资源描述：
《局部tIgE和真菌sIgE在鼻窦炎症性疾病中的表达及临床意义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：密级：UDC：编号：安徽医科大学学位论文局部tIgE和真菌sIgE在鼻窦炎症性疾病中的表达及临床意义TheexpressionandclinicalsignificanceoflocaltIgEandfungalsIgEinsinusitisdisease刘言军指导教师姓名方平教授安徽医科大学第一附属医院申请学位级别硕士专业名称耳鼻咽喉科学提交论文日期2016-03论文答辩日期2016-05学位授予单位和日期安徽医科大学2016-06答辩委员会主席孙敬武盲审评阅人2016年05月 安徽医科大学ANHUIMEDICALUNIVERSITY硕士学位论文论文题目局部tIgE和真菌sIgE在鼻窦炎症性疾病中的表达及临床意义作者姓名刘言军指导教师方平教授学科、专业耳鼻咽喉科学研究方向鼻科学论文工作时间2015年3月至2016年3月2016年5月 学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期：学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。愿意将本人的学位论文提交《中国博士学位论文全文数据库》、《中国优秀硕士学位论文全文数据库》和《中国学位论文全文数据库》中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入CNKI《中国知识资源总库》，在《中国博硕士学位论文评价数据库》中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名：导师签名：日期：日期： 目录英文缩略词表…………………………………………………………1中文摘要………………………………………………………………3英文摘要……………………………………………………………….5引言…………………………………………………………………….7材料与方法…………………………………………………………….9结果…………………………………………………………………….15讨论…………………………………………………………………….22结论…………………………………………………………………….29参考文献……………………………………………………………….29附录…………………………………………………………………….35致谢…………………………………………………………………….36综述…………………………………………………………………….37 英文缩略词表Abbreviation英文简称英文全称中文释义ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentAssay酶联免疫吸附法CRSChronsinusitis慢性鼻窦炎NPNasalpolyp鼻息肉CRSsNPChronicsinusitiswithoutnasalpolyp慢性鼻窦炎不伴鼻息肉CRSwNPChronicsinusitiswithnasalpolyp慢性鼻窦炎伴鼻息肉EOSeosinophilie嗜酸性粒细胞FBFungusball真菌球AFRSallergicfungalrhinosinusitis变应性真菌性鼻窦炎NIFSNoninvasivefungalsinusitis非侵袭性真菌性鼻窦炎SIgEspecificimmunoglobulinE特异性IgEECPeosinophilcationicprotein嗜酸性粒细胞阳离子蛋白GM-CSFgranulocytemacrophagecolony粒细胞巨噬细胞集落stimulatingfactor刺激因子1 局部tIgE和真菌sIgE在鼻窦炎症性疾病中的表达及临床意义中文摘要目的研究局部总免疫球蛋白E（tIgE）和真菌特异性免疫球蛋白E（sIgE)在鼻窦慢性疾病（sinusitisdisease）中的临床意义,为鼻窦炎症性疾病的临床诊断和治疗提供理论依据。方法研究对象为2014年11月-2015年10月安徽医科大学第一附属医院收治的140例患者，其中对照组（鼻窦肿瘤、鼻中隔偏曲等）30例，慢性鼻窦炎（CRS)60例，非侵袭性真菌性鼻窦炎（NIFS)50例。慢性鼻窦炎分为慢性鼻窦炎不伴鼻息肉（CRSsNP)组30例，慢性鼻窦炎伴鼻息肉组(CRSwNP)30例。非侵袭性真菌性鼻窦炎分为真菌球（FB)组30例和变应性真菌性鼻窦炎（AFRS）组20例。采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linkedimmunosorbentAssay,ELISA）检测所有研究对象血清和组织中tIgE的表达水平。采用ImmunoCAP100系统检测所有研究对象的血清和组织中真菌（链格孢属、白假丝酵母、特异青霉、烟曲霉、多主支孢、长蠕孢菌）sIgE的表达水平。采用SPSS19.0统计软件进行分析，符合正态分布的所有计量资料用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较使用T检验(T-test)法。定性资料采用卡方检验，以P<0.05有统计学意义。结果1.CRSwNP血清tIgE（65.15±27.21KU/L）、CRSsNP血清tIgE（70.66±27.09KU/L），均明显高于对照组（31.97±21.13KU/L），差异有统计学意义（P<0.001)。CRSsNP与CRSwNP血清中tIgE比较，差异无统计学意义（P>0.05)。2.CRSsNP组织中tIgE（124.30±4.40KU/L）、CRSwNP组织中tIgE（235.10±4.21KU/L），均明显高于对照组（56.56±5.32KU/L），差异有统计学意2 义（P<0.001)。CRSwNP组织中tIgE明显高于CRSsNP，差异有统计学意义（P<0.001)。3.CRSwNP血清真菌sIgE阳性1例，CRSsNP和对照组血清真菌sIgE检测无阳性结果，经fisherman精确率计算，P=1.0，差异无统计学意义。