甲型流感病毒核蛋白的原核表达及其抗体制备和初步应用

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分类号Ｒ３７３．１院校代码８８１０１錡秦應硕士学位论文甲型流感病毒核蛋白的原核表达及其抗体制备和初步应用学位申请人：张儒轩学科专业：病原生物学指导教师：郭潮潭研究员答辩日期：２０１７年６月 独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果Ｅ对本文的研宄做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明一。本人完全意识到本人将承担本声明引起的切法律后果￡学位论文作者签名：获降巧曰期：＞年【月曰９学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解有关保留、使用学位论文的规定，即：浙江省医学科学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江省医学科学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文３保密□，在年解密后适用本授权书。＿＿？本论文属于不保密ｓ／“”（请在以上方框内打Ｖ）＇乘冷学位论文作者跳參卿外指職师签名：考＇曰期年弓曰曰期：年办月厶曰）ｋ，ｂｆ／ AdissertationsubmittedtoZhejiangAcademyofMedicalSciencesfortheDegreeofMasterExpressionofInfluenzaAvirusNucleoprotein,PreparationofAnti-NPAntibodiesandItsPreliminaryApplicationsCandidate:ZhangRuxuanMajor:PathogenyBiologySupervisor:Prof.GuoChaotanZhejiangAcademyofMedicalSciencesHangzhou310013,P.R.ChinaMay,2017 英文缩略表缩写英文名称中文名称BMEβ-Mercaptoethanolβ-巯基乙醇bpBasePair碱基对BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白CBBCoomassieBrilliantBlue考马斯亮蓝DMEMDulbecco'sModifiedEssentialMedium杜氏基本培养基ELISAEnzymeLinkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附试验FBSFetalBovineSerum胎牛血清HAHemagglutinin血凝素蛋白HATHypoxanthine,AminopterinandThymidine次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷HRPHorseradishPeroxidase辣根过氧化物酶HTHypoxanthineandThymidine次黄嘌呤和胸苷IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GIPTGIsopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside异丙基硫代半乳糖苷kDaKilodalton千道尔顿LBLuria-Bertani溶菌肉汤mAbMonoclonalAntibody单克隆抗体M1MatrixProtein基质蛋白MDCKMadin-DarbyCanineKidneyCells犬肾上皮连续细胞系mgMilligram毫克mLMilliliter毫升NANeuraminidase神经氨酸酶NPNucleoProtein核蛋白ODOpticalDensity光密度值PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PBSTPhosphateBufferedSaline-Tween20磷酸盐-吐温缓冲液PEGPolyethyleneGlycol聚乙二醇SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠3 目录中文摘要１－ＡＢＳＴＲＡＣＴ３＂Ｍｔ５１．甲型流感病毒的概况５２．流感病毒核蛋白７３．本研究主要实验原理８４？研究目的和意义１０一第章ＮＰ的Ｂ细胞表位预测分析１１一胃节材料与方法１１１．ＮＰ氨基酸序列１１２二级结构．ＮＰ蛋白预测１１３ＮＰ蛋白亲水．性分析Ｕ４．ＮＰ蛋白柔韧性分析１２５．ＮＰ蛋白可及性分析１２６．ＮＰ蛋白抗原表位的预测分析１２二第节结果与分析１２１．ＮＰ氨基酸序列１２２．ＮＰ蛋白二级结构预测１３３．ＮＰ蛋白亲水性分析１４４．ＮＰ蛋白柔韧性分析４］５．ＮＰ蛋白可及性分析１５６．ＮＰ蛋白抗原表位的预测分析１５第三节结论与讨论１６二ＮＰ蛋白第章甲型流感病毒的原核表达１８一第节材料与方法１８ １？菌株与质粒１８２？主要仪器１８３．ｉ式齐！Ｊ１８－４－ＮＰ．构建原核表达质粒ＰＥＴ２８Ａ１９４．１引物设计与合成１９４．２目的基因扩增１９４．３ＮＰ目的片段与原核表达载体的双酶切与鉴定１９４．４ＮＰ目的片段与原核表达载体的连接反应与鉴定２０４．５连接产物转化克隆菌２０４．６质粒提取与重组质粒鉴定２０５．ＮＰ蛋白可及性分析２１５．１重组质粒转化表达菌２１５．２ＮＰ蛋白小量诱导表达２１５．３ＮＰ蛋白大量诱导表达２２５．４ＮＰ蛋白纯化浓缩２２６．重组ＮＰ蛋白鉴定２３６．１重组质粒转化表达菌２３６．２重组ＮＰ蛋白的ＥＬＩＳＡ鉴定２３第二节结果与分析２４１．引物设计２４２．目的基因扩増２４－３．ＰＥＴ２８Ａ－ＮＰ质粒构建与表达２４４．ＮＰ蛋白小量诱导表达条件的优化２５５．ＮＰ蛋白可溶性分析２６６．ＮＰ蛋白镍柱Ｗ纯化２６７．目的蛋白的ｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ鉴定２８８．目的蛋白的ＥＬＩＳＡ鉴定２８＊第三节结论与讨论２９第三章抗ＮＰ单克隆抗体的制备３１ SodiumDodecylSulfatePolyacrylamideGel十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺SDS-PAGEElectrophoresis凝胶电泳TMBTetramethylBenzidine四甲基联苯胺UUnit单位μgMicrogram微克μlMicrolitre微升4 浙江省医学科学院硕士学位论文中文摘要研究背景：流行性感冒是由流感病毒引起的人畜共患呼吸道传染病。禽流感的爆发及流行不仅威胁着人类的生命健康，而且对家禽养殖业生产和发展造成严重的打击，对社会的和谐安定和国民经济的发展都有较大影响。流感病毒是由8条节段性基因组成的负义RNA病毒，是一类极易变异的病毒，它通过基因突变和基因重排发生抗原漂移，产生新亚型。这不仅使得流感病毒疫苗研发上困难重重，令现有的疫苗失去保护作用，而且对现有抗流感药物产生耐受性，从而失去临床治疗效果。因此，流感病毒存在易传播、不可预知和爆发性，使流感病毒的防控困难重重。尽管流感是第一个实行全球性监控的疾病，但每年仍有不同程度的流感疫情在全球爆发，无法很好地控制流感疫情走向。因此，提高对流感病毒的诊断和检测能力显得尤为重要。尽快实现对流感病毒快速、准确的诊断，便于在流感疫情发生时迅速采取应对措施，有利于控制传播范围，对症下药，从而起到预防和控制流感的作用。研究目的：对甲型流感病毒NP蛋白潜在的抗原表位进行预测分析。制备和纯化NP蛋白，为抗体制备和抗体鉴定提供基础材料。制备和纯化抗NP单克隆抗体，为检测流感病毒和研究NP蛋白生物学特性提供物质基础。研究方法：（1）应用DNAStar的Protean软件，通过Garnier-Robson、Chou-Fasman、Kyte-Doolittle、Karplus-Schulz、Emini、Jameson-Wolf等方法综合预测NP蛋白的潜在B细胞抗原表位。（2）通过PCR扩增NP基因，经（EcoRI和SalI）双酶切，与pET-28a(+)载体连接。重组质粒转化大肠杆菌表达菌，优化诱导温度、IPTG浓度、诱导时间，使之在原核表达体系中稳定地表达NP融合蛋白。采用镍柱亲和层析法纯化融合蛋白，并通过Western-blot对所得蛋白进行鉴定。（3）以纯化NP蛋白为免疫原免疫Balb/c小鼠，通过细胞融合，得到能稳定分泌抗NP单克隆抗体的杂交瘤细胞，注射进入F1小鼠腹腔获得单克隆抗体腹水并纯化。通过Western-blot和ELISA法对单克隆抗体进行鉴定。（4）采用Western-blot、ELISA法鉴定所得单抗对PR8、Memphis、Aichi的检测效果。采用双抗夹心ELISA法对Memphis病毒的进行检测，并与直接ELISA法进行灵敏度比较。采用细胞免疫组化法鉴定所得单抗检测侵染MDCK的PR8、Memphis、Aichi三种病毒的能力。并对PR8病毒侵染和pcDNA3.1-NP转染MDCK细胞期间NP蛋白不同时间的表达和定位情况进行研究。1 浙江省医学科学院硕士学位论文研究结果：（1）推测NP蛋白上的第5-10、76-80、88-93、124-127、146-152、162-176、203-216、227-231、241-252、291-296、318-327、367-370、396-399、418-422、430-440、452-455、467-472、481-487位氨基酸具有较大的B细胞抗原表位潜力。（2）成功构建原核细胞蛋白表达系统pET-28a-NP，并在大肠杆菌表达菌BL21中成功诱导，得到高纯度的NP蛋白。（3）经NP蛋白免疫小鼠和细胞融合，得到5株能稳定表达抗NP单克隆抗体的杂交瘤细胞，获得5株单克隆抗体腹水，纯化后得到5株高纯度的抗NP单克隆抗体，并成功标记HRP。5株抗体及其酶标抗体均能与NP蛋白特异性结合。（4）初步测试抗NP抗体的生物学特性，证实抗体具有良好的特异性和免疫活性。该抗体能结合PR8、Memphis、Aichi的NP蛋白。在PR8侵染MDCK细胞后，8h即可检测到NP蛋白，主要位于细胞核；随时间延长观测到NP从细胞核扩散到充满胞质的过程。在pcDNA3.1-NP转染MDCK后，24h即可检测到NP蛋白；随时间延长同样观察到NP从细胞核到充满胞质的过程。结论：本研究预测分析了NP蛋白的优势抗原表位。成功构建甲型流感病毒NP蛋白的原核细胞蛋白表达系统，并获得高纯度NP蛋白。通过免疫动物、细胞融合等方法获得5株能稳定分泌抗NP单克隆抗体的杂交瘤细胞，进一步获得了效价高、特异性好的单克隆抗体。通过鉴定和检测，认为该抗体可以作为流感病毒快速诊断试剂盒的基础材料，双抗夹心ELISA流感病毒亚型鉴别试剂盒的基础材料，以及NP蛋白细胞亚定位等基础研究的材料。关键词：NP蛋白；抗原表位；单克隆抗体；生物特性；应用研究2 浙江省医学科学院硕士学位论文ABSTRACTBackground:Influenzaisazoonoticrespiratorydiseasecausedbyinfluenzavirus.ThehumanhealthandpoultryfarmingwillbeinfluencedwhenEpidemicoccurs,alsoasthedevelopmentofsocialeconomy.InfluenzavirusisanegativeRNAvirus,thegenomecontains8genes.Antigendriftiseasilyhappenedthroughgenemutationandgenerearrangement,andleadtothecreationofnewsubtypes.Theemergingsubtypesleadtheexistingvaccinesfailure.Theoverfrequencyuseofdrugsincreasesthedrugresistance.Inaddition,thecharacteristicsofinfluenzasuchasfastspreading,persistenceandunpredictability,causesignificantdifficultiestothepreventionandcontrolofinfluenza.Althoughthefluisthefirstdesieasetocarryoutaglobalsurveillance,buteachyeartherearestillvaryingdegreesofinfluenzaoutbreakintheworld.Therefore,itisveryimportanttoimprovethediagnosisanddetectionofinfluenzavirus,totakeaccuratemeasuresdirectlywhenthefluoccurs.Itisbenefittocontrolthefluspreadandfindspecificwaystotreatvirus,sothenwecanefficientlypreventandcontrolinfluenza.Purpose:PredictandanalysisthepotentialepitopesofNP.ExpressandpurifyofNP,providematerialsforantibodyproductionandidentification.ProduceandpurifyofmonoclonalantibodyagainstNP,providematerialsfordetectinginfluenzavirusanddoingresearchforbiologicalcharacteristicofNP.Methods:(1)ThepotentialBcellepitopesofNPwerepredictedthroughtheGarnier-Robson,Chou-Fasman,Kyte-Doolittle,Karplus-Schulz,EminiandJameson-Wolfmethods.(2)TheNPgenewasamplificatedbyRT-PCR,andwaslinkedintopET-28a(+)prokaryoticexpressionvectorafterdoubleenzyme(EcoRIandSalI).OptimiationconditionsofprokaryoticexpressionplasmidofpET-28a-NP,sothatstablyexpressNPfusionproteininE.colisystem.Then,theNP-fusionproteinwaspurifiedwithanickelcolumnaffinitychromatography,andidentificationpurificationofproteinthroughWestern-blotmethod.(3)TheBalb/cmicewereimmunizedwiththepurifiedNPandtheirspleencellswerefusedwithmousemyelomacells.Afterselection,TheF1micewereinjectedwithpositivehybridomacellsandproduceascitescontainsmonoclonalantibodies.(4)ThepurifiedantibodiesaretestedbyWesternblot,enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)toidentifythedetectionalabilitytoPR8,MemphisandAichi.Comparedouble-antibodysandwichELISAmethodwithdirectELISAtoconfirmthesensitivityofMemphis.Thecell-mediatedimmunityexperimentisusingtoidentifythespecific3 浙江省医学科学院硕士学位论文combinationofantibodiestoPR8,Memphis,AichiinMDCK.ThroughtwowaystolocationNPinMDCKatdifferenttime,theoneisPR8infection,theotherispcDNA3.1-NPtransfection.Results:(1)Accordingtothepredictionanalysisofproteinstructure,speculatedthatthe5-10,76-80,88-93,124-127,146-152,162-176,203-216,227-231,241-252,291-296,318-327,367-370,396-399,418-422,430-440,452-455,467-472and481-487segmentsofaminoacidsofNPhaverelativelylargepotentialpossibilityasNPBcellepitopes.