基于“脾胰同源”应用养阴益气活血法减少血糖波动干预糖尿病大血管病变的研究

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ＣｈｅｎｄｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅｇ（临床医学院）二〇一八届硕士研究生学位论文“”基于脾胰同源应用养阴益气活血法减少血糠波动干预糠尿病大血管病变的研究ｗＭＴｈｅＢａｓｅｏｎＨｏｍｏｅｎｏｆＰｉａｎｄＹｉＤｅｃｒｅａｓｉｎＧｌｕｃｏｓｅｓｔｄｕｄｙｇｙｇＦｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｏｆＤｉａｂｅｔｉｃＭａｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙｂｙＴｏｎｉｆｙｉｎｇＱｉａｎｄＹｉｎａｎｄＰｒｏｍｏｔｉｎｇＢｌｏｏｄＣｉｒｃｌｕｌａｔｉｏｎ研究生姓名：刘晓瑞指导教师：谢春光教授学科专业：中医内科学，二〇一八年五月 学位论文基于“脾胰同源”应用养阴益气活血法减少血糖波动干预糖尿病大血管病变的研究刘晓瑞指导教师姓名：谢春光教授申请学位级别：硕士学位专业名称：中医内科学论文提交时间：2018年4月论文答辩时间：2018年5月课题来源：国家自然科学基金(NO:8150151388)二○一八年四月 成都中医药大学2015级硕士学位论文中文摘要目的：本研究基于中医“脾胰同源”思想把具有养阴益气活血功效的参芪复方应用于糖尿病大血管病变动物模型GK大鼠，研究其对GK大鼠一般情况、血糖、血脂、C反应蛋白、腹主动脉及胰腺病理的影响，并通过每日血糖平均水平（MBG）、每日平均血糖的标准差（SDBG）、最大血糖波动幅度（LABG）以及血清CRP、TC、TG、INS、GC、GLP-1等指标,初步探讨运用养阴益气活血法的参芪复方可以调节血脂，减少血糖波动，降低低度炎症，保护血管内皮，从而达到干预糖尿病大血管病变的目的。方法：选用40只5月龄雄性GK大鼠，经过严格的血糖监测，测大鼠的随机血糖,-1依据血糖值水平由高到低排列编号,随机血糖小于11.1mmol.L者共有10只剔除,-1最终符合要求的为30只大鼠，将30只2次随机血糖≥11.1mmol.L的5月龄SPF级雄性GK大鼠随机分成3组：正常组（n=10）；参芪复方组（简称参芪组，n=10）；西格列汀组（简称西药组，n=10）；另设10只5月龄雄性Wistar大鼠为正常对照组（简称正常组，n=10），总计为4组。适应性饲养4周后，正常组予以普通饲料和灭菌纯水，参芪组、模型组、以及西药组给予高脂饲料进行造模，连续给予高脂饲料，同时给药，建立糖尿病大血管病变动物模型。其后正常组、模型组均按5ml/kg·d灌服生理盐水，参芪组按1.44g/kg·d灌服参芪复方浸膏，而西药组按16mg/kg·d灌服西格列汀，各组灌胃8周。实验期间观察动物一般状况。在灌胃的第4周每周一次测定一日内的8:00,10:00,14:00,16:00,18:00，5个时间段的血糖情况，并计算MBG、SDBG、LABG值。灌胃8周后处死GK大鼠，检测各组血脂水平、CRP、血清胰岛素、血清胰高血糖素、血清GLP-1，对腹主动脉及胰腺组织进行HE染色后进行病理形态学观察。结果：参芪组一般状况优于模型组，血糖波动方面，每日平均血糖标准差（SDBG）和最大血糖波动幅度（LAGE）值优于模型组。甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)以及C反应蛋白（CRP）较模型组降低，但与西药组无统计学意义。胰岛素（INS）1 成都中医药大学2015级硕士学位论文与胰高血糖素（GC）与模型组相比，无统计学意义；而GLP-1较模型组有显著的差异，P＜0.01。病理方面，参芪组的腹主动脉切片可见完整光滑内膜、中膜弹力纤维完整，细胞胞核整齐排列；胰腺切片可见胰岛分布与胰腺周界限不清，少量淋巴细胞浸润，及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积）。结论：应用参芪复方可以改善糖尿病大血管病变GK大鼠的一般状态，提高GLP-1的浓度，控制血糖的波动幅度；且可以改善脂代谢紊乱，降低CRP，减轻模型GK大鼠血管内皮损伤，延缓糖尿病大血管病变的进展。关键词：“脾胰同源”思想；血糖波动；参芪复方；养阴益气活血法；GLP-1课题来源：国家自然科学基金(NO:8150151388)2 成都中医药大学2015级硕士学位论文AbstractObjective:ThisstudyisbasedonthetraditionalChinesemedicine"thespleenandpancreaswithhomologous"thought"yangyinyiqihuoxueefficacyofShenqicompoundusedinGKanimalmodelofdiabeticmacrovasculardiseaseinratsandstudyitseffectonthegeneralcondition,bloodglucose,bloodlipid,CRP,aorticandpancreaticpathologyinGKrats,andthroughthedailyaveragebloodglucoselevels(MBG)theaveragedailybloodglucose,standarddeviation(SDBG),maximumbloodglucosefluctuations(LABG)andserumGLP-1,preliminarystudyofShenqicompoundwithYangyinYiqiHuoxuemethodcanreducebloodglucosefluctuation,soastoachievethepurposeofinterventionofdiabeticmacrovasculardisease.Methods:40maleGKratswereselectedandthebloodglucosewasmeasuredbystrictbloodglucosemonitoring.Accordingtothebloodglucoselevel,thebloodsugarwasnumberedfromhightolow,and10oftherandombloodsugarwerelessthan11.1mmol.L-1.Intheend,30ratswereconformedtotherequirements,and30maleGKratsof302timesofbloodglucoseormorethan11.1mmol.L-1wererandomlydividedintothemalerats.The3groups:blankgroup(n=10),Shenqicompoundgroup(referredtoShenqigroup,n=10),Westernglipetinegroup(n=10),and105montholdmaleWistarratsasnormalcontrolgroup(abbreviatednormalgroup,n=10),totalof4groups.After4weeksofadaptivefeeding,theblankgroupwasgivenordinaryfeedandsterilizedpurewater,theShenqigroup,themodelgroup,andthegroupofWesternglipetineweregivenhighfatdiet,andthehighfatdietwasgivencontinuously,andthediabeticmacrovasculardiseaseanimalmodelwasestablished.Thentheblankgroupandthemodelgroupweretreatedwith5ml/kg.D,andShenqigroupwasfilledwithShenqicompoundextractaccordingto1.44g/kg.D,whilethegroupofWesternglipetinewasgivenSigLeoDeandwith16mg/kg.Dfor8weeks.Thegeneralconditionoftheanimalswasobservedduringtheexperiment.Duringthefourthweekofgavage,thebloodglucoselevelsof8:00,10:00,14:00,16:00,18:00and3 成都中医药大学2015级硕士学位论文5timeintervalsweremeasuredonceaweek,andthevaluesofMBG,SDBGandLABGwerecalculated.GKratswerekilledafter8weeksofgavage.Bloodlipidlevel,CRP,seruminsulin,serumglucagonandserumGLP-1weredetectedineachgroup.TheabdominalaortaandpancreatictissuewerestainedwithHEtoobservethepathomorphologyResults:ThegeneralconditionofShenqicompoundgroupisbetterthanthatofthemodelgroup.Theaveragebloodglucosestandarddeviation(SDBG)andthemaximumbloodsugarfluctuationrange(LAGE)ofbloodglucosefluctuationarebetterthanthoseofthemodelgroup.Triglyceride(TG),cholesterol(TC)andCreactiveprotein(CRP)werelowerthanthoseinthemodelgroup,butnostatisticalsignificancewasfoundinthewesternmedicinegroup.Therewasnosignificantdifferenceininsulin(INS)andglucagon(GC)comparedwiththemodelgroup,butGLP-1wassignificantlydifferentfromthatinthemodelgroup,P<0.01.Inpathology,thethoracicandabdominalaortaslicesofShenqicompoundgroupshowedcompletesmoothendometrium,middlemembraneelasticfibers,andcellnucleiarrangedregularly.Noisletswerefoundinthepancreasslices,mostofthenucleiwerepyknosisandapoptosis,andtherewasnoabnormalchangeinthesizeandshapeoftheislets.Conclusion:ThegeneralstateoftheapplicationofShenqicompoundrecipecanimprovethevascularlesioninGKdiabeticrats,increaseGLP-1concentration,fluctuationofbloodglucosecontrol;andcanimprovelipidmetabolism,decreaseCRPandalleviatevascularendothelialinjuryinratsmodelofGK,delaytheprogressofdiabeticmacrovasculardisease.Keywords:"spleenandpancreashomology"thought;bloodglucosefluctuation;Shenqicompound;nourishingYin,invigoratingqiandactivatingblood;GLP-14 成都中医药大学2015级硕士学位论文中英文词汇缩略表英文缩写英文全称中文译名actionindiabetesandvasculardisease:preteraxanddiamicronMRcontrolledADVANCEevaluation糖尿病和心血管疾病行动AGEsadvancedglycosylationendprodrcts糖基化终末产物Akt/PKBproteinkinaseB蛋白激酶BAMPKAMP-activatedkinase腺苷酸活化蛋白激酶AngⅡangiotensinⅡ血管紧张素ⅡApoEApolipoproteinE载脂蛋白EASartherosclerosis动脉粥样硬化ATPadenosine-triphosphate三磷酸腺苷COcarbonmonoxide一氧化碳COX-2cyclooxygenase2环氧化酶2CRPhyersensityC-reactiveprotein超敏c反应蛋白DCCTDiabetesControlandComplicationsTrial糖尿病控制和并发症试验DMdiabetesmellitus糖尿病eNOSendothelialnitricoxidesynthase内皮型一氧化氮合酶EDCendothelialcells内皮细胞ET-1Endothelin1内皮素1FDAFoodandDrugAdministration美国食品药品管理局FFAfreefattyacid游离脂肪酸GOGeneOntology基因本体论HDL-Chigh-densitylipoproteincholesterol高密度脂蛋白胆固醇HEhematoxylin-eosin苏木精—伊红ICAM-1intercellularadhesionmolecule-1细胞间粘附分子-1IDFInternationalDiabetesFederation国际糖尿病联盟IL-6interleukin-6白介素-6INSinsulin胰岛素IRInsulinResistance胰岛素抵抗DPP-4KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes二肽基肽酶-4Nw-Nitro-L-argininemethylesterL-NAMEhydrochlorideNw-硝基-L-精氨酸甲酯NADPHtriphosphopyridinenucleotide还原型辅酶IINF-kBNuclearfactor-kappaB核因子kBNOnitricoxide一氧化氮OX-LDLoxidatedlowdensitylipoprotein氧化低密度脂蛋白PI3-KPhosphatidylinositol3-kinase磷脂酰肌醇3-激酶PKAproteinkinaseA蛋白激酶ARNARibonucleicacid核糖核酸ROSreactiveoxygenspecies活性氧T2DMtype2diabetesmellitus2型糖尿病TCtotalcholesterol总胆固醇5 成都中医药大学2015级硕士学位论文TGtriglyceride甘油三酯TNF-aTumorNecrosisFactor-alpha肿瘤坏死因子-αUKPDSUnitedKingdomProspectiveDiabetesStudy英国前瞻性糖尿病研究VCAM-1vascularcelladhesionmolecule1血管细胞粘附分子-1VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子VSMCvascularsmoothmusclecell血管平滑肌细胞PKCproteinkinaseC蛋白激酶CGLP-1Glucagon-likepeptide1胰高血糖素样肽-1GCglucagon胰高血糖素StandarddeviationofdailymeanbloodSDBGglucose每日平均血糖的标准差laximumamplitudeofbloodglucoseLABGfluctuation最大血糖波动幅度MBGmeanbloodglucose每日血糖平均水平ET-1Endothelin-1内皮素-1CoefficientofvariabilityoffastingFPG-CVbloodglucose空腹血糖变异系数CVDcardiovasculardiseases心脑血管疾病6 成都中医药大学2015级硕士学位论文目录中文摘要.........................................................................................................................................................1Abstract...........................................................................................................................................................3中英文词汇缩略表.........................................................................................................................................5引言..............................................................................................................................................................9实验研究........................................................................................................................................................111.