CRSwNP组织中真菌sIgE阳性12例，与CRSsNP阳性4例和对照组阳性3例相比较，经卡方检验分别为2=5.4和2=7.2，均有统计学意义（P<0.05)。CRSsNP和对照组阳性例数运用fisherman确切率算法比较P=1.0，差异无统计学意义。4.FB血清中tIgE（61.33±4.70KU/L）、AFRS血清tIgE（260.36±5.95KU/L），均明显高于对照组（31.97±21.13KU/L），差异有统计学意义（P<0.001)。AFRS与FB血清tIgE比较，有统计学意义（P<0.001)。5.FB组织中tIgE（122.11±4.24KU/L）、AFRS组织中tIgE（485.75±9.69KU/L），均明显高于对照组（56.56±5.32KU/L），差异有统计学意义（P<0.001)。AFRS与FB组织中tIgE比较，有统计学意义（P<0.001)。6.血清真菌sIgE阳性AFRS为14例、FB为1例及对照组0例。AFRS分别与FB和对照组血清中真菌sIgE阳性例数比较，经卡方检验，2=25.4和2=29.2，有统计学意义（P<0.001）。FB和对照组阳性例数运用fisherman确切率算法比较P=1.0，差异无统计学意义。组织真菌sIgE阳性AFRS为20例、FB为4例及对照组3例。AFRS分别与FB和对照组组织中真菌sIgE阳性例数比较，经卡方检验，2=33.3和2=36.1，有统计学意义（P<0.001）。FB和对照组阳性例数运用fisherman确切率算法比较P=1.0，差异无统计学意义。结论1.局部IgE参与鼻窦炎症性疾病粘膜炎症的发生，特别与CRSwNP及AFRS的发病有关。2.CRSwNP和AFRS与局部真菌变态反应有关，为临床真菌脱敏治疗提供依据。3.鼻窦炎症性疾病粘膜局部tIgE和真菌sIgE检测较外周血清更敏感，为临床诊断变态反应性疾病提供一种新方法。关键字:慢性鼻窦炎伴鼻息肉慢性鼻窦炎不伴鼻息肉真菌球变应性真菌性鼻窦炎IgE3 TheexpressionandclinicalsignificanceoflocaltIgEandfungalsIgEinsinusitisdiseaseAbstractObjective:StudyonClinicalsignificanceoflocaltotalimmunoglobulinE(tIgE)andfungispecifiimmunoglobulinE(sIgE)insinusitisdisease,andprovideatheoreticalbasisforclinicaldiagnosisandtreatmentforsinusitisdisease.Method:Studyof140patientsweretreatedintheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversityformNovember2014toOctober2015,includeof30casesofthecontrolgroup(sinustumor,nasalseptumdeviation,etc.),60casesofchronicrhinosinusitis(CRS)and50casesofnoninvasivefungalrhinosinusitis(NIFS).Chronicsinusitisweredividedinto30casesofchronicsinusitiswithoutnasalpolyps(CRSsNP)groupand30casesofchronicsinusitiswithnasalpolyps(CRSwNP)group.Noninvasivefungalsinusitisweredividedinto30casesoffungalball(FB)groupand20casesofallergicfungalsinusitis(AFRS)group.Usingenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)todetecttheexpressionleveloftIgEinserumandtissueofalltheresearchobject.UsingImmunoCAP100systemtodetecttheexpressionleveloffungi(alternaria,whitecandida,specificpenicillium,aspergillus,mastermorecigarettesspore,helminthosporium)sIgEintheserumandtissueofalltheresearchobject.SPSS19.0statisticalsoftwarewasusedforanalysis,allthemeasurementdataconformstonormaldistributionwiththemeanandstandarddeviation(x±s),thetwogroupswerecomparedbyTtestmethod.Thequalitativedatabychisquaretest,P<0.05wasstatisticallysignificant.4 Result:1.SerumtIgE(65.15+27.21KU/L)inCRSwNP,serumtIgE(70.66+27.09KU/L)inCRSsNP,weresignificantlyhigherthanserumtIgE(56.56+5.32KU/L)inthecontrolgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.001).2.TissueTIgE(124.30+4.40KU/L)inCRSsNP,tissueTIgE(235.10+4.21KU/L)inCRSwNP,weresignificantlyhigherthanserumtIgE(56.56+5.32KU/L)inthecontrolgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.001).TissueTIgEinCRSwNPwassignificantlyhigherthanthatofCRSsNP,