(2)SuccessfullyconstructofprokaryoticcellexpressionsystempET-28a-NP,induceandexpressiontheNPinE.colisuccessfully,obtainthehighpurityoftheNP.(3)Afterimmuneandcellfusion,get5strainsofhybridomacellswhichcanstablyproduceanti-NPantibodies.Afterinjection,collect5strainsofmonoclonalantibodyascites.Purifyascitesandlabelantibodieswithhorseradishperoxidase(HRP).AllantibodiesandtheirlabeledantibodiescanspecificcombinewithNP.(4)Preliminarilytestthebiologicalcharacteristicsofanti-NPantibody,demonstratingthattheantibodyisspecificandimmunological.Anti-NPantibodycanspecificallycombinewithNPinPR8,MemphisandAichi.AfterPR8infectingMDCK,westarttodetectNPat8hmainlyinnucleus;withthetimepastwecanobserveNPreleasedfromnucleustocytoplasm.ThesameprocessishappenedinpcDNA3.1-NPtransfectMDCK,butthetimethatstarttodetectNPisdelayedto24h.Conclusion:TheresearchanalysisofthedominantepitopesofNP.TheprokaryoticcellexpressionsystempET-28a-NPwhichcanexpressNPwasconstructed.UsingthesystemobtainedapureNP,andhensuccessfullypreparedhighpotency,specificityofmonoclonalantibodyagainstNPthroughimmuneBalb/candcellfusion.Afteridentifyanddetection,acquiredhighpurityNPanditsantibodiescanserveasmaterialstodevelopaquickdiagnostickitforinfluenza,ordouble-antibodysandwichELISAkitforsubtypesofinfluenza,sublocationofNPincellsandsoon.Keywords:Nucleoprotein;Epitopes,Monoclonalantibodies;Biologicalcharacteristics;ApplicationResearch4 浙江省医学科学院硕士学位论文前言1、甲型流感病毒概况流行性感冒病毒（Influenzavirus）又称为流感病毒。流感病毒是引起具有高度传染性的急性呼吸道疾病的病原体[1]。由于甲型流感病毒的抗原性极易发生变异，容易形成新的流感病毒亚型，从而导致病毒的耐药性不断增强，再加上病毒自然感染率高，使流感病毒在短时间内容易出现区域性甚至全球性大流行。如图1所示，据统计在20世纪期间引起了四次较大规模的甲型流感病毒大流行。其中包括：西班牙流感（H1N1）、亚洲流感（H2N2）、香港流感（H3N2）、前苏联流感（H1N1），仅在西班牙甲型流感病毒大流行中，造成的死亡人数高达5000万人[2]。最近二十年来，新型亚型禽流感不断地威胁着人类生命健康。如今，全球每年因流感死亡的人数约25~50万[3]。图1.流感流行病史根据流感病毒的核蛋白（nucleoprotein,NP）和膜蛋白（membraneprotein,MP）的抗原性及基因特征的差异可将其划分为甲（A）型、乙（B）型、丙（C）型等三种不同的流感病毒[3,4]。甲型流感病毒是正粘病毒科中具有包膜的单复链RNA病毒，病毒颗粒在结构上一般为多面球形，在电镜下可以观察到病毒的多面型结构。其中主要由糖蛋白HA、NA和小量的跨膜蛋白（M2）共同形成的基质蛋白、M1（主要包绕在NP周围）、非结构类蛋白（NS1、NEP）、还有构成RNA聚合酶结构蛋白（PB1、PB2、5 浙江省医学科学院硕士学位论文PA）等蛋白组成。根据病毒表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同可以将甲型流感病毒分为多种不同的亚型。图2、甲型流感病毒结构模式图如图2所示，甲型流感病毒的基因组是由8条节段性负链RNA组成，其中基因组序列全长大约为13136bp，在流感病毒的基因组中，每条RNA分别执行不同的功能，共编码11种蛋白。其中第1、2、3条（PB1、PB2和PA）基因分别编码构成三种RNA聚合酶的蛋白（PB1、PB2和PA），而RNA聚合酶在病毒转录过程中具有重要的作用，是病毒RNA复制和转录等生物学功能中不可或缺的酶。在病毒RNA的复制过程中，PB1具有RNA聚合酶的活性，主要参与RNA的复制和转录过程，PB2在转录过程中可以识别宿主的mRNA并对其进行修饰，具有一定的校对功能[5]。第4、6（HA和NA）基因分别编码两种包膜蛋白，即血凝素（HA蛋白）和神经氨酸酶（NA蛋白），是病毒脂质包膜的主要成分。HA蛋白是一种跨膜蛋白，主要由HA1和HA2两种亚基组成，是流感病毒最重要的蛋白之一，HA蛋白在流感病毒对宿主细胞的识别、吸附、融合及病毒致病力中起着关键性的作用。同时HA基因在病毒的复制过程中容易发生变异，导致抗原位点的转移，从而产生新的病毒株在新的人群或者禽类中进行传播，因此HA蛋白本身的裂解性、受体特异性是流感病毒致病性和感染性强弱的决定性因素[6,7]。NA蛋白在成熟病毒粒子从感染细胞的释放过程中具有重要的作用，主要通过水解宿主细胞表面的糖蛋白中的糖苷键从而破坏宿主细胞表面结构，促使成熟病毒粒子的释放，进而感染呼吸道粘膜和向周围扩散感染[8]。此外，NA蛋白不仅可以裂解呼吸道中的唾液酶防止病毒失活、通过改变流感病毒中血凝素的糖基部分增6 浙江省医学科学院硕士学位论文强病毒的毒性，还可以诱导宿主细胞炎症反应和激活潜在的转移因子促进细胞死亡[9]。第5条NP基因主要编码病毒核蛋白（NP），NP蛋白是甲型流感病毒的主要结构蛋白，通常与病毒RNA片段及构成RNA聚合酶（PA、PB1、PB2蛋白）相互结合构成流感病毒核糖核蛋白，参与流感病毒遗传物质的复制、转录和组装。第7条M基因可以编码流感病毒的M1和M2等基质蛋白，其中M1是病毒粒子的主要组成成分，对病毒囊膜结构的稳定和强化起到关键性作用。M2蛋白是一种跨膜蛋白，具有离子通道活性。第8条NS基因能编码非结构蛋白（NS蛋白）和核输入蛋白（NEP），主要参与调节流感病毒mRNA的合成。目前，人们对流感病毒的治疗及预防最主要是通过对人体进行疫苗接种和使用抗流感病毒药物。由于甲型流感病毒本身极易发生变异和对新型流感病毒疫苗研发的滞后性，使流感病毒未能得到及时有效控制[10-12]，从而导致甲型流感病毒大流行，不仅给人类的健康造成了灾难性的后果，也对国家的经济、医疗、和社会稳定构成了极大的威胁。同时，流感病毒的大流行也为医疗领域带来了新的挑战。为了找到更好的方法预防及治疗甲型流感，人们对甲型流感病毒的结构、功能、变异特点及耐药性进行了详细地研究。2、流感病毒核蛋白流感病毒核蛋白（Nucleoprotein，NP）由第5条基因编码，498个氨基酸组成，是流感病毒的重要结构蛋白，约占病毒颗粒的25%[13]。NP蛋白在不同亚型的甲流病毒中高度保守，差异性不超过11%[14]，具有种群和型的特异性，是诊断流感病毒最具代表性的蛋白之一，也是研究最多的流感病毒蛋白之一。晶体结构显示NP多以三聚体形式存在，其单体能自联形成较大的寡聚体复合物。单体呈新月形，可分为三部分：头部（残基150-272、438-452）、躯干部（残基21-149、273-396、453-489）和一个灵活的尾环（残基402-428）。可见头部和躯干部由非连续的多肽链组成[15,16]。有研究指出NP抗原表位是以多聚体形式发挥作用的，体内自然形成和体外复性形成的NP蛋白的抗原表位是依赖于内在NP单体的相互作用和NP-NP之间相互作用以影响流感病毒NP聚合物的抗原结构[13]。NP是CTL反应的主要靶抗原，能诱导机体产生细胞免疫，并且具有种间交叉的免疫保护，不受表面结构蛋白亚型的影响[17]。NP承载多种生物学特性，其中最重要的是影响流感病毒的复制与增殖。NP与病毒7 浙江省医学科学院硕士学位论文组RNA及病毒聚合酶的3个亚单位PB1、PB2、PA相连，参与RNA的复制与转录，从而影响病毒的复制与增殖。有研究证实，NP至少有3个互相重叠的抗原区，其中一个区在各型流感病毒中均存在。针对这一区的抗体可抑制病毒转录[18]，说明NP在RNA到mRNA转录过程中起着开关作用。Mandler发现如果在NP的高度保守区发生了单个氨基酸的替换，病毒可繁殖成完整病毒粒子，但缺乏感染性。在病毒生活周期中，NP的功能可能是通过许多相互作用来介导的。能与基因组RNA构成核糖核蛋白颗粒复合体，稳定RNA免受RNase作用。NP除了能结合聚合酶PB1和PB2及基质蛋白M1，至少还能与4种细胞多肽相互作用,输入素α类细胞核输入受体、丝状F肌动蛋白、细胞核输出受体CRM1和DEAD-box解旋酶BAT1/UAP56,而且酵母杂交文库筛选实验表明这些多肽只是其中一部分[19]。同时，NP与流感病毒宿主特异性相关。Scholtissek等[20]通过系统发生分析NP基因结构表明，所有能够感染哺乳动物的流感病毒都间接或直接源于AIV，NP在宿主的变化中起了决定性作用。NP需要穿梭于细胞核与细胞质完成其生物学功能，这种特性依赖于核定位信号。目前认为NP含有三个核定位信号（NLS）：一个是非传统的NLS（残基3—13），另一个是位于核蛋白RNA结合槽二联的NLS（残基198—216），第三个NLS（残基320—400）是研究者通过NLS删除实验获得。研究显示，去除非传统的NLS将引起细胞浆中的NP蛋白明显聚集，从而影响病毒RNA转录，而缺失NLS2的甲型流感病毒则无法传代。可见NLS对核蛋白的核输入以及核糖核蛋白体的形成起关键作用[21,22]。有研究者认为NP还包含一个核聚集信号（NAS，残基327—345），是个保守序列[15]，作用是维持NP在细胞核聚集[23]。目前对NP的研究主要集中于机体免疫应答分子机制、抗体及快速诊断、通用疫苗与新型疫苗、新型药物靶点研究几个方面。本研究的研究方向主要为抗体制备以期为流感快速诊断试剂和提供基础材料，对抗体进行其他应用方面的探索。3、本研究主要实验原理本研究的主要内容为制备NP抗原、制备单克隆抗体、以及单克隆抗体的初步应用。主要运用ELISA、Western-blot、细胞荧光免疫等基于抗原抗体反应的实验方法，利用抗原与抗体特异性结合的原理，以检测目的蛋白及单克隆抗体。（1）ELISA的原理8 浙江省医学科学院硕士学位论文1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于抗体定量测定的文章，标志1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。ELISA发展至今具有多种分类且作用倾向各不相同，如双抗夹心ELISA常用于检测大分子抗原；间接法ELISA常用于检测抗体；竞争性ELISA检测小分子抗原等。但具有相同的基本原理：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。（2）Western-blot的原理蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（GeorgeStark）。在尼尔·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析生物化学》（AnalyticalBiochemistry）中首次被称为WesternBlot。WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。（3）细胞免疫组化的原理细胞免疫组化即免疫组化技术在细胞上的运用。本文主要利用免疫荧光细胞化学技术和免疫酶细胞化学技术，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。9 浙江省医学科学院硕士学位论文4、研究目的和意义本研究对甲型流感病毒NP蛋白进行B细胞表位预测分析，构建原核表达质粒pET-28a-NP。转化大肠杆菌表达菌，通过诱导培养，得到NP融合蛋白，并进行镍柱亲和层析法纯化，获得纯化NP蛋白。以纯化蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠，通过细胞杂交制备杂交瘤细胞，通过筛选获得可以稳定产生抗NP抗体的杂交瘤细胞。通过注射腹腔得到单抗腹水，纯化后得到5株抗NP单克隆抗体。通过特异性结合鉴定，得知5株抗体均对免疫抗原具有特异性结合能力，同时能与某些亚型流感病毒的NP特异性结合。由此推断所得抗NP单克隆抗体可以为流感病毒快速诊断试剂盒及双抗夹心法流感病毒亚型快速诊断试剂盒提供基础材料。同时，抗NP抗体可以追踪细胞内NP蛋白的位置，进行NP蛋白的细胞亚定位，为NP蛋白与宿主相互作用的基础研究提供实验材料，例如可以利用抗体进行免疫共沉淀等进行蛋白相互作用的实验。另外，此抗体还可作为胞内抗流感病毒的研究的材料，将特殊纳米矿物材料包裹于抗体周围以逃避机体免疫系统，直接进入靶细胞中和病毒，以期在流感病毒的防治中发挥作用[24-26]。期望通过后续探索，继续扩展抗NP单克隆抗体在科学研究中的应用。10 浙江省医学科学院硕士学位论文第一章NP的B细胞表位预测分析B细胞表位是可以被B细胞表面受体或抗体特异性识别并相互结合的片段。B细胞在体液免疫的过程中产生可以特异性结合抗原表位的抗体。甲型流感病毒NP是高度保守的蛋白，具有型特异性。对NP进行B细胞表位预测，有可能得到针对流感病毒的广谱表位，对流感病毒的诊断与治疗具有积极意义。本研究通过Protean软件，对甲型流感病毒NP氨基酸序列进行B细胞表位预测。通过分析比较蛋白二级结构、蛋白亲水性、蛋白柔韧性、表面可及性和抗原性5个参数，得到NP的潜在B细胞优势表位，为今后NP蛋白生物学特性及单克隆抗体制备提供理论基础。第一节材料与方法1.NP氨基酸序列NP序列来自GeneBank公布的NP核苷酸序列（基因登录号：CY148246.1），通过BLAST翻译为氨基酸序列。2.NP蛋白二级结构预测蛋白质二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角。其中，α-螺旋、β-折叠结构规则且不易变形，难以与抗体结合，一般不能形成抗原表位。而β-转角为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，有利于与抗体结合，较可能成为抗原表位。含有5个以上的氨基酸残基的转角又常称为环。以往的研究表明，蛋白表面的loop区可能为功能性抗体的识别位点，特异性好，可及性强。还有一些无规则卷曲结构较松散，容易发生扭曲等形变，多出现于蛋白质抗原表位，易于与抗体结合，包含抗原表位的几率较大。因此，蛋白质的二级结构与抗原表位有重要的联系。此处采用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法对NP二级结构进行预测。