实验材料............................................................................................................................................111.1实验动物.........................................................................................................................................111.2饲养环境及饲料.............................................................................................................................111.3实验药品.........................................................................................................................................111.4主要试剂及试剂盒.........................................................................................................................111.5主要仪器和材料............................................................................................................................122方法....................................................................................................................................................132.1分组及造模方法............................................................................................................................132.2给药方法........................................................................................................................................132.3标本采集与处理............................................................................................................................132.4观察指标及检测............................................................................................................................142.4.1大鼠一般情况............................................................................................................................142.4.2血糖波动检测............................................................................................................................142.4.3血脂检测....................................................................................................................................142.4.4血清CRP运用ELISA法测定....................................................................................................152.4.5血清胰岛素、胰高血糖素、GLP-1检测的运用ELISA法测定............................................162.4.6腹主动脉及胰腺的病理染色....................................................................................................162.5统计学方法....................................................................................................................................183.实验结果分析...................................................................................................................................183.1GK大鼠一般情况的观察..............................................................................................................183.2各组GK大鼠体重比较.................................................................................................................183.3各组GK大鼠摄食比较.................................................................................................................193.4各组GK大鼠饮水比较..................................................................................................................203.58周各组GK大鼠CRP比较..........................................................................................................213.68周各组GK大鼠GC比较............................................................................................................213.78周各组GK大鼠TC比较............................................................................................................223.88周各组GK大鼠TG比较............................................................................................................223.98周各组GK大鼠GLP-1比较......................................................................................................233.108周各组GK大鼠血糖波动情况比较........................................................................................243.114各组大鼠腹主动脉HE染色观察............................................................................................243.12各组大鼠胰腺HE染色观察.....................................................................................................25讨论............................................................................................................................................................261祖国医学对糖尿病大血管病变的认识............................................................................................281.1文献探源.......................................................................................................................................281.2糖尿病大血管病变的病因病机...................................................................................................291.2.1病因............................................................................................................................................291.2.2病机............................................................................................................................................297 成都中医药大学2015级硕士学位论文2糖尿病大血管病变的现代医学认识...............................................................................................302.1.危险因素.......................................................................................................................................302.2发病机制.......................................................................................................................................312.3现代医学治疗................................................................................................................................343.“脾胰同源”思想在干预糖尿病大血管病变中的运用...............................................................343.1“脾胰同源”思想文献探源.........................................................................................................363.2“脾胰同源”的解剖学证据.........................................................................................................363.3“脾胰同源”与血糖波动内涵联系.............................................................................................374本课题动物模型的选择依据............................................................................................................385.本课题相关指标的选择...................................................................................................................396.