野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定

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１０７１２Ｓ４３２．２学校代码：分类号：０５０６研究生学号：２０１４１５ＵＤＣ：６３２密级：公开灶衣林奇长大学２０１７届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定学科专业植物病理学研究方向植物免疫学研究生李巧指导教师赵杰副教授２０７年５月完成时间中国陕西杨凌 Classificationcode:S432.2Universitycode:10712UDC:632Postgraduatenumber:2014050156Confidentialitylevel:PublicThesisforMaster’sDegreeNorthwestA＆FUniversityin2017ISOLATIONANDIDENTIFICATIONOFTHEWHEATSTRIPERUSTPATHOGENFROMNATURALLYRUST-INFECTEDBERBERISMajor:PlantPathologyResearchfield:PlantImmunologyNameofPostgraduate:LiQiaoAdviser:ZhaoJieDateofsubmission:May,2017YanglingShaanxiChina 本研究由国家自然科学基金（32171986）、国家“973”项目（2013CB127700）、国家“863”计划（2012AA101503）、国家小麦产业技术体系（CARS-3-1-11）、国家国际科技合作专项资助（2011DFG32990）、新世纪优秀人才支持计划支持（NCET-13-0490）。 野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定摘要小麦条锈病是由活体营养、专性寄生的条形柄锈菌小麦专化型引起的，是全球最具毁灭性的小麦病害之一。该病害在我国分布范围广，其病菌群体具有遗传丰富度高、基因多态性复杂的特点，该病害流行往往造成巨大的减产，严重威胁我国的小麦生产安全。使用抗病品种被认为是防治该病害最为经济、环保及有效的方法。但是，由于新毒性菌系的出现，小麦抗病品种被使用短短数年便“丧失”其抗病性，继而引起条锈病的大暴发。研究表明，小麦抗病品种抗病性“丧失”的主要原因是病原菌致病性变异导致新菌系的产生。研究证实突变、异核作用及体细胞重组等均可导致病原菌变异产生新菌系，有性生殖具有使病原菌通过遗传重组快速产生新菌系的特点，因此，有性生殖在基因型多样性中起着更为重要的作用。由于小麦条锈菌的有性生殖近年被才发现，从而证实条小麦锈菌是有性、锈、夏、冬、担5种孢子的全孢型大循环锈菌，并使得小麦条锈菌有性生殖方面的相关研究成为可能。小檗在我国具有分布广、种类多以及邻近小麦生长的特点，且小麦条锈菌的越夏及部分流行区域都有小檗的广泛分布。目前，研究证实，在自然条件下我国小麦条锈菌能在小檗上进行有性生殖。但是，野生小檗在小麦条锈菌新小种产生中的作用需进一步研究，这对小麦条锈病的有效防治具有重要意义。为此，本研究通过对2015年自然发病小檗进行小麦条锈菌的分离及其单夏孢子堆的纯化，并在中国鉴别寄主上进行了毒性测定与分析，以明确小檗上的有性生殖在条锈菌致病性变异中的作用。研究结果如下：1.从陕西、甘肃两省采集的3种感病小檗上共分离得到8个小麦条锈菌菌系标样，8个菌系在中国鉴别寄主上进行毒性测定，并与目前已知菌系相比对可知：其中只有1个菌系的毒性与已知小种Su11-126完全一致，剩余的7个为新菌系；2.对8个菌系挑取单个夏孢子堆，获得93个单夏孢子堆群体，在中国鉴别寄主上鉴定并与已知小种相比对可知：单孢子堆群体可划分为47个致病类型，其包括已知小种类型14个和新小种类型33个；其中56个为已知小种，37个为新小种。本研究再次为自然条件下中国小麦条锈菌在转主寄主小檗上进行有性生殖提供了证据，证实中国小麦条锈菌有性生殖常年发生，明确了转主寄主小檗在中国小麦条锈菌的生活史和病害循环均起作用。研究结果为我国小麦锈病的长期有效的防控提供了重要的理论依据，同时对生产实践也具有重要的指导意义。关键词：小麦；条锈病；有性生殖；毒性变异；小檗 ISOLATIONANDIDENTIFICATIONOFTHEWHEATSTRIPERUSTPATHOGENCOLLECTEDFROMNATURALLYRUST-INFECTEDBERBERISABSTRACTStriperustofwheat,causedbyanobligateandbiotrophicfungusPucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst),isoneofthemostdestructivediseasesofwheatintheglobe.ThediseasedistributeswidelyinChinaanditspathogenpopulationrepresentsahighdiversity,complexityofgeneticpolymorphism.Alargescaleepidemicofthediseaseresultedinahugeyieldloss,seriouslythreatingsafeproductionofwheatinChina.Growingwheatcultivarspossessingresistancegenesagainstthediseaseisconsideredasthemosteconomic,low-cost,andenvironmental-friendlymethodforcontrolofthedisease.However,theresistanceofwheatcultivarswasovercomebytheemergenceofnewPstraceswithinafewyearssincetheirreleased,leadingtowheatsusceptibleandfollowingoutbreakofstriperustonwheat.ThepreviousstudiesthoughtthatthemainreasonforthelossofresistanceofwheatcultivarswastheappearanceofnewracesofPstbecauseofvirulencevariationofthepathogen.Italsothoughtthatmutation,heterocaryosis,andsomaticrecombinationcontributetopathogenvariationandgaverisetonewraces.Sexualreproductionisimportantofquicklyproducingnewvirulentracesviatogeneticrecombination,playingaroleingeneticdiversityofthepathogen.However,morerecently,sexualstageofPstwasdiscoveredanditdemonstratedthatthepathogenisamarcrocyclicrustfungiwithfivetypesofsporesincludingurediospore,teliospore,basidiospore,pycniosporeandaeciosporeinthewholelifecycle.Thisfindingmakespossibletostudyonsexualreproduction.Thereisawidegeographicdistributionofbarberry(Berberis)andalargenumberofbarberryspeciesinChina.BarberrybushesgrowingaroundwheatfieldsareverycommoninmanyregionsofChina,especiallynorthwesternandsouthwesternChinaasoversummeringareasforPst.Atpresent,recentstudiesshowedthatPstcompletessexualonbarberryasalternatehostundernaturalconditionsinChina.However,thestudyonfunctionofbarberryinproductionofnewracesofPstisneededandisimportantofefficientcontrolofwheatstriperust.Therefore,theobjectivesofthepresentstudyweretoisolatePstsamplesfromnaturallyinfectedbarberry,establishtheirsingle-urediumpopulationstotesttheirvirulencebasedontheChinesedifferentialset,andanalyzetheirvirulencepatterns,andtoconfirmtheroleofsexualreproductiononbarberryinpathogenicityvariationofthewheatstriperustfungus.Theresultswereasfollows: 1.Weisolated8Pstsamplesfrom3Berberisspp.collectedfromGansuandShaanxiprovincesin2015.Basedontheirvirulencetests,onlyonePstsamplewasmatchedtotheknownPstraceSu11-126invirulencepatterns,andtheremaining7werenewraces.2.Among47virulencepatternsproducedfrom93single-urediumisolates,14wereknownracetypesand33newracetypes,Fiftysixoutof93werematchedwiththeknownPstracesinvirulencepatternsand37werenew.Inthisstudy,weobtainedmoreevidencesforsupportingtheexistenceofsexualreproductionofPstonBerberisspp.innatureinChina,leadingtoafactthatsexualreproductionofPstregularlyoccursundernaturalconditions.OurresultsconfirmedthatwildBerberisspp.playaroleincompletionofthewholelifecycleofPstandindiseasecycleofwheatstriperustinChina.Itprovidesanimportanttheoreticalbasisforthelong-termeffectivepreventionandcontrolofwheatrustinChina,andalsohasanimportantguidingsignificanceforproductionpractice.KEYWORDS：wheat,striperust,sexualproduction,virulencevariation,Berberis 