前者通过计算特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性来分析NP蛋白的二级结构。后者通过氨基酸残基的晶体结构来预测二级结构。3.NP蛋白亲水性分析根据氨基酸的亲水性不同，可分为亲水性残基和疏水性残基两类。在机体内，疏水性残基一般被亲水性残基包裹于蛋白内部，而亲水性残基择暴露于蛋白表面。因此，11 浙江省医学科学院硕士学位论文亲水性残基常参与配体与受体的相互作用。因此，亲水部位与抗原表位密切相关。本文采用Kyte-Doolittle方法根据NP序列氨基酸组成比例，对NP的亲水区和疏水区进行预测。4.NP蛋白柔韧性分析蛋白的柔韧性是指蛋白的多肽链骨架具有一定程度的柔韧性。抗原与抗体结合是一个相互嵌合的过程，多肽链骨架的柔韧性有利于抗原表位与抗体以最佳的互补状态结合。活动性强的氨基酸残基位点易形成抗原表位。采用Karplus-Schulz方法对NP蛋白骨架区的柔韧性进行分析。5.NP蛋白可及性分析蛋白可及性是指抗原中氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性，反映了蛋白质抗原内、外各层残基的分布情况。抗原表位一般位于抗原表面，有利于抗原抗体结合。因此，蛋白表面可能性越高的氨基酸区段，越容易形成抗原表位。采用Emini方法对NP表面可能性进行分析。6.NP细胞抗原表位的预测分析蛋白某段氨基酸的抗原指数越大，提示该段氨基酸作为潜在抗原表位的可能性越大。通过Jameson-Wolf方法对NP抗原指数进行分析。结合上述多种蛋白结构的预测方法和抗原表位选择相关因素，综合分析NP蛋白B细胞的潜在优势抗原表位。第二节结果与分析1.NP氨基酸序列MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIWRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN12 浙江省医学科学院硕士学位论文经Editseq软件分析，此序列共498个氨基酸，相对分子量56.21kDa。其种包含70个强碱性氨基酸（K，R），58个酸性氨基酸（D，E），145个亲水性氨基酸（A，I，L，F，W，V），136个极性氨基酸（N，C，Q，S，T，Y）。等电点为9.32。2.NP二级结构预测通过Garnier-Robson方法预测流感病毒NP二级结构：结果如图1.1所示，较大的α螺旋区域主要位于第12-30、44-54、66-88、104-120、128-136、178-182、190-198、220-242、252-266、324-348、369-383、439-455、465-472、493-498；较大的β折叠区域主要位于第10-12、30-44、55-59、61-66、93-100、147-157、163-168、170-176、215-219、275-292、298-307、311-317、350-355、358-366、386-390、405-415、422-428、473-480；β转角的区域主要位于第144-146、158-159、206-207、209-213、271-274、295-296、308-310、391-394、403-404、420-421、435-436、484-486；无规则结构主要分布于第5-9、123-126、141-143、246-251、320-322、395-397、417-419、429-434、460-462、481-483、490-492。通过Chou-Fasman方法预测流感病毒二级结构：结果如图1.1所示，较大的α螺旋区域主要位于第18-27、69-75、105-123、176-181、188-200、213-245、251-265、328-349、370-374、379-382、424-429、441-451、494-498；较大的β折叠区域主要位于第32-46、54-56、61-68、96-100、130-139、149-158、182-199、214-218、239-243、297-301、311-316、350-352、363-365、387-390、406-409、414-417、473-476、487-489；β转角的区域主要位于第3-10、14-17、28-31、49-52、57-60、76-79、82-85、88-95、101-104、124-127、140-143、145-148、160-163、167-170、172-175、203-206、209-212、247-250、266-269、272-275、286-289、293-296、302-305、307-310、317-320、324-327、353-356、359-362、366-369、375-378、383-386、391-398、402-405、410-413、418-421、430-433、437-440、452-455、460-463、467-470、483-486、490-493。综合考虑两种NP二级结构预测方法的结果，第5-9、123-127、140-143、209-212、271-274、293-296、308-310、246-251、395-397、417-419、429-434、460-463、490-493、402-405、484-486这些区段，作为抗原表位的可能性较大。13 浙江省医学科学院硕士学位论文图1.1NP二级结构预测A：α螺旋区域；B：β折叠区域；T：转角区域；C：无规则卷曲3.NP亲水性分析采用Kyte-Doolittle法对NP的亲水性进行分析（图1.2），亲水性片段大致分布区域为：第0-25、48-57、71-105、113-131、141-154、158-162、170-178、198-220、230-254、289-296、315-328、351-361、363-405、412-421、430-443、449-459、480-498。这些区段暴露于表面的几率较大，作为抗原表位的可能性较大。图1.2NP的亲水性分析4.NP蛋白柔韧性分析采用Karplus-Schulz方法对NP蛋白的柔韧性片段进行分析，分析结果所示（图1.3），第5-24、47-61、72-96、99-103、112-117、122-130、143-152、157-161、168-177、199-204、208-215、227-231、241-251、308-311、317-327、348-362、367-383、390-406、408-411、430-442、450-456、467-472、482-486、491-495。这些位点的蛋白骨架柔韧性较高，有可能发生形变，与抗体结合。图1.3NP的柔韧性分析14 浙江省医学科学院硕士学位论文5.NP表面可及性分析运用Emini方法对NP蛋白表面进行可及性分析，结果显示（图1.4），第4-21、71-92、112-115、146-151、172-175、209-218、241-249、290-295、318-325、368-377、395-400、431-441、450-454、467-471、492-498。预测这些区域的蛋白容易与溶质分子接触，作为抗原表位的可能较大。图1.4NP的表面可及性分析6.NP蛋白抗原表位预测图1.5NP的抗原表位预测分析Jameson-Wolf方法显示（图1.5），抗原指数较高的区域有：第1-32、48-61、71-108、110-132、142-165、169-180、196-221、228-232、238-256、269-277、290-299、303-312、317-328、338-344、349-363、368-407、417-426、431-446、447-474、480-488、490-498。蛋白抗原表位的决定因素并不是单一的，受到蛋白二级结构、骨架柔韧性、与溶剂分子接触机会、亲水性等综合方面考虑。因此，虽然用Jameson-Wolf法推断抗原指数较高的蛋白质区域，但并不能就此作为NP蛋白抗原表位的结果，还需要结合上述影响，进行综合推断。结合亲水性分析、表面可及性分析、柔韧性分析、β转角和无规则卷曲区域以及抗原指数较高的蛋白区域，适当排除α螺旋、β螺旋区域，推测NP蛋白B细胞抗原表位潜在性较大的区域为：第5-10、88-93、124-127、203-216、241-252、291-296、318-326、367-370、396-399、418-422、481-487。15 浙江省医学科学院硕士学位论文第三节结论与讨论本研究利用生物信息学方法，结合蛋白二级结构预测、亲水性分析、表面可及性分析、骨架柔韧性分析以及抗原性分析，对NP蛋白的B细胞优势抗原表位进行分析预测。最终显示：NP蛋白上的第5-10、88-93、124-127、203-216、241-252、291-296、318-326、367-370、396-399、418-422、481-487这11个区段的氨基酸具有较大的B细胞抗原表位潜力。但是，由于B细胞表位的决定比较复杂，除与氨基酸序列相关以外，还与其修饰有关。由软件预测的抗原表位也许在实际情况中会受到翻译后蛋白修饰的影响，从而产生偏差。但总体来说，如果单靠实验方法寻找所需要的表位工作量巨大，利用信息学方法预测后，发现新表位的效率能够提高10-20倍，且减轻工作量，同时节约大量研究经费[27]。流感病毒NP蛋白是研究较多的蛋白，目前对于该蛋白抗原表位的研究多在T细胞表位，而B细胞表位研究鲜有报道。这对单克隆抗体的制备提供理论基础。抗原表位是指抗原分子上能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能够被识别的免疫活性区，一般为5-7个氨基酸残基，最多不超过30个残基。它必须具有一定的理化性质，除了分子量，化学成分外，最重要的就是分子构象和易接近性，抗原的分子构象发生的细微变化，就可能导致其抗原性发生明显变化。易接近性则指的是抗原分子表面的特殊化学基团与淋巴细胞表面的抗原受体相互接触的难易程度。同时还和抗原的物理性状有关，一般环状的比直链分子强，聚合态比单体分子强，颗粒性比可溶性强。有研究指出，流感病毒的NP抗原表位是以多聚体形式起作用的，体内自然形成和在体外复性形成的NP蛋白的抗原表位是依赖于内在NP单体的相互作用和NP-NP之间相互作用以影响流感病毒NP聚合物的抗原结构[28]。B细胞抗原表位一般为构象表位，少数为线性表位，大小不一。构成B细胞抗原决定簇的氨基酸或多糖必须形成严格的空间构象，才能与B细胞表面受体或抗体分子的高变区相互识别、接触。若蛋白的折叠或糖链的修饰不正确，则抗原不能形成正常的三维结构，B细胞抗原决定簇功能丧失。并且，抗原变性后也可能产生新的抗原。因此，如果在蛋白表达的过程中抗原没有完全复性或是错误折叠，则有可能导致后续制备的抗体无效或针对非自然表位。研究流感病毒的抗原表位，可以清楚了解流感病毒与宿主的相互作用及免疫系统16 浙江省医学科学院硕士学位论文反应。流感病毒NP蛋白具有高度保守性，研究保守性抗原表位，对人流感和禽流感交叉感染方面的研究有很大帮助；如果应用于治疗，可以避免一些使用全病毒造成的交叉效应[29]；获得抗原表位后，利用化学方法合成，可作为流感病毒的检测探针。本研究通过DNAStar中的protean软件，对NP蛋白的二级结构与多种特性进行分析，综合预测B细胞表位，对NP蛋白的单克隆抗体制备提供理论基础，为后续鉴定抗体所针对的抗原表位提供理论支持。17 浙江省医学科学院硕士学位论文第二章甲型流感病毒NP蛋白的原核表达甲型流感病毒基因组由8个分节段的RNA片段组成，其中第五片段基因编码NP蛋白，大小为498个氨基酸残基。NP是流感病毒的重要结构蛋白，约占病毒颗粒的25%。NP蛋白在不同亚型的甲流病毒中高度保守，差异性不超过11%[28]，具有种群和型特异性，是诊断流感病毒最具代表性的蛋白之一。目前对NP蛋白的研究主要集中在宿主适应性免疫反应、疫苗应用及新型药物靶点的探索。本实验利用已有的反向基因操作质粒扩增NP基因，并将其与原核表达载体pET-28a(+)进行连接。通过PCR和双酶切以及测序鉴定后，将pET-28a-NP重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达NP蛋白。采用镍柱亲和层析法，获得纯化NP蛋白，为其功能和应用方面的研究，以及制备抗NP抗体提供材料。第一节材料与方法1.菌株和质粒DH5α大肠杆菌感受态细胞购自Takara公司，大肠杆菌菌株BL21(DE3)购自康为世纪，原核表达载体pET-28a(+)由本实验室保存。2.主要仪器超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；PCR仪（AppliedBiosystems）；可见/紫外分光光度计（Biochrom）；蛋白电泳仪，核酸电泳仪（JUNYI）；小型高速离心机（Eppendorf）；低温高速离心机（Kubota）；电子分析天平（Sartorius）；移液枪（Gilson）；精密移液器（Fisherbrand）；-80℃低温冰箱（Thermo）；普通倒置显微镜（宁波舜宇仪器有限公司）；凝胶图像分析系统（上海培清科技有限公司）；隔水式恒温培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；电热恒温水槽，脱色摇床（常州诺基仪器有限公司）；显微恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机有限公司）；酶标检测仪（KHBST-360）。3.试剂限制性内切酶、DNAMarker购自TaKaRa公司；蛋白质分子量Marker、HisPur™Ni-NTASpinColumns蛋白纯化试剂盒购自Thermoscientific；蛋白胨和酵母粉购自OXOID公司；PVDF膜购自Millipore公司；其它常规试剂均由国内生产；引物和测18 浙江省医学科学院硕士学位论文序委托上海铂尚生物有限公司合成和完成。4.构建原核表达质粒pET-28a-NP4.1引物设计与合成以A/PuertoRico/8/1934(H1N1)(PR8)的NP基因（登录号：CY148246.1）为参考序列，结合pET-28a(+)原核表达质粒多克隆位点，设计NP基因特异性引物。选取EcoRI和SalI作为酶切位点，以GC重复作为保护碱基，根据引物设计原则进行引物设计。4.2目的基因扩增以pPolI/II-PR8-NP反向操作质粒为模板，进行PCR扩增。如表2.1所示PCR反应体系，在50µl反应体系中，用pPolI/II-PR8-NP（1µl，10ng）为扩增模板，上、下游引物（20µM）2.5µl，2×TaqMaxtureMix25µl，ddH2O补至50µl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃终延伸7min。表2.1NP目的片段PCR反应体系NP目的片段PCR50µl2×TaqMaxtureMix25µl上游引物2.5µl下游引物2.5µl模板pPolI/II-PR8-NP1µlddH2O19µl4.3NP目的片段与原核表达载体的双酶切与鉴定（EcoRI和SalI）如表2.2和表2.3所示，将NP片段PCR产物与原核表达载体pET-28a(+)分别以EcoRI和SalI两种限制性内切酶进行酶切反应。表2.2NP目的片段双酶切反应体系NP目的片段双酶切50µl10×HBuffer5µlEcoRI(12U/µl)2.5µlSalI(12U/µl)2.5µlNP目的片段40µl反应条件：组分混匀后，置于37℃水浴中酶切4h。4h后各取10µl于1%琼脂糖19 浙江省医学科学院硕士学位论文凝胶中进行琼脂糖凝胶电泳，120V恒压电泳30min，鉴定双酶切产物。表2.3pET28a(+)载体双酶切反应体系pET28a(+)载体双酶切50ul10×HBuffer5µlEcoRI(12U/µl)2.5µlSalI(12U/µl)2.5µlpET28a(+)1µl4.4NP目的片段与原核表达载体的连接反应与鉴定经过双酶切的NP目的片段与同样经过双酶切的pET-28a(+)质粒以摩尔比10:1混合，并加入DNA连接酶进行连接反应（表2.4）。反应条件：轻轻混匀后，16℃连接30min后4℃连接过夜。随后取样转化。表2.4连接反应体系连接体系10µlpET-28a(+)3µlNP目的片段2µlSolutionI5µl4.5连接产物转化克隆菌将2µl连接产物加入20µlDH5α感受态细胞溶液中，轻轻吹打混匀，冰浴20min。随后将混合物置于42℃水浴热激90s，之后立即冰浴2min。向混合物中加入200µl无抗液体LB培养基，于37℃下150rpm振荡培养60min使菌体复苏。