药物选择...........................................................................................................................................397阳性对照药物的选择.......................................................................................................................428实验结果讨论...................................................................................................................................428.1应用参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠一般状态的影响..................................................428.2应用参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠血糖波动的影响..................................................438.3应用参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠胰高血糖素、胰岛素以及GLP-1的影响..........448.4应用参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠血脂的影响..........................................................458.5应用参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠血清CRP的影响..................................................468.6参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠腹主动脉的病理形态学改变的影响..........................478.7.参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠胰腺HE染色的影响...................................................47结论............................................................................................................................................................48问题与展望...................................................................................................................................................49致谢............................................................................................................................................................50参考文献.......................................................................................................................................................51附件附件一：综述.............................................................................................................................................56附件二：在校期间公开发表的的学术论文...............................................................................................61附件三：声明.............................................................................................................................................628 成都中医药大学2015级硕士学位论文引言随着当今社会经济水平的快速发展，生活方式地不断改变加之全球人口老龄化进程的加速，目前糖尿病患病人数呈现急速增长的趋势，根据国际糖尿病联盟（IDF）的相关统计，截止到2011年全球的糖尿病患者人数已达3.7亿，2017年已达到4.25亿，预计到2045年，全球糖尿病患者可能达到6.29亿。据统计[1]中国14个省，糖尿病流行病学调查结果显示中国现有糖尿病患者达9240万例,居全球之首。糖尿病患者数量庞大，且增长迅速，给我国社会和经济发展带来沉重的负担。糖尿病并不可怕，可怕的是其并发症，具有早期难以发现，发现后难以治疗的特点。根据我国糖尿病患者医疗花费研究显示，用于控制血糖的费用不[2]超过20%，而其余80%的费用是治疗糖尿病引起的并发症。其中，糖尿病大血管病变是引起糖尿病患者主要致残、致死原因，是危害最大的糖尿病慢性并发症，约80%的2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)患者死于大血管并发症，如心肌梗死、脑卒中等。糖尿病大血管病变的主要病理基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的形成，它与单纯的As相比病变发生时间早、范围大、[3]程度重。另一项数据表明，糖尿病患者的血管病变发病率是非糖尿病患者的2[4][5][6]至4倍。我国住院糖尿病病人中合并大血管病变者高达65%。本病为终身疾病，无法根治，各种慢性并发症严重损害了人们健康，大大降低了患者的生活质量，与此同时也给国民经济造成巨大负担。而大血管并发症是与血糖波动息息相关的。糖尿病患者日内与日间血糖波动[7]幅度是正常人群的3倍和2.5倍，临床与实验研究结果均表明，波动性高血糖[8]危害甚至比稳定性高血糖更大。早在2007年，国际糖尿病联盟（IDF）发布的《餐后血糖管理指南》明确指出血糖波动促进糖尿病慢性并发症的发生以及发展。有研究发现，与空腹血糖变异系数（FPG-CV）＜16%者相比，FPG-CV＞29%[9]者发生糖尿病血管并发症的相对危险度增加2.68倍。一项为期10年的糖尿病人群随访研究结果表明，随访前3年的FPG-CV是糖尿病总死亡率、心血管死亡[10]率增加的独立预测因子。新研究同样表明，波动性高血糖被认为是引起心血管[11]并发症的另一个独立危险因素。而究其原因，波动性高血糖导致机体炎症反应、自由基增多及蛋白激酶C、多元醇、糖基化终产物、己糖胺、核因子КB系统、高血糖记忆效应等途径引发血糖内皮损伤、动脉粥样硬化，是糖尿病血管病变的9 成都中医药大学2015级硕士学位论文[12][13]始动环节。因此，糖尿病患者在治疗过程中，需“精细降糖，平稳达标”，既要重视对血糖的严格控制，又要尽可能地降低血糖波动，减低炎症反应，这是干预糖尿病大血管病变并发症，降低糖尿病患者病残率、病死率的关键问题。在祖国医学方面，糖尿病属于中医“消渴”范畴，文献中尚未记载糖尿病大血管病变的相关病因、病机。通过四诊合参对糖尿病大血管病变中医病机分析，[14]我们认为糖尿病大血管病变的核心病机为气阴两虚，从而导致瘀血阻滞。而具有益气养阴活血功效的参芪复方正是紧扣疾病病机，参芪复方是导师谢春光教授治疗2型糖尿病的经验方，已有15年的临床以及动物实验研究作为前期的基础，[15]从前期的临床研究显示，参芪复方具有改善胰岛素抵抗、稳定血糖等综合作用。前期动物实验研究结果显示，参芪复方对于模型大鼠血糖、胰岛素等都有良好的[16][17][18][19][20][21]调节作用，并能很好的改善其炎症状态。另一方面，从“脾胰同源”理论辩治血糖波动，脾、胰在功能与解剖上均有联系，“脾不散精”，不能“水精四布，五经并行”，从而停聚成为“糖浊”，引起血糖的上下波动幅度增大。基于此，本次实验把具有显著疗效的参芪复方用于糖尿病模型的血糖波动以及大血管病变，在开始造模时，参芪组即开始给予参芪复方进行治疗，并观察其对GK大鼠的一般情况、血糖波动情况（MBG、SDBG、LABG值），检测大鼠血脂水平、CRP、血清胰岛素、胰高血糖素、GLP-1，对腹主动脉及胰腺组织进行HE染色后进行病理形态学观察。初步探讨把具有养阴益气活血功效的参芪复方运用于糖尿病血糖波动以及对大血管病变的有效性机制。10 成都中医药大学2015级硕士学位论文实验研究1.实验材料1.1实验动物自发性T2DMGK（Goto-KakisakiWistarrats）大鼠40只，5月龄，雄性；经过严格的血糖测定，前期筛查，最终符合要求的为30只大鼠。Wistar大鼠10只，5月龄，雄性，均为SPF（specificpathogenfree）级。GK大鼠购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司（中国科学院上海实验动物中心），生产许可证号：SCXK（京）2012-0002。1.2饲养环境及饲料饲养环境：所有实验动物均在四川省中医药科学院实验动物中心SPF级动物房饲养，分为5只/笼，每天更换垫料一次，由专人定期消毒。饲养环境温度为22-23℃，湿度为55%-60%。每天光照/黑暗时间为12h/12h，考虑到该模型血糖不太稳定，容易波动，适应性饲养4周后进行造模。饲料：实验期间正常对照组Wistar大鼠喂饲普通饲料，普通饲料购买于四川省中医药科学院实验动物中心。其余各组GK大鼠喂养高脂饲料，高脂饲料配方为：普通饲料占88.2%，精炼猪油10%，胆固醇1.5%，猪胆盐0.3%，由四川省中医药科学院实验动物中心制成条状块料，烤干、辐照灭菌，真空包装备用。饮水：实验期间，实验动物饮用水均为灭菌纯水，由四川省中医药科学院实验动物中心提供。1.3实验药品参芪复方药物组成（成人一日剂量）：人参15g，生黄芪15g，生地10g，天花粉10g，山茱萸10g，丹参10g，山药10g，制大黄6g。参芪复方组分浸膏：1g浸膏相当于原生药10g，由四川省中医药研究院中医研究所药剂科生产。（批号：20161117）-1磷酸西格列汀片：100mg·片*7片，由MerckSharpDohmeLtd.（UnitedKingdom）（批准文号：国药准字J20140095）。1.4主要试剂及试剂盒ELISA试剂盒品牌：Bogoo酶标仪型号：DENLEYDRAGONWellscanMK311 成都中医药大学2015级硕士学位论文公司：Thermo产地：芬兰分析软件：AscentsoftwareforMultiskan洗板机型号：Wellwash4MK2公司：Thermo产地：芬兰数字显示隔水式电热恒温培养箱型号：PYX-DHS规格：4002*500公司：上海跃进医疗器械厂离心机型号：TGL-168编号：11-07公司：上海安亭科学仪器厂移液枪：Thermolabsystems规格：20-200ul漩涡混合器型号：XW-80A公司：上海青浦沪西仪器厂烘箱：电热恒温鼓风干燥箱型：DHG-9023A公司：上海精宏实验设备有限公司分液器：连续分液器型号：0.1～50ml公司:TOMOSLIFESCIENCEGroup高通量组织研磨器品牌：宁波新芝1.5主要仪器和材料血糖仪：美国强生血糖仪（型号：ONETOUCHUltra）；血糖试纸：美国强生公司ONETOUCHUltra离心机：德国ThermoFisher公司12 成都中医药大学2015级硕士学位论文-20℃冰箱：BCD-236HT，中国海尔公司液氮罐（金凤）Eppendorf移液枪枪头（AxyGen）2ml冻存管（Corning）2方法2.1分组及造模方法将实验分为3组，每组10只，共30只5月龄雄性GK大鼠。模型按随机血糖由高到低排列编号，随机分为：模型组（n=10）、西药组（n=10）、参芪组（n=10）。另设10只5月龄雄性Wistar大鼠作为空白对照组，共4组。30只大鼠适应性饲养4周，4周后除正常组外，连续给予高脂饲料8周，高脂饲料喂养的同时给药，建立糖尿病大血管病变动物模型。2.2给药方法干预方法，按下表给药。组别例数饲药给药剂量给药方式给药时间正常组10生理盐水5ml/kg·d灌胃8w模型组10生理盐水5ml/kg·d灌胃8w参芪组10参芪复方1.44g/kg·d灌胃8w西药组10西格列汀16mg/kg·d灌胃8w注：参芪组和西药组给药剂量相当于成人剂量的10倍，每周定时测大鼠体重并根据体重变化及时调整灌胃量。（参芪复方给药剂量为原生药剂量），参芪组按1.44g/kg·d灌服参芪复方，西药组：按16mg/kg·d剂量灌服西格列汀。2.3标本采集与处理各组大鼠连续给药8周后处死，处死前禁食不禁水5小时，股动脉取血大概为0.5-0.7ml，以3000r/min离心10分钟，分离血清，放置于-20℃低温冰箱中保存，待测血脂和用于ELISA实验。颈椎脱臼处死，迅速剪开胸腹腔，无菌条件下5min内取出腹主动脉，置于事先标记好的冻存管（Corning）里，然后投入液氮中保存，用于后续试验检测。同时处死时纵向剪开腹部，在胰头部位剪取适13 成都中医药大学2015级硕士学位论文量胰腺组织，固定于的多聚甲酸溶液，再用石錯包埋切片，用于观察大鼠胰腺形态学变化。2.4观察指标及检测2.4.1大鼠一般状态观察每日定时观察各组大鼠的毛色、神态、饮水、摄食、体重、尿量、排泄、行为活动反应等情况，记录GK大鼠死亡情况。2.4.2血糖波动监测开始用药后每周严格消毒，尾静脉取血，用血糖仪测试（强生血糖试纸稳豪型：50片试纸和针，国食药监械（进）字2014第2400247号强生（Johnson&Johnson）血糖仪：稳豪倍易型（银色），沪食药监械(准)字2014第2400013号）；每周一次测定一日内8:00,10:00,14:00,16:00,18:00这5个时间段的血糖情况，并用每日血糖平均水平（MBG）、每日平均血糖的标准差（SDBG）、最大血糖波动幅度（LABG，日内血糖最高值与最低值之差）衡量各组血糖稳定性，统计灌胃4周后各组大鼠MBG、SDBG、LABG值。2.4.3血脂检测血脂检测指标包括胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）。其步骤如下：（1）准备试剂与收集血样：1.收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。血清、血浆用蒸馏水至少5倍稀释，做好预实验以确定稀释倍数。2.标准品液配制：设标准管8管，第一管加蒸馏水900ul，第二至第八管加入蒸馏水500ul。在第一管中加入20mmol/L的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。除此之外，TC接下来还应该包括底物工作液配制：临用前将OPD片放入蒸馏水中溶解，每片加蒸馏水5ML。（2）检测程序：1.加样：每孔各加入标准品或待测样品20ul。2.每孔加入底物工作液100ul。3.每孔加酶标抗体工作液10ul。振荡混匀后将反应板置37℃15分钟。此外TC14 成都中医药大学2015级硕士学位论文还每孔加入100ul终止液混匀。4.30分钟内TC用酶标仪在490nm处测吸光值,而TG在550nm处测吸光值。（3）结果计算与判断：1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。2.以标准品2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0mmol/L为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。3.TC根据样品OD值在该曲线图上查出相应CHOL含量，再乘上稀释倍数即可，TG根据样品OD值在该曲线图上查出相应TRIG含量。