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.001).3.TheserumoffungalsIgEinCRSwNPwaspositivein1cases,detectionofserumfungisIgEincontrolandCRSsNPnopositiveresults,calculationoffishermanaccuraterate,P=1.0,thedifferencewasnotstatisticallysignificant.ThetissueoffungalsIgEinCRSwNPwaspositivein12cases,comparewithf4casesinCRSsNPand3casesincontrolgroup,bychi-squaretestrespectively,2=5.4and2=7.2,werestatisticallysignificant(P<0.05).CRSwNPandthecontrolgroupthenumberofpositivecasesbyfishermanexactrateofalgorithmP=1.0,thedifferencewasnotstatisticallysignificant.4.SerumtIgE(61.33+4.70KU/L)inFB,serumtIgE(260.36+5.95KU/L)inAFRS,weresignificantlyhigherthanserumtIgE(31.97+21.13KU/L)inthecontrolgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.001).5.TissueTIgE(122.11+4.24KU/L)inFB,tissueTIgE(485.75+9.69KU/L)inAFRS,weresignificantlyhigherthanserumtIgE(56.56+5.32KU/L)inthecontrolgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.001).TissueTIgEinAFRSwassignificantlyhigherthanthatofFB,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.001).6.TheserumoffungalsIgEpositivefor14casesinAFRS,1caseinFBand0caseinthecontrolgroup.AFRScomparedwithFBandcontrolgroupinserumfungalsIgE5 positivecasesrespectively,bychi-squaretest,2=25.4and2=29.2,werestatisticallysignificant(P<0.001).FBandthecontrolgroupthenumberofpositivecasesbyfishermanexactrateofalgorithmP=1.0,thedifferencewasnotstatisticallysignificant.ThetissueoffungalsIgEpositivefor20casesinAFRS,4caseinFBand3caseinthecontrolgroup.AFRScomparedwithFBandcontrolgroupintissuefungalsIgEpositivecasesrespectively,bychi-squaretest,2=33.3and2=36.1,werestatisticallysignificant(P<0.001).FBandthecontrolgroupthenumberofpositivecasesbyfishermanexactrateofalgorithmP=1.0,thedifferencewasnotstatisticallysignificant.Conclusion1.ThetissueIgEisinvolvedinsinusitisdisease,particularlyrelatedtotheformationofnasalpolypsandAFRS.2.CRSwNPandAFRSassociatedwithlocalfungalallergy,providethebasisforclinicalfungusdesensitizationtreatment.3.LocaltissuetIgEandfungalsIgEdetectionmoresensitivethanseruminsinusitisdisease,andprovidesanewmethodforclinicaldiagnosisofallergicdiseases.Keywordchronicsinusitiswithnasalpolyps/chronicsinusitiswithoutnasalpolyps/fungalball/allergicfungalsinusitis/IgE6 局部tIgE和真菌sIgE在鼻窦炎症性疾病中的表达及临床意义1引言慢性鼻窦炎不伴鼻息肉（Chronicsinusitiswithoutnasalpolyp,CRSsNP)、慢性鼻窦炎伴鼻息肉组(Chronicsinusitiswithnasalpolyp,CRSwNP)、真菌球（Fungusball,FB)和变应性真菌性鼻窦炎（allergicfungalrhinosinusitis,AFRS）本质上均认为是鼻窦炎症性疾病[1]，其发生发展过程中，涉及的病因和相关因素很多，其中包括机体全身性因素、环境因素以及鼻腔局部因素，上述病因及相关因素在鼻窦炎症性疾病的发生和发展的不同阶段和环节可能先后或同时参与，也可单独或协同发生作用。鼻窦炎症性疾病局部粘膜炎症及致病机制中有很多共同过程：即各种病因和相关因素刺激局部粘膜，导致鼻粘膜免疫细胞激活，出现各种免疫应答反应，促进免疫细胞分泌各种炎症因子和和炎症介质；这些炎症因子和和炎症介质一方面能够诱导炎症细胞向粘膜聚集，出现粘膜炎症，另一方面可以作用鼻腔血管、神经和腺体，出现临床症状。