于超净工作台中将100µl转化菌液加入卡那霉素抗性的LB琼脂平板上（终浓度50µg/mlkan+），用无菌金属涂布器涂匀，将平板倒扣于37℃培养12-16h直至出现转化菌落。4.6质粒提取及重组质粒鉴定表2.5目的片段双酶切鉴定反应体系NP双酶切鉴定20µl10×HBuffer2µlEcoRI(12U/µl)1µlSalI(12U/µl)1µlNP目的片段16µl20 浙江省医学科学院硕士学位论文从LB平板上挑取6个单个转化菌落，接种至5ml（含50µg/mlkan+）液体LB培养基中，37℃培养过夜。取1ml根据康为无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒，溶于50µlEB中，-20℃保存。对提取的重组质粒分别进行双酶切(EcoRI和SalI)鉴定，反应体系见表2.5。同时，对重组质粒进行PCR鉴定，反应体系见表2.6。双酶切反应条件：37℃水浴4h。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，共25个循环；72℃终延伸7min。各取样5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测。120V电泳30min。确认阳性后将阳性质粒委托上海博尚公司测序。表2.6重组质粒PCR鉴定反应体系重组质粒PCR鉴定50µl2×TaqMaxtureMix25µl上游引物2µl下游引物2µlpET28a(+)-NP1µlddH2O20µl5.重组NP蛋白表达5.1重组质粒转化表达菌在冰水混合物中将3µl测序正确的质粒转化入20µl感受态细胞BL21中，冰浴20min，42℃热激45s，立刻冰浴2min。将混合物中加入200µl无抗液体LB培养基，于37℃下150rpm振荡60min，全部接种于卡那抗性的LB培养基中，37℃下200rpm振荡培养过夜。次日按1:100的稀释度将上述表达菌液接种于20ml卡那抗性的LB培养基中。37℃下200rpm振荡培养至OD600=0.4-1（约3h）。5.2NP蛋白小量诱导表达表达菌在振荡培养下至OD600=0.8时，对NP蛋白进行小量诱导表达。首先取1ml菌液作为对照（0h）。将剩余菌液等量分为两管，加入IPTG（终浓度1mM）分别于28℃和37℃中恒温振荡培养。分别于振荡培养2h、3h、4h、5h、6h时间点取样1ml菌液，立即10000rpm离心5min，沉淀以30µl蛋白裂解缓冲液裂解，煮沸5min，10000rpm离心2min，放4℃备用。待所有样品收集完毕各取10µl进行SDS-PAGE电泳分析，恒压160V电泳50min。21 浙江省医学科学院硕士学位论文在确认诱导温度后，进一步探索IPTG浓度对蛋白诱导效率的影响。将20ml表达菌振荡培养至OD600=0.8时，取1ml菌液作为对照（0h）。将剩余菌液根据加入IPTG的终浓度分为四管，分别为0.5mM、1mM、1.5mM、2mM。分别于4h、6h、8h时间点取样1ml，样品处理和后续跑胶步骤同上。5.3NP蛋白大量诱导表达将过夜活化的转化表达菌以1:500体积比接种于500ml卡那抗性的液体LB培养基中。37℃200rpm恒温振荡培养4h至OD600=0.8时，取1ml未诱导菌液留样，而后加入250µl浓度为1M的IPTG（终浓度0.5mM），37℃200rpm继续培养8h。培养结束，取1ml诱导菌液留样，5000rpm离心5min收集剩余菌体于4个50ml离心管中。沉淀以40mlPBS悬浮，5000rpm离心5min，收集沉淀。分别记录离心管净重与收集菌体后的重量，计算菌体质量，-80℃冻存待用。将样品进行SDS-PAGE，160V电泳50min。5.4NP蛋白纯化浓缩确认NP蛋白所在组分。取一管沉淀菌体超声破碎。以18ml浓度为20mM的PBS溶液重悬。将离心管置于冰水混合物中，400W功率下超声30min（工作4s，间隔6s），超声后菌液澄清些许，10000g离心15min，分别收集18ml上清和沉淀（包涵体蛋白）。上清取样后放置4℃备用，沉淀以10ml含6M盐酸胍的平衡缓冲液溶解，放置37℃水浴30min使沉淀充分溶解于缓冲液中，取样。10000g离心15min，收集上清10ml，取样，经0.4µm筛板过滤，待过柱。将上述取样按比例进行SDS-PAGE，160V电泳50min。其中含有盐酸胍的样品需去除盐酸胍后上样。步骤为：加入9倍于样品体积的冰乙醇，-20℃放置30min，14000rpm离心15min，沉淀加入500µl的90%冰乙醇，14000rpm离心10min。沉淀加入10µl1×SDSbuffer溶解，煮沸5min，10000rpm离心3min，4℃待用。柱平衡：将镍凝胶轻晃混匀，吸取2ml加入Thermo的凝胶管中，室温下静置直至凝胶沉淀，移除底盖让剩余液体自然滴净。缓慢加入2ml平衡液，静置5min，移除底盖滴净剩余液体。蛋白溶解液过柱：将16ml超声上清与16ml柱平衡缓冲液混合，分次将混合液加入镍柱中，室温下轻摇30min后静置5min，待凝胶沉落收集流穿液。重复8次，直至所有混合液都加入镍柱中，共收集32ml流穿液，取样。轻轻向镍柱中加入2mlwashbuffer，室温静置5min，收集杂蛋白液，重复3次，共收集622 浙江省医学科学院硕士学位论文ml杂蛋白液，取样。向镍柱中加入2mlelutionbuffer，室温静置5min，收集洗脱液2ml，重复6次，依次得到洗脱液1-6号，各2ml，取样。将取样的各组分进行去盐酸胍处理后，上样，进行SDS-PAGE电泳分析。根据电泳条带，将目的蛋白浓度大且杂蛋白少的洗脱液进行蛋白浓缩。将蛋白液加入透析袋，上下分别用封口夹夹紧，以PEG20000包裹，置于4℃冰箱中。过程中关注蛋白液情况，防止蛋白因浓度过大而析出。待浓缩至目标体积，终止包埋。用1ml移液枪将蛋白液吸出，记录体积，检测目的蛋白浓度，计算获得目的蛋白的总量。6.重组NP蛋白鉴定6.1重组NP蛋白的Western鉴定在纯化后的NP蛋白加入5×SDSBuffer，煮沸5min，以0.5µg/孔上样，10%浓度的SDS-PAGE电泳50min。电泳结束后，将凝胶取出，于转移缓冲液中平衡。依次将PVDF膜进入甲醇10s，去离子水5min，最后置于转移缓冲液中。转移槽安装次序：从负极到正极依次为黑孔板、纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、纤维垫、红孔板。装入前用1ml枪头用滚压的方式赶走气泡。80mA转膜2h，期间将整个转移槽置于冰水中。转膜结束后，将PVDF膜用镊子小心取出，置于5%脱脂奶粉的PBS封闭液中封闭1h。封闭结束后，将转印膜置于1:1000的抗His鼠多抗，室温下摇床孵育2h。以PBS洗涤转印膜3次，每次5min。加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体，室温摇床孵育2h。PBS洗涤5次，每次5min。将膜置于四氯萘酚显色液中显色，待条带显出，用水终止显色。观察并拍照。6.2重组NP蛋白的ELISA鉴定于前一晚将纯化的NP蛋白以1µg/孔起始，5倍倍比稀释至1×5-8µg/孔进行过夜包被，包被液50µl/孔。次日早晨去除剩余液体，0.5‰的PBST洗涤3次，每次1min。加入1:1000以PBS稀释的抗His鼠抗，50µl/孔。37℃作用2h。弃去抗体液，0.5‰的PBST洗涤3次，每次1min。加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体，50µl/孔，37℃作用2h。弃去剩余抗体，0.5‰的PBST洗涤3次，每次1min，将剩余液体轻轻扣干。TMB显色试剂盒显色，于37℃避光作用20min后，加入50µl/孔0.25M的H2SO4终止，混匀后立即检测OD450。以无NP蛋白包被的作为阴性对照组，所有处理组均设3个复孔，数据取均值。23 浙江省医学科学院硕士学位论文第二节结果与分析1.引物设计根据A/PuertoRico/8/1934(H1N1)（PR8）的NP基因（登录号：CY148246.1），结合pET28a原核表达载体多克隆位点，设计NP基因特异性引物（表2.7）。选用EcoRI和SalI作为酶切位点，根据引物设计原则设计引物如下。表2.7PCR上下游引物设计引物序列上游引物GCGCGCGAATTCAGTCTTCTAACCGAG下游引物GCGCGTCGACCTTGAATCGTTGCATCTG2.目的基因扩增以构建好的pPolI/II-PR8-NP反向操作质粒为模板扩增NP基因，经琼脂糖凝胶电泳，结果如图2.1所示，NP基因大小约为1500bp，与预计大小相符。MkPCR产物20001500bp1000750500250100图2.1NP基因PCR产物3.pET-28a-NP质粒构建与表达将目的片段NP的PCR产物同原核表达载体pET-28a(+)分别以EcoRI和SalI两种限制性内切酶酶切。后将两酶切产物进行DNA连接。连接转化克隆菌后，挑取克隆菌株培养鉴定，经酶切和PCR鉴定结果如图2.2。PCR结果为阳性，即在大小约为1500bp左右有目的条带，证明NP目的片段成功插入pET-28a(+)载体中。通过对重组质粒双酶切，确定质粒中的酶切产物中有一段为外来片段，大小约为1500bp，与NP24 浙江省医学科学院硕士学位论文目的片段相符。图2.2pET28a-NP重组质粒的PCR鉴定及双酶切鉴定M1：DL2000；1：重组质粒PCR鉴定；2：重组质粒EcoRI单酶切；3：重组质粒EcoRI和SalI双酶切；M2：DL150004.NP蛋白小量诱导表达条件的优化通过对NP小量诱导表达确定NP蛋白的最佳诱导条件，有效提高实验效率，减少试剂浪费。在28℃和37℃两个常用的诱导温度下，分别设置2h，3h，4h，5h，6h诱导时间点。结果如图2.3，可见在37℃的诱导温度下，有大小约60kD的蛋白条带，并随着诱导时间延长逐渐变浓，分子量大小与NP相符。相较之下，28℃下相应的蛋白条带较淡，提示蛋白诱导量不如37℃实验组高。因此，确定37℃为NP蛋白的诱导温度。图2.3NP蛋白诱导条件的探索（温度和时间）由图可知，37℃为最佳诱导温度，且蛋白量随诱导时间增加而上升，因此将诱导时间提升至8h，以观察蛋白诱导量变化。同时设置IPTG浓度梯度，以确认最佳IPTG25 浙江省医学科学院硕士学位论文诱导浓度。结果如图，IPTG浓度对NP蛋白的诱导量影响不大，但8h时间点比4h、6h所得目的蛋白量更多。因此选择37℃，IPTG浓度0.5mM，诱导8h为NP蛋白的诱导条件，进行后续大量NP表达。图2.4时间及IPTG梯度下的NP蛋白诱导5.NP蛋白可溶性分析取其中一管大量诱导的菌体超声破碎，分别对超声上清、超声沉淀取样进行SDS-PAGE。结果显示，NP在超声上清中和超声沉淀中均存在，NP在菌体内以可溶性和包涵体两种形式存在。两种形式各有优缺点，当目的蛋白处于可溶性状态时，蛋白处于自然构象，但缺点是杂蛋白多，纯化难度增大；当蛋白为包涵体时，杂蛋白较少，有利于蛋白纯化，但包涵体为蛋白无规则聚集的沉淀，为蛋白复性增加难度。图2.5重组蛋白NP可溶性分析1：未诱导对照；2：诱导全菌；3：超声上清；4：超声沉淀37℃30min后；5：超声沉淀离心后上清；6：超声沉淀滤液（上柱样品）6.NP蛋白镍柱纯化26 浙江省医学科学院硕士学位论文将含有6M盐酸胍的包涵体溶液按照镍柱包涵体纯化说明书进行操作。分别得到流穿液及洗脱液1-6。流穿液为上样蛋白液与柱结合后收集的液体，成分包含杂蛋白与部分目的蛋白。将结合与镍柱的蛋白洗脱下来的为洗脱液，成分主要应为目的蛋白。其中洗脱液分为6个成分，为分次洗脱，目的是探索目的蛋白在洗脱过程中的浓度和纯度变化。图2.6NP包涵体6M盐酸胍溶液过镍柱1：未诱导对照；2：诱导全菌；3：流穿液；4-9：洗脱液1-6根据图2.6所示，在流穿液中仍有大量未结合上镍柱的目的蛋白。洗脱液1-6的组分有所区别。洗脱液1和洗脱液2中能见少量目的蛋白以外的杂蛋白，而洗脱液1的目的蛋白含量很少，与柱中还存留杂蛋白洗涤液有关，洗脱液1起到了平衡柱溶液的作用。洗脱液2和洗脱液3中，目的蛋白浓度较大，其中洗脱液3已经未见明显的杂蛋白。洗脱液4-6中有少量目的蛋白，同时未见杂蛋白。图2.7目的蛋白包埋纯化1：未诱导对照；2：诱导全菌；3：NP(2，3洗脱峰浓缩)；4：NP(1，4-6洗脱峰浓缩)；5-8：BSA0.5µg，1µg，1.5µg，2µg按照洗脱液中的目的蛋白量多少，分别将洗脱液2-3混合进行包埋浓缩，将洗脱27 浙江省医学科学院硕士学位论文液1、洗脱液4-6混合进行包埋浓缩，与BSA一起进行SDS-PAGE，估算纯化的蛋白浓度及总量，结果见图2.7。根据条带2计算125ml菌液中NP蛋白总量约为3×50/12.5×125=1.5mg；根据条带3和条带4计算过柱纯化得到的NP蛋白总量约为1.5×1×750+0.5×1×160=1.2mg。本次NP蛋白纯化率为1.2/1.5×100%=80%。7.目的蛋白的Western-blot鉴定将纯化的NP取0.5µg上样，160V电泳50min后将蛋白转至PVDF膜。于抗His抗体结合后与HRP标记的羊抗鼠抗体结合，洗涤后对膜进行显色。结果所示（图2.8），在60kD左右出现一条明显条带，大小与预计的NP重组蛋白相符。在CBB染色下的相应大小也有明显条带，证实NP重组蛋白能与Anti-His抗鼠抗体发生特异性结合。NP原核表达系统构建成功，诱导和纯化得到目的蛋白NP。图2.8NP重组蛋白鉴定8.目的蛋白的ELISA鉴定利用间接ELISA法对目的蛋白NP进行鉴定。NP蛋白以1μg/孔起始，5倍稀释至1×5-8µg/孔进行过夜包被。在封闭、Anti-His鼠抗结合、酶标抗体结合后以TMB显色，测定OD450。结果如图2.9所示，前四个梯度OD值呈现高位平台，数值约2.5，而后开始下降，在第8，第9个梯度时OD值呈现低位平台，数值约0.5。结果说明，NP蛋白在第1-4个梯度时蛋白量饱和，Anti-His鼠抗始终结合饱和量的NP蛋白，因此OD值呈高数值平台；从第4个梯度开始，到第8个梯度，OD值呈现下降曲线，说明此时NP蛋白的稀释使Anti-His鼠抗的结合量减少；到第8-9个梯度，OD至呈现28 浙江省医学科学院硕士学位论文低数值平台，说明此时NP蛋白的稀释已经不影响OD值，突破了蛋白的最小检测浓度，此时的数值为抗体产生的本底。由此证实目的蛋白可以与Anti-His鼠抗结合，为NP重组蛋白，同时确定了NP重组蛋白的ELISA饱和包被量约为8ng/孔。OD450NP稀释倍数（-log5）图2.9NP重组蛋白的ELISA鉴定第三节结论与讨论甲型流感病毒核蛋白是高度保守性蛋白，具有种群和型的特异性，且甲乙两型的核蛋白相似度小于32%，常用于甲型流感病毒免疫诊断和新型流感病毒疫苗的研究开发。NP是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原，在抗异源亚型流感病毒感染中起重要作用。因此，核蛋白的免疫功能对于解决禽流感病毒感染的交叉保护具有现实意义。NP主要影响病毒增殖与复制，也常作为流感病毒药物作用靶点。特别是通过NP蛋白鉴别病毒感染和疫苗免疫方面的应用无论是对畜牧业还是人类的健康生活都具有积极意义，显示良好的应用价值。外源基因表达的方法主要有真核表达、原核表达、表面噬菌体展示技术等，在外源蛋白表达方面各有优缺点。同时，大肠杆菌李莎[30]通过PCR法扩增NP基因，并通过原核表达载体pET-32a(+)成功表达了NP蛋白。李艳[31]等通过RT-PCR法获得NP基因，将其克隆至pMD18-TSimpleVector中构建pMD18-T/NP质粒，双酶切pMD18-T/NP与p-fast后，连接构建真核表达载体p-fast-NP，转化DH10Bac细胞，转座构建杆状病毒NP-Bacmid，经酶切及测序鉴定后将NP-Bacmid转染到sf9细胞中，通过免疫印迹法鉴定NP蛋白的表达，采用亲和层析法纯化NP蛋白。王新卫[32]等人利用PCR技术扩增NP片段，将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C末端获得29 浙江省医学科学院硕士学位论文重组质粒pR-np，以此重组载体转化大肠杆菌Escherichiacoli2(E2)，用溶菌酶缺陷噬菌体T4-z1感染重组E2菌，重组载体与缺陷噬菌体T4-z1基因发生同源重组，将np基因整合到噬菌体基因组中，用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-z1-np。鉴定表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。