（4）注意事项：1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。2.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。3.本试剂盒宜置4℃冰箱保存。4.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断。5.样本如果浑浊需要离心或稀释后检测。2.4.4血清CRP运用ELISA法测定（1）准备试剂与收集血样：1.10×标本稀释液用蒸馏水作1：10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。2.收集标本：血清，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。正常标本测定前用标本稀释液至少作1：5稀释（取40ul，加标本稀释液160ul,稀释5倍）。3.标准品液配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成1000ng/ml的溶液。取8个1.5ml离心管，每管加入标本稀释液300ul。在第一管中加入1000ng/ml的标准品溶液300ul置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出300ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出300ul弃去。第八管为空白对照。4.洗涤液：用重蒸水1：20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）（2）检测程序：1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。3.每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后15 成都中医药大学2015级硕士学位论文置37℃20分钟。4.洗板：同前。5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃10分钟。6.洗板：同前。7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。8.每孔加入100ul终止液混匀。9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。（3）结果计算与判断1.所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。2.以标准品500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、0ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线。根据样品OD值计算出相应CRP含量，再乘上稀释倍数即可。2.4.5血清胰岛素、胰高血糖素、GLP-1检测的运用ELISA法测定采用ELISA法测定分别测定胰岛素、胰高血糖素、GLP-1.具体步骤如下：（1）准备试剂与收集血样1.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。2.收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。3.标准品液配制：胰岛素设标准管7管，每管加入标本稀释液100ul。在第一管中加入10ng/ml的标准品，而胰高血糖素的标准品液配制：取8个1.5ml离心管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。至于GLP-1标准品液配制：取8个1.5ml离心管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入100ng/ml的标准品溶液100ul置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照溶液100ul混匀后用加样器吸出100ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第六管中吸16 成都中医药大学2015级硕士学位论文100ul弃去。第七管为空白对照。加上原液管总共八管。4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）（2）检测程序1.加样：每孔各加入标准品或待测样品5ul。将反应板振荡60秒；而胰高血糖素加样中每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板置振荡器（400-500rpm）室温120分钟。GLP-1则为每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。2.每孔加入第一抗体工作液45ul(空白除外)，盖紧封板膜以避免交叉污染。将反应板置振荡器（400-500rpm）室温（18-25℃）120分钟；而胰高血糖素和GLP-1则为每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟。3.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；4.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃10分钟。5.洗板：同前。6.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。7.每孔加入100ul终止液混匀。8.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。（3）结果计算与判断1.所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。2.以标准品10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0ng/ml为横坐标；而胰高血糖素以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线。3.根据样品OD值计算出相应胰岛素、胰高血糖素、GLP-1含量含量即可。2.4.6腹主动脉及胰腺组织病理染色剥离并摘除所需的腹主动脉标本后立即用4%的多聚甲醛固定标本，充分固定24小时后进行脱水，固定组织均于取材后脱水前用自来水冲洗过夜，全自动脱水机各级乙醇脱水、TO透明液透明、两次浸蜡；包埋机常规石蜡包埋；轮转式切片机切片5μm；HE染色：切片以TO透明液透明，加拿大树胶封片供镜检。17 成都中医药大学2015级硕士学位论文而胰腺组织大鼠后，作苏木素一伊红染色，镜下观察病理改变：主要从胰岛形态、胰岛数量及染色的深浅程度、胞核位置等角度进行观察。以上标本均按病理检验SOP程序进行。部分标本照像并硬盘记录数据。2.5统计学方法数据均采用SPSS20.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，符合参数检验者，采用单因素方差分析各实验组的整体差异，实验组两两比较采用SNK检验；不符合参数检验者，采用多组计量资料秩和检验；重复测量数据采用重复测量设计资料的方差分析。统计结果以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有强显著性差异。3.实验结果分析3.1GK大鼠一般情况的观察本实验所采用的GK大鼠，是国际公认的自发性2型糖尿病动物模型，接近中医学认为本病病因先天禀赋不足的特点，且与现代医学2型糖尿病相似，对应祖国医学的“消渴”、“脾瘅”等病名。具有个体性差异小，死亡率较低，得到的统计学数据可靠等优点。通过对整个实验过程的观察，GK大鼠躯干部分浅棕黄色，头部、四肢白色，Wistar大鼠毛色较白且更有光泽。适应性饲养4周，GK大鼠精神状态较好，皮毛光亮，反应敏捷。造模开始，与正常Wistar大鼠对照组相比，GK大鼠饮水量偏多，摄食量偏少，体重偏低。各组GK大鼠，随周龄增长，出现精神萎靡，反应迟缓，动作缓慢的现象。实验过程中有个别大鼠的尾尖部有坏死现象，坏死部位会自动脱落，考虑由于测血糖次数过多引起。模型组大鼠在实验第7周（第44天）死亡一只，死亡解剖后，发现有肝脓肿表现，可能是由于感染引起的肝脓肿导致死亡，余大鼠数量均未有变化。3.2各组GK大鼠体重比较18 成都中医药大学2015级硕士学位论文_表1各组大鼠体重比较（g）（x±s）组别N实验前第4周第8周正常组10341.1±18.5369.1±16.9405.6±21.3ΔΔΔΔΔΔ模型组9308.2±19.0332.8±19.8364.6±15.2ΔΔΔΔΔΔ参芪组10314.5±11.5337.4±11.4362.3±10.8ΔΔΔΔΔΔ西药组10316.2±14.6338.1±16.5367.3±17.8注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与西药组比较，P＜0.05，P＜0.01。从上表可知，体重未见显著差异，各组间无统计学意义。3.3各组GK大鼠摄食量比较_表2各组大鼠日摄食量比较（g）（x±s）组别N实验前第4周第8周**正常组1023.3±1.823.0±0.823.0±0.9ΔΔΔΔΔΔ模型组919.4±1.319.1±0.819.6±1.1ΔΔΔΔΔΔ**参芪组1019.1±1.718.5±0.518.3±0.5ΔΔΔΔΔΔ西药组1019.4±1.018.9±0.718.8±0.619 成都中医药大学2015级硕士学位论文注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与西药组比较，P＜0.05，P＜0.01从上表可知，第8周时，参芪组与正常组差异具有显著性（P＜0.01）。3.4各组GK大鼠饮水量比较_表3各组大鼠日饮水量比较（ml/d）（x±s）组别N实验前第4周第8周****正常组1035.6±3.737.2±2.938.2±3.5ΔΔΔΔΔΔ模型组942.4±4.648.8±3.054.1±4.1ΔΔΔΔ**ΔΔ**参芪组1043.5±4.644.1±3.745.6±4.7ΔΔΔΔ*ΔΔ**西药组1042.7±4.844.8±3.846.0±3.3注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP20 成都中医药大学2015级硕士学位论文＜0.01；与西药组比较，P＜0.05，P＜0.01从上表可知，第4周，参芪组与模型组相比，P＜0.01,差异具有显著性；第8周，参芪、西药二组与模型组有显著性差异（P＜0.01）。3.58周各组GK大鼠CRP比较_表48周各组大鼠CRP比较（ng/ml）稀释10倍（x±s）组别N8周**正常组10108.85±13.03ΔΔ模型组9164.75±20.89**Δ参芪组10130.01±31.75*ΔΔ西药组10140.93±15.00注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与西药组比较，P＜0.05，P＜0.01从上表可知，参芪组较模型组的CRP水平有明显的降低，差异具有显著性（P<0.01）；参芪组与西药组CRP水平差异无统计学意义。3.68周各组GK大鼠GC比较_表28周各组大鼠GC比较（pg/ml）（x±s）组别N8周**正常组10175.42±33.60ΔΔ模型组9567.93±76.75参芪组10500.26±77.80ΔΔ**ΔΔ西药组10379.13±93.9721 成都中医药大学2015级硕士学位论文注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与西药组比较，P＜0.05，P＜0.01从上表可知，参芪组与西药组差异具有显著性，有统计学意义（P＜0.01）。3.78周各组GK大鼠TC比较_表38周各组大鼠TC比较（mmol/L）稀释100倍（x±s）组别N8周**正常组100.18±0.02ΔΔ模型组90.25±0.02**参芪组100.21±0.02**Δ西药组100.21±0.02注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与西药组比较，P＜0.05，P＜0.01；从上表可知，参芪组和西药组TC均低于模型组，差异具有显著性（P<0.01）。3.88周各组GK大鼠TG比较22 成都中医药大学2015级硕士学位论文_表48周各组大鼠TG比较（mmol/L）稀释10倍（x±s）组别N8周**正常组100.42±0.03ΔΔ模型组90.62±0.06**Δ参芪组100.47±0.03**Δ西药组100.49±0.04注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与西药组比较，P＜0.05，P＜0.01。从上表可知，参芪组和西药组TG均低于模型组，差异具有显著性（P<0.01）。3.98周各组GK大鼠INS比较_表68周各组大鼠INS比较（ng/ml）（x±s）组别N8周**正常组100.54±0.10ΔΔ模型组90.34±0.13参芪组100.44±0.09**西药组100.50±0.10注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与西药组比较，P＜0.05，P＜0.01；23 成都中医药大学2015级硕士学位论文3.108周各组GK大鼠GLP-1比较_表58周各组大鼠GLP-1比较（ng/ml）（x±s）组别N8周**正常组101.63±0.06ΔΔ模型组91.36±0.08**ΔΔ参芪组101.53±0.07**Δ西药组101.57±0.06注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与西药组比较，P＜0.05，P＜0.01从上表可知，与模型组相比，参芪组和西药组CLP-1浓度均增高，且P＜0.01,有明显的统计学差异。3.114周各组GK大鼠血糖波动情况比较_表6实验第4周各组大鼠血糖波动情况比较（mmol/l）（x±s）组别NMBGSDBGLAGE******正常组105.00±0.420.63±0.381.72±1.06ΔΔΔΔΔΔ模型组1019.39±1.563.15±0.858.76±2.23ΔΔΔΔ**ΔΔ**参芪组1018.21±1.632.08±0.765.78±2.26ΔΔΔΔ**ΔΔ**西药组1017.79±1.882.02±0.575.45±1.4824 成都中医药大学2015级硕士学位论文注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与西药组比较，P＜0.05，P＜0.01。从上表可知，SDBG值参芪组与模型组相比，P＜0.01，差异有明显的统计学意义；而LAGE值参芪组与模型组相比，P＜0.01，差异同样有明显的统计学意义。3.12各组大鼠腹主动脉HE染色观察正常组见正常大动脉，可见完整光滑内膜、中膜弹力纤维完整，细胞胞核整齐排列，外膜可见附着营养血管及脂肪等（见图1）。模型组内膜不光滑，内皮细胞部分破坏，可见少量附壁细胞；中膜弹力纤维层及其细胞核均排列紊乱，血管壁变薄（以中膜弹力纤维层为主），并可见血管全层嗜酸性变，红染（见图2）。参芪组为正常大动脉，可见完整光滑内膜、中膜弹力纤维完整，细胞胞核整齐排列，外膜可见附着营养血管及脂肪等；内膜不光滑，内皮细胞部分破坏，可见少量附壁细胞；中膜弹力纤维层及其细胞核均排列紊乱，血管壁变薄（以中膜弹力纤维层为主），并可见血管全层嗜酸性变，红染，并可见弹力纤维间疑似脂质空泡（见图3）。西药组内膜不光滑，内皮细胞部分破坏，可见少量附壁细胞；中膜弹力纤维层及其细胞核略排列紊乱，血管壁轻微变薄，未见血管全层嗜酸性变，红染并可见弹力纤维间疑似脂质空泡（见图4）。25 成都中医药大学2015级硕士学位论文图1组正常组HE×200图2模型组HE×200图3参芪组HE×200图4西药组HE×2003.13各组大鼠胰腺HE染色观察正常组可见正常的胰腺组织，可见其外分泌部（胰腺）及内分泌部（胰岛），胰岛大小形态未见异常改变（见图5）。