CRS是临床常见疾病，在国内外都存在较高的发病率，加拿大研究机构发现CRS的患病率约占总人口的5%[2]，中国有超过7千万CRS患者，约占人口总数的5-15%之间[3]。近年来，根据国内外慢性鼻-鼻窦炎症性疾病最新治疗指南，将CRS分为CRSsNP和CRSwNP两大类，主要临床特征为鼻腔及鼻窦粘膜的慢性持续性炎症表现，病程在12周以上[4,5]，上述疾病的病因及发病机制尚未完全清楚，研究表明其发病原因是多种因素，多步骤的复杂过程，常见的致病因素主要包括微生物因素（病毒、细菌及细菌超抗原、真菌）、哮喘、骨炎、纤毛损伤、变态反应因素、免疫应答缺陷、遗传因素、环境因素、鼻腔解剖结构异常等[6]，但是其具体发病机制尚未完全清楚，CRS的发病过程中变态反应起重要作用，特别与鼻息肉7 （NasalPolyp,NP）的形成有密切关系[7]。免疫学研究发现Th2细胞在鼻息肉中大量活化，大量分泌白介素4（Interleukin,IL-4)、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等细胞因子，可刺激体液免疫应答使B淋巴细胞分泌IgE[8]。病理组织学发现CRS特别是合并鼻息肉患者鼻腔粘膜存在与变态反应有关的细胞因子及趋化因子、大量嗜酸性粒细胞（eosinophil,EOS)浸润及IgE高表达[9]。Bachert等[10]研究发现鼻息肉组织中IL-5、tIgE和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（eosinophilcationicprotein,ECP）表达水平明显高于对照组，tIgE的表达水平与IL-5、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白和嗜酸性粒细胞数目呈正相关，同时发现tIgE、sIgE和EOS浸润密切相关，说明局部变应性反应可能参与鼻息肉的形成。很多学者指出CRS患者鼻腔分泌物及组织中发现真菌存在，说明上述疾病可能与局部真菌变态反应有关。Ponikau等[11]通过对CRS患者采用鼻腔鼻窦灌洗方法收集充足粘液并加入二硫苏糖醇溶液时包裹在粘液中的真菌游离出来，再行游离真菌培养，获得极高真菌阳性率（96%），同时证实多种真菌菌属。而且其其接受手术的101例CRS的组织病理切片进行嗜银染色，发现84例有真菌细胞。Dosa等[12]通过显微镜观察在95例CRS患者鼻腔分泌物,其中79例（83%）患者鼻腔分泌物中共检测出237种真菌成分。大量文献指出鼻息肉组织中存在真菌sIgE，Sabirov等[13]发现患者鼻息肉组织中链格孢sIgE的表达水平明显高于正常组织，指出鼻息肉组织中链格孢sIgE与嗜酸性粒细胞的表达有关,同时认为无论患者全身过敏反应是否阳性，局部组织IgE介导过敏反应可以作为重要的致病因素导致鼻息肉发生。Cleland等[14]应用DNA体外扩增--多聚酶链反应对23例CRS患者术前和术后鼻腔分泌物中多种真菌类病原体检测，发现手术后鼻腔分泌物真菌数目较术前明显减少。AFRS和FB为非侵袭真菌性鼻窦炎（Noninvasivefungalsinusitis,NIFS)的2个亚型，AFRS的临床特点无特异性，多数患者有发作的鼻息肉，以中青年为主，常伴有家族过敏史。FB好发于中老年女性，发病缓慢，起病较隐匿，患者免疫功能基本正常。近年来因免疫缺陷病患者的增加以及抗菌药物的滥用以及空气污染导致NIFS的发病率有上升趋势[15]。尽管国内外有大量关于NIFS的文献报道，但是8 NIFS的病因和具体的发病机制仍然不清楚。有文献指出真菌变应原局部变态反应引起的IgE介导的I超敏反应和真菌病原体可能是AFRS潜在发病机制之一，但是仍然存在争论。Katzenstein等[16]最早发现部分患者上颌窦内粘液有黄曲霉过敏现象，这些患者鼻窦内检测出坏死性嗜酸性粒细胞以及非侵入性真菌菌丝，因此首先提出AFRS的概念。Matsuwaki等[17]证明AFRS手术后鼻窦中变应性黏蛋白内存在真菌sIgE，同时患者血清中也检测出真菌sIgE，并指出局部IgE与AFRS患者鼻窦粘膜水肿、息肉及变应性黏蛋白形成的过程中发挥重要作用。研究发现空气中真菌变应原可直接刺激AFRS患者鼻腔粘膜的促进Th2细胞活化并分泌相应的炎症介质和细胞因子[18]。综述所述，鼻窦和鼻腔粘膜局部tIgE和真菌sIgE的表达在鼻窦炎症性疾病的病理生理学机制中发挥重要作用，具体机制需要进一步研究。本课题以CRS和非侵袭性真菌性鼻窦炎为对象，研究血清及组织中tIgE和真菌sIgE在鼻窦炎症性疾病中表达水平的差异，探讨tIgE和真菌sIgE与上述疾病之间的联系和可能机制。2材料和方法2.1临床资料2.1.1CRS的诊断标准和病史资料2012EPOS[19]指南根据鼻腔有无鼻息肉将CRS分为CRSsNP和CRSwNP，根据2012EPOS的指南，CRS的诊断依据为：①症状：包括主要症状（鼻腔通气功能障碍或鼻充血、黏脓性鼻涕或后鼻滴漏）和次要症状（嗅觉减退或丧失、头面部疼痛或肿胀感），主要症状必具其一。除鼻部症状外，还可有咽痛、咳嗽及困倦等。②鼻内镜检查：是CRS诊断的重要依据。可见中鼻道变窄、组织水肿或息肉，前组鼻窦炎脓液位于中鼻道，后组鼻窦炎脓液位于嗅裂。可用Lund-Kennedy评分评价CRS的性质和严重程度。③电子计算机断层扫描(ComputedTomography,CT)检查显示窦口鼻道复合体（OMC）和（或）鼻窦黏膜增厚。④病程：持续时间超过2周，临床症状未缓解甚至加重。9 2014年11月-2015年10月我院治疗60例CRS患者分为CRSsNP组30例和CRSwNP组30例。病史资料分别为：①CRSsNP组：共计30例，男性22例，女性8例；年龄20-61岁，平均年龄38±2.5岁；病程0.3-8.6年，平均病程1.8±0.3年。②CRSwNP组：共计30例，男性20例，女性10例；年龄16-71岁，平均年龄43±2.7岁；病程1-8年，平均病程4.1±0.5年。2.1.2NIFS的诊断标准和病史资料根据Bent和Kuhn在1994提出的NIFS诊断标准[20]，将其分为AFRS和FB2个亚型。FB是最早发现和最常见的NIFS，本病主要见于成人，女性略多，起病不易发现，发展缓慢，患者无免疫功能异常。