本实验采用常用的原核表达载体pET-28a(+)，成功构建出携带NP基因的原核蛋白表达载体pET-28a-NP。经过多次摸索，最后将37℃，IPTG浓度0.5mM，诱导8h定为NP蛋白的最佳诱导条件，使得NP蛋白成功在BL21(DE3)中高效表达。其中诱导时间进一步增长有可能继续增加NP蛋白的诱导量，但从实验安排考虑，没有继续进行更长时间梯度的NP诱导情况摸索。经过Ni-AgroseHis标签蛋白纯化试剂盒步骤纯化，得到纯度较高的NP蛋白。成功表达和纯化NP蛋白，为进一步研究NP蛋白及抗NP单克隆抗体的制备提供基础材料。利用原核表达系统生产的抗原其反应原性一般不会丧失，可以直接用于病毒感染的检测，而且所表达的蛋白一般都融合了一定的标签以方便蛋白的纯化。同时，原核表达体系易于生长和控制、用于细菌培养的材料较经济、大肠杆菌菌株类型多且具有各种与之匹配的质粒可供选择。一般来说，可溶性蛋白的结构与自然状态下相同；包涵体是由于蛋白无规则聚集产生的沉淀。形成的原因主要有：1）表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。2）重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。3）重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。4）重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，易形成包涵体沉淀。本实验中，NP在大肠杆菌中的表达以两种形式存在：可溶性蛋白和包涵体。其中，NP以可溶性蛋白存在于超声上清液中，但杂带较多，不利于纯化，且容易受到蛋白水解酶对表达产物的降解。NP以包涵体形式存在于超声沉淀中，需要用变性剂溶解后方可进行镍柱纯化。复性对于蛋白能否恢复自然结构的影响较大。但包涵体中杂带少，有利于蛋白纯化，且表达蛋白不易受到蛋白水解酶降解。权衡之下采用包涵体过柱纯化NP蛋白，效果显著。30 浙江省医学科学院硕士学位论文第三章抗NP单克隆抗体的制备单克隆抗体是单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。单克隆抗体具有特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。本实验应用纯化NP蛋白免疫Balb/c小鼠，通过细胞融合筛选得到能够持续、稳定分泌抗NP单克隆抗体的杂交瘤细胞，注射腹腔收集单克隆抗体腹水，纯化得到抗NP单克隆抗体。为今后进行NP蛋白检测及功能研究、甲型流感病毒检测试剂盒研发、流感病毒药物研发提供物质基础。第一节材料与方法1.细胞株、实验动物和病毒SP2/0骨髓瘤细胞和MDCK细胞为本实验室保存。Balb/c小鼠（6-8周龄，雄性，体重约20g）和杂交F1代小鼠（6-8周龄，雄性）由浙江省实验动物中心提供，饲养于清洁级环境。A/PuertoRico/8/1934(H1N1（)简称PR8病毒），A/Memphis/1/1971(H3N2)（简称Memphis病毒），A/Aichi/2/1968(H3N2)（简称Aichi病毒）为本实验室保存。2.试剂弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；HRP标记的羊抗鼠IgG、TMB显色液购自康为世纪有限公司；预染蛋白Marker购自Thermoscientific公司。ELISA酶标板购自JETBIOFIL，DMEM（Hyclone），非必需氨基酸、HT原液（100×）、HAT原液（50×）、青霉素-链霉素（50×）购自Invitrogen公司；胎牛血清购自PAA公司；聚乙二醇（PEG1500）购自Roche公司。3.抗原乳化本次实验的抗原乳化采用注射器抽拉法，借助三通管和针筒，分次将抗原溶液与免疫佐剂吹打混匀。首次免疫时，用一只1ml针筒吸取弗氏完全佐剂100µl；另一针筒分3次吸取0.5µg/µl的纯化NP溶液100µl。每一次吹打10min左右，待乳化完31 浙江省医学科学院硕士学位论文全，再加入吸取新的蛋白溶液，继续吹打乳化，直至100µl蛋白液全部乳化完毕。全过程尽量不吹入空气。吹打完毕，将乳化液在4℃冰箱放置一晚，若第二天没有出现分层，则乳化液可以直接用于免疫动物。如果第二天出现分层，表示没有乳化完全，继续吹打乳化。在后续免疫时，与NP蛋白液混合的是等体积的弗氏不完全佐剂，同时NP蛋白液的浓度为1µg/µl。4.动物免疫本实验制备单克隆抗体，免疫动物为Balb/c小鼠。采用5点皮下注射法，分别为腹股沟2点、腋下2点以及后颈1点。共免疫4次，前三次间隔时间2周。首次免疫时每只抗原量50µg，200µl乳化液均匀注射在5点皮下。剩余3次免疫体积不变，抗原量提升至100µg/只。免疫3次后，需要检测小鼠体内的抗体生产情况，以确认是否可以进行后续杂交瘤融合。在第3次免疫完成后的第10天，分别从免疫小鼠和正常小鼠的尾静脉采血10µl，加入90µlPBS溶液中，3000rpm离心10min后分离血清，用于间接ELISA法检测血清中抗体的效价。用包被液将NP蛋白稀释至10µg/ml，50µl/孔包被酶标板，4℃过夜。次日吸弃剩余蛋白液，以2%BSA的PBST溶液封闭1h，50µl/孔。0.5‰的PBST洗涤三次，每次1min。取已经分离的小鼠血清1:100稀释为初始浓度，稀释液为0.5%BSA的PBST溶液，50µl/孔。37℃下作用1h。PBST洗涤3次，加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体，37℃下作用1h。PBST洗涤5次后，加入100µl/孔的TMB显色也，37℃下避光显色20min，加入0.25M的H2SO4终止，阳性反应呈现橘黄色。阴性实验组为无NP蛋白包被。反应结束后，于450nm波长测定各反应孔的OD值，取效价最高的小鼠脾脏进行后续杂交瘤制备实验。5.杂交瘤细胞制备进行细胞融合的前一天，首先准备饲养层细胞，能够给杂交瘤细胞的生长提供有利环境。一只健康Balb/c小鼠颈部放血处死，于75%酒精中浸泡消毒。于超净工作台内取小鼠脾脏。准备40ml20%FBS含有双抗的DMEM培养液，放入小鼠脾脏，针筒的针刺入脾脏，反复吹打，将脾细胞散至培养液中。吹打混匀，加入4块96孔板中，100µl/孔，细胞培养箱培养过夜。第二天上午，将小鼠尾血检测效价最高的小鼠处死，同昨日取脾细胞。将6瓶长满25cm2细胞瓶的SP2/0吹打收集，加入无血清的DMEM双抗培养液混匀，1000rpm离心8min，完毕后倒尽废液，重复洗涤三次。完成后，细胞置于37℃水浴中，将SP2/032 浙江省医学科学院硕士学位论文与小鼠脾细胞按照4-6:1混匀，于1min内加完1mlPEG1500，混匀30s后；加入1ml无血清的双抗DMEM，1min内加入；加入2ml双抗DMEM，2min内加入；加入7ml双抗DMEM，3min内加入；加入10ml双抗DMEM，5min左右加入，从开始加PEG1500至培养液加完，整个过程控制在10min左右。且无FBS的双抗DMEM事先进行37℃预热。将细胞1000rpm离心8min，取细胞加入40ml20%FBS的双抗DMEM40ml，吹打混匀。将细胞加入昨日的饲养层细胞，100µl/孔。下午观察细胞，加入3×HAT100µl/孔，培养过夜。一周内观察细胞，视生长状况以HAT培养基进行半量换液。细胞融合一周后，更换HT选择培养液进行培养。细胞融合8-10天后，当融合细胞覆盖底孔20%-30%时，采用间接ELISA法对杂交瘤细胞培养液上清进行效价测定，择OD值较高的阳性孔进行细胞克隆。准备好已铺饲养层细胞的96孔板，将杂交瘤细胞轻轻吹散均匀，用红细胞计数板计数，取50个杂交瘤细胞，用5mlDMEM完全培养基稀释后，100µl/孔加入饲养细胞培养板中，待细胞团长至40%-70%，再重复克隆过程。3个克隆后，可用10%FBS的双抗DMEM培养基进行半量换液培养，继而扩大培养。6.抗NP单克隆抗体制备单克隆抗体腹水制备：选取效价较高5株杂交瘤细胞进行细胞扩大培养。同时，向20只杂交F1小鼠腹腔内注射0.5ml石蜡，创造炎症环境。7天后，分别将5株杂交瘤细胞进行收集。吹打细胞，将粘附与培养皿底面的细胞吹起，细胞培养液转移至15ml离心管中，1000rpm离心3min，弃上清，向沉淀细胞中加入3mlPBS溶液，1000rpm离心3min，弃上清。向细胞中加入1mlPBS，并用细胞计数板进行细胞计数，将细胞液用PBS稀释至1.25-2.5×107个/ml，每只小鼠注射0.2ml，控制细胞数量在2.5-5×106个/只。7-10天可见小鼠腹部明显膨大，届时处死小鼠，剪开腹部收集腹水。腹水于4℃5000rpm离心10min，弃上清油层和底部的红细胞，取中间黄色澄清部分液体，即为含有单克隆抗体的腹水。7.抗NP单克隆抗体纯化单克隆抗体纯化主要运用辛酸-饱和硫酸铵盐析沉淀法及单独的饱和硫酸铵盐析沉淀法。两者的区别在于前者在硫酸铵沉淀法之前增加一步辛酸纯化法，目的是增加抗体纯度，但只适用于IgG类型抗体。辛酸纯化法将腹水和乙酸缓冲液以1:2体积比33 浙江省医学科学院硕士学位论文混合，置于冰水混合物中进行磁力搅拌，边搅边加入正辛酸（500ml腹水对应17ml正辛酸），搅拌30min后，10000rpm离心20min，收集上清液。滤纸过滤后装入透析袋在4℃下进行透析，透析液为pH7.4，0.01M的PBS溶液，30min更换一次，第三次透析过夜，第二天将溶液进行饱和硫酸铵沉淀法纯化。饱和硫酸铵沉淀法：先取2mL单抗腹水，将其与等量的PBS混合，再缓慢加入4mL饱和硫酸铵，使硫酸铵终浓度为50%，边加边搅拌，在4℃下放置30min。4℃下10000rpm离心30min后，弃去上清，加入2.2mlPBS重悬沉淀，然后再加入1.8mL饱和硫酸铵，使硫酸铵终浓度为45%，边加边搅拌，在4℃下放置30min。10000rpm离心30min后，弃上清，向沉淀中加入1mlPBS，将其充分溶解，即为粗提的的单克隆抗体。8.抗NP单克隆抗体标记HRP用过碘酸钠法对5株抗NP单克隆抗体分别标记。抗体标记HRP首先活化HRP。将1.8mlNaIO4与1.8mlHRP混匀，4℃避光放置半小时，加入1.8ml乙二醇，继续4℃避光半小时。随后进行HRP标记。取各株抗体各2mg，加入0.6mg活化液，装入透析袋中，置于CBS（碳酸缓冲液）中4℃过夜透析，取出液体，加入80µlNaBH4，置于4℃下2h，半小时搅拌一次。将液体加入透析袋，PBS中4℃过夜透析，换液2次。然后进行饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体，即得到HRP标记的单克隆抗体。9.单克隆抗体检测9.1单克隆抗体的Western-blot鉴定对纯化后的NP蛋白进行SDS-PAGE，每孔0.5µg上样，80V湿转150min将蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1h后，分别与1:500稀释的纯化的5株抗NP单克隆抗体室温结合2h，用PBS洗涤3遍后加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体，室温作用2h。PBS洗涤5遍以后，配制四氯萘酚显色液对蛋白膜显色，出现条带后将膜放入去离子水中终止显色。9.2间接ELISA法抗体效价检测应用间接ELISA法对纯化后的5株单抗进行效价检测。NP蛋白以饱和浓度0.1µg/孔包被过夜。弃去蛋白液，用洗涤3次，5株单抗分别以1:100稀释度起始，10倍稀释设置8个梯度，与抗原于37℃下结合1h。弃去单抗溶液，洗涤后加入1:1000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃下作用1h。洗涤5次，将液体扣干后，每孔加入10034 浙江省医学科学院硕士学位论文µl的TMB显色，37℃20min后加入50µl0.25M的H2SO4终止。检测OD450。P/N值超过2.1的判定为阳性。第二节结果与分析1.单克隆抗体的Western-blot鉴定对筛选得到的5株杂交瘤细胞上清液进行Western-blot鉴定。10%的SDS-PAGE分离NP蛋白，PR8、Mempis、Aichi病毒，转印至PVDF膜，封闭后以离心取上清的5株杂交瘤细胞培液孵育，室温2h后洗涤，孵育HRP标记的羊抗鼠抗体，洗涤后四氯萘酚显色液显色。结果如图3.1显示，5株杂交瘤细胞上清均能与NP蛋白以及PR8、Memphis病毒的NP结合，但均未能与Aichi病毒的NP结合。说明5株杂交瘤细胞所产生的抗体可以与免疫抗原NP特异性结合，并且能够与部分甲型流感病毒如PR8、Memphis的NP特异性结合。图3.1杂交瘤细胞上清western-blot1：NP蛋白；2：PR8病毒；3：Memphis病毒；4：Aichi病毒2.单克隆抗体纯化图3.25株抗体腹水第一次纯化SDS-PAGE1-5：抗NPmAb-1~5第一次纯化；6-8：BSA0.4µg，0.8µg，1.2µg35 浙江省医学科学院硕士学位论文对获得的5株抗体腹水进行2次纯化。第一次纯化采用辛酸-饱和硫酸铵纯化法。将纯化后的抗体进行SDS-PAGE，结果如下。抗NPmAb-1~4腹水经过纯化后在50kD左右均有明显的抗体条带，但抗NPmAb-5在纯化后抗体条带不明显。推测前4株抗体的抗体类型为IgG，而第5株抗体的抗体类型不是IgG。第二次纯化采用饱和硫酸铵纯化法。结果3.3所示，抗NPmAb-1~5腹水经过纯化后，均有明显的抗体条带，其中抗NPmAb-5的条带比前四株抗体条带略高分子量略大，可能是抗体类型与前四株不同。图3.35株抗体第二次纯化SDS-PAGE1-5：抗NPmAb-1~5第二次纯化；6-10：BSA0.4µg，0.8µg，1.2µg，1.6µg，2µg3.单克隆抗体标记HRP及Wester-blot鉴定选择第2次纯化的抗体进行HRP标记。标记完成后，以0.5µg的NP蛋白进行SDS-PAGE，转膜后对5株HRP标记的单克隆抗体进行western-blot鉴定，以验证标记效果。结果如图3.4所示，5株HRP标记的单克隆抗体均能够特异性结合NP蛋白，且条带明显、单一，证实5株抗体均成功标记HRP。图3.45株酶标抗体的western-blot鉴定1-5：HRP标记的NPmAb-1~5作为抗体孵育蛋白膜36 浙江省医学科学院硕士学位论文4.纯化抗体效价检测利用间接ELISA法对第二次纯化的抗体进行效价检测。根据结果，5株抗体的阴性值分别为0.4806，0.4036，0.4126，0.3766，0.3936。以阴性对照组OD值的2.1倍为阳性判定值，得5株抗体的效价分别为1×106,1×104,1×106,1×106,1×105。说明5株抗体能够特异性结合NP蛋白，且效价较高。同时，从图中可以得到5株抗体对NP蛋白结合的饱和浓度，分别为105,102,105,105,104稀释，选用抗体的饱和浓度进行后续ELISA实验。OD450稀释倍数（-log10）图3.55株纯化抗体效价检测第三节结论与讨论本实验应用原核表达后纯化的NP蛋白作为免疫原，通过皮下多点注射法免疫Balb/c小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，筛选得到能稳定分泌抗NP单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞以2.5-5×106个/只的数量注入小鼠腹腔，待腹部隆起后取腹水，即单克隆抗体腹水。对抗体进行纯化，得到5株抗NP单克隆抗体。采用间接ELISA法分别对5株抗体进行效价测定，达到了106,104,106,106,105。通过Western-blot对单克隆抗体进行分析，提示5株单克隆抗体不仅能与免疫原NP蛋白特异性结合，还能与PR8、Memphis病毒中的NP发生特异性结合，却不与Aichi病毒发生特异性结合。可能是由于Aichi病毒的NP抗原表位需要在NP蛋白呈自然多聚体的状态下呈现。成功对5株单抗进行HRP标记，且标记后不影响抗体与抗原的特异性结合。在抗体制备领域，获得免疫原的方式除了本文展示的原核表达体系，另有真核表达体系、灭活病毒直接免疫、真核表达质粒直接肌注免疫以及较为前沿的噬菌体表面展示技术等[33-35]。相较于后者，本研究采用的原核表达体系优点在于：①原核体系蛋37 浙江省医学科学院硕士学位论文白诱导过程简单且蛋白表达量大，诱导的蛋白经过纯化复性可以基本恢复天然结构，确保抗原位点的准确性。②纯化后蛋白条带单一，纯化度高，以此为免疫原免疫动物增加了针对抗原的单抗获取概率，大大减小单克隆筛选部分的工作量。免疫是抗体制备的重要步骤。进行抗原免疫时，一般先将抗原与免疫佐剂进行乳化，而后再进行皮下注射。