模型组胰岛分布与胰腺周界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，以及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积），可见胰岛含铁血黄素沉积（见图6）。参芪组胰岛分布与胰腺周界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积）（见图7）。西药组见胰岛分布与胰腺周界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积）（见图8）。26 成都中医药大学2015级硕士学位论文图5组正常组HE×200图6模型组HE×200图7参芪组HE×200图8西药组HE×20027 成都中医药大学2015级硕士学位论文讨论1祖国医学对糖尿病及大血管病变的认识1.1文献探源糖尿病在中医文献中称之为“消渴”，“三消”，“消瘅”等病名。消渴之名首见于《黄帝内经》，消、渴均是以症状而命名的,说文解字中解释：消：涸，尽也，为消瘦、消耗、消散之意；渴,则是干而欲饮之意。早在内经中就有脾瘅、[22]消、风消等名称的记载。《素问·奇病论》曰：“有病口甘者，此五气之溢也，名曰脾瘅。夫五味入口，藏于胃，脾为之行其精气，津液在脾，故令人口甘也。此肥美之所发也。此人必数食甘美而多肥，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”，并以为“善渴”、“数饮”“善食而瘦”等为主要的临床症状，从而出现了“三多一少”（多饮、多食、消瘦）典型的描述。针对病因病机，同时提出了“治之以兰，除陈气也”，明确指出当用甘寒之品，生津止渴，[23]同时禁食膏粱厚味，燥热伤津之品。汉张仲景《金匮要略》有专篇论治消渴病，并最早提出治疗方药，首创白虎汤人参，肾气丸等，成为后世治疗消渴的基础方。并将消渴发病归纳总结为肾虚、肺胃津伤，胃热等，认为“营气不足，燥热内生”，或阳明胃热亢盛，耗伤津液。北宋时期，朝廷官方修书《太平圣惠方》提出著名的“三消论”，明确指出“三消”一词：“三痟者，一名痟渴，二名痟中，三名痟肾……一则饮水多而小便少者，消渴也；二则吃食多而饮水少，小便赤黄者，消渴也；三则饮水随饮便下，小便味甘而白浊，腰腿消瘦者，消肾也”。隋代巢元方所著《诸病源候论》将消渴分“八候”，论著中指出久服五石散，肾阴被灼，下焦虚热为消渴的病因。清代医家在前人的基础上探索新的思路，提出了新的观[24]点，叶天士在临证中注重情志因素对消渴病的影响，在《临证指南医案三消》中指出：心境愁郁，内火自燃，乃消证大病。说明情志失调是导致消渴病的因素之一。随着病程的进展，消渴日久，常常发生各种变证。隋代巢元方所著《诸病源候论》首次阐述消渴并发痈疽等并发症，并认识到适当运动对消渴的益处，主张“消渴病人先行一百二十步，多者千步，然后食之”。《素问·通评虚实论》凡治消瘅、仆击、偏枯、痿厥，气满、发逆，肥贵人则高粱之疾也。《金匮要略·消渴小便不利淋病脉证并治第十三》记载：“消渴，气上撞心，心中热痛。”刘28 成都中医药大学2015级硕士学位论文河间《宣明论方》说消渴一证“可变为雀目和内障。”隋朝巢元方《诸病源候论·消渴侯》提及：“其久病发痈疽。”《备急千金要方·消渴》也记录了：“消渴之人，愈与未愈，常须思虑有大痈。”外科正宗认为糖尿病血管病变为“因平昔厚味膏粮熏蒸脏腑，丹石补药消灼肾水，房劳过度，气焰精伤，致使经络阻塞，气血痰湿凝滞”。元·张子和《儒门事亲·三消论》指出“夫消渴者，多变为聋、盲、疮、痤、瘫之病而为病”。相关论述指导后世医家认识糖尿病大血管并发症。1.2糖尿病大血管病变的病因病机1.2.1病因祖国传统医学对于消渴病的认识积累较多的临床经验，根据医籍的记载，消渴病的病因主要有以下几点：①先天禀赋不足，五脏虚弱，气血虚弱，最终导致精亏液竭从而引发消渴。[25]就如《灵枢·五变篇》记载有“五脏皆柔弱者，善病消瘅。”②长期饮食不节，过食肆食肥甘厚味、醇酒等损伤脾胃之品，导致内热酿生，火热内积，五脏干燥，耗伤津液发为消渴。如《素问·奇病论》有：“肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥也。肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴。”③长期不良的情绪刺激等导致气郁，从而郁久化火，火热消灼阴津，如《灵枢》所言“怒则气上逆，胸中蓄积，血气逆留，臗皮充肌，血脉不行，转而为热，热则消肌肤，故为消瘅”。又如《临证指南医案·三消》记载：“心境愁郁，内火自燃，乃消症大病。”④劳欲过度，肾精耗损，最终导致体内虚火内生，“虚阳暴悍，肾水燥涸，无以上润于心肺，故内外消烁”则“火因水竭而益烈，水因火烈而益干”，终致肾虚肺燥，发为消渴。1.2.2病机首先，气阴两虚为糖尿病大血管病变发生与进一步发展的基础病机。气阴亏虚不仅作为消渴的发病基础，也是糖尿的并发症大血管病变的发生与发展的的基础病机。《灵枢·五变》言：“五脏皆柔弱者，善病消瘅。”指出消瘅病发生的基础在于脏腑的虚弱。而《灵枢·本脏篇》还记载关于消瘅病本虚这一发病基础的认识：“心脆，则善病消瘅、热中”、“肺脆，则苦病消瘅、易伤”、“肝脆，29 成都中医药大学2015级硕士学位论文则善病消瘅、易伤”、“脾脆，则善病消瘅、易伤”、“肾脆，则苦病消瘅、易伤”、“五脏皆脆者，不离于病。”《金匮要略·消渴小便不利淋病脉证并治第十三》中，仲景阐述消渴病的病机时也指出了气虚这一发病基础：“寸口脉浮而迟，浮即为虚，迟即为劳；虚则卫气不足，劳则营气竭。现代医家对消渴病的证[26][27]型进行研究也发现气阴.两虚是临床最常见的基本证型。其次，如果说“气阴亏虚”为本，那么瘀血阻滞则为标。瘀血阻滞为糖尿病大血管病变发生发展的病理产物和致病因素。气阴亏虚，气虚则推动无力，阴虚则脉道涩滞，从而瘀血阻滞，瘀血阻滞日久，必将影响机体气血的正常运行，导致变证丛生。《内经》中已有关于消渴血瘀证的记载，如《灵枢·五变篇》有“薄皮肤而目坚固以深者，长衡直扬，其心刚，刚则多怒，怒则气上逆，胸中蓄积，血气逆流，臗皮充肌，血脉不行，转而为热，热则消肌肤，故为消瘅……”，指出怒可导致气滞，气滞进而导致血瘀，瘀久可化热，热伤津耗气，发为消渴。《血[28]证论》中也有瘀血导致消渴的相关论述：“瘀血在里则口渴……内有瘀血，故气不得通，不能载水津上升，是以为渴，名曰血渴，瘀去则不渴矣。”随着对消渴病病因病机的不断探讨认识，总结其根本病机，一言蔽之，即为“本虚标实”。发展至现代，人们的生活方式的改变，老龄化人口的加剧，社会的不断进步，糖尿病的发生率急剧攀升，当代医家，辨证予以“滋阴清热、生津润燥、肝脾同调、益气补肾”等治疗方法。中医着重强调“天人合一”、“辨证论治”的整体观思路，并非单单以减低血糖为目的，而是着眼于整个人体的状态，达到整个血糖的稳定，尽量减少血糖忽高忽低的出现，最终减少并发症的发生及发展，阴阳得以平衡，也就是《黄帝内经》中记载的“治未病”的预防思路，对于糖尿病及其并发症，本着防变的思路，更是胜于治。2糖尿病大血管病变的现代医学认识2.1.危险因素血糖的稳定性受到多种因素的控制，正常人在神经、内分泌及肝组织等精密调节下血糖的波动幅度不大，血糖相对稳定。而作为糖尿病患者，由于胰岛素敏感性下降和胰岛功能的紊乱，导致血糖波动幅度的增加，平稳性得不到很好的控制。导致糖尿病大血管病变的危险因素较多，包括：吸烟、嗜酒、饮食事宜等生活因素；肥胖、高尿酸血症、“三高”（高血压、高血糖、高血脂）、高凝状30 成都中医药大学2015级硕士学位论文态等相关疾病因素；空气污染等环境因素及遗传因素等均可诱发或加重糖尿病大血管病变。糖尿病大血管病变主要累及下肢血管、主动脉、脑动脉等，从而导致冠心病、卒中、坏疽等疾病的发生，对糖尿病患者造成极大的伤害，增加致残率及致死率的风险。波动性高血糖相对于慢性持续性高血糖对糖尿病血管并发症危害更大。2.2发病机制2.2.1高血糖及波动性高血糖当血糖值高于正常范围即为高血糖，糖尿病主要是以监测血糖为主，以持续的血糖升高为特点，大量动物及临床研究证明，高血糖在糖尿病大血管和微血管病变中起重要作用。国外一项最新研究表明高血糖状态可直接导致血管内皮细胞的改变，高血糖时体内果糖、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖等酮糖与体内多种蛋白质结合，发生非酶糖基化形成糖基化终末产物(advancedglycationendproducts，AGEs)，大血管壁的胶原蛋白非酶糖基化形成的AGEs，一方面可以直接捕捉血液脂质，另一方面与内皮细胞上的特异性受体结合，主要通过刺激血管内皮细胞[29]生长因子的表达引起内皮细胞通透性增加，进而损伤患者的血管内皮。血糖波动是指体内血糖在高峰与低谷之间波动的不稳定状态，是人体为适应环境在体内精密的神经内分泌系统调节下的一种生理反应。正常人群血糖通常为3.9～7.8mmol/L。血糖一般在餐后10min左右开始上升，1h左右达峰值,2～3h内恢复到餐前水平。全天血糖最高点多见于早餐后1h；凌晨2:00―3:00胃肠道已没有碳水化合物而且体内各种升糖激素又都处于低水平，所以血糖达到低谷。黎明期间因升糖激素的分泌，肝糖输出又形成一个小的高峰。1d内的血糖波动幅度小于2～3mmol/L，频率为每日5次。日间血糖波动幅度一般在0.8mmol/L以内。而DM血糖波动主要表现为：①整体血糖水平升高，餐后血糖过度升高，并伴有血糖达峰的延迟；②胰岛素峰值延迟又容易导致餐后低血糖；③日内及日间血糖波动幅度明显增大，日内可达正常糖调节人群的3倍，日间为2～5倍。不加控制的餐后高血糖以及因治疗不当引发的严重低血糖是血糖异常波动的主要原因。[30]慢性波动性高血糖为高血糖的表现形式之一，诸多研究研究，波动性高血糖造成的糖尿病血管并发症比慢性高血糖更大。自从1995年DCCT(diabetes31 成都中医药大学2015级硕士学位论文controlandcomplicationstrial)研究组提出糖化血红蛋白不能反应精细血糖调节开始，慢性波动性血糖逐渐被重视。该研究显示在强化治疗组与常规治疗组的HbA1c均为9%，强化治疗组8年糖尿病视网膜病变的风险不足6%，而常规组[31]的风险则高达14%。近年来，动物研究方面，发现血糖波动时可加剧大鼠血管舒张功能紊乱，与内皮损伤、氧化应激、炎症反应、胰岛素抵抗等有关，其中PI3K/AKT/eNOS通路[32]可能参与并引起NO合成减少，进一步加速动脉粥样硬化的进程。临床研究方[33]面，发现血糖波动较大的患者血清P-选择素等炎症因子的水平明显升高；长期大幅度血糖波动，使得内皮和凝血纤溶系统功能障碍以及自由基产生增加，减弱了高葡萄糖浓度状态下细胞形态和功能受损、新生血管等改变，导致糖尿病动[34][35]脉粥样硬化的发生与发展。也研究把波动性高血糖与持续性高血糖对比，相对于持续性高血糖更能加速糖尿病患者动脉粥样硬化的进展，波动性高血糖通过急、慢性作用加重血管损害，急性作用为瞬时葡萄糖高峰(SpikeS)与血糖波动(excursion)引起动脉壁急性损害或经氧化应激的直接毒性作用；慢性作用通过升高HbAlc和AGES水平，引起动脉粥样硬化。餐后高血糖为波动性高血糖的临床表现，己被证明是动脉硬化的危险因子，并且是独立于稳定性高血糖外的动脉[36]粥样硬化的危险因子，而餐后高血糖主要通过增加氧化应激和启动炎症途径导[37]致血管并发症的发生。高血糖与心血管危险流行学调查（DECODE）等研究也证[38]实，心血管疾病死亡率与餐后2小时血糖的相关性大于空腹血糖。总之，无论临床还是基础研究均支持血糖波动时独立于HbA1c以外的糖尿病慢性血管并发症的重要预测因素。而减少血糖波动，是干预糖尿病大血管并发症，降低致残率与病死率的关键性问题。2.2.2代谢记忆与胰岛素抵抗[39][40][41][42]众多大型前瞻型性的研究一致显示：糖尿病患者存在高血糖“代谢记忆（metabolicmemory）”现象，其意思大致为若糖尿病患者长期处于高血糖的状态，在后期即便血糖得到有效控制的情况之下，靶细胞仍可“记忆”早期血糖环境。其言下之意为，即使降低血糖水平，仍然易患糖尿病相关并发症。胰岛素抵抗(insulinresistance)是指机体器官组织对胰岛素的生物学反应出现降低的情况。其具体表现为外周组织对胰岛素的敏感阈值升高，不能增加32 成都中医药大学2015级硕士学位论文葡萄糖的摄取及利用，胰岛素的降糖作用减弱。而2型糖尿病的主要发病机制就[43]是胰岛素抵抗以及胰岛细胞功能缺陷。Stern根据胰岛素抵抗和AS之间的相关性提出了“共同土壤学说”，认为胰岛素抵抗是心脑血管疾病中众多代谢性异常的致病基础和原始动因。而2型糖尿病胰岛素抵抗患者胰岛素样生长因IGF-1[44]（insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1）水平下降，低水平的IGF-I在糖尿[45]病和心血管疾病的发病机制中发挥作用。Vaessen的研究证明，暴露于相对较低IGF-I水平，会导致2型糖尿病心肌梗死的风险增加。2.2.3脂代谢紊乱及氧化应激糖尿病患者脂代谢紊乱多表现为：血清甘油三酯、胆固醇水平增高，“脂毒性”学说指出2型糖尿病伴有的脂代谢素乱可能是导致糖尿病大血管并发症发生发展的重要危险因素之一，脂代谢素乱增强氧化应激，加剧血管炎症，加速动脉[46]粥样硬化。糖尿病脂代谢异常主要表现为甘油三酯（TG）升高，TC、TG浓度升高是心脑血管疾病（Cardiovasculardiseases，CVD）主要危险因素。TC的浓度与CVD的发生率之间具有指数效应。高水平的TG产生过量的FFA，导致内皮细胞活化，血管发生炎症，甚至血栓形成，从而进一步促进AS的形成，在CVD的发病机制中起到了重大的作用。高脂血症还可引起内皮细胞损伤和灶状脱落，导致血管壁通透性升高，血浆脂蛋白得以进入内膜，其后引起巨噬细胞的清除反应和血管壁平滑肌细胞（SMC）增生，并形成斑块。高脂血症与脂质过氧化物损伤在糖尿病血管病变中起协同作用，而Brownlee提出“糖尿病并发症的共同机制”学说,认为高血糖引发的过氧化产物是糖尿病[47]并发症机制中关键性的第一步,即高糖损伤的共同基础——氧化应激。很多研究证实,高糖可以导致体内氧化及抗氧化水平失衡,通过葡萄糖的代谢、自身氧化及蛋白的糖基化等多种途径引起组织中自由基升高,升高的活性氧和氧自由基可以和多种细胞成分发生反应,引起血管细胞膜的脂质过氧化和[48][49]细胞损伤，细胞膜和血管通透性增加；并能促进LDL的氧化修饰产生OX-LDL和脂质过氧化,诱导血管基因表达的改变和促进细胞增殖从而引发动脉粥样硬[50][51]化的加速。本研究还发现GGT也与动脉硬化程度相关。随着动脉硬化程度的加重，GGT呈升高趋势。有序回归提示GGT也是影响2型糖尿病患者动脉硬化的[52]独立相关因素。GGT参与体内的氧化应激过程。目前也确实发现了活化的GGT33 成都中医药大学2015级硕士学位论文[53]与氧化型LDL共存于动脉粥样硬化斑块的泡沫细胞中。因此GGT被视为氧化应激的标志物，其升高提示机体存在过度氧化应激。2.2.4炎症在2型糖尿病发病中的作用目前越来越多的临床和基础实验证据均支持，炎症在2型糖尿病及其大血管[54]并发症中起到了非常关键的作用。慢性低度炎症会导致糖尿病大血管病变发生[55][56]已经被广大学术界所认可。大量的临床和实验研究证明，CRP、纤溶酶原激活物抑制剂-1、TNF-a、P-选择素、白介素-6等炎症因子均参与糖尿病大血管病变的发生与发展。而超敏C-反应蛋白（highsensitiveC-reactiveprotein，[57][58][59]CRP）以其更准确、敏感成为研究的热点。机理方面研究，Wang等研究证实CRP可诱导肿瘤坏死因子（TNF-a），从而促进多种炎症介质相关基因的表达增高，从而导致血管内皮细胞功能紊乱。2.2.5内皮功能紊乱目前已知，内皮细胞的凋亡可能是导致糖尿病慢性血管疾病发展期间动脉粥样硬化的重要原因之一。糖尿病大血管病变早期以内皮功能障碍为主，内皮细胞成为损伤的主要靶点。研究发现，波动性高血糖能诱导主动脉血管内皮细胞的凋亡和功能障碍，其损伤机制甚为复杂，目前尚未完全阐明。糖尿病大血管病变早期，诸多病理因素作用于内皮细胞，造成内皮损伤，主要表现为血管内皮舒张功[60-62]能障碍以及内皮结构完整性遭到破坏。而血管内皮细胞障碍是糖尿病血管并发症早期启动因素之一。内皮功能障碍早期主要表现为血管内皮依赖性舒张功能（EDR）下降，导致抗炎、调节血管张力和抗血小板聚集等功能减弱。而高血糖以及波动性高血糖是引起内皮功能障碍的首要原因，可通过多个途径如激活多元醇途径、蛋白激酶C等介导内皮细胞损伤。