临床症状多为单侧鼻腔通气功能障碍、涕中带血或脓涕，若分泌物有臭味提示可能合并细菌感染。部分患者可出现患侧面部疼痛，症状可持续数月或数年。FB最常见鼻窦病变的是上颌窦，很少累及多个鼻窦。CT检查是本病首选的影像学检查方法，最常见表现为患侧鼻窦内可见软组织密度影，其中可见不规则高密度钙化灶。钙化灶是FB最常见的CT表现，主要是菌丝及真菌团块中磷酸钙等金属盐沉积所致。鼻内窥镜术中病变窦腔内可间黄褐色、白色、棕色泥沙样物或粘稠分泌物。组织病理学检查有大量的真菌菌丝聚集，粘膜呈慢性炎症反应，无明显嗜酸性粒细胞浸润，无真菌侵入周围组织。AFRS常有变态反应性病史，其临床症状常与CRSwNP类似，多为中青年，可有特应性体质，无普遍性及性别差别，患者常有鼻塞，鼻腔流脓涕，视觉障碍，头面部不适或疼痛等，部分患者可有粘稠、奶油样鼻涕。AFRS鼻窦CT表现为病变中央高密度变应性黏蛋白影（磨玻璃样密度影伴中央区星状分布的钙化点），周围骨质可伴不同程度的吸收或破坏。鼻内镜检查可见中鼻道或嗅沟可见特征性黄-绿-褐色粘稠分泌物，可呈花生酱样或奶酪样不易抽吸。鼻腔亦可见鼻息肉。组织病理学检查可见变应性黏蛋白为特征性表现，有大量的EOS浸润，鼻腔内可见鼻息肉，窦内可检测到块状的真菌菌丝存在，菌丝不侵袭鼻窦粘膜和周围骨质，有时可见Charcot-Leydon结晶。为了提高AFRS的临床诊断减少误诊，有学者根据AFRS的上述临床表现，提出了诊断标准[21]。必要条件：①单个或多个病变鼻窦内出现磨玻璃样密度影伴中央区星状分布的钙化点等典型的影像学表现；②鼻10 腔鼻窦出现特征性黄-绿-褐色粘稠分泌物，组织病理检查发现变应性黏蛋白和真菌菌丝存在；③粘膜和粘膜下无真菌侵袭。非必要条件：①变应性病史；②体内实验出现有一个或多个真菌过敏阳性结果；③血清学检查真菌sIgE和tIgE升高；④外周血嗜酸性粒细胞相对值增高。必须同时符合3个必要条件和1个或多个非必要条件可诊断为AFRS。将同期在我院接受治疗的非侵袭真菌性鼻窦炎分为FB组30例和AFRS组20例。病史资料分别为：①FB组：共计30例，男性14例，女性16例；年龄20-86岁，平均年龄49.5±3岁；病程0.5-6年，平均病程1.6±0.3年。②AFRS组：共计20例，男性10例，女性10例；年龄19-81岁，平均年龄44.9±4岁；病程0.7-8年，平均病程2.1±0.4年。2.1.3对照组的选择及病史资料对照组为同期在我院接受治疗的鼻窦非慢性炎症性疾病30例（鼻腔内翻性乳头状瘤1例、鼻腔鼻窦良恶性肿瘤15例、鼻窦囊肿4例和鼻中隔偏曲10例）。男性21例，女性9例；年龄16-76岁，平均年龄44.7±3.5岁。对所有研究对象的基本临床资料和数据分析见表1.表1：所有研究对象的基本临床信息项目对照组CRSsNP组CRSwNP组FB组AFRS组例数3030303020男（%）21(70%)22(73.3)20(66.7%)14(46.7%)10(50%)女（%）9(30%)8(26.7%)10(33.3%)16(53.3%)10(50%)年龄（岁）16-7620-6116-7120-8619-81*平均年龄（岁）44.7±3.538±2.543±2.749.5±344.9±4病程（年）--0.3-8.61-80.5-60.7-8*平均病程（年）--1.8±0.34.1±0.51.6±0.32.1±0.4*平均年龄及平均病程以“均数±标准差(Mean±SD)”表示。2.1.4病例选择标准排除有下列情况的患者：①合并心、脑、肝、肺、肾等全身系统性疾病以及11 结核、肝炎等传染性疾病；②有免疫缺陷病和自身免疫性疾病；③正在应用血管紧张素转化酶抑制剂或受体阻滞剂药物；④一月内有使用皮质醇激素，白三烯受体拮抗剂以及两周内使用抗组胺药物等抗过敏药物；⑤正在行脱敏治疗；⑥除AFRS以外有过敏病史者。2.2实验材料2.2.1主要耗材和实验仪器一次性静脉采血针湖北仙明医疗器械有限公司（中国）5ml一次性真空负压采血管河北丰华塑料厂（中国）一次性塑料试验管河北丰华塑料厂（中国）sc-3614低速离心机科大创新股份有限公司（中国）-80℃冰箱（BCD-196TE）青岛haier股份有限公司（中国）20µl、200µl、1000µl移液枪Finnpipette公司（芬兰）Unicap100全自动荧光检测系统Pharmacia公司（瑞典）托盘天平上海钢衡电子科技有限公司（中国）超净工作台上海钢衡电子科技有限公司(中国)UPK-I-10纯水机上海江莱生物科技有限公司（中国）PRAELX800全自动酶标仪莱姆德公司（美国）组织均浆器Wheaton公司（美国）2.2.2主要试剂ELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，中国）血清和组织真菌sIgE检测试剂（均由瑞典Pharmacia公司提供），具体如下：ImmunoCAPsIgE荧光素酶免疫测定、ImmunoCAPsIgE定标曲线、ImmunoCAPsIgE校准品、PharmaciasIgE阴性对照品、抗IgEImmunoCAP、PharmaciasIgE对照品、过敏原ImmunoCAPm1（特异青霉）、过敏原ImmunoCAPm5(白假丝酵母)、过敏原ImmunoCAPm2（多主支孢）、过敏原ImmunoCAPm8(长蠕孢)、过敏原ImmunoCAPm3(烟曲霉)、过敏原ImmunoCAPm6(链格孢)、ImmunoCAP底物液、ImmunoCAP终止液、ImmunoCAP系统洗涤液。12 2.3实验方法2.3.1标本采集2.3.1.1血清标本的制备所有研究对象从夜间12时禁食水至次日6时至7时采集外周静脉血，抽取前壁肘正中静脉，采血前用安多福消毒液擦拭皮肤，一次性采血针斜形45°刺入静脉，一次性负压采血管收集静脉血，采血量约为5ml，静置1-2小时，使用SC-3614低速离心机1000r/min离心20min后将每位患者血清分成2份分别装入试管中并编号，保存在-80°C冰箱内。2.3.1.2鼻腔组织均浆液的制备所有研究对象的标本组织均在术中采集，鼻内窥镜下均取自同侧上颌窦粘膜组织（0.2g-1g），磷酸缓冲盐溶液（PBS缓冲液）冲洗组织，除去组织内血液，擦干，托盘天平称重，放入10ml的小烧杯内。使用移液管量取PBS缓冲液，所需PBS缓冲液的体积应为组织重量的9倍，取所需溶液总量的2/3放入小烧杯内，然后将待检标本放入小烧杯内。