶储液4.150.8351.0mol/l3.75---Tris-Hcl(PH8.8)1.0mol/l---0.625Tris-Hcl(PH6.8)10%SDS溶液0.080.0610%过硫酸铵0.10.1TEMED0.010.006注：上表所标体积为配制两块胶的用量。若配制一块或多块，可按比例减半或加倍。10、考马斯亮蓝染液在90mL甲醇：水（1∶1，1：1）和10mL冰乙酸的混合液中溶解0.25g考马斯亮蓝G250，用滤纸过滤除去颗粒状物质。11、Westernblotting封闭液（5%脱脂奶粉溶于TBST溶液）称取1g脱脂奶粉，加入10mLTBST溶液溶解后用TBST溶液定容至20mL。12、IPTG贮存液称取2gIPTG溶于8mL去离子水中，用去离子水定容至10mL后0.22µm过滤除菌，-20℃保存。13、ELISA包被缓冲液：(0.05mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液)Na2CO31.59g、NaHCO32.93g、蒸馏水定容至1L；4℃保存，一周内用完。14、ELISA洗涤液(0.01mol/L，pH7.4的PBST)72 致谢致谢时光匆匆，转眼间稍纵即逝，又到了毕业时分，而我也将迎来了三年硕士生活的终点，还记得三年前，怀揣着对科研的无限热情和对研究生生活的美好向往来到了美丽的武汉，美丽的病毒所。记得刚来的时候发现这里的树好多好绿，这里的花好艳好香，处处充满着好奇，就像我的研究生生活处处充满着不同的色彩。回首研究生生活的点滴，有欢笑、也有苦楚；有磨难、也有坚持；有拼搏、也有突破；收获了实验知识，科研态度，生活经验，虽然没有实现当时的愿望，但是这三年老师教会的，师兄师姐给与的，对于我来讲，亦是满载而归。首先，真诚的感谢我的导师张波研究员，感谢您这三年来一直不离不弃的帮助我，很多的时候都是我的做事方式方法不对导致实验或者其事情老是出现一些问题，可是您没有不管我，而是一直耐心帮助我分析原因，教会我做实验的方式方法，合理安排实验时间以及如何做好计划后按部就班去做实验，去生活。一直如此，我就是在不断犯错误和您及时纠正错误的过程中成长起来的。还记得刚来实验室的时候，我就是个愣头青，谁的话也听不进去，听了也记不住，貌似我能把任何一个“惹火”，也老是惹您生气，可是每次犯错误，您都苦口婆心的劝导，清晰的指出问题的关键所在，您严谨的治学态度，对时间的合理规划，对实验的巧妙计划，对课题方向的把握，敏锐的洞察力很是让我们折服。像您这种全身心扑在科研上，对科研严谨，真是在实打实做科研的老师才是我们广大青年学生学习的榜样！另外，衷心感谢我的师母叶寒青老师，感谢您在实验上给与的无私指导，您教会了我做荧光定量，教会了我做流式检测等实验和您在生活上给与我的温暖，您温柔大方，总是那么温暖，那么和蔼可亲，每每跟着您做实验总是想跟您说话，感谢您一直以来的耐心指导，能有张老师和您这样负责的导师和师母真是我的幸运。在此，请允许我表达对你们深深的祝福和敬佩，祝您们在今后的日子里工作顺利，身体健康，一直都这么幸福满满。衷心感谢邓老师，刘老师，及108实验室全体成员。衷心感谢邓成林老师，我其实更喜欢叫您“小老师”，每次看您做实验还是管理实验室都是特别稳，事情安排的特别合理，所以所有的事情总是又好又快的做完，所以每次出了问题总是第一个跑去问您。在生活中您就像个大姐姐跟我们一起吃饭，逛街，剪头发，73 基孔肯雅病毒核酸检测方法建立和结构蛋白E2单克隆抗体制备及鉴定买了好吃的分给我们，在您身上也感觉到了暖暖的。衷心感谢刘老师在实验方面、生活方面提供的帮助和支持，您的能力特别强，每次实验或者生活中出了问题总会跟您聊聊，在聊天中总会得到一些不一样的答案，对自己的问题解决提供了很大帮助。衷心感谢李晓丹师姐、张红垒师兄、张盼涛师兄、张秋艳师姐、陈冬冬师兄，张哲瑞师弟、李嘉琪师妹、张亚南师妹、李娜师妹，感谢生活学习中一直有你们的陪伴，特别是我的“圈圈姐”和“冬冬师兄”，非常感谢你们俩在实验和生活上的莫大帮助，非常珍惜和你们在一起的岁月，祝你们以后事业旺旺，生活旺旺，也祝108实验室越来越好、越来越牛气，我也相信咱们实验室定能厚积薄发！感谢龚鹏老师和您实验室的全体师生。感谢您在实验仪器和实验材料上提供的帮助，您的内敛、沉稳、睿智让我深受感染。在此，特别感谢逯国亮师兄和舒波师兄，感谢你们在实验上和实验仪器的使用上提供的帮助和指导，在此祝你们以后事业顺利、前程似锦！最后，感谢邓柳老师，感谢杨婕妤师姐、吴继芹师姐、刘伟驰师姐以及石晓玲同学，感谢你们提供的无私帮助。