内皮源性一氧化氮(EDNO)对血管内皮功能完整性有重要作用,包括3个方面：保持血管内皮依赖性舒张活性，维持血管内膜无血栓形成，维持血管内膜的非增殖状态。综上，多种途径使血管内皮活性因子失衡，引起内皮细胞功能紊乱，致使AS的发生。2.3现代医学治疗目前，血糖波动的管理重要是针对降低餐后高血糖，减少低血糖的发生，提高血糖的稳定性，主要治疗方案包括：长期的生活方式的干预、积极控制血糖、34 成都中医药大学2015级硕士学位论文口服降糖药物和胰岛素治疗，同时降压、调脂以及抗血小板治疗等联合应用。（1）生活方式干预：主要为健康教育、合理饮食、规律运动、戒烟限盐、控制体重、限制饮酒、心理平衡等，饮食尤为重要，摄入大量纤维，减少糖的吸收，优先摄取低升糖指数的碳水化合物，是控制血糖变化的主要方法。（2）降糖治疗：口服降糖药物根据作用不同，分为促胰岛素分泌剂（磺脲类、格列奈类、DPP-4抑制剂）和双胍类、增敏剂（TZDs）、α-葡萄糖苷酶抑制剂。UKPDS研究显示，二甲双胍在肥胖和超重人群中的使用与大血管病变和死亡发生的风险显著下降相关。随着餐后高血糖与糖尿病大血管病变相关性研究增多，-糖苷酶抑制剂、格列奈类引起人们的关注。TZDs的临床使用备受关注，美国FDA，2010年9月，基于使用罗格列酮增加患者心脏病发作风险，严格限制文迪雅的使用。2011年欧洲研究机构流调表明，吡格列酮可能小幅度增加膀胱癌的风险，但也有学者提出TZDs在缓解胰岛素抵抗的药物中，有着不可替代的作用。二肽基肽酶-4抑制剂，钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体激动剂已经证实在诸如葡萄糖漂移的平均幅度和CGM的标准标差等方面有显著的改善。西格列汀降低葡萄糖波动的更大影响可能与葡萄糖依赖性降低作用机制相关，而对血糖浓度不敏感的磺酰脲增加血糖波动的风险。胰岛素对血管具[61]有扩张作用，可以减少小而密的低密度脂蛋白胆固醇，有利于减少动脉粥样硬[62]化的形成尚有抗炎作用。使用降糖药物的同时，应警惕低血糖的发生，Cryer等指出“一次严重的医源性低血糖或由此诱发的心血管事件可能会抵消一生维持[63]血糖在正常范围所带来的益处”。（3）降压治疗：单纯高血压就是冠心病的独立危险因素，不言而喻，糖尿病合并高血压患者，降压治疗的重要性。降压治疗的获益主要与血压控制本身相关。供选择的降压药物主要与ACEI、ARB、钙离子拮抗剂(CCB)、利尿剂、受体阻滞剂。其中ACEI或ARB为首选药物。为达到降压目标，通常需要多种降压药物联合应用。（4）调节血脂：在进行调脂治疗时，应将降低LDL-C作为首要目标。如无他汀药物的禁忌证，所有罹患心血管疾病的糖尿病患者都应使用他汀类调脂药。对无法达到降脂目标或对传统降脂药无法耐受时，应考虑使用其他种类的降脂药物如[64]（普罗布考等）。老药新用，普罗布考的降胆固醇作用已被广为认可，近来有35 成都中医药大学2015级硕士学位论文[65][66][67][68][69]报道，其新的抗炎、抗AS、减轻氧化应激作用，引起人们新的关注。（5）抗血小板治疗：糖尿病患者的高凝血状态是发生大血管病变的重要原因，阿司匹林已被推荐用于糖尿病和非糖尿病患者心血管疾病的一线预防和二级预防。无明显阿司匹林禁忌症，有高危心血管风险的糖尿病患者，阿司匹林作为一级预防，具有中危心血管风险的糖尿病患者可考虑小剂量阿司匹林作为一级预防。有心血管病史的糖尿病患者应用小剂量阿司匹林作为二级预防。对阿司匹林过敏者，可考虑使用氯吡格雷替代治疗。（6）其他治疗：AMPK成为防治药物的新靶点。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）作为二甲双胍、他汀类和TZDs等药物的作用靶点，介导这些药物的心血管保护效应。最新有报道指出，AMPK能够调控VEC合成NO和抗氧化应激引起的损伤。3.“脾胰同源”思想在干预糖尿病大血管病变中的运用3.1“脾胰同源”思想文献探源在传统医学领域，历年有诸多医家持有“脾胰同源”之说，因古代没有解剖学，未能发现内在器官之间的关联，故认为中医之“脾”其实包括了现代医学脾脏和胰脏二者共同的功能，何绍奇先生就曾认为糖尿病病位在胰，而胰归属于脾，绝大多数患者应从脾论治，治脾即是治胰，脾的运化恢复才是真正的降糖之[72]道。溯源古代诸多典籍记载，有众多证据侧面支持这一观点。糖尿病中医古籍中称之为“消渴”“消瘅”“脾瘅”等，消渴之名首见于《素问·奇病论》，明确提出本病与脾脏之间的关系，曰“此五气之溢也，名曰脾瘅，……此肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”。古代文献多记录“脾虚致消”，《素问·脏气法时论》曰：“脾病者，身重，善饥”；《灵枢·本脏》曰：“脾脆则善病消瘅易伤”；《灵枢·邪气脏腑病形》曰：“脾脉微小为消渴”。张锡纯也在《医学衷中参西录》中指出：“消渴一证，古有上、中、下之分，谓其证皆起于中焦而极于上、下，谓其证起[73]于中焦，是诚有理，因中焦病，而累及于脾也……”3.2“脾胰同源”的解剖学证据现代医学之胰腺位置隐蔽、且不易观察，是位于腹后壁的狭长腺体。胰腺是人体的第二大消化腺，分为内、外分泌腺，外分泌腺分泌胰液，胰液中含有多种36 成都中医药大学2015级硕士学位论文酶如胰蛋白酶原、脂肪酶、淀粉酶、碳酸氢钠等，可消化人体摄入的淀粉、蛋白质和脂肪等。内分泌腺即胰岛散在于胰实质内，其中α细胞分泌胰高血糖素，主要拮抗胰岛素；而作为体内唯一一个能降低血糖物质的胰岛素，是由β细胞分泌的。胰岛素分泌一旦出现缺陷和（或）胰岛素抵抗，二者均可使血糖升高，导致[74]糖尿病的发生。传统祖国医学虽无“胰”之一脏，但古医籍中有记载，《难[75]经四十二难》曰：“脾重二斤三，扁广三寸，长五寸，有散膏半斤”，其中所[76]言之“散膏”，《难经汇注笺正》认为即是胰腺组织。而近代的张锡纯先生称胰为“膵”，其在《医学衷中参西录》中指出：“古人不名膵而名为散膏，散膏即膵也，为膵之质为胰子，形如膏，而时时散其膏之液于十二指肠之中，……故曰散膏，为脾之副脏”；“膵为脾之副脏，尾衔接于脾门，其全体之动脉有自脾脉分支而来，故与脾有密切关系”。“散膏”半斤，即是指其重量，那么按照[77]秦朝的度量衡来换算，大约为125g，与现代医学胰腺的重量和形态相吻合。3.3“脾胰同源”与血糖波动内涵联系前面已经论述波动性高血糖会导致炎性反应，引起血管内皮损伤以及动脉粥样硬化，是造成血管病变的开始动环节。而“脾胰同源”正好可以对血糖波动进行相应的阐释。众所周知脾主运化，《素问·经脉别论》曰：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺，通调水道，下输膀胱，水精四布，五经并行”。其中的“脾气散精”即是将胃腐熟的饮食水谷转化为水谷精微和津液，并把水谷精微和津液吸收转输到全身脏腑，以营养五脏六腑、四肢百骸，使其发挥正常功能。现代医学之胰腺，是人体第二消化腺，内分泌腺即胰岛分泌胰岛素和胰高血糖素，维持体内血糖稳定，如若分泌胰岛素的胰岛β细胞功能缺陷，或者外周组织对胰岛素的敏感性下降（即胰岛素抵抗），则会发生血糖升高，导致糖尿病的发生。“血糖”在现代中医学当中归属于“水谷精微”的范畴，胰岛细胞分泌胰岛素降低“血糖”，如脾脏运化水谷一般，现代解剖学的“脾”只是一个淋巴器官，即使切除脾脏也不妨碍消化。而胰腺分泌胰液，参与食物中淀粉、脂肪、蛋白质的消化，胰岛素和胰高血糖素参与血糖的调节，促进糖、脂肪的合成与贮存，促进蛋白质、核酸的合成，与中医学“脾主运化”的功能不谋而合。何绍奇提出“脾胰同源”说，认为胰的功能包含于脾的“转输”和“散精”之中。37 成都中医药大学2015级硕士学位论文可以说，脾不散精是导致糖尿病以及血糖波动的因素之一。张锡纯在《医学衷中参西录》中提出：“消渴一证，起于中焦而极于上下，……因中焦病，而累及于脾，……有时膵脏发酵，多酿甜味，由水道下陷，其人小便遂含有糖质。迨至膵病累及于脾，致脾气不能散精达肺而津液少，不能通调水道则小便无节，是以渴而多饮多溲也”，并认为导致消渴的病机为“元气不升，大气下陷，脾不散精”。脾散精功能受损，不能将水谷精微布散全身，而是聚为“糖浊”，表现为血糖升高；脾不散精，不能上达于肺，故口干欲饮；脾为胃行其津液”，燥热伤胃，脾阴不足，故口渴多饮，多食易饥：脾不能转输水谷精微，则水谷精微下流入小便，加之肾阴亏虚，开门太过，肾失封藏，故小便多而味甘。张志聪注［78］释《素问·五脏生成》曰：“脾主运化水谷之精，以生养肌肉”，脾运化失常，水谷精微与津液的生成、转输障碍，肌肉不得濡养则肌肉瘦削，致倦怠乏力。脾不散精则津液输布代谢障碍，水液不化，聚而成湿，停而为痰；中焦升降失常，不能“泌糟粕，蒸津液”，清浊难分，浊从中而化；水停则血瘀，痰浊瘀血积久，则聚而为毒。病程日久，膏脂痰浊毒使脉络瘀闭、多脏受损，则中风、胸痹、［79］目盲、肾劳、皮痹(肌肤甲错)、脉痹(脱疽)等变证百出。4本课题动物模型的选择本课题所选用的动物模型是目前公认适合糖尿病研究的自发性糖尿病动物模型，是在自然条件下或由于基因突变而出现类似人类糖尿病表现的动物模型。大多数纯系动物个体差异性较小，致病遗传因子单一且环境因素易控制，适合对糖尿病这一多致病因素疾病进行遗传剖析。相比小鼠，大鼠的体积较大，更容易出现严重的AS病理改变，能满足取血量和组织取材量要求。其中自发性2型糖尿病GK大鼠遗传恃性和病程发展特点与人类糖尿病类似，表现为胰岛功能不足、中度高血糖、中度胰岛素抵抗，血脂升高，以及合并糖尿病大血管病变，且不伴随肥胖，病程晚期出现糖尿病视网膜病变、神经血管病变等并发症，适合建立糖尿病高血脂及动脉粥样硬化模型。且GK大鼠饲养方便、抵抗力强、死亡率低，食性与人相近，不需注射胰岛素即可存活较长时间。因此，GK大鼠同时适合进行AS和糖尿病的病机和药物有效性评价研究,本实验采用高脂饲料饮食诱导法，利用长期高脂饲料喂养加重GK大鼠的胰岛素抵抗，造成血糖的不稳定状态，并促进血管病变的形成。符合T2DM存在内38 成都中医药大学2015级硕士学位论文在基因易感性和外在高脂饮食诱导而发病的特点。5本课题相关指标的选择5.1MBG、SDBG、LABG值MBG（MeanofBloodGlucose)即每日血糖平均水平，指的是24小时内在5个时间点的平均血糖值；SDBG（StandardDeviationofBloodGlucose)即每日平均血糖的标准差，代表5个时间点所有血糖的测定值偏离平均血糖的程度，其有效的反映了血糖的离散特征，可作为估测血糖稳定性的简易参数之一，但缺点是不能区分血糖主要波动方向及频次。而LABG即最大血糖波动幅度（LABG）,是血糖数据中的最大值与最小值的差。MBG、SDBG、LABG值这几个参数都是统计学中常用的反映血糖数据离散程度的基本指标，也是较为常用的的血糖波动幅度的评估。5.2GLP-1GLP-1即胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1)是胰高血糖素样肽成员之一，由肠道L细胞分泌，是一种在餐后分泌的激素。GLP-1随餐后血糖水平升高而释放并刺激胰岛素产生、抑制胰高血糖素释放、减缓营养物被吸收进入血液的速率，从而少血糖的波动幅度。GLP-1能促进胰岛素分泌，抑制胰岛β细胞的凋亡，促进胰岛β细胞增殖，是2型糖尿病治疗的重要靶标。6.药物选择6.1参芪复方的选择导师谢春光教授致力于中医药对糖尿病大血管病变的实验研究及临床防治工作，并结合前贤经验，创立具有养阴益气活血功效的参芪复方，并经过了15年的临床和实验研究，目前该方已完成新药二期临床前的药学研究、毒理学研究，工艺稳定，质量可靠，可以避免药物因素干扰实验。6.1.1参芪复方方义分析本实验所用参芪复方由人参、生黄芪、生地、山茱萸、丹参、制大黄、山药、天花粉组成。功效：养阴益气活血，助脾散精。本方采用人参、黄芪为君，大补元气，助脾散精，促进水谷精微及津液布散，并能推动血液的运行。人参：味甘，微苦，性平，归脾、肺、心经；可大补元气，补脾益肺，生津，39 成都中医药大学2015级硕士学位论文安神益智。《医学起源》引《主治秘要》曰:“补元气，止渴，生津液”。张锡纯《医学衷中参西录》中云：“盖人参之性，大能补气，元气旺而上升，自无下陷之虞……助元气以生津液。”故用人参以大补元气。现代中药药理学：能降低血糖，增强机体免疫功能，抗炎，人参的药理活性常因机体功能状态不同而呈双向作用。黄芪：味甘，性微温，归脾、肺经；具健脾补中，升阳举陷，益卫固表，利尿，托毒生肌之功效。《神农本草经》：“主治痈疽，久败疮，排脓止痛……补虚。”现代中药药理学：能升高低血糖，降低高血糖，扩张冠状动脉和外周血管，降低血压，能降低血小板粘附力，减少血栓形成，还有抗衰老、抗缺氧等作用。生地：味甘、苦、性寒，归心、肝、肾经；具清热凉血，养阴生津之功效。《神农本草经》：“主折跌绝筋，伤中，逐血痹，填骨髓，长肌肉，作汤除寒热积聚除痹。生者尤良。”现代中药药理学：本品水提取液有降压、镇静、抗炎、抗过敏作用。山茱萸：味酸、涩，性微温，归肝、肾经；具补益肝肾，收敛固涩之功效。《药性论》“补肾气，兴阳道，添精髓，疗耳鸣。”现代中药药理学：山茱萸注射液能抑制血小板聚集，抗血栓形成。山茱萸醇提取物对四氧嘧啶、肾上腺素性及链脲佐菌素所形成的大鼠糖尿病，有明显降血糖作用。山药：味甘，性平，归脾、肺、肾经；具补脾养胃，生津益肺，补肾涩精之功效。《本草纲目》：“益肾气，健脾胃。”现代中药药理学：山药对实验大鼠脾虚模型有预防和治疗作用，有降血糖，抗氧化等作用。天花粉：味甘、微苦，微寒，归肺、胃经。具清热泻火，生津止渴，消肿排脓之功效。《本草汇言》“善能治渴，从补药而治虚渴，从凉药而治火渴，从气药而治郁渴，从血药而治烦渴，乃治渴之要药也。”现代中药药理学：天花粉水提取物的非渗透部位能降低血糖活性。丹参：味苦，性微寒，归心、心包、肝经；具活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，除烦安神之功效。《日华子本草》：“养血定志，通理关节……破宿血，补新生血。”现代中药药理学：能扩张冠脉，增加冠脉血流量，改善心肌缺血，促进心肌缺血或损伤的恢复；能改善微循环，促进血液流速；能改善血液流变性，降低血液粘度，抑制血小板和凝血功能，激活纤溶，对抗血栓形成；能调节血脂，40 成都中医药大学2015级硕士学位论文抑制动脉粥样硬化斑块形成。制大黄：味苦，性寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经；具有清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经之功效。《神农本草经》：“味苦，寒。主下瘀血、血闭、寒热，破积聚，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，调中化食，安和五脏。”现代中药药理学：有止血，保肝，降压等作用。参芪复方与脾胰同源之间的关系：此方共8味药物组成，其中一半的药物归经均与脾经息息相关，复方中的君药人参、黄芪均归脾经所属，《本草备要》记载人参曰：“生，甘苦，微凉；熟，甘，温。入脾、肺经。”关于黄芪的记载“味甘，性微温，无毒，入肺脾二经。”臣药山药入肺、脾、肾经；佐药制大黄：味苦，性寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经。4味药物均入脾经，《医方考》曰：“夫脾胃者，土也。土为万物之母。诸脏腑百骸受气于脾胃，而后能强”，不仅仅因脾者为后天之本，仓廪之官，气血生化之源，更重要的是，对于消渴患者，引药物入脾经，可以更好地帮助脾的功能，使其功能恢复正常，助脾散精。因中医之“脾”其实包括了现代医学脾脏和胰脏二者共同的功能，胰归属于脾，绝大多数患者应从脾论治，治脾即是治胰，脾的运化恢复才是真正的降糖之道。纵观全方，药味不多，但配伍紧凑，各司其职，能补能敛，能滋阴亦能降火，能活血而不伤正气，方中人参大补元气，黄芪甘温益气，二者共为君药，尊“虚者补之”“损者益之”之义，二药共凑补益肺脾肾气之效，使正气充足，阴液能生，瘀血能行，邪气自除。以山药、生地、山茱萸、天花粉共为臣药，四药伍用，相互协同，共补脾、肺、肾三焦之阴液亏虚，兼以凉血，而无自腻凝滞之弊，阴足则气充，气阴充足，则血行运行流畅。以丹参、制大黄共为佐药，二药相配，活血化瘀，使血脉畅通，活血不伤血，行血兼行气，活血养血，气血双调，攻补兼施，使气血流畅，血脉通利。方中以人参、黄芪、山药补脾益肺，山茱萸、生地黄、山药补肾水养阴精。使脾、肺、肾三脏同补，滋阴补精，重在固本，使邪无所藏，精血渐复，则病自愈。方中借鉴施今墨先生之药对：黄芪配山药。气阴兼顾，健脾益气，补肾固精，相得益彰，使脾气健旺，下元固壮，气阴双补；天花粉配生地；养阴清热，伍用相得，则功效益彰。