免疫佐剂的作用机制尚不完全清楚：①它可能增加抗原的表面面积，易为巨噬细胞所吞噬；②延长抗原在体内的存留期，增加与免疫细胞接触的机遇；③诱发抗原注射部位及其局部淋巴结的炎症反应，有利于刺激免疫细胞的增殖作用。弗氏不完全佐剂是由油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或Tween-80）混合而成，弗氏完全佐剂在弗氏不完全佐剂的基础上加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌（终浓度为2-20mg/ml），能够引起更强的免疫反应。所以通常完全佐剂只在初次免疫时使用，后续继续使用的话可能会由于免疫过强而导致动物死亡。细胞融合是抗体制备的关键步骤。细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有生物法用灭活的仙台病毒，化学法如用聚乙二醇和物理法如电脉冲，振动、离心、电激。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，可能是引起了细胞膜中磷脂的酰键及极性基团的结构重排。本实验成功制备抗NP单克隆抗体，为下一步建立甲型流感病毒快速检测和鉴别诊断方法、为NP蛋白功能研究及检测提供物质基础。38 浙江省医学科学院硕士学位论文第四章抗NP单克隆抗体的初步应用1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术，得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。目前生产的单抗大多是鼠源性，具有性质均一、特异性强、生产易标准化等优点，在科学研究、临床诊断与治疗等方面发挥着重要作用。本研究主要应用ELISA法和细胞免疫组化法对NP抗体进行扩展应用研究。ELISA法显示抗NP单克隆抗体可以特异性结合不同亚型的流感病毒。双抗夹心ELISA法相较于非夹心法有效缩短检测时间，且提高了检测敏感度。通过细胞免疫组化法成功鉴定侵染MDCK的不同亚型流感病毒，且成功对不同时间下的NP进行亚细胞定位。显示所得单克隆抗体可以在流感病毒基础研究和免疫诊断方面发挥作用。第一节材料与方法1.病毒株和细胞株A/PuertoRico/8/1934(H1N1)（简称PR8病毒），A/Memphis/1/1971(H3N2)（简称Memphis病毒，A/Aichi/2/1968(H3N2)（简称Aichi病毒）为本实验室保存。MDCK细胞为本实验室保存。2.试剂DMEM（Hyclone）；青霉素-链霉素（100×）购自Invitrogen公司；小牛血清（杭州四季青生物制品公司）；0.25%胰酶（吉诺生物医药技术有限公司）；甲醇购自上海凌峰化学试剂有限公司。3.ELISA法检测流感病毒3.1间接ELISA法鉴定流感病毒用包被液稀释热灭活的PR8、Memphis、Aichi病毒，均以2µg/孔起始，倍比稀释至2-7µg/孔包被过夜，液体量50µl/孔。弃去病毒液，洗涤3次，加入1:2000稀释的NPmAb-3为一抗进行孵育，50ul/孔，37℃下结合1h，洗涤3次，加入1:1000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃下结合1h后，洗涤5次，将剩余液体扣干。每孔加入100µl的TMB显色，37℃20min后每孔加入50µl的0.25MH2SO4终止。阴性组以包被液代替病毒液。39 浙江省医学科学院硕士学位论文3.2双抗夹心法ELISA检测流感病毒3.2.1确认Memphis抗体包被浓度将Memphis抗体以1:100稀释度起始，倍比稀释，共设10个梯度，50µl/孔包被过夜。次日弃去抗体液，洗涤3次，加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体，50µl/孔，37℃下作用1h。PBST洗涤5次，加入100µl/孔TMB溶液37℃下孵育20min，以50µl/孔的H2SO4终止，检测OD450。3.2.2双抗夹心ELISA法和直接ELISA检测Memphis病毒的敏感度比较双抗夹心ELISA法以抗Memphis单克隆抗体作为包被抗体，1:1000稀释度包被过夜。夹心抗原为以2µg/孔的热灭活Memphis病毒为起始，PBS倍比稀释至2-7µg/孔，37℃下作用1h，检测抗体为1:2000稀释的HRP-NPmAb-3，37℃孵育1h，TMB显色15min，测定OD450值。阴性对照组以抗原稀释液代替抗原。直接ELISA法以2µg/孔的热灭活Memphis病毒为起始，倍比稀释至2-7µg/孔包被过夜。检测抗体为HRP-NPmAb-3。后续检测与双抗夹心ELISA法相同。将两种方法所得OD450值进行灵敏度比较。4.间接免疫染色法检测侵染细胞的流感病毒将PR8（24HAU）、Memphis（23HAU）、Aichi（23HAU）三种病毒分别接种于96孔板中的MDCK单层细胞，经完全培养基培养18h后，吸弃培养，用PBS轻轻洗涤一次后，甲醇固定30min。加入1:1000稀释的NPmAb-3于37℃孵育2h。PBS洗涤3次后，用1:1000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG孵育2h。洗涤3次后，用现配的四氯萘酚显色液进行显色，待颜色呈现，弃去显色液，加入PBS终止显色。5.细胞免疫荧光法进行NP蛋白亚细胞定位5.1PR8病毒侵染下的NP蛋白亚细胞定位将PR8病毒（24HAU）以无FBS无双抗的DMEM稀释，加入到已接种MDCK单层细胞的96孔板中，结合1h后弃去病毒液，加入含有终浓度2µg/mlTPCK胰酶的完全培养基分别培养4h、8h、16h、32h，甲醇固定30min。PBS洗涤3次，一抗为1:1000稀释的NPmAb-3，37℃孵育2h。二抗为1:1000稀释的AlexaFluor488标记山羊抗小鼠IgG。洗涤3次后，加入DAPI染色10min，荧光显微镜观察。5.2pcDNA3.1-NP真核质粒转染下的NP蛋白亚细胞定位将0.2µg真核质粒pcDNA3.1-NP与25µL无血清的DMEM轻轻混匀，取2µL40 浙江省医学科学院硕士学位论文Lipofectamine2000与25µL无血清的DMEM混匀，室温静置5min。而后将质粒稀释液和转染试剂稀释液轻轻混匀，室温静置20min，将混合液加入汇合率90%的MDCK细胞中。作用4h后加入50µL/孔的完全培养液，分别培养16h、24h、32h、40h、48h。甲醇固定30min。后续与5.1的实验方法相同。第二节结果与分析1.间接ELISA法用于流感病毒的测定采用用间接ELISA法，测得抗NP抗体与梯度稀释的PR8、Memphis和Aichi病毒结合情况。结果显示OD值随抗原浓度的下降而下降，说明抗体具有特异性检测PR8与Memphis毒株的能力。以阴性OD值的2.1倍为阳性判定值。PR8、Memphis和Aichi的阴性对照值分别为0.052，0.048和0.077。结果显示抗体对PR8的检测灵敏度为16ng，对Memphis的检测灵敏度为125ng，对Aichi的检测灵敏度为250ng。OD450250ng125ng16ng稀释倍数（-log2）图4.1间接ELISA检测PR8、Memphis和Aichi病毒2.与抗Memphis抗体组成ELISA双抗夹心法检测流感病毒2.1确认Memphis抗体包被饱和浓度1600倍稀释OD450稀释倍数（-log2）图4.2确认Memphis抗体包被浓度41 浙江省医学科学院硕士学位论文Memphis抗体倍比稀释包被过夜后用酶标抗体显色，结果图4.2显示，Memphis抗体的饱和稀释倍数为1600倍。将1000倍稀释作为后续实验的包被浓度。2.2双抗夹心ELISA法检测Memphis病毒以双抗夹心ELISA法，与病毒直接包被的直接ELISA法进行比较。如图4.3，与直接包被病毒组相比,，在病毒同为2µg/孔起始，倍比稀释的前提下，双抗夹心ELISA法的OD检测值明显更高。且直接包被病毒组在2×2-4µg（0.125µg）已经达到最小检测浓度，但ELISA在2×2-9µg时依然没有达到最小检测浓度。为了对双抗夹心ELISA法能够检测Memphis病毒的最小浓度进行探究，将饱和浓度的Memphis抗体包被后，以2µg/孔起始5倍稀释抗原，结果如图4.4所示，双抗夹心ELISA法对于Memphis的灵敏度可以达到128pg，灵敏度明显高于直接包被病毒的间接ELISA法。OD450125ng稀释倍数（-log2）图4.3直接ELISA法检测Memphis病毒128pgOD450稀释倍数（-log5）图4.4双抗夹心ELISA法检测Memphis病毒3.间接免疫染色法检测细胞内的流感病毒PR8、Memphis和Aichi三种毒株侵染细胞后固定，将5株纯化的抗NP单克隆抗42 浙江省医学科学院硕士学位论文体孵育显色后与阴性对照进行比较。结果如图4.5所示，NPmAb-3对侵染MDCK的三种病毒均有良好的特异性结合效果。NPmAb-4和NPmAb-5与病毒结合后有微弱的显色，NPmAb-1和NPmAb-2基本无显色，说明这两株病毒对侵染MDCK的流感病毒基本不具备结合能力。由此得出结论，本研究得到的抗NP单克隆抗体中，NPmAb-3可以结合PR8、Memphis和Aichi三种不同亚型的病毒，最适合应用于细胞免疫荧光作为检测抗体，对侵染细胞的不同亚型流感病毒具有检测作用。图4.55株单克隆抗体对侵染细胞的PR8、Memphis、Aichi的检测作用4.抗NPmAb可以进行NP蛋白的亚细胞定位4.1不同时间下PR8感染MDCK的NP亚细胞定位图4.6不同时间下PR8侵染MDCK细胞的NP亚细胞定位43 浙江省医学科学院硕士学位论文流感病毒侵染细胞后不同时间下NP蛋白在细胞中的定位。PR8病毒侵染MDCK细胞后，8h后可以观察到细胞内的荧光，结合DAPI染色的情况，初步判断绿色荧光即NP蛋白所在部位。在8h实验组中，多数细胞仅细胞核产生荧光；16h一部分细胞仅细胞核产生荧光，另一部分细胞的核质均发荧光，细胞核的亮度较大；32h组中细胞核与细胞质均产生荧光，亮度差异不明显，如图4.6。说明NP蛋白在病毒侵染前期主要分布于细胞核，随着时间的推移逐渐进入细胞质，在核质中均分布。4.2不同时间下pcDNA3.1-NP质粒转染MDCK细胞的NP亚细胞定位44 浙江省医学科学院硕士学位论文图4.6不同时间下pcDNA3.1-NP质粒转染MDCK细胞的NP亚细胞定位在不同时间pcDNA3.1-NP质粒转染细胞的NP蛋白细胞亚定位实验中，检测到NP蛋白的时间明显较病毒侵染延迟，自转染24h后出现荧光，可能由于质粒进入细胞，表达需要时间，此前累积的蛋白量较少有关。在24h实验组，被转染的细胞仅细胞核发出明亮荧光；32h实验组，一些细胞仅细胞核产生荧光，一些细胞细胞核与细胞质均产生荧光，细胞核的荧光强于细胞质；40h和48h实验组，细胞核与细胞质均发光（图4.6）。说明通过质粒转染的方法将NP蛋白转入MDCK细胞当中，蛋白的路径与病毒侵染相似。第三节结论与讨论本实验选取结合性较好的3号抗NP单克隆抗体作为研究材料，进一步探索抗NP抗体的应用前景。采用间接ELISA法验证NP单抗对PR8、Memphis、Aichi三种病毒的结合能力，结果显示单抗均可以跟三种病毒特异性结合，其中对于PR8的灵敏度最高，达到16ng，另外Memphis的灵敏度为125ng，Aichi为250ng。过夜包被抗Memphis抗体为捕获抗体，HRP-NPmAb-3为检测抗体组成双抗夹心ELISA法对Memphis病毒进行检测，与直接包被Memphis病毒进行比较，显示双抗夹心ELISA对于Memphis病毒的检测灵敏度明显高于非夹心法，分别为128pg和125ng。这一结果为NP抗体作为双抗夹心ELISA流感病毒亚型诊断试剂盒的基础材料提供数据支持。细胞免疫染色法结果显示，NP单克隆抗体能够特异性结合PR8、Memphis、Aichi病毒，提示所得NP单抗具有检测不同亚型流感病毒的能力。后续可以增加大量不同亚型流感病毒通过ELISA和细胞免疫染色法与NP单抗进行结合性试45 浙江省医学科学院硕士学位论文验，以验证NP抗体对甲型流感病毒具有广谱鉴定性。应用细胞免疫荧光法，通过PR8侵染细胞和真核质粒pcDNA3.1-NP转染细胞，于不同时间点用NP抗体结合，荧光变化路径相似，荧光最开始出现于细胞核，后慢慢扩散至胞质，整个过程与目前对NP在细胞内的生化反应路径相符。流感病毒基因组的转录与复制均在宿主细胞核中进行。病毒侵染细胞后，在酸性环境中与M1脱离的vRNP由各组分的NLS引导从细胞质进入到细胞核，此时NP蛋白数量较少，荧光亮度不足难以观测，所以在一段时间以后才能检测到荧光；入核后在RNA依赖的RNA合成酶的作用下进行基因组的转录与复制，大量NP在细胞核聚集，所以开始可以观察到多数细胞的细胞核明亮；而后，NP蛋白通过CRM1依赖通路以vRNP的形式出核，所以细胞核与细胞质中均可以检测到大量的NP蛋白[33,36]。通过病毒侵染的细胞荧光出现的时间早于真核质粒转染的细胞，原因可能为两者之间蛋白表达量的差异。通过质粒转染的效率不如病毒侵染的效率，同时，质粒转染的数量也不如病毒侵染的数量，所以从蛋白合成开始累积到足够被荧光显色的时间较长。抗NP抗体能够追踪NP蛋白的位置，显示NP蛋白在病毒入侵细胞后的路径，说明该抗体在科学研究当中的具有应用价值。同时，在真核转染条件下研究NP的功能，检测其在细胞中的表达水平，能为开展研究NP在病毒与宿主的相互作用中所发挥的作用打下良好的基础。单克隆抗体由于其高同质性、易于标准化、对抗原表位具有单一针对性等优点，在科学研究中具有强大的应用潜力。本文的NP单抗也具有其他的应用潜力，如通过所得的5株抗NP抗体，针对本文第一部分利用生物信息法预测的NP蛋白B细胞表面抗原位点，将其合成短肽，利用间接ELISA法，以短肽为包被抗原，抗NP抗体为检测抗体，通过结果的阳性情况筛选得到NP蛋白的B细胞抗原表位，能够进一步探究NP蛋白的生物学特性，为其在疫苗制备的方面提供理论依据。抗NP抗体应用于免疫共沉淀法，捕获MDCK中与NP互作的蛋白，且获得一定进展。类似于免疫共沉淀，还可以将抗NP抗体作为亲和层析的配体，在NP蛋白与其他蛋白相互作用等方面发挥功用。将它作为配体，固定在层析柱上，通过亲和层析，即可从复杂的混合物中分离、纯化得到NP蛋白以及与NP蛋白相互作用的其他蛋白。另外，在制备流感病毒疫苗时，该抗体也许可辅助增强抗原的免疫原性。1984年以来，Celis发现，抗乙肝病毒（HBs）IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可产生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入HBs抗体组46 浙江省医学科学院硕士学位论文成的复合物则可有效的诱生免疫反应，于是有了乙肝的抗原-抗体复合物型治疗性疫苗。这样的应用是否可以应用在流感病毒的防治中，可进一步探究。抗体本身即可作为一种药物，用于流感病毒的防治。针对NP蛋白在流感病毒生命周期中的重要作用，利用生物矿化技术，试将本抗体进行胞内抗流感病毒研究。47 浙江省医学科学院硕士学位论文第五章总结与展望通过三年的研究生学习，熟悉了分子病毒学、免疫学、细胞生物学和分子生物学等生命科学的知识，并掌握了基因的获取、质粒的构建、目标蛋白的表达和纯化、抗原和单克隆抗体的制备与鉴定等一系列实验研究技能。通过本实验研究，得到以下四点结论：1、明确NP蛋白潜在的B细胞抗原表位：本研究应用生物信息学软件，采用多参数预测模型对NP蛋白二级结构和B细胞表位进行预测，第5-10、88-93、124-127、203-216、241-252、291-296、318-326、367-370、396-399、418-422、481-487区域作为NP蛋白B细胞抗原表位的潜在可能性比较大。2、构建出原核表达质粒pET-28a-NP，获得了较高纯度的NP重组表达蛋白：pET-28a-NP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过IPTG浓度1mM、37℃诱导表达8h，成功获得NP蛋白。通过镍柱亲和层析法和割胶纯化法大量制备了纯化的NP蛋白。3、获得了5株抗NP单克隆抗体：利用纯化的NP蛋白作为抗原，免疫Balb/c小鼠，将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选得到能稳定分泌抗NP单克隆抗体的5株杂交瘤细胞。ELISA和Western-blot证实5株单抗均对NP蛋白具有较好的抗原结合特异性，同时也能与PR8和Memphis特异性结合。