目录第一章文献综述...........................................................11.1小麦的来源及重要性...................................................................................................11.2小麦条锈病...................................................................................................................11.2.1小麦锈病的发生史及分布....................................................................................11.2.2条锈病的危害及流行............................................................................................21.2.3条锈病的防治........................................................................................................31.3小麦条锈菌...................................................................................................................31.3.1病原分类地位及形态............................................................................................31.3.2生物学特征............................................................................................................41.3.3生活史....................................................................................................................41.3.4条锈菌专化型........................................................................................................51.3.5我国条锈菌小种的命名及研究进展....................................................................61.4小麦条锈菌寄主及转主寄主.......................................................................................61.4.1寄主及转主寄主的发现........................................................................................61.4.2转主寄主的种类及分布........................................................................................71.4.3转主寄主的研究进展............................................................................................71.4.4转主寄主的作用....................................................................................................81.5小麦锈菌致病性变异...................................................................................................91.5.1突变........................................................................................................................91.5.2遗传重组..............................................................................................................101.5.3有性生殖..............................................................................................................101.6有性生殖的作用及意义.............................................................................................111.7本研究的目的与意义.................................................................................................121.8前景及展望.................................................................................................................12第二章小麦条锈菌有性菌系的分离及致病力的测定分析........................132.1材料及方法.................................................................................................................132.1.1鉴别寄主..............................................................................................................132.1.2病菌标样的采集..................................................................................................132.1.3小麦条锈菌菌系的分离......................................................................................132.1.4单孢群体的制备..................................................................................................142.1.5毒性测定..............................................................................................................142.2结果及分析.................................................................................................................14 2.2.1小檗在田间的侵染情况......................................................................................142.2.2小檗上小麦条锈菌系的分离..............................................................................162.2.3分离菌系的毒性测定..........................................................................................172.3讨论.............................................................................................................................17结论..................................................................22参考文献.................................................................23附录..................................................................29致谢..................................................................34作者简介.................................................................35 第一章文献综述1第一章文献综述1.1小麦的来源及重要性小麦是一年生长或跨年生长的温带长日照禾本科作物。与其它农作物相比较，小麦拥有较强的适应能力，所以它的种植面积位于世界之首，而具有早熟、多粒、高度适应等优点的普通小麦（TriticumaestivumL.）也就成为了广泛种植的小麦品种。普通小麦最初来源于叙利亚、伊拉克、约旦等国家，在西南亚的“新月形沃地”是第一种植区，也是小麦多样性的中心。追本溯源，四倍体小麦（含有AABB基因组）是野生的一粒小麦（含AA基因组）和拟斯卑尔托山羊草（含BB基因组）杂交的后代。在8000年前后，由于四倍体小麦和粗山羊草（含DD基因组）的一次自然杂交，加之自然的选择和人类的驯化，于是便形成我们今日普遍种植的普通小麦。该小麦是异源六倍体（2n=6x，AABBDD），有1700Mb大小且重复序列高达85%的基因组。根据记载推测得知，普通小麦起源于伊朗北部，大约在5000年前，才传入中国的黄河流域，之后又传播到中国的云南、西藏地区。由于受云南和西藏的西北部地区高山围绕、文化技术落后等因素的影响，使许多野生型性状（如断穗轴）遗留下来成为可能。但是，不可否认的是小麦传播到中国以后，经过种植方式的不断演变，不但在我国产生了形状各异的小麦品种，还形成了独具我国特色的三个普通小麦亚种即云南小麦、西藏半野生小麦及新疆小麦。于是，我们有足够的理由可以认为，我国是小麦的一个次生发源地。在全球粮食作物中占有重要地位的小麦，能够为全球35%以上的人口提供赖以生存的物质基础。而小麦在我国的总产量、消费量都位于世界之首；另外，我国的人口众多；由此可知小麦在我国的粮食作物中占据了重要的位置，其的产量及安全生产对我国经济的发展和国家的稳定都起着重要的作用，因此，小麦的安全生产受到我国相关领导的高度重视。这对小麦方面的科研工作者来说，保证小麦的安全生产是一项任重而道远的任务。而小麦条锈病又是所有生物和非生物胁迫中最具有毁灭性的病害之一，因此也给小麦条锈病的工作者带来了巨大的挑战。1.2小麦条锈病1.2.1小麦锈病的发生史及分布小麦锈病是条锈病、叶锈病和秆锈病的总称，也被称之为“黄疸病”。据记载，在有小麦种植的时候就可能有小麦锈病的发生，甚至更早。公元前700年，古罗马就有祭祀锈神的习俗，在公元前384-326年，锈病在不同的年份具有差异的现象就被古希腊的亚里士多德发现，并认为是由温度和湿度引起的。之后，小麦锈病经历一个称之为“黑色时代”的时期，直至1600年之后，锈病在世界大区流行、严重危害的情况才被记载下来。虽说我国对小麦锈病发生的历史还没有做过专门的研究，但是，据我国的小麦种 2野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定植的历史年代可推测，至少在公元前1200年，我国河南等一些地区的小麦就有可能遭受锈病的威胁。但是在1930年之前锈病的相关记载比较少。小麦锈病不仅是历史悠久的古老病害，而且还是可通过高空进行远距离传播的气流真菌性病害。由此世界范围内，有小麦种植的区域都有小麦锈病的发生。但是，小麦锈病的种类、分布及危害情况在不同地区或国家的表现是有所差别的。比如，秆锈病在美国发生比较严重，叶锈病在苏联的大部分地区普遍严重发病，条锈病主要在西欧发生，仅在南部少数加盟共和国发现（李振岐等1989）。而条锈、叶锈和秆锈在我国均有发生，但以条锈病的发生比较普遍、危害也比较严重，我国也是世界上重要的小麦条锈菌的流行区系。1.2.2条锈病的危害及流行小麦条锈菌有分布广、传播快、变异频率高的特点，因此其的暴发常常会给小麦的安全生产带来巨大的挑战。小麦条锈病之所以能对小麦造成如此之大的危害，是因为它不仅能吸收寄主植物中大量的营养物质，而且还能干扰和破坏寄主植物的正常生理功能。比如，由于锈菌的侵染导致小麦的光合作用面积减少，光合作用效率降低，进而对小麦的生长及灌浆都会产生影响；另外，由于受侵染小麦的养分减少，严重失水，灌浆受阻，因此千粒重下降，蛋白质含量降低，从而使小麦的品质严重受损，并且还易受到冻害和旱害等自然灾害的胁迫。因此，小麦条锈病对其的产量和品质都会造成巨大的破坏，且发病越早越重，对小麦造成危害也就越大（李振岐等1989）。我国被认为是世界上主要的条锈病流行区系，且其流行区系于其他国家及地区存在差异（杨华安和吴立人1990）。我国的小麦条锈病大多发生在西北、华北、西南、长江中下游等地区（陈刚等2006），并形成了三个独具特色的流行区系，即新疆流行区系，西南流行区系及西北、华北流行区系(SaariandPrescott1985)。且我国具有被称为条锈菌的“易变区”和新小种“策源地”的陇南地区，加之其又具有变异频率快、暴发强、流行速度快、范围广等特点，小麦条锈病在我国造成了10余次全国范围内的大流行，尤其是1950、1964、1990和2002这四年的大流行造成的损失最为严重。可以说其是所有的生物和非生物胁迫中最具毁灭性的病害，在条件适宜的条件下可以造成小麦达90%以上产量损失，严重影响了我国小麦的安全生产（Chenetal.2009;李振岐和曾士迈2002;Kangetal.2010;万安民等2003）。研究证实小麦条锈病流行的一个重要原因是条锈菌致病性变异所引起的新菌系的产生从而使小麦抗病品种抗性“失效”（李振岐和曾士迈2002）。历史上，小麦品种抗条锈性“丧失”的现象在我国屡次发生，并导致了7次全国范围的小麦品种更替（李振岐和曾士迈2002）。而具有小麦条锈菌“越夏易变区”或“新小种策源地”之称的陇南地区，具有适宜的气候条件，可以保证条锈菌顺利的进行越冬和越夏，即使没有其它条锈病流行区向其提供菌源的条件下，该地区的条锈菌也能顺利完成周年的循环侵染。并且， 第一章文献综述3我国条锈菌新致病小种绝大多数都是在该地区首次被发现（贾秋珍等2012;邝文静等2013;李振岐和曾士迈2002），再由该地向其它地区进行传播，因此我们有充分的理由可以认为该地的菌源在条锈病流行中起着重要的作用（庞小芳2008）。