全方以补益脾气为根本，使脾气得运，精微得布，同时养脾肺肾之阴，清热润燥，生津以助血行；辅以活血化瘀。扶正祛邪，标本兼顾，实为临床治疗糖尿病及其并发症加减运用之良方。41 成都中医药大学2015级硕士学位论文6.1.2参芪复方前期研究参芪复方紧扣中医病机，配伍精当，经过多年临床及基础实验研究，证明其在糖尿病大血管病变的防止中有较好的疗效。其治疗作用的可能机制有：提高脂[80][81]联素表达，降低NF-kBp65的表达与活化，降低2型糖尿病血管炎症动物模型的C反应蛋白、肿瘤坏死因子α含量，抑制主动脉单核趋化蛋白-1、胞间黏附分子-1(intercellularadhesionmolecule，ICAM-1)、血管细胞间粘附份子-1（vascularcelladhesionmolecule，VCAM-1）、内皮素-1(Endothelin，ET-1)[82]等的表达、抑制环氧化酶(Cyclooxygenase-2，COX-2)mRNA及caspase-3表[83][84]达，说明参芪复方可以改善糖尿病大血管炎症状态，减轻血管细胞凋亡等。7阳性对照药物的选择阳性对照药物的选择原则是要先了解药物的安全性，有效性的前提下，根据实验的目的及要求，遵照实验对照选出公认的有效的药物。本实验所选择的是应用较为广泛的DPP-IV抑制剂西格列汀。现研究发现，口服葡萄糖比静脉注射同等剂量的葡萄糖所导致的胰岛ß细胞分泌胰岛素显著增加，从而发现人体肠道内的一些肽类，即肠促胰岛素：内源性胰高血糖素样肽（glucagon-likepeptide-1,GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽（glucose-dependentinsulinotropicpeptide,GIP）,具有刺激胰岛ß细胞分泌胰岛素的功能。西格列汀则为DPP-4抑制剂的一种，通过抑制DPP-4对内源性肠促胰岛激素的降解，提高内源性GLP-1的浓度，通过改善胰岛α和ß细胞的敏感性，促进ß细胞释放胰岛素，抑制α细胞分泌胰高血糖素，在葡萄糖稳态调节中启到重要作用，西格列汀用于本实验研究中，除了能降低血糖，而无体重增加和低血糖的风险。故本研究选西格列汀作为西药对照药物。8实验结果讨论8.1应用参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠一般状态的影响此次实验所采用的GK大鼠具有“多饮、多食”，肥胖的生物学特性，与祖国医学的“消渴病”相似，与西医学2型糖尿病类似。在整个实验中我们观察到，正常组大鼠精神状态佳，性情温顺，反应较灵活，运作较敏捷。模型组GK大鼠，精神状态欠佳，对疾病抵抗力差，性情急躁，相互追逐，撕咬现象明显。参芪组动物精神状态与西药组相比较好，皮肤抓痕及咬伤情况相对较少。同时，在饮食42 成都中医药大学2015级硕士学位论文方面，参芪组动物在灌胃8周后的摄食量减少，与模型组及正常组均有显著的统计学差异；而在饮水方面，从灌胃第4周开始，参芪组GK大鼠的饮水量大大减少，与模型组及正常组均有显著的统计学差异。可见参芪复方能有效抑制GK大鼠具有“多饮、多食”的特性。综上所述，应用参芪复方能改善糖尿病大血管病变模型GK大鼠的一般状况。8.2应用参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠血糖波动的影响本课题的目的就是要通过中药的治疗手段来平稳控制GK大鼠的血糖波动问题，因此，从灌胃的第4周每周一次测定一日内的8:00,10:00,14：00，16:00,18:00的血糖情况，采用日间血糖波动的评估指标，包括全天血糖水平的标准差(standarddeviationofbloodglucose,SDBG)、每日血糖平均水平（MBG）、最大血糖波动幅度（LABG）这3个主要指标。并计算MBG、SDBG、LABG值。MBG即每日血糖平均水平，指的是24小时内在5个时间点的平均血糖值；SDBG即每日平均血糖的标准差，代表5个时间点所有血糖的测定值偏离平均血糖的程度，其有效的反映了血糖的离散特征，可作为估测血糖稳定性的简易参数之一。每日平均血糖的标准差（SDBG）是代表日内所有血糖测定值偏离平均血糖的程度，反映血糖的离散特征，是估测血糖稳定性的简易参数，但因其无法区别主要的和细小的波动，故无法体现血糖对于机体组织器官损害的权重大小，同时也不能分析[85]血糖波动的频率，正常参考值＜1.40mmol/L；而LABG即最大血糖波动幅度（LABG）,日内最大和最小血糖值之差，缺点是不能充分利用血糖监测值的全部信息，仅反映DM患者日内单一的最大血糖波动。是评价最大血糖波动的幅度，其正常参考值＜4.4mmol/L。上述几个参数都是统计学中常用的反映血糖数据离散程度的基本指标，也是较为常用的的血糖波动幅度的评估。而从4周的血糖波动实验数据的结果来看，SDBG值参芪组与模型组相比，P＜0.01，差异有明显的统计学意义；而LAGE值参芪组与模型组相比，P＜0.01，差异同样有明显的统计学意义。DM患者存在更明显的血糖波动。除整体血糖水平升高外，表现为日内血糖波动幅度明显增大，是正常糖调节人群的3倍；日间血糖波动幅度明显增大，是正常糖调节人群的2.5倍；由于早期相胰岛素分泌缺失，肝糖输出增加，肌肉摄糖减少，T2DM患者餐后血糖过度升高且持续较长时间，并伴有血糖达峰的延迟，43 成都中医药大学2015级硕士学位论文[86]餐后急性高血糖状态以早餐最明显。此前已经论述过，波动性高血糖比持续性高血糖，更能加速糖尿病患者动脉粥样硬化的进展，波动性高血糖可以通过急、慢性作用加重血管损害，急性作用为瞬时葡萄糖高峰与血糖波动引起动脉壁急性损害或经氧化应激的直接毒性作用；而慢性作用通过升高HbAlc和AGES水平，引起动脉粥样硬化。目前血糖波动已成为继空腹血糖、餐后血糖及糖化血红蛋白(HbA1c)之后又一临床评估体内血糖情况的新指标。研究发现血糖波动更能全面、真实地反映人体内血糖的情况,是糖尿病（DM）及其慢性并发症的独立危险因素之一，也是独立于血糖水平、餐后血糖和HbA1c之外与DM的发生、发展及预后显著相关的因素。[87-88]血糖波动与DM并发症，临床研究证实了DM的预后及慢性并发症的发生、发展不仅与血糖水平、HbA1c密切相关，也与血糖波动程度密切相关。如在大血管病变中，心血管疾病是DM重要的并发症之一，英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)的10年随访研究发现在同一个HbA1c下，强化降糖组的大血管事件少于常规治疗组，分析原因认为与强化组患者更多的接受胰岛素治疗、血糖波动较少有关。与微血管病变中糖尿病肾病，国内外有相似的发现之处，显示血糖的高波动比单纯高血糖更易促进肾小球系膜细胞胶原合成增加和细胞外基质积聚，加速肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞凋亡，同时引起肾脏许多局部致肾病的内分泌激素或细胞因子如胰岛素样生长因子、血小板源生长因子及转化生长因子β及[89]氧化亚氮等的分泌增加。针对血糖波动的危害性，近年国际上提出了“精细降糖，平稳达标”这一新的治疗理念，即DM血糖控制要兼顾“HbA1c、空腹血糖、餐后血糖和血糖波动”[90]四位一体的概念，既要严格控制HbA1c、空腹血糖、餐后血糖,又要尽量减少血糖的波动幅度。不可一味追求血糖数值的达标，在常规治疗方案中，血糖控制的越严格，低血糖事件的发生率就越高，血糖波动越大，大血管病变的发病率就越高。而实验结果也证明，参芪复方可以控制血糖波动，稳定其波动幅度，从而降低减少并发症发生率的目的。8.3应用参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠胰高血糖素、胰岛素以及GLP-1的影响。灌胃8周后实验各组GK大鼠血清INS水平结果如下：参芪组与其他三组均44 成都中医药大学2015级硕士学位论文无统计学意义；血清胰高血糖素（GC）结果如下：参芪组与模型组无统计学意义；而血清GLP-1水平结果如下：参芪组和西药组高于模型组，P＜0.01，有明显的统计学意义，但参芪复方与西药组无明显差异。简言之模型组GK大鼠血清胰岛素水平下降，胰高血糖素水平明显升高，参芪组的血清胰岛素高于模型组，但在统计学上并不明显，西药组具有更高的胰岛素水平。T2DM血脂代谢紊乱的重要原因是胰岛β细胞胰岛素分泌缺陷和α细胞胰高血糖素分泌增加，即“双激素异常”学说。胰岛素与胰高血糖素是一对相互拮抗对立的激素，二者相互协同共同调节人体内的血糖水平，若因任何因素造成二者比例失调，均可促进糖尿病的发生。研究证实，GLP-1不仅可以改善胰岛素β细胞功能分泌胰岛素，且对胰岛α细胞具有抑制作用，从而发挥平稳降糖的作用。在第8周胰岛素水平，西药组与模型组有统计学差异。因为西格列汀可提高内源性GLP-1的浓度，从而促进β细胞释放胰岛素，抑制α分泌胰高血糖素，所以我们可以看到西药组的胰岛素浓度增加，胰高血糖素的浓度是降低的；而参芪组则是通过调控GLP-1，提高其浓度，但不可调控胰高血糖素的水平，故在胰高血糖素的浓度比较时，参芪组浓度较高，西药组浓度较低，两者有差异；同时在第8周时GLP-1参芪组与西药组均高于模型组，差异有统计学意义。本实验也证实了DPP-4抑制剂的西格列汀具有双向调节胰岛素和胰高血糖素水平的作用，从而发挥了减少血糖波动的主要功效，同时参芪组也具有该作用，然而功效不如西药组明显。8.4应用参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠血脂的影响而本研究实验结果显示，灌胃8w后参芪组和西药组GK大鼠血清TC、TG均低于模型组，差异具有显著性（P<0.01）。而参芪组与西药组TC、TG水平差异无统计学意义。模型组大鼠伴有胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的升高，参芪组能明显改善GK大鼠的血脂水平。从实验结果可见，应用参芪复方能降低GK大鼠血清TC、TG水平，降低糖尿病大血管并发症的危险因素，从而减缓糖尿病大血管病变的发生发展过程。长期高血糖和高血脂时，机体产生过量ROS，抗氧化酶活性降低，氧化抗氧45 成都中医药大学2015级硕士学位论文［91］化系统发生改变，过量的ROS可引起分子、细胞和组织的损伤，其机制涉及［92］“糖毒性”、“脂毒性”引起的氧化应激。同时体内抗氧化酶发生糖化或氧化,导致机体抗氧化酶活性下降，清除自由基的能力下降，而反映氧化应激水平［93］的物质，如脂质过氧化的终末产物MDA含量明显升高。氧化应激状态在糖尿病血管并发症的发病中起着重要的作用，能量代谢紊乱是其重要环节。体内糖代谢紊乱导致机体葡萄糖自身氧化、蛋白非酶糖化、肾素-血管紧张素系统激活及代谢应激，高糖过度生成过氧化物的同时影响了ATP形成和电子转移传递，结果造成糖尿病血管的内皮功能障碍，促进了糖尿病并发症的发生和发展。SOD和GSH-Px是体内抗氧化系统中重要的酶，其中SOD可以歧化氧离子，并进一步转化为水和氧气，GSH-Px催化有机或无机过氧化物转化为水或相当的醇类，有利于维持机体正常的生理功能，免受自由基损伤。MDA则是脂质过氧化产物之一，常用来反映机体的脂质过氧化程度，一定情况下代表了体内过氧化损伤的程度。本研究显示，2型糖尿病SOD和GSH-Px活力明显降低，MDA含量显著升高。而2型糖尿病合并高脂血症时，SOD和GSH-Px的活性较糖尿病血脂正常组更高，血清MDA的含量也更低于糖尿病血脂正常组；本研究结果提示，血脂代谢紊乱加重了糖尿病的氧化应激的程度，表明糖尿病合并高脂血症时，抗氧化系统酶活性下降，脂质过氧化程度升高，氧化应激反应进一步增强，加重机体损伤。脂代谢和糖代谢密切相关，T2DM大约有50％的患者合并有血脂异常，其典型的血脂异常表现为甘油三酯水平升高、高密度脂蛋白胆固醇水平降低、低密度脂蛋白水平升高，此即糖尿病脂质三联症（lipidtriad）又称动脉粥样硬化血脂谱。脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化最重要的危险因素。近来研究发现，TC、TG的增高被认为是糖尿病大血管病变的独立的危险因素。本次实验所采用的糖尿病大血管病变GK大鼠表现为典型血脂代谢紊乱，表现为血清TC、TG水平升高，二者改变均可促进动脉粥样硬化的发生，引起大血管病变。8.5应用参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠血清CRP的影响C反应蛋白（CRP）是相对分子量约为115000～140000的血浆β球蛋白，由于最早发现其和肺炎球菌的C多糖结合而得名，是由肝细胞合成的一种急性时相反应蛋白，是反映进行性系统炎症非特异性的敏感标志物，也是代表性的炎症因子，能损伤血管内皮细胞（VECs），可通过多种生物活性促进动脉粥样硬化（AS）46 成都中医药大学2015级硕士学位论文发生发展。CRP不仅仅是一个代表性的炎症细胞因子，还是动脉粥样硬化发生发展活性介导剂，它通过上调上皮细胞的通透性，促进内皮细胞的黏附分子表达，固定补体，募集单核细胞和巨噬细胞到学过内皮炎症中心，以及激活局部血小板和血栓形成。总之，这些发现说明CRP能通过放大和加重局部炎症过程，在斑块水平上直接介导血管组织损伤，因此有文献报道靶向CRP可以预防和治疗AS，CRP有研究表明,2型糖尿病发生大血管病变的几率与血清CRP水平呈正相关。而本次实验各组GK大鼠血清CRP结果中，参芪组较模型组的CRP水平有明显的降低，差异具有显著性（P<0.01）；参芪组与西药组CRP水平差异无统计学意义。可见西药组和参芪组都能在一定的程度上降低血中的CRP，从而减轻血管炎症反应，延缓糖尿病血管并发症的发生发展。8.6参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠腹主动脉的病理形态学改变的影响模型组造模成功，可见内膜不光滑，内皮细胞部分破坏，中膜弹力纤维层及其细胞核均排列紊乱，血管壁变薄，并可见血管全层嗜酸性变，红染，其血管损失程度较重。西药组可见内膜不光滑，内皮细胞部分破坏；中膜弹力纤维层及其细胞核略排列紊乱，血管壁轻微变薄，未见血管全层嗜酸性变，红染并可见弹力纤维间疑似脂质空泡。而参芪组可见完整光滑内膜、中膜弹力纤维完整，细胞胞核整齐排列，外膜可见附着营养血管及脂肪等；内膜不光滑，内皮细胞部分破坏，可见少量附壁细胞；未见其它明显病理变化。其损伤程度较模型组轻，说明参芪复方能改善糖尿病大血管病变的内皮细胞损伤情况。且与西药组相比，参芪复方对GK大鼠动脉内皮的细胞具有保护作用。参芪组发挥了改善血管内皮损伤的良好作用，西药组次之。8.7参芪复方对糖尿病大血管病变GK大鼠胰腺HE染色的影响模型组胰岛分布与胰腺周界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，以及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积），同时可见胰岛含铁血黄素沉积；西药组见胰岛分布与胰腺周界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积）；参芪组胰岛分布与胰腺周界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积）。47 成都中医药大学2015级硕士学位论文结论1．本次实验采用5月龄SPF级雄性自发性2型糖尿病GK大鼠，予高脂饮食连续造模8周，成功复制出了糖尿病大血管病变动物模型。2.运用参芪复方可以改善糖尿病大血管病变GK大鼠的“多饮多食”等一般状况，稳定血糖，减少血糖波动，改善血脂紊乱，减轻低度炎症状态，提高GLP-1浓度，从病理切片来看可减轻腹主动脉病理形态学损伤，防止胰岛细胞的形态发生改变。3.基于中医“脾胰同源”思想应用参芪复方可减少血糖波动，保护胰岛素功能，干预GK大鼠糖尿病大血管病变，对糖尿病大血管病变具有有效性及可行性。48 成都中医药大学2015级硕士学位论文问题与展望如前所述，临床与实验研究均证实，参芪复方对于干预糖尿病大血管病变具有确切疗效；复方中药减少血糖波动、干预糖尿病大血管病变既往尚未见文献报道。中医药的调节特点着眼于“血糖的整体水平”，有着整体调节和稳定血糖的独特优势。本研究以血糖波动为入口，基于“脾胰同源”理论，研究具有养阴益气活血作用的参芪复方调控GLP-1表达，保护胰岛ß细胞功能，减少血糖波动，从而干预糖尿病大血管病变的作用。具有一定的创新性，但由于实验条件、实验时间等因素的影响，尚存在以下问题，在今后的研究中仍需要继续深入探索：1.