剪碎待检鼻腔组织，将含有待检组织的缓冲液转移到Wheaton均浆器内，再将未用的1/3PBS缓冲液清理紧贴在玻璃壁上的鼻腔组织碎块，然后液体慢慢转移到Wheaton均浆器内，仔细研磨的组织碎块，使其充分均浆化。将制备好的液体放入SC-3614低速离心机3000r/min离心10min，离心完成后用移液管吸取上清。将每位患者组织均浆液分成2份分别装入试管中并编号，保存在-80°C冰箱内。2.3.2检测流程2.3.2.1酶联免疫法测血清和组织均浆液tIgE采用酶联免疫法测血清和组织均浆液tIgE的表达水平，实验前从冰箱内取出试剂盒，放置至常温下平衡。提前将血清和组织均浆液从-80°C冰箱取出，放置在室温下至完全解冻。试剂盒操作步骤如下：（1）将第一排的6个孔设为标准品孔，其余为样本孔，样本孔各加不同浓度的标准品50μl；（2）待测样品孔进行标记，将样品孔中内加入样品稀释液40μl，将10μl待测样品分别加入每个待测样品孔中内，将待测样品稀释为5倍，混均。设空白孔，空白13 对照孔不加样品。加样时将样品置于孔底中心，枪头不能触碰孔壁；（3）将标准孔和样本孔内加入50μl生物素标记的抗体，轻轻震荡混均后置于37℃温育60min；（4）在温育期间可以将洗涤液配好，5ml浓缩洗涤缓冲液与95ml蒸馏水按1:20的比例稀释后备用；（5）揭掉板膜甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，震荡30s，甩去洗涤液，吸水纸拍干，重复操作5次后甩干；（6）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，振荡混匀，37℃温育30分钟，空白孔不加；（7）同（5）再次洗涤；（8）每孔加入底物A、B50μl，震荡混匀，37℃避光温育15min；（9）每孔加入终止液50μl；（10）将酶标板放入莱姆德PRAELX800全自动读板机中，打开软件并调整参数至450nm波长下测定各孔的吸光度（OD值）。2.3.2.2计算横坐标设为标准品的浓度，纵坐标为标准品的OD值，画标准曲线，计算出直线回归的方程式，依据每孔的OD值计算出相应待测样品的浓度后乘以稀释倍数5，即为样品的实际浓度。2.3.2.2ImmunoCAP100系统检测血清和组织均浆液真菌sIgE1.采用ImmunoCAP100全自动荧光检测系统检测血清和组织均浆液真菌sIgE的表达水平，ImmunoCAP100具体操作步骤如下:①标本解冻：从-80℃冰箱取出冰冻的血浆和组织均浆液，放置在室温下至完全解冻。②输入请求：输入待检标本基本信息，选择实验方法为过敏原检测。③打印清单：选择打印清单（Printlists),以打印出期望的清单，包括请求清单、消耗清单及分配清单等。④加装与开始：这些步骤包括待测样本、试剂、Elia酶标孔的加装以及最后的启动。按软件指导将待测血清和组织均浆液与试剂加装至仪器左侧样本传送盘内，对位置进行标记，以简化加装试剂过程（一定要将试剂及待测样本加装在传送盘上正确的位置上）。加装14 完成后开始处理。真菌sIgE具体检测步骤：向ImmunoCAP100全自动荧光检测系统96孔板上加入40ul待测样本同时加入CAP，37°C温度下30min，用冲洗器洗去未结合样本，将洗过的标本每孔加入50ul酶标记第二抗体，继续孵育150min，洗去酶标记第二抗体后加入底物液（每孔50ul），10min后加入终止液将与底物洗到阅读板上，计算机自动读取标记物的荧光值，自动计算得出血清和组织均浆液中真菌sIgE含量。（注意：ImmunoCAP100工作环境温度：18-32°C，温度变化：2°C/小时（最大），空气湿度：19%-85%RH，每次操作处理时间在2.5个小时。）2.真菌变应原种类的选择：本研究所检测真菌种类主要根据国内外文献报道及本地区常见的真菌种类研究结果，选择六种真菌变应原（链格孢属、特异青霉、白假丝酵母、烟曲霉、多主支孢、长蠕孢菌）作为患者血清和组织均浆液中真菌SIgE检测项目。3.结果判定：根据测量值sIgE≥0.35KUA/L为阳性结果，并根据浓度大小分为0—6个等级，具体如下(表2)：表2：sIgE阳性结果的分级单位<0.35≥0.35≥0.7≥3.5≥17.5≥50(KU/l)级别0级1级2级3级4级5级无过敏轻度过敏中度过敏重度过敏特重度过极重度过敏敏3统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行分析，资料录入SPSS19.0统计包。符合正态分布的所有计量资料用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较使用T检验(T-test)法。定性资料采用卡方检验（Chi-squaretest），以P<0.05有统计学意义.15 4结果4.1CRS血清tIgE表达水平的检测结果如图1所示，对照组、CRSsNP组和CRSwNP组血清tIgE表达水平分别为：31.97±21.13KU/L、65.15±27.21KU/L、70.66±27.09KU/L，差异有统计学意义（P<0.0001）。血清tIgE表达水平组间两两比较：①CRSsNP组血清tIgE表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.0001)。②CRSwNP组血清tIgE表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.0001)。③CRSwNP组与CRSsNP组血清tIgE表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05)。图1对照组（Control）、CRSsNP和CRSwNP血清tIgE表达水平Fig1TheexpressionlevelofserumtIgEincontrolgroup(Control),CRSsNPandCRSwNP注：***表示两组间差异有统计学意义(P<0.05)。4.2CRS组织tIgE表达水平的检测结果如图2所示，对照组与CRSsNP组、CRSwNP组组织tIgE表达水平分别为：56.56±5.32KU/L、124.30±4.40KU/L、235.10±4.21KU/L，差异有统计学意义（P<0.0001）。