研究表明小麦秆锈菌在小檗上进行的有性生殖不仅可以提供初始菌源，还可以导致病原菌致病性变异产生新的小种，从而在秆锈病的流行及病害循环中起到重要的作用。而一直被认为以夏孢子的方式循环侵染危害小麦的条锈菌，其的有性生殖在条锈病害流行中的作用，直到其的转主寄主小檗被发现之后才得以进行。我国的学者从野生感病小檗上成功分离获得了20个小麦条锈菌系（Wangetal.2016;Zhaoetal.2013），而美国有报道表明，小檗在条锈的病害流行中不起作用，主要在秆锈的病害循环中起到作用（WangandChen2015;Wangetal.2015）。那么，在我国自然条件下，条锈菌在小檗上的有性生殖对条锈菌致病性变异是否具有作用，进而在条锈病的流行中起到作用呢？这是对小麦条锈病的持久有效的防治具有重要的意义，非常值得我们更深入的探究。1.2.3条锈病的防治春季小麦拔节和抽穗前喷施农药可在一定程度上阻止小麦条锈病的发生和蔓延，但是农药长期使用后，会使条锈菌产生耐药性，从而在一定程度上促使小麦条锈病的大暴发，并且还会带来巨大的环境压力。因此，生产实践中达成共识—使用抗病品种是防治条锈病最为环保、经济、持久有效的手段（ChenandLine1995;RöbbelenandSharp1978;WuandNiu2000）。但是，抗病品种平均被栽培使用3~5年，其的抗病性也就会“丧失”，从而使条锈病的持久、有效的防治成为一个世界性的难题（Chenetal.2009;李振岐和曾士迈2002;Wanetal.2004），也给抗条锈病的小麦育种工作者带来了巨大的压力。这就要求我们在防治小麦条锈病的时候既要坚持以品种防治为主，也要发挥药剂防治和栽培防治的作用。同时我们在进行品种防治的时候，不仅要重视群体基因的多样性、抗病品种的多元化，还要在种植时做到抗性品种的合理布局。此外我们还要着重关注条锈菌“策源地”与“易变区”小麦条锈病的发生，进而相应地延长抗性品种的使用年限，这也表明了条锈菌在小檗上的有性生殖在条锈菌致病性变异中作用对条锈病的防治具有重要的意义。1.3小麦条锈菌1.3.1病原分类地位及形态小麦条锈菌属于真菌界，担子菌门，冬孢菌纲，锈菌目，柄锈菌科，柄锈菌属。由于对条锈菌的研究不断深入，对其的命名也不断地完善，它的命名也经过了数次变更，直到1953年才出现沿用至今的命名即小麦条锈菌专化型PucciniastriiformisWest.f.sp.triticiErikset.Henn.（Stubbs1985）。小麦条锈菌的繁殖体为五种类型的孢子即夏孢子（urediospore）、冬孢子（teliospore）、 4野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定担孢子（basidiospore）、性孢子（pycniospore）和锈孢子（aeciospore）。夏孢子为单胞，球形，鲜黄色，孢子壁无色，内含物为黄色，有6~16个排列不规则的芽孔。在小麦的叶片、叶鞘、茎秆上形成肉眼可见的、排列成行的、卵形的夏孢子堆。冬孢子双胞，棍棒状，顶部扁平状或斜切状，分割处缢缩，顶端壁厚，褐色，上浓下淡，下部瘦消，短柄，有色，常见其在叶片背面生长，生长于叶鞘上的相对比较少，形成灰黑色、排列成条的冬孢子堆，并长期埋于表皮下。性孢子与锈孢子生于以小檗为主的转主寄主上。性孢子器小，烧瓶状，橙黄色，埋生于叶片表皮下，孔口外露，成熟时可以形成大量受精丝（单胞、无色）和性孢子（椭圆形、单胞）。锈子器生于叶片背部，且与性子器生长位置相对，初始生于转主寄主的表皮下，后突破叶片表皮，成簇聚生，呈杯状。锈孢子球形，表面光滑，橙黄色，在锈子器内链状生长。1.3.2生物学特征研究并掌握条锈菌的生物学特性，可为研究小麦条锈病的发生规律和防治打下坚实的基础。条锈菌是喜低温、气流传播、活体营养、高度专化型的转主寄生真菌。其的流行受环境因素的影响比较大，特别对温度、湿度条件比较敏感。对锈菌无性循环中的重要阶段如夏孢子的越夏、生长、萌发、侵染和繁殖都会产生影响；在有性生殖阶段，特别是冬孢子的休眠、萌发以及侵染转主寄主中具有重要作用。且其必须在活体寄主植物上才能完成越夏或越冬的阶段，从而度过不良环境，瘦弱的寄主植物也不利于其的生长、繁殖。条锈菌在我国具有群体毒性丰富、遗传多样性高以及变异频繁的特点，并且还有被称为条锈菌“策源地”的陇南地区，该地区可为条锈菌侵染、繁殖和循环都提供了适宜的环境条件，这都极大地增加了我国条锈病的防治难度，也给条锈病的科研工作者带了巨大的挑战。1.3.3生活史锈菌属于转主寄生真菌，即其要完成整个生活史则必须寄生于两个不同种的植物上(Alexopoulos1979;Schumann2010)。而小麦条锈菌一直都被认为只具有无性生殖阶段，可以在一种植物上完成侵染循环，而缺少相应的有性阶段。直至2010年，有研究表明了小檗可以作为条锈菌的转主寄主（Jinetal.2011），并可在其上进行有性生殖。从而，小麦条锈菌大循环才得以完善（图1-1）。性孢子阶段（0期）是条锈菌生活史中的第一个阶段，在这个阶段中冬孢子萌发产生担孢子，担孢子在适宜的条件下可以侵染转主寄主，并在转主寄主上形成单核的性孢子（pycniospore）和受精丝（receptivehyphae），之后性孢子和受精丝融合并在寄主组织内形成双核的菌丝，然后形成单孢、双核的锈子器（aecia），即锈孢子阶段（I期）。这个阶段不会侵染转主寄主，但是锈孢子（aeciospore）可以侵染1种或多种禾本科的初生寄主，并在初生寄主上产生夏孢子（urediniospore），这就是夏孢子阶段（II期），夏孢子单孢，通常是双核，夏孢子可以循环侵染初生寄主完成其无性阶段。无性阶段可以持续整个寄主的生长期，从而造成锈病的大区流行。在谷 第一章文献综述5类作物生长后期或者作物收获期或者外界条件不适宜夏孢子侵染和萌发时，就会在禾谷类寄主植物上形成冬孢子以便度过不良环境。这就是冬孢子阶段（III期），条锈菌的冬孢子为双胞、双核，有的锈菌（如秆锈菌）的冬孢子需要通过长时间的休眠以后才能够萌发，但条锈菌的冬孢子不需要经过休眠或经过短暂休眠后就能萌发。冬孢子打破休眠萌发，并在每一个冬孢上产生一个附有四个担孢子的先菌丝，这就是担孢子阶段（IV期）。担孢子是单胞，通常为单核，但是在一些锈菌中发现了1、2或多个核的现象（AniksterY.1986;WangandChen2012;Wangetal.2015;Zhaoetal.2013,2016a）。担孢子不能侵染初生寄主，但是可以侵染其的转主寄主并完成有性阶段，从而完成锈菌的全孢大循环。（引自Zhaoetal.2016a）图1-1.小麦条锈菌的生活史(citedfromZhaoetal.2016a)Figure.1-1LifecycleofPucciniastriiformisf.sp.tritici1.3.4条锈菌专化型锈菌的寄生专化性是指条锈菌对一定属种或品种的寄生植物的选择或适应性的选择，也就是说是植物抗逆性长期选择的结果。因此，寄主专化型有可能是进化的标志。对寄生专化性的研究可以为抗锈品种的合理应用打下坚实的基础，从而对小麦锈病的防治及抗锈性品种的长期使用都具有重要的意义。人们对锈菌专化性的研究，从1894年Eriksson提出禾本科植物秆锈菌寄生专化的现象开始，并根据秆锈菌在不同种属的禾本科上的适应性，将其划分为了6个专化性（formaspecialis即f.sp.），之后又经过不断的补充，便形成了目前的9个秆锈菌专化型。但是，由于专化型之间存在明显的形态差异，又将其改为变种（variety即var.）。随后，在小麦叶锈菌、条锈菌和燕麦冠锈菌中也陆 6野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定续发现类似的专化型现象的存在。条形柄锈菌的5个专化型最早是Eriksson提出的（Chenetal.2005;陆师义等1956）。之后分别在1959、1960和1967这三年陆续有三个不同的专化型被报道（Britton1956;Manners1960;Tollenaar1967）。但是，由于小麦和大麦的条锈菌有一定重叠现象的存在，所以其间没有严格的划分标准。直到2004年，大麦和小麦条锈菌间存在显著差异的一个专化型才被Wellings等（2004）发现并报道。1.3.5我国条锈菌小种的命名及研究进展小麦是条锈菌的主要初生寄主。大麦、黑麦以及披碱草属、山羊草属、冰草属等禾本科杂草也能作为一些小麦条锈菌小种的寄主。由此可知条锈菌有明显的生理分化现象，因此可通过识别寄主的不同将其划分为形态相似，但致病性存在差异的生理小种。因此条锈菌小种的命名引起了广泛的关注，但其命名存在明显的地域差异。比如，美国对小种的命名采取的措施是发现一个命名一个，至今已经有140多个小种被命名（Chenetal.2010）；而我国则是根据其在不同鉴别寄主上的表型特征先暂定为一个新的致病类型，再由全国锈病协作组根据其在田间的毒性频率进行统一命名。直至1944年，方中达在我国西南地区，用包括7个小麦品种和一个大麦品种的一套鉴别寄主鉴定出条锈菌生理小种9个（Fang1944），在其的带领下，中国展开了对条锈菌生理小种的研究工作。汪可宁（1963）在之前研究的基础上，依据鉴别寄主必须有一套能够区分病原菌内部毒性及毒性动态变化和准确、科学地对已鉴定的小种进行命名的体系这两个标准，并以原德国鉴别寄主在应用中存在的问题引以为戒，提出了中国最早的一套小麦条锈菌生理小种鉴别寄主体系，这套鉴别体系由保春128、西北丰收、Trigo-EurekaF.S.S.、StrubesDickkopf、西北54号、Fulhard及碧蚂1号这7个小麦品种组成。中国鉴别寄主体系通过淘汰已经不具有鉴别能力的品种以及增加具有鉴别能力的新品系，经过1997、1982、1983、1992等几年的不断完善，到2008年形成包括Triticumspeltavar.album和贵农22这两个品种在内共19个品种的鉴别寄主体系，并一直沿用至今。自我国最早一套条锈菌小种鉴别体系提出之后，我国对条锈菌的毒性分析与监测工作达60余年，确定了33个小种（race）（条中系列）和40多个致病类型（pathotype）（洛10类群、洛13类群、水源类群）。从而为我国抗条锈病的宏观防控提供了重要理论依据。1.4小麦条锈菌寄主及转主寄主1.4.1寄主及转主寄主的发现条锈菌是一种必须从活的寄主植物上汲取生长所需营养物质的专性寄生真菌，即是活体营养型的真菌。通常情况下认为，凡是能被小麦条锈菌侵染并在其上表现为感病的植物，我们都可以称之为小麦条锈菌的寄主（林晓民和李振岐1990）。研究表明，小麦是条锈菌的主要初生寄主，但大麦、黑麦等也可以作为小麦条锈菌的初生寄主（Stubbs1985;夏敏2003）。 第一章文献综述7条锈菌是一种必须在两种不同科或属的植物上才能完成整个生活史的转主寄生真菌。一直以来小麦条锈菌都被认为以夏孢子的方式循环侵染初生寄主（小麦为主的禾本科植物）来完成无性生活阶段及病害循环，有性生殖阶段的研究大都以失败告终，因此条锈菌被误认为不存在有性阶段。直至Jinetal.（2011）通过室内人工接种表明小檗能够为条锈菌的转主寄生提供场所之后，小麦条锈菌有性生殖的研究才得以开始。随后，赵杰等（2011,2015）等证实了在中国有超过20种的小檗能够作为小麦条锈菌的转主寄主。迄今为止，研究表明有33种小檗和十大功劳可以为条锈菌的转主寄生。1.4.2转主寄主的种类及分布小檗属于毛茛目小檗科，是一种灌木。据记载，世界上近半数的小檗种类都可以在中国发现，多达250余种，并且大多数小檗都分布在我国的西北和西南地区。本实验室在2010和2011年对西北及西南地区的甘肃、四川、陕西、贵州和云南的野生小檗进行调查，结果发现大多小檗都毗邻麦田生长（赵杰等2011）。另外，这些地区也是小麦条锈菌的越冬和越夏区以及条锈病发病重地（Wanetal.2004;康振生等1987)，且都可以发现被锈菌侵染野生小檗的存在，以及我国也是世界上小麦条锈病流行范围最大的地区(SaariandPrescott1985)。由此可知，小檗可在小麦条锈病的循环及流行中起到作用，但是起到什么样的作用还需要我们不断地去探究。小檗科，十大功劳属的十大功劳也能够作为小麦秆锈菌的转主寄主，Wang等（2013）报道在人为控制条件下，十大功劳可以作为小麦条锈菌的转主寄主。而我国的十大功劳种类繁多，世界多半数种类的十大功劳在我国都有分布，并主要集中在贵州、云南、四川、浙江、广东、广西、江西、湖北等省（应俊生2001;陈谦海等2004）。但是，十大功劳可作为小麦条锈菌转主寄主的相关研究在我国还没有报道。1.4.3转主寄主的研究进展从锈菌的转主寄主植物被发现至今已经有300多年的历史。但是，直到小麦条锈菌的转主寄主被发现之后，才证实所有锈菌都属于转主寄生真菌。它们以夏孢子在禾本科或草本科植物上完成无性生殖阶段，以锈孢子在不同科或种的其它植物上完成有性生殖阶段。在所有锈菌中，秆锈菌是最早被发现与小檗存在关系的。早在1660年，法国的鲁昂镇就有铲除谷类附近小檗的一条法规被颁布，但当时并不知道这是何种原因（Schaferetal.1984）。1726年在美国的康乃迪克州通过了禁止种植小檗的法规，随后美国的马萨诸塞州和罗德岛州也分别在1754和1766年通过了该条法规。从此，也拉开了铲除小檗战役的帷幕，并持续了半个多世纪（Roelfs1982）。deBary（1866）证实秆锈菌在禾本科植物和小檗上存在转主寄生现象。与小檗同科的十大功劳也被证明可以作为秆锈菌的转主寄主。目前已有90多种或变种的小檗、十大功劳以及它们杂交的后代都能被秆锈菌侵染，但是，有20多种小檗和十大功劳对秆锈具有抗性（Roelfs1985）。即便是对感 8野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定病的转主寄主植物，只是嫩叶和嫩枝易于侵染，由此可以看出，锈菌的转主寄主植物的范围远远窄于其的初生寄主。