本实验仅从动物模型证实应用参芪复方具有减少血糖波动，降低低度炎症，保护大血管病变的作用，无法从动物实验体现中医辨证论治的精髓，还待设计临床实验方法。2.由于经费等原因，本实验动物样本量较少，研究周期较短。3.受实验条件限制，未能将GK大鼠每只单独饲养，从而得到每一只GK大鼠饮水量，摄食量的变化情况，且未能观察到GK大鼠小便及血压等情况。49 成都中医药大学2015级硕士学位论文致谢本课题研究是在导师谢春光教授悉心指导和严格教诲下完成，同时本课题也是国家自然科学基金青年基金项目的内容，其主持人刘桠博士同样给予细致而专业的指导，在此，向两位老师表示衷心的感谢！在硕士阶段的理论、科研、临床学习过程中，以及从本课题实验立题至本论文结稿，自始至终都得到了导师谢春光教授细心严谨的指导和热情至诚的关怀。导师博大精深的学识、严谨求实的治学态度深深影响着我，并鞭策着我不断前进，使我终身受益。在此论文完成之际，谨向导师致以最衷心的感谢和最诚挚的敬意。在三年的学习和实验过程中，成都中医药大学附属医院内分泌科就像一个家庭，不仅给了我关怀，也让我有了成长，在此向陈秋主任，带习老师龚光明副主任医师，袁海泼主治医师致以最真诚的感谢。感谢四川省中医药科学院实验动物中心为我们提供良好的实验平台，并在实验过程中给予了热情的指导和帮助。也借此机会，对富晓旭、张翕宇、晁俊、钟文、杨婵、周秀娟、刘晓可、方俪鹃、张愿、赵雪慧、杜青营、鄢然、雷远洪等师兄师姐师弟师妹的无私帮助和在本研究中的贡献表示真诚的感谢！向所有参与答辩指导的专家前辈致以最诚挚的敬意和最衷心的祝福!最后，感谢向多年来给予我大力支持和无私帮助的家人爱人和亲友，致以衷心的谢意！50 成都中医药大学2015级硕士学位论文参考文献[1]YangW,LuJ,WengJ,JiaW,JiL,XiaoJ,ShanZ,LiuJ,TianH,JiQ,ZhuD,GeJ;ChinaNationalDiabetesandMetabolicDisordersStudyGroup.PrevalenceofdiabetesamongmenandwomeninChina.NEnglJMed.2010Mar25;362(12);1090-101.[2]潘长玉,田慧,刘国良,李秀钧,傅祖植,陈家伟.中国城市中心医院糖尿病健康管理调查.中华内分泌代谢杂志.2004;20(5):420-424.[3]KeymelS，HeinenY，BalzerJ，etal．Characterizationofmacro-andmicrovascularfunctionandstructureinpatientswithtype2diabetesmellitus［J］．AmJCardiovascDis，2011，1(1):68-75．[4]GrundySM,HowardB,SmithSJr,EckelR,RedbergR,BonowRO.PreventionConferenceVI:DiabetesandCardiovascularDisease:executivesummary:conferenceproceedingforhealthcareprofessionalsfromaspecialwritinggroupoftheAmericanHeartAssociation.Circulation.2002May7;105(18):2231-9.[5]HowardBV,RodriguezBL,BennettPH,HarrisMI,HammanR,KullerLH,PearsonTA,Wylie-RosettJ.PreventionConferenceVI:DiabetesandCardiovasculardisease:WritingGroupI:epidemiology.Circulation.2002May7;105(18):el32-7.[6]向红丁.全国住院糖尿病患者慢性并发症及其相关危险因素10年回顾性调查分析[J].中国糖尿病杂志,2003,11(4):232-237.[7]周健，喻明，贾伟平，等.应用动态血糖监测系统评估2型糖尿病患者日内与日间血糖波动的幅度[J].中华内分泌代谢杂志，2006,22(3):286-287.[8]CerielloA,KipatrickES.Glycemicvariability:bothsidesofthestory［J］．DiabetesCare.2013，36(Suppl2):S272-275．[9]SatyaKrishnaSV,KotaSK,ModiKD.Glycemicvariability:Clincalimplication［J］．IndianJEndocrinolMetab.2013，17(4):611-619．[10]MuggeoM，ZoppiniG,BonoraE，BonadonnaRC，MoghettiP，VerlatoG.Fastingplasmaglucosevariabilitypredicts10-yearsurivivaloftype2diabeticpatients:theVeronaDiabetesStudy［J］．DiabetesCare,2000,23(1):45-50.s[11]NathanDM，McGeeP,SteffesMW，LachinJM；DCCT/EDICResearchGroup.RelationshipofglycatedabumintobloodglucoseandHbA(1c)valuesandtoretinopathy,nephropathy,andcardiovascularoutcomesintheDCCT/EDICstudy［J］．Diabetes,2014,63(1):282-290.[12]杨静.血糖波动对心脑血管内皮影响的新进展[J].医学综述，2011,17（22）：3446-3449.[13]ZhangXG，ZhangYQ，ZhaoDK，WuJX，ZhaoJ，JiaoXM，ChenB，LvXF.Relationshipbetweenbloodglucosefluctuationandmacrovascularendothelialdysfunctionintype2diabetespatientswithcoronaryheartdisease［J］．EurRevMdePharmacol,2014,18,(23):3593-3600.[14]高泓,谢春光,赵旭.糖尿病大血管病变的中医病机分析[J].时珍国医国药,2009,20(6)：1314-1315.[15]谢毅强,李军茹,张红敏,等.参芪复方治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的临床研究[J].中华适用中西医杂志,2005,18（17）:844-846.[16]张红敏,陈世伟,谢春光,等.参芪复方对GK大鼠白色脂肪组织脂联素基因表达的影响[J].中成药,2006,28（7）:996-1001.[17]张红敏,陈世伟,谢春光,等.参芪复方对GK大鼠炎症标志物的影响及机理探讨[J].中药材,2006,29（3）:249-253.51 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成都中医药大学2015级硕士学位论文附件附件一：综述GLP-1对2型糖尿病及其血管并发症影响的研究进展糖尿病大血管病变发病率高，据一项数据表明，糖尿病患者的血管病变发病[1][2]率是非糖尿病患者的2至4倍。一项临床数据表明，我国住院糖尿病病人中[3]合并大血管病变者高达65%。糖尿病大血管病变危害严重，糖尿病大血管病变是糖尿病患者主要的致残、致死原因，是危害最大的糖尿病慢性并发症，约80%的2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)患者死于大血管并发症，如脑卒中、心肌梗死等。胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1,GLP-1)是胰高血糖素样肽成员之一，由肠道L细胞分泌，是一种在餐后分泌的激素。GLP-1随餐后血糖水平升高而释放并刺激胰岛素产生、抑制胰高血糖素释放、减缓营养物被吸收进入血液的速率。GLP-1能促进胰岛素分泌，抑制胰岛β细胞的凋亡，促进胰岛β细胞增殖，是2型糖尿病治疗的重要靶标。现将GLP-1应用在糖尿病以及其血管病变做一综述：1.GLP-1对2型糖尿病的作用1.1促进胰岛素的合成。GLP-1主要生物效应是调节葡萄糖代谢的平衡，增加糖依耐性胰岛素释放，促进胰岛素发挥生物学效应，抑制葡萄糖的产生。GLP-1可在基因转录水平对胰岛素的合成进行调控，增加其合成量。GLP-1主要通过cAMP和PKA依赖的信号通路发挥作用，通过上调转录因子cAMP反应元件结合蛋[4]白，进而增加胰岛素基因的表达。1.2保护胰岛β细胞。GLP-1具有促进胰岛β细胞的增殖和改善胰岛β细胞功能的作用。研究提示，激活的GLP-1受体信号传导通路对胰岛β细胞的再生有一定[5]的影响，可刺激胰岛β细胞增殖，并抑制β细胞凋亡。另外，对链脲佐菌素所致糖尿病大鼠的胰岛细胞、离体的人类β细胞以及胰腺癌细胞进行凋亡诱导试验，结果均表明GLP-1可减少胰岛细胞的凋亡。1.3抑制胰高血糖素的分泌。GLP-1可抑制α细胞分泌胰高血糖素，但目前机制尚不清楚。还有研究表明高糖环境刺激也能增加GLP-1的释放，胰岛α细胞长期56 成都中医药大学2015级硕士学位论文接触GLP-1能增加它们产生和分泌GLP-1的能力，这一现象是通过成对同源异形盒转录因子6(pairedbox6,Pax6)的刺激和激素原转化酶PC1/3表达增加而实现[6]的。1.4抑制食欲,适当减重。研究表明，适当地减轻体重有助于糖尿病患者对血糖的控制。GLP-1对患者体重的控制作用主要体现在延缓胃排空，增加饱胀感，抑制食欲，减少能量摄入等方面。其机制可能是通过激活与食欲调节密切相关的下[7]丘脑室旁核、垂体等处的特异性受体而产生。2.GLP-1对血管病变的作用2.1GLP-1与心血管疾病：GLP-1不仅具有降血糖的功效，还发挥一些心脏保护作用，已经显示出对心血管疾病(CVD)一些危险因素的积极影响，包括降低血管收缩压、减轻体质量和改善血脂来降低心血管疾病发生风险，由于这些原因，肠促胰素不仅认为是新型降糖药物，而且对心血管疾病治疗有效。众所周知，血压和血脂是影响糖尿病患者心血管疾病风险的重要因素。多项研究显示，GLP-1可能通过改善内皮功能、降低体质量、直接作用于血管上的GLP-1Ｒ使血管舒张、［8］［9］降低交感神经系统活性来有效调节血压。另外据文献报道，糖尿病血脂异常主要特点是高血糖相关的三酰甘油(TG)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平增高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低，血脂调节异常可导致心肌脂质沉积、室壁增厚、心室重构、心肌收缩功能下降，严重损害心脏功能。大规模的临床研究证明，GLP-1R信号可通过调节肝脏脂质代谢的关键酶、损害肝细胞新生脂肪生成和β氧化来降低肝脏VLDL-TG生成率。新出现的证据表明，GLP-1对心血管的效应可能通过增强心肌葡萄糖摄取能力和/或增加冠状动脉血流，静脉内给予低剂量GLP-1受体激动剂显著降低心肌梗死面积，改善冠状动脉疾病的心脏收［10］缩功能。相类似的研究发现，对于ST段抬高型心肌梗死经皮冠状动脉介入治疗的患者，静脉低剂量滴注GLP-1受体激动剂可提高其心肌细胞存活率，改善［11］心脏功能。动物模型实验亦表明，肠促胰素可以保存心肌细胞活力，提高代［12］［13］谢效率，抑制心肌梗死后的结构和功能重塑。另有研究指出，GLP-1受体激动剂可以使小鼠心肌细胞中的蛋白激酶AKt和GSK-3β磷酸化，发挥心脏保护［14］作用。最近，一项关于所有GLP-1RA类结果的Meta分析,发现主要的心血管事件、心肌梗死和心血管病死率较对照组发生率明显降低。综上所述，GLP-1R57 成都中医药大学2015级硕士学位论文可通过多种途径介导心血管的保护功能。2.2GLP-1与微血管疾病：糖尿病肾病(DN)是糖尿病的主要微血管并发症，可在20%～40%的患者中发生，尽管改善了生活方式和药物干预，许多患者仍进展至终末期肾病，故而临床上需要新的策略以减轻这方面的负担。糖尿病肾病的特征在于细胞外基质过度积累、肾小球基底膜增厚、肾小球和肾小管各种类型细胞的肥大和/或缺失，最终发展为肾小球硬化和肾小管间质纤维化，高血糖作为糖尿病最基本的病因可直接损伤肾脏，也可通过炎性反应、细胞因子、晚期糖基化终［15-16］末产物堆积等多种途径进一步促进糖尿病肾病的发生、发展。GLP-1R信号通路抑制肾脏中烟酰胺嘌呤二核苷酸［NAD(P)H1］氧化酶的活性、增加环磷酸腺苷(cAMP)以及蛋白激酶A(PKA)活性水平，最终减少尿蛋白，延缓糖尿病肾病的［17］发展，利格列汀主要经肝胆途径代谢，其肾脏清除率非常低(＜1%)，从而避免在肾功能不全患者中调整剂量，最近有研究观察到利格列汀能减少肾小球损［18］伤、蛋白尿及糖尿病大鼠模型体内的氧化应激。另外累积的证据指向炎性和促炎细胞因子在糖尿病肾病中起到关键性作用，研究发现西格列汀能够抑制糖尿［19］病肾脏中促炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白水平，提示西格列汀对糖尿病肾病有一定的治疗意义。还有数据显示DPP-4抑制剂可减少蛋白尿、尿白蛋白/肌酐比、血肌酐，提高肌酐清除率和延缓糖尿病大鼠肾小球和肾小管［20］间质纤维化。可见，GLP-1及其相关药物可能在糖尿病肾病患者中存在潜在肾脏保护作用。参考文献：[1]GrundySM,HowardB,SmithSJr,EckelR,RedbergR,BonowRO.PreventionConferenceVI:DiabetesandCardiovascularDisease:executivesummary:conferenceproceedingforhealthcareprofessionalsfromaspecialwritinggroupoftheAmericanHeartAssociation.Circulation.2002May7;105(18):2231-9.[2]HowardBV,RodriguezBL,BennettPH,HarrisMI,HammanR,KullerLH,PearsonTA,Wylie-RosettJ.PreventionConferenceVI:DiabetesandCardiovasculardisease:WritingGroupI:epidemiology.Circulation.2002May7;105(18):el32-7.[3]向红丁.全国住院糖尿病患者慢性并发症及其相关危险因素10年回顾性调查分析[J].中国糖尿病杂志,2003,11(4):232-237.[4]HolzGG.Newinsightsconcerningtheglucose-dependentinsulinsecretagogueactionofglucagon-likepeptide-1inpancreaticbeta-cells[J].HormMetabRes，2004，36(11-12)：787-794.[5]FarillaL1,BulottaA,HirshbergB.Glucagon-likepeptide1inhibitscellapoptosisandimprovesglucoseresponsivenessoffreshlyisolated58 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２０５成都中医药大学１级硕士学位论文附件三：申明及授权书独创性声明本人郑重申明：所呈交的学位论文是本人在成都中医药大学攻读硕士学位期间在导师指导下独立进行研宄工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果一。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名（亲笔）：￥＼余／＾及＾年６月日另学位论文使用授权书根据国家相关规定，已通过的学位论文应当公开发表。本人同意：成都中医药大学有权通过影印、复印等手段汇编学位论文予以保存，并提供査阅和借阅；有权向国家有关部门、其他相关机构送交论文及电子版，公布（或刊登）论文内容。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者签名（亲笔）：Ｍ力这年６月左日指导教师签名（亲笔）：洳》年＜月ｙ曰６２