表明所得单抗特异性良好，可以用于下一步研究。4、初步确定了抗NP单克隆抗体的生物特性及其初步应用，：通过制备的抗NP单克隆抗体作为检测抗体或探针，对NP抗体进行初步应用探索，得到：（1）通过间接ELISA法证实NPmAb-3抗体能够检测PR8、Memphis和Aichi病毒，灵敏度分别为16ng，250ng和125ng。推测该单抗可以作为检测甲型流感病毒的基础材料。（2）通过与Memphis抗体联用构建双抗夹心ELISA法，将检测Memphis病毒的灵敏度明显提高，从125ng到128pg。推测NPmAb-3可以作为甲型流感病毒亚型双抗夹心ELISA试剂盒的基础材料。（3）NPmAb-3、NPmAb-4、NPmAb-5可以检测侵染MDCK细胞的PR8、Memphis和Aichi，其中NPmAb的检测效果最佳，说明该抗体能与某些自然结构的病毒特异48 浙江省医学科学院硕士学位论文性结合。推测该单抗可以作为一种优秀的探针。（4）PR8流感病毒感染MDCK细胞后8h后既可以检测到NP蛋白，NP蛋白的表达量及分布随时间延长发生从细胞核到充满细胞的变化。这种变化同样发生在真核表达质粒pCDNA3.1-NP转染MDCK细胞，不同的是产生荧光的时间从8h延长至24h。并且所得到的结果与目前研究得到的NP蛋白在细胞内的生还反应和迁移路径相符。推测该抗体可以作为一种良好的探针，用于NP蛋白的基础研究，比如蛋白互作和细胞亚定位的研究。综上所述，该单抗能用于鉴定某些亚型流感病毒，病毒细胞定位及NP蛋白细胞亚定位的良好探针。49 浙江省医学科学院硕士学位论文致谢本论文是在郭潮潭研究员的悉心指导下完成的，从论文的立题、构思、实验设计到研究论文的写作，导师都给予了精心指导和亲切关怀，并付出了大量的心血。郭老师深厚的专业知识、严谨的治学态度和认真的工作作风，让我深受启迪并将终身受益。在此论文完成之际，衷心感谢导师三年来对我学业发展的支持和帮助！感谢课题组全体老师和同学的鼎力支持。感谢丁建祖老师给予的帮助和实验上的指导，对本文的完成起了至关重要的作用。实验室浓厚的科研氛围，催人奋进；大家团结互助的精神，也为我的学习和生活带来了积极的影响。感谢生物工程研究所每一位关心和帮助过我的老师和同学，谢谢你们！感谢科技处各位老师对我学业和生活中的关心与帮助！最后，感谢我的家人和朋友多年来给予的支持和鼓励。50 浙江省医学科学院硕士学位论文参考文献[1]张清，孙坚，何士勤。甲型流感病毒核蛋白的研究进展[J]。南昌大学学报，2015，50(8)：116-121。[2]NgAK,WangJH,ShawPC.StructureandsequenceanalysisofinfluenzaAvirusnucleoprotein[J].SciChinaCLifeSci.2009,52(5):439-49.[3]CoxRJ,BrokstadKA,OgraP.Influenzavirus:immunityandvaccinationstrategies.Comparisonoftheimmuneresponsetoinactivatedandlive,attenuatedinfluenzavaccines[J].ScandJImmunol,2004,59(1):1-15.[4]UpadhyayC,AmmayappanA,VakhariaVN.DetectionofNP,N3andN7antibodiestoavianinfluenzavirusbyindirectELISAusingyeast-expressedantigens[J].VirolJ,2009,7(6):158.[5]PeralesB,Sanz-EzquerroJJ,GastaminzaP,etal.ThereplicationactivityofinfluenzaviruspolymeraseislinkedtothecapacityofthePAsubunittoinduceproteolysis[J].JVirol,2000,74(3):1307-1312.[6]TumpeyTM,MainesTR,VanHoevenN,etal.Atwo-aminoacidchangeinthehemagglutininofthe1918influenzavirusabolishestransmission[J].Science,2007,315(5812):655-659.[7]KarasinAI,LandgrafJ,SwensonS,etal.GeneticcharacterizationofH1N2influenzaAvirusesisolatedfrompigsthroughouttheUnitedStates[J].JClinMicrobiol,2002,40(3):1073-1079.[8]WagnerR,MatrosovichM,KlenkHD.Functionalbalancebetweenhaemagglutininandneuraminidaseininfluenzavirusinfections[J].RevMedVirol,2002,12(3):159-166.[9]许莎莎，田鹏，等。甲型流感病毒的研究进展[J]。热带医学杂志，2015，15(10)：1450-1454。[10]MosconaA.Oseltamivirresistancedisablingourinfluenzadefenses[L].NEnglJMed.2005,353(25):2633-2636.[11]BrightRA.AdamantaneresistanceamonginfluenzaAvirusesisolatedearlyduringthe2005-2006influenzaseasonintheUnitedStates[J].JAMA,2006,298(8):891.[12]ZhouJ,ZouL,ZhangXetal.AdamantaneandoseltamivirresistantseasonalA(H1N1)andpandemicA(H1N1)2009influenzavirusesinguangdong,china,during2008and51 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浙江省医学科学院硕士学位论文综述H9N2亚型流感病毒的生物学特性及其潜在危险性张儒轩郭潮潭摘要H9N2亚型流感病毒是低致病性流感病毒，降低家禽产蛋率，严重影响养殖业的发展，并且获得感染哺乳动物的能力，威胁人类健康；能够与其他流感病毒重组，产生新型流感病毒，造成流感大爆发。本文列举了H9N2亚型流感病毒的生物学特性，通过总结近年来H9N2的流行情况，致病性改变和其作为新型流感病毒的基因供体等几个方面的研究，阐述H9N2亚型流感病毒的潜在危险性。关键词流感病毒H9N2亚型致病性基因供体危险性ThebiologicalcharacteristicsanditspotentialriskofH9N2influenzavirusZhangRuxuan,GuoChaotan.InstituteofBiologicalEngineering,ZhejiangAcademyofMedicalSciences,Hangzhou310013,ChinaCorrespondingauthor:GuoChaotan,E-mail:gchaotan@163.comAbstractThelowpathogenicavianinfluenzaH9N2virusisabletoreduceeggproductionofpoultry,seriouslyaffectingthedevelopmentofaquaculture.Recentlythevirusgainstheabilitytobindthehuman-likereceptors,threateningthehealthofhuman.ThisarticleliststhebiologicalcharacteristicsofinfluenzaH9N2virus,elaboratesthepotentialriskofinfluenzaH9N2virusbysummarizingtheprevalenceofH9N2,pathogenicchangesandasgenedonorfornewinfluenzaviruses.KeywordInfluenzavirus,H9N2subtype,Pathogenicity,Genedonor,Risk流行性感冒（简称流感）是一种由流感病毒引起的全球性人畜共患的急性传染病。其危害十分严重，如在上世纪中，出现了四次严重的流感大爆发，分别是1918年的西班牙流感（H1N1），1957年的亚洲流感（H2N2），1968年的香港流感（H3N2），1977年的苏联流感（H1N1），死亡人数上亿人。近二十年来，流感病毒进入高速进化时期，新的亚型层出不穷，出现了多种亚型禽流感感染人的事件，如H5N1（1997年）、H9N2（1998年）、H7N7（2003年）、新型H1N1（2009年）、H7N9（2013年）、H10N8（2013年）和H5N6（2014年）等。这些病毒如何跨越种54 浙江省医学科学院硕士学位论文间屏障感染人的传播机制还不十分清楚，对该病的有效防控留下了一些隐患，有待于阐明。多个研究报道提示H9N2亚型对近来流感病毒的快速变异提供了有利条件。本文从对H9N2亚型病毒的生物特性着手揭示它的生物作用，从而警示它的潜在危险性。一、H9N2亚型流感病毒的生物学特性H9N2亚型是甲型流感病毒的一个普通亚型。其基本形态结构与其他亚型病毒高度相似。以下针对H9N2亚型与其他亚型病毒相比在生物学上的类似点和特殊性加以论述。1、形态结构相似：H9N2型是甲型流感病毒的一个普通亚型，其基本结构无特殊性。其外形呈球状，直径80-120nm，由一层脂质囊膜包裹着8条编码负义RNA片段[1],能编码11种蛋白。其中，囊膜上有两类糖蛋白纤突，分别为H9亚型血凝素（HA）和N2亚型神经氨酸酶（NA），前者主要参与与宿主细胞上的唾液酸受体结合，从而介导病毒的吸附和穿膜过程[2]，后者NA作为受体破坏酶，能够促进子代病毒从宿主细胞上释放出来[3]。这两种蛋白与流感病毒的致病性和组织嗜性密切相关。2、宿主范围较广：流感病毒类型非常丰富，目前为止自然界分离到126种亚型。而H9N2亚型相对于H5等其他亚型具有更广泛的宿主谱[4]，几乎能感染所有家禽和野鸟，还可以感染雪貂、猪、狗和人等哺乳动物。许多研究表明，HA上Q226L突变使得原本只能结合禽样受体（SAα2,3Gal）的H9N2病毒又能结合人样受体（SAα2,6Gal），这是H9N2的跨种间传播感染机制的分子基础[5-7]。其中，猪、鹌鹑、火鸡，野鸡、珍珠鸡等的呼吸道和肠道中同时包含两种受体，在H9N2的跨种间传播中起到了“混合容器”的作用。抗原漂移[8]和其他一些哺乳动物适应性分子突变[9]同样扩展了H9N2的宿主范围，H9亚型的低致病性为病毒的大范围传播和储存提供有利条件。3、流行病史较长：自1966年Hommee等人[10]在美国首次从火鸡中成功分离到H9N2亚型流感病毒（A/Turkey/Wisconsin/1/66）以来，已经历了近50年。1976年在香港从鸭体内也分离到该亚型毒株（A/Duck/HongKong/86/76），亚洲地区也流行40年了。1998年在我国广东省首次从普通感冒病人中分离到H9N2亚型（A/Shantou/239/98）[11]，提示该病毒变异具有跨种间屏障感染人类的能力。有幸是没有出现大范围的人感染病例，提示H9N2亚型病毒没有明显的人际间传播的能力。与此同时，该亚型病毒陆续从多种禽鸟和哺乳动物中分离出来[12-13]，特别是在与人类55 浙江省医学科学院硕士学位论文生活密切相关的家禽中经常出现。如今，H9N2亚型病毒已成为中国主要的流行毒株。自H9N2流行以来，主要在欧亚和中东地区传播，有证据表明中国可能是H9N2亚型流感病毒的流行发源地[14-15]。4、致病低感染高：H5N1和H7N9等亚型流感病毒作为高致病性禽流感病毒，在家禽和人类中均造成较高的死亡率，严重威胁家禽养殖业发展和人类的健康，因此得到了监管部门的高度重视。而H9N2亚型流感病毒不会对家禽造成致命伤害，而是引起温和的临床症状或隐性感染[16]，并且能在家禽中广泛传播。HA断裂位点的序列是流感致病性高低的主要决定因素。H5和H7等亚型的高致病性禽流感病毒的HA具有多元断裂位点，能被多个器官的蛋白酶裂解，扩大了病毒感染的组织范围，导致全身感染，因此具有高致病性；而H9N2的HA裂解位点处碱性氨基酸的数量少，一般只能被呼吸道和消化道的蛋白酶裂解，产生轻微而局部的症状，表现为低致病性。然而低致病性并不意味着没有危险性。H9N2在家禽中有较强的传染性，影响家禽产蛋率，造成家禽业巨大经济损失[17]；与其他病原共同作用时产生协同作用，造成家禽死亡[18]。某些地区对家禽血样进行血凝抑制实验，H9N2的血清阳性率均接近50%，且从野鸟和家禽体内均能分离得到H9N2亚型禽流感病毒[19-21]，说明几近半数的家禽感染过H9N2病毒，提示H9N2亚型流感病毒已在农场中广泛传播，且在家禽中传播能力强，感染率高；野鸟和候鸟作为H9N2病毒的宿主，帮助H9N2病毒跨区域传播，扩大传播范围。5、隐性感染人类：自H9N2亚型禽流感病毒获得哺乳动物适应性突变以来，文献记载有偶发的人感染H9N2流感发病病例。而未发病或发病轻微的H9N2隐形感染人数却不在少数，且隐形感染特别容易发生在家禽工人当中。不同地区不同时间的流行病学研究数据显示[22-25]，暴露于家禽的人群的H9N2病毒血清阳性率显著高于普通人群。感染的概率还与年龄和家禽是否接种有关，目前受H9N2亚型感染人数显著高于确诊人数，相关部门和公众应加强对H9N2流感的认识，加强防治，严密监控。二、H9N2病毒是近期高致病禽流感发生的基础过去的二十年中，H9N2亚型流感病毒在世界各地蔓延。除了引起家禽流感大爆发和偶发性的人感染病例，H9N2病毒还作为其他亚型流感病毒形成的原料，与其他亚型流感病毒共感染某些宿主，形成巨大的基因池，产生一系列新型重组流感病毒，如高致病性禽流感H5N1和H7N9，还有H5N6[26]和H10N8[27]。H9N2病毒作为这些56 浙江省医学科学院硕士学位论文重组流感病毒的基因供体，或多或少取代了原有毒株的内部基因，一定程度上改变了原有毒株的毒力、适应性和发病机理，成为流感爆发的潜在威胁。1、H5亚型与H9N2亚型基因之间的关系：高致病性流感病毒H5N1和H5N6的内部基因来自于H9N2，重组后病毒的宿主适应性和感染能力有所增强，造成H5N1在香港大流行。从中国南部[28]水鸟体内分离的H9N2亚型流感病毒进行进化分析，发现有五条内部基因NP、PB2、PB1、PA、NS与2001年在香港流行的H5N1病毒高度同源。H5N1和H9N2共感染家禽以及H1N1和H5N1感染人类的情况增加了病毒的潜在变异性，使得H5N1病毒更容易感染人类[29]。近来在患者中分离到H5N6的6段内部基因与H9N2的相似性非常高[30]，可以推测该H5N6的6条内部基因全部来源于H9N2。2、H7亚型与H9N2亚型基因之间的关系：高致病性禽流感病毒H7N9和H7N7的内部基因来源于H9N2。2013年新型流感病毒H7N9流行期间，从湖南永州的一位7岁男孩体内分离出H9N2亚型病毒[8]。该毒株与从环境当中得到的4株H9N2毒株中的其中一株高度相似（98.5-99.8%），且其内部六条基因与当时盛行的H7N9高度同源（95.7-99.5%）。许多学者[31-33]研究得出，2013年爆发的人感染的H7N9禽流感病毒的内部六条基因来自禽流感H9N2亚型。在近十年的H9N2基因型中，基因型G57发生抗原性变化，成为中国接种疫苗的鸡场中的主要毒株，引起2010-2013年的H7N9大流行。除H7N9亚型以外，H7N7重组病毒WZ-Ck-H7N7毒株的六条内部基因也来源于H9N2病毒的ZJ-HJ/07亚系[27]。H7N7人感染病例不多，多数为结膜炎，流感样症状，但荷兰一人因流感继发肺炎合并急性呼吸窘迫综合征而死亡。3、H10亚型与H9N2亚型基因之间的关系：2013年12月6日在我国江西省，首次发生人感染H10N8亚型且导致死亡事件。经基因分析，从73岁女患者中分离到的流感病毒(A/Jiangxi/Donghu-346/2013（JX346）与当地从鸡中分离到的H10N8亚型禽流感病毒的基因高度相似[34]，提示该病毒是通过鸡传染给人类的。H10N8属弱病毒，并且不具备人际间传播的能力。