Jackson和Mains（1921）证明了唐松草（Thalictrumspp）可作为叶锈菌的转主寄主。随后，Ducomet和Schad、Eremeeva、Alabouvette和Meneret以及Ito分别在1925、1926、1927和1934年通过相关试验为唐松草能够作为小麦叶锈菌的转主寄主提供了证据。从1964到1980年，小麦叶锈菌的其它种类的转主寄主也被相继发现。比如小乌头（Isopyrumfumarioides）在西伯利亚被发现（Chester1946），牛草舌属（Anchusaspp.）在葡萄牙被发现（d’OliveiraandSamborski1966），在意大利（Sibiliac.1960）和俄罗斯（Azbukinaz.1980）发现铁线莲属（Clematisspp.）。d’Oliveira&Samborski（1966）表明不同转主寄主上的叶锈菌属于不同的种，且具有杂交不亲和性。直到1894年，才开展了小麦条锈菌转主寄主相关的研究，当时有学者期望能从叶锈菌的转主寄主家族中的紫草科中获得条锈菌的转主寄主（Eriksson&Henning1894），但未获得成功。由于小麦条锈菌和P.koeleriaeArth.，P.arrhenatheriEriks.及P.montanensisEllis.这三种柄锈菌具有高度的相似性，且小檗和十大功劳均能为这三种柄锈菌的有性生殖提供场所，因此Main（1933）提出小檗和十大功劳可能是小麦条锈菌的转主寄主的假设。Tranzschel（1934）希望能通过条锈菌的担孢子接种新缬草属的植物来获得其的转主寄主，但也未获得成功。Hart和Becker（1939）在条锈菌的转主寄主的研究中也作出了巨大的努力，但仍未能够如愿。之后小麦条锈菌就被误认为只存在无性阶段，直到有学者通过人工室内接种试验，证明小檗能够为小麦条锈菌的转主寄生提供场所（Jinetal.2010），这一发现使小麦条锈菌的研究迈入一个“新时代”，也使研究者们对条锈菌的生活史产生新的认识。本实验室从2010年开始，就对小檗的种类及分布展开了系统的调查，并通过室内试验证实中国有28种小檗可以作为条锈菌的转主寄主，并且首次从田间自然感病的小檗上分离获到小麦条锈菌菌系，为自然条件下有性生殖后代的分离提供了直接证据（Wang2016;Zhaoetal.2013）。在美国，有学者通过在人为控制条件下的研究，也证实十大功劳也可以作为条锈菌的转主寄主（WangandChen2013）。从而，为小麦条锈菌有性生殖方面的研究打下坚实的基础。1.4.4转主寄主的作用对于一些锈菌来说，冬孢子是其越冬的唯一阶段，因此转主寄主在其生活史中是必不可少的，并有可能起到提供初始菌源的作用。比如冬天严寒的西伯利亚东部，不适宜冬小麦的种植，只有春小麦种植，秆锈菌的夏孢子在该地不能顺利的越冬；由于该地区特殊的地理环境，使其在秋季的时候也不能通过气流传播从其他区域获得菌源。所以只有在冬孢子打破休眠之后萌发产生担孢子，担孢子再侵染蓝堇草（I.fumarioides）产生的性孢子才能成为当地秆锈菌的唯一来源（Brizgalovaetal.1935,1937）。又比如在美国太平洋的东部，虽然冬小麦是该地区主要种植的农作物，但是，秆锈菌不能以菌丝的形 第一章文献综述9态在初生寄主的组织内越冬，冬孢子也成为其越冬的唯一阶段（Wangetal.2012,2015）。从其它流行区传入该地的菌源也比较少，因此，转主寄主上产生的锈孢子成为当地的主要菌源。以上研究均证实在自然条件下，转主寄主可以在秆锈病害流行及循环中起到提供初始菌源的作用。Stakman等（1934）通过研究证实，大麦和小麦秆锈菌的有性生殖可导致新菌系的产生；Newton&Johnson（1944）从小檗上获得了新的燕麦秆锈菌菌系；Wang等（2012）从爱达荷北部的感病小檗上分离获得的16个菌系被鉴定为10个小麦秆锈菌小种。这些研究都证实了有些锈菌在转主寄主上的有性生殖可能在病原菌致病性变异中起到作用，从而引起新小种的产生。Roelf&Groth（1980）将从华盛顿东部和爱达荷北部小檗丛附近获得的秆锈菌系与以无性生殖的洛基山东部的菌系进行秆锈毒性多样性分析。结果表明，从有性生殖分离获得的426菌系被鉴定为100个小种（23.5%），而在无性生殖的2377个菌系中只鉴定为17个小种（0.07%），锈菌有性生殖发生的地区其小种的数量显著高于无性生殖的地区。最近，美国太平洋西北部的秆锈菌也被证明具有丰富的遗传多样性（Jinetal.2014;Rouseetal.2009;Wangetal.2015）。这也证明了转主寄主上的有性生殖，可以使一些锈菌群体多样性更加丰富。近期，随着小麦条锈菌转主寄主的确定之后，小麦的三大锈病均是转主寄生真菌。一般情况下，转主寄主在锈病循环流行中具有提供初始菌源、产生新的小种以及丰富群体多样性的重要作用。但是转主寄主在锈菌病害流行及病原菌变异中的作用因锈菌的种类和生态环境的不同而有所差异。小麦秆锈菌的转主寄主的发现相比较早，因此其的作用已经得到证实。而条锈菌方面的研究相对较少，目前仅有我国的学者在自然条件下，从感病小檗上分离获得了条锈菌，为我国条锈菌有性生殖的发生提过了直接的证据（Wangetal.2016;Zhaoetal.2013），但分离比相对比较低。小檗在条锈病害流行中是否也起到了如此重要的作用还有待于进一步的研究。1.5小麦锈菌致病性变异人们将具有一定抗病基因品种的专化致病能力称为条锈菌的致病性。而目前新毒性小种产生从而导致抗性品种抗性“失效”的主要原因是病原菌致病性变异引起的。条锈菌主要通过突变、体细胞重组、异核作用、有性生殖等途径引起病原菌致病性的变异。1.5.1突变突变是指细胞在分裂时基因发生错配或者是由于化学物质、辐射等外界因素所引起基因的变化。从广义上看染色体的畸形也属于突变。小麦上的三种锈菌均有因突变而引起锈菌致病性的变异，进而产生新的致病类型。Newton等（1930）人发现秆锈菌的突变可以引起其颜色和致病力的变化。Roberts在1936年最先提出小麦叶锈菌存在突变现象，随后叶锈菌存在突变的现象被越来越多的学者发现。在美国西部，由于突变产生新 10野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定小种是导致Moro这个小麦品种的抗性失效的主要原因（BeaverandPowelson1969）。1932年有学者证明小麦条锈菌通过突变也可以产生新的生理小种（Gassneretal.1932）；Stubbs等（1968）通过X射线照射成功的获得了条锈菌的突变体；商鸿生等（1994）利用紫外线处理CYR29获得了7个致病力变异菌系；黄丽丽等（2005）利用紫外线对CYR29处理获得了Jubi和Funo两个菌系；王欣丽等（2009）利用紫外线对CYR23处理获得致病力增强的突变体；姚秋燕（2006）用EMS化学诱变剂对条锈菌进行诱变也成功获得了突变体，并且该诱变剂对不同小种的突变率也存在差异。这些研究都为小麦条锈菌致病性变异及相关研究做出了贡献，但是突变率较低（康振生等2015）。1.5.2遗传重组一般情况下，异核作用是指芽管或菌丝融合时进行的核交换和重新组配的现象。对锈菌通过异核作用产生新的致病类型的研究相对较晚。秆锈菌中存在异核现象并可以引起新的致病类型产生最早是被Nelson（1955）发现的；赵来顺等（1964）发现条锈菌芽管融合的现象；Little&Manners（1969）在排除突变和有性过程的室内可控条件下，通过条锈菌不同小种的混合接种首次证实了条锈菌也能通过异核作用产生新的致病类型。而在自然条件下小麦条锈菌的异核作用的发生情况未见报道，直到康振生等（1993a,1994a,1994b）通过系列荧光染色及电镜技术，观察到了异核作用所特有的胞间菌丝的融合、细胞核经隔膜溶孔邻近菌丝细胞间移动等一系列现象，从而表明了我国存在条锈菌通过异核作用产生新菌系的现象（康振生等1991,1993b）。体细胞重组的前提是异核现象的产生。Taylor通过对条锈菌白化菌的研究发现了体细胞重组产生新小种的现象（Taylor1976）。Manners（1988）在已有小麦条锈菌体细胞杂交研究的基础上，在实验室条件下成功观察到推定的重组小种。程晶晶等（2015）在一系列混合的条锈菌接种实验的基础上，利用SSR标记表明了在室内接种条件下，条锈菌能通过体细胞重组导致新的毒性小种产生。在中国小麦条锈病具有高度的遗传多样性，以及SSR标记技术证实了在中国陇南地区存在体细胞重组的现象，且频率平均为16.6%。从而为我国在自然条件下，提出小麦条锈菌遗传重组可导致病原菌致病性变异具有重要的意义。1.5.3有性生殖小麦条锈菌的转主寄主被发现之后，三种锈菌被证实均是由性、锈、夏、冬和担这5种类型的孢子组成的全孢型大循环锈菌。有性繁殖被认为是诱导锈菌致病性变异的主要途径。Stakman等（1919）、Craigie（1927）、Gassner等（1933）及Jin（2011）等研究证实，在叶锈菌和秆锈菌中存在有性生殖引起病原菌致病性变异产生新小种的现象。研究证明在欧洲、北美的一些国家，秆锈菌在小檗上的有性生殖不仅可以为邻近的小麦提供初始菌源，而且可导致病原菌致病性变异进而产生新小种，从而加剧秆锈病的流行与发生。而一直被认为只存在无性性阶段的条锈菌在这方面的研究难以进行。直到 第一章文献综述11小檗可以作为条锈菌转主寄主被证实之后，条锈菌的有性繁殖在其致病性变异中作用的研究才得以展开。Wang等（2012）证明了条锈菌小种在有性生殖阶段存在遗传重组与分离的现象，从而表明了其在条锈菌致病性变异中具有重要作用。Zhao等（2013）和Wang等（2016）从自然感病小檗上共分离得到了20个小麦条锈菌菌系，证实自然条件下条锈菌在小檗上能够完成有性生殖，但分离菌系较少。Wang等（2015）报道在美国，由于条锈菌冬孢子的存活期与小檗生长期不吻合，并且当地温湿度条件也不适合条锈菌的生长，从而认为在美国，小檗在小麦条锈的病害循环中不起作用，主要对小麦秆锈病产生重要的影响。那么我国小麦条锈菌在小檗上的有性生殖在其致病性的变异及病害的流行中是否起到作用还有待于进一步的研究。1.6有性生殖的作用及意义病原菌适应变异的能力很大程度上是由生殖方式决定的，有研究证实无性阶段的突变、异核作用及体细胞重组等均可导致新菌系的产生，但与其相比较，有性生殖具有使病原菌快速产生新的毒性基因克服寄主抗性的特点，因此有性生殖在基因型多样性中起到更为重要的作用（McDonaldandLinde2002;王宗华等1998）。近年来，国内外研究都证实小麦条锈菌在我国具有独特的致病毒性谱，即丰富的基因型多态性、较高的毒性多样性和高的遗传重组率。我国作为世界上主要的小麦条锈病流行区，并且还有被称为小麦条锈菌群体的“易变区”和“策源地”的陇南地区，那么，我国条锈菌的有性生殖是否在其复杂的毒性群体结构中起到作用呢？许多锈菌的科研工作者也为解答这一疑惑做出了巨大的努力。Steele等（2001）发现澳大利亚和新西兰地区，以无性繁殖方式生存的条锈菌群体的遗传多样性很低。我国也有学者利用分子标记技术，对我国陇南地区1年内采集的标样和法国20年内采集的标样，进行群体遗传多样性的比较，结果表明，我国群体多样性达法国总和的7倍以上（Duanetal.2010）。Mboup等（2009）和Ali等（2010）根据我国的条锈菌有较高的遗传重组频率和较强的冬孢子产生能力，他们大胆的猜测小麦条锈菌在我国存在有性生殖阶段。Waterhouse（1929）首先证明了秆锈菌可以通过小种间的杂交产生新类型。在北美，小檗在小麦秆锈病流行中起到重要作用（Jin2011;Roaneetal.1960）。Ali等（2014）发现在巴基斯坦境内毗邻喜马拉雅地区，小麦条锈菌有性生殖的存在。我国小檗具有种类多、分布广、毗邻麦田生长的特点，并且已证实有28种小檗可以作为条锈菌的转主寄主（Zhaoetal.2011,2013）。上述研究都表明了我国小麦条锈菌的有性生殖在丰富其的遗传多样性中起到重要作用。研究表明，在美国太平洋西北部，秆锈菌在小檗上的有性生殖在秆锈的病害流行中起到提供初始菌源和产生新的小种或致病类型的两个重要作用（Jin2011）。但是，由于该地区不具有条锈菌冬孢子侵染小檗的温、湿度条件以及冬孢子活力的存活期与小檗的生长时期不吻合等条件，从而也表明了该地区的小檗在小麦条锈病的流行中不起作用 12野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定（Wangetal.2015）。而中国学者从自然感病的野生小檗上成功分离到了小麦条锈菌菌系，但是分离比较低（Wangetal.2016;Zhaoetal.2013）。因此，小檗在小麦条锈菌致病性变异产生新小种以及病害流行中的作用还需要更深入的研究。1.7本研究的目的与意义在小麦的生产过程中会受到各类生物和非生物胁迫，然而以小麦条锈病造成的破坏最大，损失最为严重。抗病品种的利用被认为是防治条锈病最为有效、经济、环保及持久的手段。然而，由于抗性品种抗性“丧失”成为感病品种，往往引起该病害的大流行，造成巨大的经济损失。研究表明，致病性变异产生新的致病类型是引起抗品种病性“失效”的根本原因。长期以来，小麦条锈菌有性生殖一直是一个未解谜团，直到近年有研究表明小檗可以作为小麦条锈菌的转主寄生的植物之后，小麦条锈菌有性生殖方面的研究才成为可能。因此，本研究拟通过对自然感病小檗上条锈菌的分离、致病力测定与分析，从而为在自然条件下，在中国，小麦条锈菌的有性生殖是常年发生的提供直接证据，同时也为转主寄主小檗在中国小麦条锈的发生与流行中起作用提供证据。研究结果对中国小麦条锈病的长期、有效防控措施的提出与全面制定以及中国小麦的安全生产均具有重要的意义。1.8前景及展望通过条锈病工作者长期坚持不懈的努力，中国在条锈病的综合防治方面取得了巨大的成就，在国际上占有重要的学术地位。但是，由于小麦条锈菌致病性变异导致新致病类型的不断出现，从而使抗性品种的抗性“丧失”，使条锈病的持续、有效的防治成为了一个全球性的难题，也给条锈病的科研工作者带来巨大的挑战。