组织tIgE表达水平组间两两比较：①CRSsNP组组织tIgE表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.0001)。②CRSwNP组组织tIgE表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.0001)。③CRSwNP组组织tIgE表达水平明显高于CRSsNP组，差异有统计学意义（P<0.0001)。16 图2对照组（Control）、CRSsNP和CRSwNP组织tIgE表达水平Fig1TheexpressionleveloftissuetIgEincontrolgroup(Control),CRSsNPandCRSwNP注：***表示两组间差异有统计学意义(P<0.05)。4.3CRS血清和组织中真菌sIgE的检测结果如表3所示，各组血清真菌sIgE检测的阳性结果：30例CRSwNP患者血清真菌sIgE中只有1例患者链格孢过敏，CRSsNP和对照组血清无真菌sIgE阳性。三组阳性例数经fisherman精确率计算，P=1.0，差异无统计学意义。如表4所示，各组组织真菌sIgE检测的阳性结果：30例CRSwNP患者组织真菌sIgE阳性例数为12例，分别为长孺孢sIgE阳性1例、链格孢sIgE阳性4例、烟曲霉sIgE阳性4例、多主枝孢sIgE阳性2例和白假丝酵母菌sIgE阳性1例。30例CRSsNP患者组织真菌sIgE阳性例数为4例，链格孢sIgE阳性1例、烟曲霉sIgE阳性2例和多主枝孢sIgE阳性1例。30例对照组组织真菌sIgE阳性例数为3例，分别为链格孢sIgE阳性1例、烟曲霉sIgE阳性1例和多主枝孢sIgE阳性1例（表5）。经卡方检验，CRSwNP组与CRSsNP组和对照组真菌sIgE阳性例数比较，分别为2=5.4，P<0.05和2=7.2，P<0.05，差异均有统计学意义。CRSsNP组与对照组真菌sIgE阳性例数比较，差异无统计学意义（P>0.05)。17 表3对照组（Control）、CRSsNP和CRSwNP血清真菌sIgE阳性例数的比较Table3ComparisonofthepositivecasesofserumfungisIgEincontrolgroup(Control),CRSsNPandCRSwNP组别属性合计阳性阴性Control03030CRSsNP03030CRSwNP13030合计19090表4对照组（Control）、CRSsNP和CRSwNP组织真菌sIgE阳性例数的比较Table4ComparisonofthepositivecasesoftissuefungisIgEincontrolgroup(Control),CRSsNPandCRSwNP组别属性合计阳性阴性Control32630CRSsNP42430CRSwNP121830合计226890表5对照组（Control）、CRSsNP和CRSwNP的血清及组织六种真菌sIgE阳性数目的统计Table5ThesIgEpositivenumberofsixkindsoffungiinserumandtissueofcontrolgroup(Control),CRSsNPandCRSwNPsIgE血清组织ControControlCRSsNPCRSwNPCRSsNPCRSwNP变应原l（n=21）（n=30）（n=30)(n=30)(n=30)(n=21)白假丝酵母菌000001长孺孢000001链格孢001114特异青霉000000烟曲霉00012418 多主枝孢000112合计00134124.4非侵袭性真菌性鼻窦炎血清tIgE表达水平的检测结果如图3所示，对照组与FB组、AFRS组血清tIgE表达水平分别为：31.97±21.13KU/L、61.33±4.70KU/L、260.36±5.95KU/L，差异有统计学意义（P<0.0001）。血清tIgE表达水平组间两两比较：①FB组血清tIgE表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.0001）。②AFRS组血清tIgE表达水平明显高于FB组，差异有统计学意义（P<0.0001）。③AFRS组血清tIgE表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.0001）。图3对照组（control）、FB和AFRS血清tIgE表达水平Fig3TheexpressionlevelofserumtIgEincontrolgroup(Control),FBandAFRS注：***表示两组间差异有统计学意义(P<0.05)。4.5非侵袭性真菌性鼻窦炎组织tIgE表达水平的检测结果如图4所示，对照组与FB组、AFRS组组织tIgE表达水平分别为：56.56±5.32KU/L、122.11±4.24KU/L、485.75±9.69KU/L，差异有统计学意义（P<0.0001）。组织tIgE表达水平组间两两比较：①FB组组织tIgE表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.0001)。②AFRS组组织tIgE表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.0001)。③AFRS组组织tIgE表达水平明显FB组，差异有统计学意义（P<0.0001)。19 图4对照组（control）、FB和AFRS组织tIgE表达水平的检测结果Fig4TheexpressionleveloftissuetIgEincontrolgroup(Control),FBandAFRS注：***表示两组间差异有统计学意义(P<0.05)。4.6非侵袭性真菌性鼻窦炎血清和组织中真菌sIgE的检测结果如表6所示，各组血清真菌sIgE检测的阳性结果：20例AFRS患者血清真菌sIgE阳性例数为14例，分别为长孺孢sIgE阳性1例、链格孢sIgE阳性5例、特异青霉sIgE阳性1例、烟曲霉sIgE阳性4例、多主枝孢sIgE阳性3例和白假丝酵母菌sIgE阳性1例。30例FB患者只有1例多主枝孢sIgE阳性，其他均为阴性。对照组血清无真菌sIgE阳性患者。AFRS组与FB组血清sIgE阳性例数比较，2=29.2，P<0.001。