衷心感谢鄢慧民老师以及您实验室全体师生。感谢鄢老师在实验器材方面提供的帮助。在此特别感谢李幺明老师，漆秀文师姐及冯征山同学。衷心的感谢你们在单克隆抗体制备上提供的无私帮助和指导；特别是李么明老师和漆秀文师姐，每一次都是耐心的，不厌其烦的为我解答问题，非常感谢你们！衷心感谢袁志明老师以及您实验室全体师生，非常开心能和你们一起开组会学习。很怀念在您实验室做实验的那段时光，感谢刘孝云师姐、伊尹华师姐、王玉娟师姐、赵璐师妹，非常喜欢你们轻松爽朗的风格，感谢你们的陪伴。衷心感谢肖庚富老师及您实验室全体师生。总感觉我们两个实验已经融为一体，感谢您们在实验材料，仪器等方面提供的无私帮助，特别感谢刘洋老师、王宗林师兄、朱圣淋师兄、辛麒麟同学、王培林同学等，感谢你们的帮助和支持。衷心感谢研究生处的王燕飞老师，感谢您在我无助时的无私帮助，每次跟您聊天总会有获益匪浅；感谢何满老师，您可是带我们进入病毒所的领路人啊，还记得我每次问您问题，您总是很耐心的帮我解答。感谢孔汪霄老师以及研究生处的各位老师。衷心感谢动物房安学芳老师、张帆老师、朱幼玲老师、李莉老师、感谢你们在动物实验方面提供的帮助。74 致谢衷心感谢我的同学徐明月，辛麒麟，万伟伟，尹家一，赵娜，任佳琪，李童，陈桐等，感谢你们一直以来的陪伴和支持，使我的研究生生活不再枯燥。衷心感谢我的父母和姐姐。感谢你们一直以来对我的支持和关爱，特别要感谢我的妈妈，您就像我的朋友，我会把好多事情都讲给您听，特别是自己在钻牛角尖想不明的时候，您总是用最浅显的道理开导我，让我努力，让我上进。还有父亲，您的每一条鼓励我的短信我都有保留，每次受挫我总会看一看，这给与了我无穷的力量，还要感谢姐姐在生活中给与我的无私关爱，祝福我的家人们身体健康，幸福满满。谨以此文献给所有关爱、支持、帮助我的人。李晓2018年5月于小洪山75 作者简历作者简历基本信息姓名：李晓性别：女出生年月：1991年2月民族：汉籍贯：山东泰安教育经历2015.9-2018.6中国科学院武汉病毒研究所，硕士，微生物学专业。2010.9-2014.6泰山医学院，生物技术专业，获得理学学士学位。参加的研究项目及获奖情况1.Si-QingLiu*,XiaoLi*,Cheng-LinDeng,Zhi-MingYuan,BoZhang.Developmentandevaluationofone-stepmultiplexreal-timeRT-PCRassayforsimultaneousdetectionofZikavirusandChikungunyavirus.(2017)JMedVirol.2018Mar;90(3):389-396.2.Si-QingLiu,XiaoLi,Ya-NanZhang,Ai-LiGao,Cheng-LinDeng,Jun-HuaLi,ShoukatJehan,Nadiaamil,FeiDeng,HongPingWei,Bozhang.Detection,isolation,andcharacterizationofchikungunyavirusesassociatedwiththePakistanoutbreakof2016-2017.VirolSin.2017Dec;32(6):511-519.3.Li,J.-Q.,Deng,C.-L.,GU,D.,Li,X.,Shi,L.,Zhang,Q.-Y.,Zhang,B.,Ye,H.-Q.DevelopmentofarepliconcelllanebasedhighthroughputantiviralassayforscreeninginhibitorsofZikavirus.(2017)j.antiviral.2017.12.017.76 学位论文版权使用授权书本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托中国科学院大学向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社提交，同意编入ＣＮＫＩ学位论“文全文数据库并充实到学位论文学术不端行为检测”系统比对资源库，同意按章程规定享受相关权益。保密论文在解密后遵守此规定。论文级别：□博士［＾士学科专业：论文题目：疼￥南雜栽嫩检测沐梦立＾铱资必蟛抝划看夂１Ｓ：＆论文作者签名：指导教师签名：年月日沖丨兄尔＞Ｘ？呀年Ｖ月日友备注：此页不放入论文首页，交研究生处
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