目前已经有足够的证据证明小麦条锈菌可在小檗上完成有性生殖。另外，在中国条锈菌的“越夏区”和“冬繁区”麦田周围，小檗毗邻麦田生长的情况非常普遍，而且锈菌侵染普遍存在。这些都为揭示在中国自然条件下，小檗在条锈菌致病性变异和病害流行中起到作用提供了证据，无疑为中国条锈病的综合防治提供了新的策略和途径。然而，自然条件下小檗在条锈菌致病性变异、群体结构和病害循环中具体起到什么样的作用以及铲除麦田附近的小檗能否降低条锈菌致病性的变异的速度还有待于进一步的研究。 第二章小麦条锈菌有性菌系的分离及致病力的测定分析13第二章小麦条锈菌有性菌系的分离及致病力的测定分析长期以来，小麦条锈菌的研究者对其有性阶段的探索都以失败告终，导致人们误认为条锈菌只存在无性阶段，而不存在有性阶段。直到Jin等（2010）通过室内人工接种，证明小檗能够作为条锈菌的转主寄主，才证实小麦条锈菌存在有性阶段。2011和2013年从自然感病的野生小檗上成功分离到了条锈菌菌系，证实在中国自然条件下，条锈菌可在小檗上完成有性生殖阶段并在条锈菌的致病性变异中起到作用（Wangetal.2016;Zhaoetal.2013）。美国有学者报道，小檗在小麦条锈病害流行中不起作用，主要是在小麦秆锈病中起到作用（Wangetal.2015）。有性生殖与无性生殖相比，其对病原菌适应变异能力及基因型多样性有更大的影响。因此，深入研究条锈菌在小檗上的有性生殖对其致病性变异的影响及在病害流行中的作用，对条锈病的持久、有效的防治具有重要的意义。2.1材料及方法2.1.1鉴别寄主中国鉴别寄主包括19个小麦品种（如附表1），条锈病的感病小麦品种铭贤169（MX169）用于感病对照和病原菌的分离、单孢子堆的挑取及菌种的繁殖。所用小麦种子均由本实验室提供。所用小麦品种在接种前一周左右，将籽粒饱满的小麦种子播在装有培养基质（内蒙古蒙肥生物科技有限公司生产）的塑料培养盆（7cm×7cm×8cm）中，并插入相应的标签牌，标注具体信息。然后将小麦移入温度为16±3℃，光周期为16h/8h（光照/黑暗）的无锈菌室中培养。在培养过程中适时补水。待小麦一叶展平二叶刚露出时使用。2.1.2病菌标样的采集本实验室自2010年以来连续对中国的野生小檗展开了年度调查，发现中国陕、甘两省广泛分布有多种小檗，如短柄小檗、堆花小檗、陕西小檗、少齿小檗、假豪猪刺等。本研究于2015年5、6两个月份，在甘肃徽县石佛村、陕西凤县黄牛铺镇及宝鸡新街镇这3个不同地点，不同株的小檗上采集带有新鲜的、成熟的锈子腔的小檗叶片，将采集的叶片按照地点、小檗种类的不同分别装入A4纸张大小的纸袋中，并分别标记后放于低温盒中保存带回实验室用于菌系的分离。将装有采集叶片的纸袋内加入干燥剂放于4℃中保存，最好在2d内使用。2.1.3小麦条锈菌菌系的分离将在同一地点采集同种小檗上的叶片标样，用吹风机的凉风对其干燥处理，再对附有锈子腔的那一面进行喷雾处理，以其表面有水雾状为佳，然后将叶片有锈子腔的一面向下，平铺在一块平展的、且与培养盘大小相当的铁丝网上，尽量避免叶片间的重叠。 14野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定随后，将其置于距离一盘生长至一叶期的小麦幼苗（MX169）上方，大约为10cm，且小麦在使用前要经过脱蜡处理，并喷去离子水，以叶片表面附有水雾为佳。将该小麦苗放在温度为10℃，黑暗的保湿培养箱中保湿，一般时间为36~48h。然后，将小麦取出并对其进行隔离处理，之后将其放在光周期为光照16h/黑暗8h、温度为13±3℃的无锈菌培养室中进行培养。培养期间，定期观察，及时将有花斑产生的小麦幼苗移入新的育苗盆中，并用圆形透明塑料罩进行隔离，用塑料培养皿盖或两层纱布罩在隔离罩的上方，最后放入同样条件下的无锈菌培养室中培养。2.1.4单孢群体的制备为了避免夏孢子堆间的污染，当标样菌系在小麦叶片上有夏孢子堆产生，但是孢子堆还还没有开裂的时候，用大头针随机挑取单个孢子堆，接种在一叶期、经过脱蜡处理、新培养的MX169叶片的正面。在挑取下一个夏孢子堆时要及时更换大头针，每个标样菌系挑取15~20个单夏孢子堆。接种后的小麦幼苗喷去离水使叶片表面形成水雾，然后用塑料隔离罩隔离，并置于10℃黑暗条件下的保湿箱内进行保湿，一般为24h。之后，按2.1.3中的菌系分离的培养方法和条件进行后续培养。接种后约两周左右夏孢子开始破裂时分别收集单夏孢子堆（以下简称单孢）菌系产生的新鲜夏孢子。收集的夏孢子在MX169进行扩繁，以获得足够的菌量用于毒性的测定，保湿和培育方法与上述操作步骤相同。2.1.5毒性测定为了确定从小檗上分离得到的8个小麦条锈菌菌系及从这8个菌系分离获得的93个单孢群体的毒性，我们将这些菌系分别在19个中国鉴别寄主上进行毒性的测定，并以其在MX169上的反应作为对照。接种、保湿、培养方法同2.1.3中的操作步骤相同，于17~20d的时候，对这些菌系在中国鉴别寄主上的表型进行鉴定，并依据反应型划分的0，0；，1，2，3和4共六级分级标准进行表型鉴定并记录，具体标准如附表2。其中，反应型0~2级为抗病反应型（avirulence，A），3~4级为感病反应型（virulence，V）。2.2结果及分析2.2.1小檗在田间的侵染情况通过对田间小檗的调查，结果表明在春季自然条件下，假豪猪刺（BerberissoulieanaSchneid.）、少齿小檗（B.potaniniiMaxim.）和陕西小檗（B.shensianaAhrendt）这3种小檗均能受到锈菌不同程度的侵染（如图2-1）。由于一个或多个担孢子可以同时侵染一个小檗叶片，所以在同一个小檗叶片上我们可能会看到多个性子器病斑产生的现象。不同小檗上的性子器病斑呈现出来的颜色也是有所差异的，比如在受锈菌侵染的假豪猪刺叶片上为明显的暗红色，而在受锈菌侵染的少齿小檗与陕西小檗上则呈现的颜色较淡，为黄褐色。3种受侵染的小檗均能在其叶片背面产生锈子腔，完成锈子器阶段。通常情 第二章小麦条锈菌有性菌系的分离及致病力的测定分析15况下，我们见到小檗叶片受锈菌侵染的现象比较多。但是，当叶片生长变老时，不太适宜锈菌侵染的时候，其幼果和嫩茎也会被侵染（图2-2），从而小檗被锈菌持续侵染的时间也相应地延长了。图2‐1自然条件下受锈菌侵染的野生小檗Fig.2-1NaturalinfectionofbarberryspeciesbyPucciniaspp.undernaturalconditionsinspringA-C:假豪猪刺;D-F:陕西小檗G-I:少齿小檗.A-C:BerberissoulieanaSchneid;D-F:B.shensianaAhrendt;G-I:B.potaniniiMaxim. 16野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定图2-2小檗果实及嫩茎上侵染产生的锈子器Fig.2-2AeciaproductionofPucciniaspp.onyoungfruitsandtwigsofbarberry(BerberisshensianaAhrendt)undernaturalinfectionconditionsinspringA:幼果;B:嫩茎A:Youngfruits;B:Youngtwigs.2.2.2小檗上小麦条锈菌系的分离从采集的3种感病小檗中成功分离获得8个小麦条锈菌菌系（附表1）。其中，1个小麦条锈菌菌系标样是从甘肃徽县石佛村的假豪猪刺（B.soulieanaSchneid.）上分离得到（记为U1）；2个小麦条锈菌系标样来自陕西凤县黄牛铺镇的少齿小檗（B.potaniniiMaxim.）上（分别记为U2和U3）、5个小麦条锈菌系标样是从陕西宝鸡新街镇的陕西小檗（B.shensianaAhrendt）上分离得到的（记为U4-U8）。这8个菌系在MX169上都表现出条锈病典型的症状部分如图2-3。通过随机挑接单个夏孢子堆的方法，对这8个条锈菌菌系进行单孢子堆的纯化，共成功地获得了93个单孢菌系群体。图2‐3分离获得的部分条锈菌标样在小麦感病品种MX169上的反应Fig.2-3PartialsamplesofPucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst)producingurediaonleavesofsusceptiblewheatcv.Mingxian169A.假豪猪刺上获得的一个条锈菌标样;B.少齿小檗上获得的条锈菌标样;C.陕西小檗上获得的条锈菌标样A.APstsamplerecoveredfromBerberissoulieanaSchneid;B.APstsamplerecoveredfromB.potaniniiMaxim;C.APstsamplerecoveredfromB.shensianaAhrendt. 第二章小麦条锈菌有性菌系的分离及致病力的测定分析172.2.3分离菌系的毒性测定对从小檗上分离得到的8个小麦条锈菌系在中国鉴别寄主上进行毒性测定，并与目前已知的条锈菌小种和全国小麦条锈菌生理小种监测数据（2013和2014年度）进行比对分析可知，从自然感病的野生小檗上分离获得的8个菌系，在中国鉴别寄主上都表现出不同的毒性（附表3）。其中，菌系标样U1与Su11-126的毒性完全匹配，剩余的7个菌系标样，都和目前已知的小种毒性存在差异，并且这7个菌系的毒性也不相同，所以，确认为它们为新的致病类型。菌系U2的毒性与小种Su11-126比较接近，但是U2在鉴别寄主洛夫林13上的反应型为混合反应型，而在Su11-126上则为感病反应。菌系U6和U7的毒性类型与Hy8小种类似，但仍然存在有差异。菌系U6的毒性与小种Hy8-1在鉴别寄主小麦基因型TrigoEureka(Yr6)、保春128、丹麦1号和水源11（YrSu）这4个小麦基因型上的表现不同，菌系U6均为混合型反应，而Hy8-1则为感病反应。同样地，菌系U7和Hy8-1在维尔（YrVir1,YrVir2）、丹麦1号、尤皮2号（YrJu1,YrJu2,YrJu3,YrJu4）和中四这4种鉴别寄主上表现不同，菌系U7在这四种鉴别寄主上表现为混合反应型，但Hy8-1在前三个鉴别寄主中表现为感病，在中四则表现为抗病。对从感病野生小檗上分离获得的8个菌系进行挑取单个夏孢子堆获得的93个单孢群体在中国鉴别寄主上进行的毒性测定，其结果为，93个单孢菌系可划分为47个不同的毒性类型（附表4）。其中，14个为已知小种的类型，33个为新的致病类型；56个已知小种，37个新小种（附表5）。CYR31、CYR32、Fc-10、Fo-7、Fo-8、G22-68、Hy-33、Hy-37、Hy-64、Hy-68、Hy8-1、Su11-126和Su11-5-3这14个已知的小种类型，这其中既有像CYR32这样当前主要流行小种，也有一些像Fc-10这样在监测中出现频率不高的小种。新致病类型可以划分为7个毒性类群，它包括在鉴别寄主丰产3号上表现为感病有Fc毒性类群；在维尔上表现为感病的Fo毒性类群；在贵农22表现为感病的G22毒性类群；在杂46上表现为感病的HyG毒性类群；在洛夫林10或洛夫林13表现为感病的LvG毒性类群；在水源11表现为感病的SuG毒性类群和在中四感病的的ZS毒性类群。2.3讨论本研究结果为自然条件下存在条锈菌的有性繁殖提供了直接的依据，并在2011、2013和2015这三个独立的年份都成功分离到小麦条锈菌菌系，这证明了条锈菌的有性生殖在中国是常年发生的。2011和2013这两个不同年份从来自于小麦条锈菌越夏易变区的野生小檗上均成功分离到小麦条锈菌菌系。其中，从甘肃采集的短柄小檗（B.brachypoda）、假豪猪刺（B.soulieana）和堆花小檗（B.aggregata）这三种小檗上成功分离获得了11个小麦条锈菌；从毗邻甘肃的陕西西部地区采集的陕西小檗（B.shensiana）上成功分离得到5个小麦条锈菌菌系；从西藏林芝地区采集的刺黄花（B.polyantha）上成功得到4个小麦条锈菌菌系（Wangetal.2016;Zhaoetal.2011）。2015 18野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定年（本研究）从甘肃的假豪猪刺（B.soulieana）、少齿小檗（B.potaninii）和陕西小檗（B.shensiana）这三种小檗上成功分离到了8个小麦条锈菌菌系。通过对这三个年份（2011、2013和2015）的研究结果进行分析可以得知，在中国的不同年份，不同种类的小檗上都能够成功地分离到小麦条锈菌。并且这三个年份都成功地从陕西小檗上分离到了小麦条锈菌菌系，两个年份成功地从假豪猪刺上分离到小麦条锈菌菌系。由此，我们可以认为在自然条件下，中国小麦条锈菌在野生小檗上的有性生殖是常年发生的。研究结果表明了在自然条件下，中国条锈菌的有性生殖在新菌系的产生中起到作用。本实验室在2011年（Zhaoetal.2011）、2013年（Wangetal.2016）和2015年（本研究）这三个独立的年份中均从自然发病的野生小檗上分离到小麦条锈菌菌系，通过对这三年获得的菌系进行毒性分析结果表明，从小檗分离获得的条锈菌具有多样的病原菌毒性分化现象，其中新菌系在所分离获得的菌系中占有的比例很高，即条锈菌的有性生殖可以提高其的毒性变异率，这与室内研究获得的条锈菌单夏孢子有性生殖后代群体高毒性变异的结论相吻合（Tianetal.2016）。因此，综合三年的试验研究，表明了在小麦与感病小檗共存的地区，小麦条锈菌在小檗上的有性生殖可发生毒性重组，从而在病原菌致病性变异中起到重要的作用。综合本研究和前两次的研究结果来看，这三个独立的年份都从野生小檗上成功分离到了小麦条锈菌的有性菌系。这充分表明，在中国自然条件下，野生小檗可为小麦条锈菌的有性生殖提供场所，从而在小麦条锈菌的病害循环中起到作用。