研究人员通过对人传染流感病毒H10N8毒株进行进化分析发现，近来分离到的H10N8毒株的六条内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）均来源于H9N2亚型病毒[34]。从而可以提示H10N8亚型流感病毒也来源于H9N2禽流感病毒。57 浙江省医学科学院硕士学位论文三、H9N2亚型流感病毒具有潜在危险性综上所述，H9N2亚型病毒具有温和的致病力，感染宿主范围广，隐形感染率高等生物特性，极易与其他亚型流感病毒共感染细胞，产生变异。目前H9N2亚型流感病毒在世界范围内流行，虽然病毒自身对宿主危害不大，但其作为其他亚型流感病毒的变异来源，增加了其他亚型流感病毒爆发的危险，对人类社会的潜在威胁巨大。因此，现阶段除了对H5和H7等高致病性禽流感进行研究，研究人员也应加强对H9N2亚型病毒的研究和监控，把握H9N2的实时动态比如与其他流感病毒的共感染情况，以便能在预测新型流感病毒发生和控制流感大爆发方面发挥作用。参考文献[1]JessicaAB,CarolynBB,JacquelineMK,etal.Past,present,andpossiblefuturehumaninfectionwithinfluenzavirusAsubtypeH7[J].2009,15(6):859–865.[2]BiswasPK,ChristensenJP,AhmedSS,etal.Avianinfluenzaoutbreaksinchickens,Bangladesh[J].EmergInfectDis.2008,14(12):1909-1912.[3]CompansRW,DimmockNJ,Meier-EwertH.EffectofantibodytoneuraminidaseonthematurationandhemagglutinatingactivityofaninfluenzaAvirus[J].JVirol.1969,4(4):528-534.[4]陈宗遒,陆剑云,肖新才,等.广州地区2006-2012年人感染H5/H7/H9亚型禽流感病毒风险监测[J].中华流行病学杂志.2013,(9):900-905.[5]WanH,PerezDR.Aminoacid226inthehemagglutininofH9N2influenzavirusesdeterminescelltropismandreplicationinhumanairwayepithelialcells[J].JVirol.2007,81(10):5181-5191.[6]WanH,SorrellEM,SongH,etal.ReplicationandTransmissionofH9N2InfluenzaVirusesinFerrets:EvaluationofPandemicPotential[J].PLoSONE.2008,3(8):e2923.[7]YuanJ,XuL,BaoL,etal.CharacterizationofanH9N2avianinfluenzavirusfromaFringillamontifringillabramblinginnorthernChina[J].Virology.2015,476:289-297.[8]BouvierNM,PaleseP.Thebiologyofinfluenzaviruses.Vaccine[J].2008,12(26):49-53.[9]HuangY,LiX,ZhangH,etal.HumaninfectionwithanavianinfluenzaA(H9N2)virusinthemiddleregionofChina[J].JMedVirol.2015,87(10):1641-1648.[10]HommePJ,EasterdayBC.Avianinfluenzavirusinfections.I.CharacteristicsofinfluenzaA-turkey-Wisconsin-1966virus[J].AvianDis.1970,14(1):66-74.58 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浙江省医学科学院硕士学位论文2008and2010[J].ZoonosesPublicHealth.2015,62(2):131-140.[24]KhanSU,AndersonBD,HeilGL,etal.ASystematicreviewandmeta-analysisoftheseroprevalenceofinfluenzaA(H9N2)infectionamonghumans[J].JInfectDis.2015,212(4):562-569.[25]GomaaMR,KayedAS,ElabdMA,etal.AvianinfluenzaA(H5N1)andA(H9N2)seroprevalenceandriskfactorsforinfectionamongEgyptians:aprospective,controlledseroepidemiologicalstudy[J].JInfectDis.2015,211(9):1399-1407.[26]GuM,ChenH,LiQ,etal.EnzooticgenotypeSofH9N2avianinfluenzavirusesdonatesinternalgenestoemergingzoonoticinfluenzavirusesinChina[J].VetMicrobiol.2014,174(3-4):309-315.[27]JinY,YuD,RenH,etal.PhylogeographyofavianinfluenzaAH9N2inChina.BMCGenomics.2014,15(1):1110.[28]LiKS,XuKM,PeirisJS,etal.CharacterizationofH9subtypeinfluenzavirusesfromtheducksofsouthernChina:acandidateforthenextinfluenzapandemicinhumans?[J].JVirol.2003,77(12):6988-6994.[29]AbdelwhabEM,Abdel-MoneimAS.Epidemiology,ecologyandgenepoolofinfluenzaAvirusinEgypt:willEgyptbetheepicenterofthenextinfluenzapandemic?[J].Virulence.2015,6(1):6-18.[30]PanM,GaoR,LuQ,etal.HumaninfectionwithanovelhighlypathogenicavianinfluenzaA(H5N6)virus:Virologicalandclinicalfindings[J].JInfect.2015,2:1-8.[31]PuJ,WangS,YinY,etal.EvolutionoftheH9N2influenzagenotypethatfacilitatedthegenesisofthenovelH7N9virus[J].ProcNatlAcadSciUSA.2015,112(2):548-553.[32]LamTT,WangJ,ShenY,etal.ThegenesisandsourceoftheH7N9influenzavirusescausinghumaninfectionsinChina[J].Nature.2013,502(7470):241-244.[33]LiuJ,ZhangJ,HuangF,etal.ComplexreassortmentofpolymerasegenesinAsianinfluenzaAvirusH7andH9subtypes[J].InfectGenetEvol.2014,23:203-208.[34]MaC,LamTT,ChaiY,etal.EmergenceandevolutionofH10subtypeinfluenzavirusesinpoultryinChina[J].JVirol.2015,89(7):3534-3541.60 浙江省医学科学院硕士学位论文附件1攻读学位期间发表论文目录[1]张儒轩、沃恩康、丁建祖、方迪、陈帅帅、杨新燕、郭潮潭。甲型流感病毒NP单克隆抗体制备及其初步应用。《国际流行病学传染病学杂志》，2017，44（2）：79-84。[2]张儒轩、郭潮潭。H9N2亚型流感病毒的生物学特性及其潜在危险性。《国际流行病学传染病学杂志》，2016，43（1）：43-46。[3]陈帅帅、沃恩康、张儒轩、王怡婷、杨新燕、郭潮潭。纳米化蒙脱石衍生物对甲型流感病毒的吸附研究。《国际流行病传染病学杂志》，2015，42（3）：151-156。[4]沃恩康、王怡婷、杨新燕、张儒轩、方迪、刘亚辉、郭潮潭。H5N6人禽流感病毒分离株序列分析及其生物学特性研究。《国际流行病传染病学杂志》，2017，44（1）：10-15。[5]陈帅帅、丁建祖、尤金彪、沃恩康、王怡婷、曹毅、郭霞、杨新燕、张儒轩。流感病毒M1单克隆抗体的制备及其生物学特征。《国际流行病传染病学杂志》，2015，42（1）：3-8。[6]郭潮潭、尤金彪、曹毅、胡致平、陈帅帅、沃恩康、王怡婷、杨新燕、张儒轩。再生障碍性贫血激发流感病毒感染的危险性研究。《国际流行病传染病学杂志》，2015，42（4）：237-239。[7]Dong-ShengHuang,ZhaohuiWang,Xu-JunHe,BillH.Diplas,RuiYang,PatrickJ.Killela,QunMeng,Zai-YuanYe,WeiWang,Xiao-TingJiang,LiXu,Xiang-LeiHe,Zhong-ShengZhao,Wen-JuanXu,Hui-JuWang,Ying-YuMa,Ying-JieXia,LiLi,Ru-XuanZhang,TaoJin,Zhong-KuoZhao,JiXu,ShengYu,FangWu,JunboLiang,SizhenWang,YuchenJiao,HaiYan,Hou-QuanTao.RecurrentTERTpromotermutationsidentifiedinalarge-scalestudyofmultipletumourtypesareassociatedwithincreasedTERTexpressionandtelomeraseactivation.EuropeanJournalofCancer,2015,51(8):969-976.61 浙江省医学科学院硕士学位论文附件2（溶液配方）分子克隆常用试剂：3M醋酸钠：40.8gNaOAc·3H2O置于烧杯中，加入约40mL的去离子水搅拌溶解，加入冰醋酸调PH至5.2，加去离子水将溶液定容至100mL，高压灭菌后，室温保存。LB培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，NaOH调节pH值至7.0后定容，高温高压灭菌后，4℃保存。LB培养基（50μg/mL卡那霉素）：高温高压灭菌后的LB培养基1L中加入50mg的卡那霉素。IPTG（200mg/mL）：称取20gIPTG置于烧杯中，加入80mL去离子水，充分混合溶解后，定容至100mL，用0.22μm孔径一次性滤膜过滤，小份分装后，-20℃保存。0.5mol/LEDTA（pH8.0）：18.61gEDTA-Na2·2H20，溶于80mL去离子水中，搅拌混匀后用NaOH调pH至8.0，定容至100mL，高压灭菌，4℃保存。TEBuffer（pH8.0）：10mmol/LTris-Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。10×TBEBuffer（pH8.3）：890mmol/LTris-Borate，20mmol/LEDTA，充分搅拌溶解后定容，室温保存。溶液I：50mmol/LGlucose，25mmol/LTris-Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA，高压灭菌，4℃保存。溶液II：0.2mol/LNaOH，1%SDS，临用时配制。溶液III：5mol/L乙酸钾60mL，冰醋酸11.5mL，水28.5mL。溶液IV：饱和平衡酚、氯仿与异戊醇按体积比25/24/1混合，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖一层水，4℃保存。PBS磷酸盐缓冲液（0.01M，pH7.2-7.4）：1袋磷酸盐粉末，加蒸馏水至2L，室温保存。20mMPBS：20mM磷酸钠+300mM氯化钠。EquilibritionBuffer：20mMPBS+10mMimidazole，pH7.4。WashBuffer：20mMPBS+25mMimidazole，pH7.4。ElutionBuffer：20mMPBS+250mMimidazole，pH7.4。62 浙江省医学科学院硕士学位论文MESBuffer：20mM2-（N-吗啉）乙磺酸+0.1MNaCl，pH5.0。SDS-PAGE电泳常用试剂：30%丙烯酰胺：29.2%（w/v）丙烯酰胺，0.8%（w/v）双甲叉丙烯酰胺，用0.45μm滤膜滤去杂质，于棕色瓶中4℃保存。10%SDS：称量10g高纯度的SDS置于100~200mL烧杯中，加入约80mL的去离子水，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节PH值至7.2，将溶液定容至100mL后，室温保存。10%过硫酸铵：称取1g过硫酸铵，加入10mL的去离子水后搅拌溶解，4℃保存。浓缩胶缓冲液：1mol/LTris-HClpH6.8。分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HClpH8.8。5×电泳缓冲液：0.125mol/LTris，1.25mol/L甘氨酸，0.5%SDS。5×上样缓冲液：0.25mol/LTris-HCl（pH6.8），50%丙三醇，10%SDS，0.5%BPB，5%β-巯基乙醇。考马斯亮蓝R-250染色液：0.1%考马斯亮蓝R-250，25%异丙醇，10%冰醋酸。考马斯亮蓝染色脱色液：水、甲醇与冰醋酸按体积比6/3/1混合。0.25mol/L氯化钾：18.6g氯化钾溶于去离子水中，定容至1L。单克隆抗体制备常用试剂：饱和硫酸铵：称取60g硫酸铵于60-70℃的去离子水中，充分溶解定容至100mL，4℃过夜，可见有结晶析出，上清即为饱和硫酸铵，加入氨水调节PH至7.0~7.2。0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）：NaHCO32.93g，Na2CO31.59g，加蒸馏水至1000mL调pH值至9.6，4℃保存。ELISA检测常用试剂：包被液：NaHCO32.93g，Na2CO31.59g，加蒸馏水至1000mL调pH值至9.6，4℃保存。洗涤液（PBST溶液）：0.01mol/LPBS1L，加入1mLTween-20（0.1%），室温保存。封闭液：牛血清白蛋白（BSA）5g，加1mol/LPBST溶液（pH7.4）至100mL，4℃保存。脱脂奶粉5g，加PBST溶液（pH7.4）至100mL，4℃保存。63 浙江省医学科学院硕士学位论文TMB显色液：TMB与TMB-显色液以1:19混合终止液：0.25mol/LH2SO4。Western-blot常用试剂：膜转移缓冲液（Tanktransferbuffer）：192mmol/L甘氨酸，25mmol/LTris，10%甲醇。封闭缓冲液（5%脱脂奶粉）：5g脱脂奶粉溶于100mLPBS缓冲液，4℃保存。样品稀释液（0.5%脱脂奶粉）：0.5g脱脂奶粉溶于100mLPBS缓冲液，4℃保存。Westernblot显色液（四氯萘酚显色液）：0.1mol/L柠檬酸钠5.5mL，0.1mol/L四氯萘酚（甲醇溶液）0.5mL，60mMDPD0.5mL，3%H2O230μL。0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）：0.1mol/L柠檬酸3.8mL，与0.1mol/L柠檬酸钠16.2mL混匀。0.1mol/L四氯萘酚：1.78g四氯萘酚粉末溶于100mL甲醇中。细胞培养常用试剂：无血清DMEM培养基：DMEM完全培养基5%FBSDMEM培养基：470mL无血清DMEM培养基，25mL小牛血清，青霉素-链霉素（100×）5mL，4℃保存。10%FBSDMEM培养基：445mL无血清DMEM培养基，50mL小牛血清，青霉素-链霉素（100×）5mL，4℃保存。固定液：甲醇。64