同时，2013年（Wangetal.2016）、2015年（本研究）从野生小檗上分离获得的小麦条锈菌菌系中都有CYR32、CYR31、G22-68、Su11-26等这些目前田间已知的条锈菌小种，这表明，自然条件下这些已知小种的担孢子可侵染附近的野生小檗，并在其上完成有性生殖，从而为小麦条锈病的发生以锈孢子的方式提供菌源，进而在小麦条锈病的病害循环及流行中起作用（图2-1）。中国被认为是世界上小麦条锈菌最大的流行区系，中国的西部地区，特别是在甘肃和四川的西北部地区被认为是中国锈病流行的“热点”地区，这些地区也是锈菌以夏孢子越夏或越冬的场所，大约有90%的新小种特别是引起抗性品种失效的小种都是在这些“热点”地区被首次发现，进而为该地区甚至华东地区条锈病的流行起到提供初始菌源的作用。由于先前的研究可知，甘肃和陕西有大量被锈菌侵染的小檗大多都生长在麦田附近，并且我们在三个年份都成功从感病小檗上分离获得小麦条锈菌菌系，这也表明了生长在麦田附近的小檗能为条锈菌担孢子侵染小檗以及小檗上的锈孢子侵染小麦提供更多的机会。尽管我们发现有锈菌侵染小檗附近的麦田发病比较严重，小檗被锈菌侵染的越严重，其附近麦田的发病情况也就越严重，但是小檗是否能为邻近麦田提供初始菌源以及铲除麦田附近的小檗是否能够有效控制条锈菌的变异频率还有待于进一步的研究。 第二章小麦条锈菌有性菌系的分离及致病力的测定分析19UredialstageTelialstageWheatAsexualreproductionTeliospore(III)Basidiospore(IV)Urediospore(II)BasidiosporeinfectiononbarberrySexualreproductionAeciospore(I)Pycniospore(0)NectarAecialcupPycnialstageAecialstageFertilization图2-1中国小麦条锈菌生活史及病害循环Fig.2-1LifecycleofPucciniastriiformisf.sp.triticianddiseasecycleofwheatstriperustinChina迄今为止，在全球范围内，对野生小檗在小麦条锈病发生及流行中作用的研究十分有限，仅美国有报道。但是，他们的研究认为，在自然条件下，小檗在美国小麦秆锈菌的有性生殖和病害的流行中起主要作用，而在条锈菌中不起作用（Wangetal.2015）。在美国，小檗之所以在秆锈菌中起到重要作用而对条锈菌不起作用，这与条锈菌和秆锈菌利用不同的机制来保护它们的冬孢子来越过不良的环境条件有关。秆锈菌和条锈菌的冬孢子在结构、休眠、越夏上都具有显著的差异。在结构上，条锈菌的冬孢子是埋生于叶片表皮层细胞之下的，不易裸露，而秆锈菌则在植物组织表面上形成假囊壳，在高湿度的条件下很容易暴露出来；在休眠上，条锈菌的冬孢子经过越夏后不需要休眠或只需经过短暂的休眠就能够萌发，而秆锈的冬孢则不能在越夏之后就立即萌发，它需经过一段较长时间的休眠之后才能够萌发。在美国太平洋西北部地区，小麦条锈菌冬孢子自7月产生，随着时间的推移冬孢子的活力逐渐下降，到翌年的3月只有不到1%的冬孢子能够萌发，到5月则完全丧失活力，这与小檗的生长时期不吻合，而秆锈菌经过一段时间的休眠到翌年的1月份才能够萌发，在4到5月份仍具有较高活力，这就与小檗的生长 20野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定期完美吻合；并且当地气候干燥，条锈菌由于其的结构特点需要在高湿的条件下才能够萌发，而秆锈菌裸露出来的冬孢子极易吸收水分萌发，从而决定了小檗在美国太平洋西北部在秆锈病害流行起作用而对条锈病害流行不起作用（WangandChen2015）。但是，在中国甘肃、陕西等条锈菌的易变区，由于该地区小麦生长在高海拔地区，这就使该地区小麦的收获季节向后推迟，从而有大量的冬孢子在这一时期产生，使这一时期的冬孢子萌发时期与小檗生长季节完美吻合，另外这些地区的秋季是湿润多雨的，从而为担孢子侵染麦田附近的小檗提供了有利的环境条件。这也表明了在中国自然条件下，小檗在小麦条锈病的流行及循环中起到作用。在三个独立年份的试验研究中，我们从感病的野生小檗上分离到的小麦条锈菌的比例比较低。这与多种因素有关，通过分析认为受侵染小檗锈菌种类的复杂性、锈孢子的活力是造成分离率低的主要原因。首先，从小檗上成功分离获得小麦条锈菌的重要前提是要保证锈孢子的活力。虽然，我们都是在锈孢子产生的适合时期进行标样的采样，但是，根据我们从2010年开始的年度田间调查，发现降雨、温度等气象条件对小檗的侵染起到重要作用，特别是降雨，由于持续的高湿环境是冬孢子萌发所必须的条件，降雨的持续性对小檗受侵染的连续性起到决定性的作用。近几年，在我们调查与采样中发现，小檗的侵染不具有连续性，因此，锈孢子的产生时间也有所不同，前后可持续30多天。因而，在采取的锈孢子标样中，既有成熟但活力已经降低甚至已经丧失活力的锈孢子，又有还没有完全发育成熟的锈孢子，这都对从感病小檗上分离获得小麦条锈菌菌系的比率产生巨大的影响。其次，侵染小檗的锈菌种类具有复杂多样性。研究证明，小檗也可以为小麦秆锈菌、条锈菌以及其它柄锈菌提供转主寄生的场所。Zhao等（2015）通过人工接种，从小檗上也成功分离获得了小麦秆锈菌、小麦条锈菌（Wangetal.2016;Zhaoetal.2013）。同时，在试验中我们还发现，一部分的锈孢子标样在感病小麦铭贤169表现为低反应型（Wangetal.2016;Zhaoetal.2013），这也说明还存在柄锈菌（Puccinia）的其它类型也可以侵染小檗的。已有研究报道，小檗可以作为早熟禾条锈菌（P.pseudostriiformis,syn:P.striiformisf.sp.poae）和P.arrhenatheri(Kleb.)Erikss.的转主寄主，并能为它们的有性生殖提供场所，并成功地从小檗上分离到了前者（Jinetal.2010;Naefetal.2002）。此外，我们的研究发现小檗还可以被一些禾本科杂草锈菌侵染。据此推测，自然条件下，可能有更多的锈菌种类能够侵染小檗，这也对从小檗上获得小麦条锈菌比例产生巨大的影响。中国小麦条锈菌的新毒性菌系大多都是在越夏易变区首次被发现的，但是其原因一直未能得到科学的解释。我们近期的研究工作无疑是科学地解释了越夏易变区新菌系频繁出现的主要原因，即中国条锈病易变区形成主要是由广泛分布的转主寄主小檗和有性生殖的发生造成的。早期欧美国家小麦秆锈病之所以能够得到有效防控，立法规定铲除麦田附近小檗起到了巨大的作用（Jinetal.2010;Roelfs1982;Stakman1919;Zadoksetal.1985）。这一举措不仅使小麦秆锈菌的小种数量得到了明显减少，而且秆锈菌的群体结 第二章小麦条锈菌有性菌系的分离及致病力的测定分析21构也趋向稳定。这为小麦条锈病的防治提供了借鉴，从而也为中国小麦条锈病的综合防治提供了新的策略与途径。小檗在小麦秆锈病的流行中起到重要的作用，而小檗在条锈病的流行中是否也起到这样重要的作用还有待于进一步的研究。但是，作为具有小檗数量及种类繁多的中国，在小麦条锈病的综合防治中，应针对越夏区麦田附近的小檗采取相应的措施，如铲除或药剂处理，通过阻断小麦条锈菌的发生，以达降低小麦条锈菌毒性变异的频率，减缓新小种产生的频率，从而达到延长抗条锈性小麦品种的使用年限以及保障小麦安全生产的目的。 22野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定结论本研究通过对陕、甘两省3种感病野生小檗进行菌系分离，共获得8个小麦条锈菌菌系。对这8个菌系进行单孢子堆纯化，共获得93个单孢子堆群体。对这些菌系在中国鉴别寄主上进行鉴定分析并与目前已知小种比对可知：在8个菌系中，只有1个菌系与已知小种Su11-126的毒性完全匹配，其余的7个为新菌系；93个单夏孢子堆群体可划分为47个不同的致病类型，这47个致病类型中有已知小种类型14个，新小种类型33个；已知小种为56个，新小种为37个。从本研究与前期的研究结果（2011年和2013年）综合来看，在三个独立的年份均从野生小檗上成功分离到了小麦条锈菌有性菌系，为证实在自然条件下，在中国小麦条锈菌在野生小檗不仅能够完成有性生殖，并且是常年发生的客观事实提供了更多的直接证据。研究结果为中国小麦条锈病的持续、有效的防治提供了新的策略和途径，为通过小麦条锈病的综合防控保障中国小麦的安全生产提供了科学依据。 参考文献23参考文献陈刚,王海光,张录达,王滔,马占鸿.2006.小麦条锈病区域流行相关性研究初报.中国农学通报,22(7):415~420陈谦海,徐天禄,何顺志.2004.贵州植物志.贵阳:贵州科技出版社:39~52程晶晶,康振生,黄丽丽,王美南,万安民,程蓬.2015.温室条件下条形柄锈菌体细胞重组的分子确证.菌物学报,34(6):1128~1142黄丽丽,王欣丽,康振生,赵杰.2005.紫外线诱导小麦条锈菌毒性突变及突变体的RAPD分析.菌物学报,24(3):400~406贾秋珍,黄瑾,曹世勤,张勃,王晓明,金社林.2012.感染我国重要小麦抗源材料贵农22的条锈菌新菌系的发现及致病性初步分析.甘肃农业科技,1:3~5康振生,李振岐,商鸿生,马青,王惠文.1993b.小麦条锈菌夏孢子芽管细胞核荧光.西北农业大学学报,21(1):11~14康振生,李振岐,商鸿生.1991.小麦叶内锈菌细胞核荧光染色方法.西北农业大学学报,19（增刊）:54~57康振生,李振岐,商鸿生.1993a.小麦条锈菌异核作用产生的一新菌系.西北农业大学学报,21(1):97~99康振生,李振岐,商鸿生.1994a.小麦条锈菌夏孢子阶段核相状况的研究.植物病理学报,24(1):26~31康振生,李振岐,商鸿生.1994b.小麦条锈菌异核新菌系的筛选及核游离试验研究.植物病理学报,24(2):101~105康振生,李振岐,张硕成.1987.小麦条锈菌洛夫林13菌系的初步研究.西北农林科技大学学报(自然科学版）,2:0~15康振生,王晓杰,赵杰,汤春蕾,黄丽丽.2015.小麦条锈菌致病性及其变异研究进展.中国农业科学,48(17):3439~3453邝文静,张贵胜,章振羽,姬红丽,沈丽,倪建英,王宗华,彭云良.2013.小麦条锈病菌avrYr10/24/26/ch42突变体的毒性研究.西南农业学报,26(6):2323~2331李振岐,曾士迈.2002.中国小麦条锈病.北京:中国农业出版社李振岐,商鸿生.1989.小麦锈病及其防治.上海:上海科学技术出版社林晓民,李振岐.1990.我国小麦条锈菌寄主范围的研究.植物病理学报,20(4):265~270陆师义,范桂芳,谢淑敏,吴维中,孔显良,杨作民,汪可宁,李瑞碧.1956.小麦条锈病研究-Ⅰ.小麦条锈菌的专化性研究.植物病理学报,2:153~166庞小芳.2008.小麦条锈病流行的原因与防治对策.农业科技与信息,23:40~41商鸿生,井金学,李振岐.1994.紫外线诱导小麦条锈菌毒性突变的研究.植物病理学报,24(4):347~351万安民,赵中华,吴立人.2003.2002年我国小麦条锈病发生回顾.植物保护,29:5~8汪可宁,洪锡午,司权民,王剑雄,沈谨朴.1963.我国小麦条锈菌生理专化研究.植物保护学报,2(1):23~36王欣丽,朱飞,黄丽丽,魏国荣,康振生.2009.紫外线诱变对小麦条锈菌致病性突变的影响.核农学报,23(3):375~379 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附录29附录附表1中国鉴别寄主及相应抗性基因Table1Chinesedifferentialsetandresistancegenes编号品种Yr基因DifferentialNo.DifferentialhostYrgene1TrigoEurekaYr62FulhardUnknown3保春128(Lutescens128)Unknown4南大2419（Mentana)Unknown5维尔(Virgilio)Yrvir1，Yrvir26阿勃（Abbondanza）Unknown7早洋（EarlyPremium）Unknown8阿夫（Funo）YrA，+9丹麦1号（Danish1）Yr310尤皮II号（JubilejinaⅡ）YrJu1,YrJu2,YrJu3,YrJu411丰产3号（Fengchan3）Yr112洛夫林13（Lovrin13）Yr9，+13抗引655（Kangyin655）Yr1，YrKy1，YrKy214水源11（Suwon11）YrSu15中四（Zhong4）Unknown16洛夫林10（Lovrin10）Yr917Hybrid46Yr3b,Yr4b18Triticumspeltavar.albumYr519贵农22（Guinong22）Unknown注：中国鉴别寄主基因型所携带Yr基因参考Wanetal.（2004）和Chenetal.（2009）。附表2小麦条锈病苗期侵染型分级标准Table2AscaleforevaluationoninfectiontypeofPucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst)ondifferentialhosts反应型infectiontype分级Scale反应型描述CharacterofPstreactionondifferentials免疫型0叶上无任何可见的症状近免疫型0；叶上有小的坏死斑点，但无可见的夏孢子堆产生高度抗病型1夏孢子堆小且少，叶上呈现坏死斑中度抗病型2夏孢子堆较少且中等大小，有可见的坏死斑现象中度感病型3夏孢子堆大且多，并且夏孢子堆周围有褪绿现象产生高度感病型4夏孢子堆大且多，周围叶片组织不发生褪绿现象 30野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定附表3从自然感病小檗上分离获得的8个菌系标样在中国鉴别寄主上的毒力反应Table3ReactionofeightsamplesofPucciniastriiformisf.sp.triticirecoveredfrombarberry(Berberisspp.)leaveswithaecialinfectionsonChinesedifferentialset在中国鉴别寄主上的反应型标样寄主地点小种aReactiononChinesedifferentialsetSampleHostLocationRace1234567891011121314151617181920U1B.soulieanaGansuVVVVAVVVVAVVAVAVVAAVSu11-126U2B.potaniniiShaanxiVVVVAVVVVAVVAAVAVVAAVNewraceU3B.potaniniiShaanxiAVVAVAVVVAVAVAAVVAAVVAAVNewraceU4B.shensianaShaanxiAVAVAVVVVVVVAVVAVVAAVAAVAVNewraceU5B.shensianaShaanxiAAAVAAVAVAVAVAVAVAAVAAVAVAVAVNewraceU6B.shensianaShaanxiVAVVAVVVVVVAVVVAVAAVVAAVNewraceU7B.shensianaShaanxiVVVVVAVVVVAVAVVAVAVVVAAVNewraceU8B.shensianaShaanxiVVVVVAVVVVVAVVAVAVVAAVNewrace注：U1-U8分别为小檗上分离得到的8个菌系；鉴别寄主：1TrigoEureka（Yr6），2Fulhard，3保春128，4南大2419，5维尔（YrVir1,YrVir2），6阿勃，7早洋，8阿夫(YrA,+)，9丹麦1号(Yr3)，10尤皮Ⅱ号（YrJu1，YrJu2，YrJu3,YrJu4），11丰产3号（Yr1），12洛夫林13（Yr9,+），13抗引655（Yr1,YrKy1,YrKy2)，14水源11（YrSu），15中四，16洛夫林10（Yr9），17杂种46（Yr3b,Yr4b），18Triticumspeltavar.ablum（Yr5），19贵农22，20铭贤169（条锈感病小麦品种），V=有毒力(反应型3~4)，A=无毒力(反应型0~2)，AV/VA=混合反应型。aNote:Chinesedifferentialset：1.TrigoEureka(Yr6);2.Fulhard;3.Lutescenes128;4.Mentana;5.Virgilio(YrVir1,YrVir2);6.Abbondanza;7.EarlyPiemium;8.Funo(YrA,+);9.Danish1(Yr3);10.Jubilejina2(YrJu1,YrJu2,YrJu3,YrJu4);11.Fengchan3(Yr1);12.Lovrin13(Yr9,+);13.Kangyin655(Yr1,YrKy1,YrKy2);14.Suwon11(YrSu);15.Zhong4;16.Lovrin10(Yr9);17.Hybrid46(Yr3b,Yr4b);18.Triticumspeltavar.album(Yr5);19.Guinong22;20.Mingxian169,asusceptiblewheatcv.forthewheatstriperustfungusandusedascontrolineachofthetests.V=virulence(infectiontype3-4),A=avirulence(infectiontype0-2),VA/AVindicatesmixedreactionsbutmorevirulentinVApatternandmoreavirulentinAVpattern.附表4从2015年秋季自然感病小檗上分离获得8个菌系标样中，获得的93个单孢子堆在中国鉴别寄主上的反应Table4Avirulence/virulencepatternsof93singleuredialisolatesderivedfrom8samplesofPucciniastriiformisf.sp.triticirecoveredfromnaturallyinfectedBerberisspp.inspringin2015VirulenceBerberisSampleAvirulenceformulaVirulenceformulaRacepatternRemark(VP)B.KnownU1-210,13,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,16,17CYR31VP1soulieanaraceB.KnownU8-213,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17CYR31VP1shensianaraceB.KnownU2-315,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,16,17CYR32VP2potaniniiraceB.KnownU6-115,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,16,17CYR32VP2shensianaraceB.KnownU6-1115,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,16,17CYR32VP2shensianaraceB.KnownU6-1215,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,16,17CYR32VP2shensianaraceB.KnownU6-415,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,16,17CYR32VP2shensianaraceB.KnownU6-515,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,16,17CYR32VP2shensianarace 附录31B.NewU6-61,2,3?,7,8,9,12,13,14,15,16,18,19/5,6,10,11,17?FcVP3shensianaraceB.NewU6-101,2,4,5,6,7,8,9,11,12,13,14,15,16,17,18,19/3,10FcVP4shensianaraceB.NewU3-95,6,8?,12,13,14,15,16,17,18,19/1,2,3,4,7,9,10,11FcVP5potaniniiraceB.KnownU6-31,2,3,4,5,6,7,8,9,12,13,14,15,16,17,18,19/10,11Fc-10VP6shensianaraceB.NewU3-21,2,3?,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19/FoVP7potaniniiraceB.NewU3-11?,2,4,5,6,7,8,9,11,13,15,18,19/3?,10?,12?,14?,16?,17FoVP8potaniniiraceB.NewU3-42,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19/3?FoVP9potaniniiraceB.KnownU8-15,7,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19/1,2,3,4,6,8Fo-7VP10shensianaraceB.KnownU3-32,3,4,5,6,7,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19/3,8Fo-8VP11potaniniiraceB.NewU5-11,3,4,11?,12,14?,15,18/2,5,6,7,8,9,10,13,16,17,19G22VP12shensianaraceB.NewU4-31,3,4,5,8,12,13,15,18,19/2,6,7,9,10,11,14,16,17G22VP13shensianaraceB.NewU4-101,4?,5?,15,18/2,3?,6,7,8,9,10,11,12,13?,14,16,17,19G22VP14shensianaraceB.NewU5-91,6?,10,15,18/2,3,4,5,7,8,9,11,12,13,14,16,17,19?G22VP15shensianaraceB.NewU5-41,6,15,16,18/2?,3,4,5,7,8,9,10,11?,12?,17,19G22VP16shensianaraceB.NewU5-111,6,7,8,9,12,13,15,16,18/2,3,4,5,10,11,14?,17,19?G22VP17shensianaraceB.KnownU4-111,13,15,18/2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17,19G22-68VP18shensianaraceB.KnownU4-41,13,15,18/2,,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17,19G22-68VP18shensianaraceB.KnownU4-91,13,15,18/2,,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17,19G22-68VP18shensianaraceB.KnownU5-121,13,15,18/2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17,19G22-68VP18shensianaraceB.KnownU5-31,13,15,18/2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17,19G22-68VP18shensianaraceB.KnownU5-51,13,15,18/2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17,19G22-68VP18shensianaraceB.KnownU5-61,15,18/2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,16,17,19G22-68VP18shensianaraceB.KnownU5-81,15,18/2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,16,17,19G22-68VP18shensianaraceB.KnownU7-55,10,13,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17Hy-33VP19shensianaraceB.KnownU3-114,13,18,19/1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12,14,15?,16,17Hy-37VP20potaniniiraceB.KnownU8-35,9,12,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,10,11,14,16,17Hy-64VP21shensianaraceB.KnownU1-45,9,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,11,12,14,16,17Hy-68VP22soulieanaraceB.KnownU2-115,9,10,1,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,11,12,14,16,17Hy-68VP22potaniniiraceB.KnownU2-95,9,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,11,12,14,16,17Hy-68VP22potaniniiraceB.KnownU7-15,9,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,11,12,14,16,17Hy-68VP22shensianaraceB.KnownU7-85,9,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,11,12,14,16,17Hy-68VP22shensianaraceB.KnownU2-613,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23potaniniiraceB.KnownU4-513,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23shensianaraceB.KnownU5-1013,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23shensianaraceB.KnownU6-1313,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23shensianaraceB.KnownU6-213,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23shensianaraceB.KnownU6-813,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23shensianarace 32野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定B.KnownU7-1113,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23shensianaraceB.KnownU7-1213,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23shensianaraceB.KnownU8-413,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23shensianaraceB.KnownU8-613,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23shensianaraceB.KnownU8-713,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23shensianaraceB.KnownU8-813,15,18,191,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17Hy8-1VP23shensianaraceB.KnownU1-95,10,11,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,12,14,16,17Hy-85VP24soulieanaraceB.NewU6-71,13,15,18,19/2?,3,4,5,6,7?,8,9,10,11,12,14,16,17HyGVP25shensianaraceB.NewU5-21,2,13,14?,15,16,18,19/3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,17HyGVP26shensianaraceB.NewU3-71,2,4?,5,6?,8?,9?,10,13,15,16?,18,19/3,7,11,12,14,17HyGVP27potaniniiraceB.NewU3-81,3,5,9,12?,13,15,18,19/2,4,6,7,8,10?,11,14?,16,17HyGVP28potaniniiraceB.NewU5-71,4,9,12,13,15,18/2,3,5,6?,7,8,10,11,14,16,17,19?HyGVP29shensianaraceB.NewU4-21,5,6,7,8,10,15,18,19/2,3?,9,11,12,13,14,16,17HyGVP30shensianaraceB.NewU4-61,5,9,11,13,14,15,18,19/2,3,4,6,7,8,10,12,16,17HyGVP31shensianaraceB.NewU4-121,6,12,13,15,16,18,19/2,3,4,5,7,8,9,10,11,14,17HyGVP32shensianaraceB.NewU4-81,8,12,13,15,18,19/2,3,4?,5,6,7,9,10,11,16,17HyGVP33shensianaraceB.NewU6-91,9,13,15,18,19/2?,3?,4?,5,6,7?,8,10,11,12?,14?,16?,17HyGVP34shensianaraceB.NewU4-73,4,6,7?,10,12,13,15,16,18/1?,2,5,8,9,11,14,17,19?HyGVP35shensianaraceB.NewU7-95,13,15,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,17HyGVP36shensianaraceB.NewU7-35,13,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,10?,12?,15?,16,17HyGVP37shensianaraceB.NewU7-45,13,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17HyGVP37shensianaraceB.NewU7-65,9,10,13,18,19/1,2,3,4,6,7,8,11,12,14,15,16,17HyGVP38shensianaraceB.NewU4-17?,10,13,18,19/1,2,3,4,5,6,8,9,11,12,14,15,16,17HyGVP39shensianaraceB.NewU3-62,5,6?,9,10,11?,13,14,15,17,18,19/1,3,4,7,8,12?,16LvGVP40potaniniiraceB.NewU3-55,8,10,11,13,15,17,18,19/1?,2,3,4,6,7?,9?,12,14,16LvGVP41potaniniiraceB.KnownU1-15,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42soulieanaraceB.KnownU1-35,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42soulieanaraceB.KnownU1-55,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42soulieanaraceB.KnownU1-75,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42soulieanaraceB.KnownU1-85,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42soulieanaraceB.KnownU1-105,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42soulieanaraceB.KnownU2-105,9,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,11,12?,14,16?,17Su11-126VP42potaniniiraceB.KnownU2-125,10,12,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7?,8,9,11,14,16,17Su11-126VP42potaniniiraceB.KnownU2-45,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42potaniniiraceB.KnownU2-55,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42potaniniiraceB.KnownU2-75,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42potaniniiraceB.KnownU2-85,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42potaniniirace 附录33B.KnownU3-105,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42potaniniiraceB.KnownU7-25,10,13,15,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42shensianaraceB.KnownU8-55,10,13,15,18,19,/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,16,17Su11-126VP42shensianaraceB.KnownU1-65,10,12,13,15,17,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,14,16Su11-5-3VP43soulieanaraceB.NewU7-1013,16,18,19/1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,15,17ZSVP44shensianaraceB.NewU7-75,10,13,18,19/1,2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17ZSVP45shensianaraceB.NewU2-15,6,8,9,10?,13,16,17,18,19/1,2,3?,4?,7,11?,12,14,15SuGVP46potaniniiraceB.NewU2-25,7?,10,11?,13,14?,15,18,19/1?,2,3,4,6?,8,9,12?,16,17SuGVP47potaniniirace注：？在该品种上抗病居多或感病居多的混合型，Fc丰产3号致病类群（Yr1），Fo阿夫致病类群（YrA,+），G22贵农22致病类群（抗病基因未知），HyG杂46致病类群（Yr3b,Yr4b），LvG洛夫林10/洛夫林13致病类群（Yr9/Yr9+），SuG水源11致病类群（YrSu），ZS中四致病类群（抗病基因未知）。Note:?=segregationofresistantandsusceptibleplantsbutmoreresistantormoresusceptible.Fc=racegroupvirulentforFengchan3(Yr1);Fo=racegroupvirulentforFuno(YrA,+);G22=racegroupvirulentforGuinong22(geneunknown);HyG=racegroupvirulentforHybrid46(Yr3b,Yr4b);LvG=racegroupvirulentforLovrin10/Lovrin13;SuG=racegroupvirulentforSuwon11(YrSu);ZS=racegroupvirulentforZhong4(geneunknown).表5从8个条锈菌标样（锈菌侵染小檗上分离）获得的93个单孢子堆的致病类型及数量Table5Racetypeandnumberof93singleuredialisolatesderivedfrom8samplesofPucciniastriiformisf.sp.tritici.recoveredfromBerberisspp.withaecialinfection未知已知小种小种KnownraceNewrace小种CYR31CYR32Fc-10Fo-7Fo-8G22-68Hy-33Hy-37Hy-64Hy-68Hy8-1Hy-85Su11-126Su11-5-3Race数量2611181115121151Subtotal总数5637Total 34野生小檗上小麦条锈菌系的分离及其致病力的测定致谢时光飞逝，即将告别三年的研究生生活。在刚迈入小麦条锈病的研究工作中，由于缺乏相关的经验，在科研的道路上难免会遇到困难。若没有导师的悉心指导，实验室其他老师及一起学习同学们的支持，该课题的研究也难以顺利完成。首先，我要向我的导师赵杰副教授表达感激之情。之所以能顺利完成该课题，得益于导师的悉心指导，导师从试验的选题、设计、开展以及论文的撰写、修改等方面都给予了极大的支持。在科研中，他常教导我们作为一个科研人员要具备思考力和创造力，并用他严谨的科研态度以及忘我的敬业精神给我们树立了榜样。让我对科研从懵懂无知到逐渐的热爱；同时受到赵老师乐观、积极的生活态度的影响，使自己在遇到困难时不是在抱怨而是积极勇敢的去面对、去解决。其次，要感谢康振生教授的悉心指导及支持。借此机会，我谨向康老师致以诚挚地敬意！同时还要感谢课题组詹刚明老师、魏国荣老师、陈银潮老师、赵晶老师、庄华老师、韩德俊老师、王晓杰老师、郭军老师、王建锋老师等老师在实验及生活中给予我帮助和指导，让我的学习和生活变得更加充实和有意义。我还要感谢实验室的王龙、覃剑锋、赵元元、左淑霞、郑丹、杜志敏、黄淑杰等人在实验和生活中给予我莫大的帮助。虽然许多人都给予我无私帮助，我在此未能一一提及，但我会永远记在心上的！因为在你们的陪伴下，我的研究生生活才变得如此的温馨精彩！最后，我要由衷的感谢我的家人，是你们在我低落的时候给予支持与鼓励，让我一次又一次的重拾信心。在此我要对你们说：请您们放心，在未来的道路上我会更踏实、更努力的。李巧2017年5月 作者简介35作者简介李巧，女，汉族，1989年7月出生于河南商丘，硕士研究生。学习经历：2010.9－2014.7河南科技大学林学院植物保护专业学习，获农学学士学位。2014.9－2017.7攻读西北农林科技大学植物保护学院植物病理学专业，研究方向为植物免疫学。在攻读硕士学位论文期间，顺利完成各门课程的学习，并发表学术文章2篇：**李巧,覃剑锋,赵元元,赵杰,黄丽丽,康振生.2016.《源自陕、甘野生小檗的小麦条锈菌有性生殖后代的毒性分析》植物病理学报,46(6):809~820**赵杰,赵元元,李巧,黄丽丽,康振生.2017.《小麦条锈菌转主寄主小檗（Berberisgermanensis）的人工接种鉴定》.植物病理学报,47(2):274~277