AFRS组与对照组血清真菌sIgE阳性例数比较，2=25.4，P<0.001。FB组和对照组血清真菌sIgE阳性例数运用fisherman确切率算法比较P=1.0，差异无统计学意义。如表7所示，各组组织真菌sIgE检测的阳性结果：20例变AFRS组织真菌sIgE全部为阳性，共检测出29个真菌sIgE，其中有11例为2种真菌sIgE阳性，1例为3种真菌sIgE阳性，其他患者只检测出一种真菌sIgE，具体见表8。30例FB组组织真菌sIgE阳性例数为5例，分别为长孺孢sIgE阳性1例、链格孢sIgE阳性1例、烟曲霉sIgE阳性2例和多主枝孢sIgE阳性1例。30例对照组组织真菌sIgE阳性例数为4例，分别为链格孢sIgE阳性2例、烟曲霉sIgE阳性1例和多主枝孢sIgE阳性1例。经卡方检验，AFRS组与FB组组织真菌sIgE阳性例数比较，20 2=33.3，P<0.001。AFRS组与对照组真菌组织真菌sIgE阳性例数比较，2=36.1，P<0.001。FB组和对照组组织真菌sIgE阳性例数运用fisherman确切率算法比较P=1.0，差异无统计学意义。表6对照组（Control）、FB和AFRS血清真菌sIgE阳性例数的比较Table6ComparisonofthepositivecasesofserumfungisIgEincontrolgroup(Control),FBandAFRS组别属性合计阳性阴性Control03030FB12930AFRS14620合计156580表7对照组（Control）、FB和AFRS组织真菌sIgE阳性例数的比较Table7ComparisonofthepositivecasesoftissuefungisIgEincontrolgroup(Control),CRSsNPandCRSwNP组别属性合计阳性阴性Control42630FB52530AFRS20020合计295180表8对照组（Control）、FB和AFRS的血清和组织六种真菌sIgE阳性数目的统计Table8ThesIgEpositivenumberofsixkindsoffungiinserumandtissueofcontrolgroup(Control),FBandAFRSsIgE血清组织21 ControControlFBAFRSFBAFRS变应原l（n=21）（n=30）（n=20)(n=30)(n=20)(n=21)白假丝酵母菌001002长孺孢001012链格孢005217特异青霉001003烟曲霉0041212多主枝孢012113合计011445295讨论5.1真菌的选择和实验室检测方法真菌在我们生活的环境里几乎无处不在，一般以孢子形态存在，伴随着人的呼吸运动进入鼻腔内，可通过鼻窦口进入鼻窦内，因此，健康人鼻腔鼻窦分泌物中也可以检测到真菌。真菌一般对机体致病能力较弱，正常人鼻腔粘膜的纤毛清除功能可以将真菌排出体外，通常情况下不引起宿主发生病理生理反应。当机体处于免疫力低下导致局部鼻腔防御功能减退（如纤毛粘液毯的防御功能减弱）、长期广谱抗菌药的滥用、免疫抑制剂的使用和全身消耗性疾病和等情况，真菌在鼻腔粘膜停留时间较长，可刺激宿主引起病理反应。因此，真菌在慢性鼻-鼻窦炎症性疾病中的已经越来越受到关注，临床上常见的真菌检测方法如下：1.直接涂片镜检法是临床上常用的检测方法，此方法不但能够识别真菌，而且还可以提示真菌的致病活性。先观察标本上有无孢子和菌丝，再根据孢子和菌丝的特征和形态等，根据其特点来区分其种属。但是此方法既不能确定大多数真菌的种属，又不能排除阴性的标本是否存在真菌感染[22]。22 2.分离培养法是目前最常用的诊断方法，有传统法和快速法两种。传统法的优点是根据培养观察不仅可以确定真菌的种属，也可以行药敏实验，指导临床治疗；不足之处是生长缓慢，生殖周期较多数细菌长，而且培养过程中容易受到外界环境影响，阳性率较低[23]。快速法主要用于念珠菌的诊断，但是对于AFRS最常见的病原菌如曲霉菌，目前无适宜的快速培养方法。3.组织病理学法临床可供选择方法有：HE染色、嗜银染色法等，根据真菌种属选择相应的染色方法，不仅可以鉴别真菌种类，同时也可以观察粘膜的炎症反应，本方法是诊断鼻孢子菌的唯一方法。但这种方法只能证实组织中真菌的存在，确诊真菌的种属常需要进一步的分离和鉴定，而且其结果可受到标本的选择部位和染色方法等因素影响[24]。4.分子生物学方法目前有DNA体外扩增--多聚酶链反应（PolymerasechainreactionamplificationofDNAinvitro,PCR)、限制性酶切片段多态性分析(Restrictionfragmentpolymorphismanalysis)、随机扩增多态性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)以及DNA探针法(DNAprobemethod)等方法可用于真菌的早期检测，提高感染患者的生存机会。分子生物学方法检测待测标本容易导致真菌污染，同时缺乏标准化限制其临床广泛应用。5.免疫学方法本方法根据抗真菌抗体滴度动态变化，从而证明是否存在真菌感染，在诊断念珠菌、组织胞浆菌有重要作用。目前该方法已经获得广泛发展，临床技术已经成熟，对及早诊断或确定某种特殊真菌感染有很大价值。耳鼻喉科常用的免疫学检测方法有体内实验（皮肤实验）和体外实验（血清免疫学检测，如采用ImmunoCAP100系统检测血清真菌SIgE[25]）。本课题主要研究真菌感染在慢性鼻-鼻窦炎症性疾病局部粘膜炎症反应的作用及真菌引起的免疫反应，上述介绍的直接涂片镜检法、分离培养、组织病理学检23 查及分子生物学检查只能说明鼻腔局部存在真菌。研究表明真菌是鼻腔粘膜正常菌群，一般不引起鼻腔的炎症反应，几乎所有健康人鼻腔粘膜都能发现真菌的存在[26]。因此，耳鼻喉科常采用体外实验或体内实验等免疫学方法检测机体是否存在真菌引起的变态反应。体内实验可引起严重的不良反应，干扰因素较多，常出现阴性结果。本实验采用ImmunoCAP100系统检测血清和组织中真菌SIgE，有特异性和敏感性高可直接确定真菌种属、安全性高即使有严重过敏体质者仍可检测、血清和组织均浆液都能检测、简便快捷等优点因而得到临床广泛应用。大量文献指出不同的地域，真菌的种类也不同。Hoddeson[27]通过对变应性鼻炎患者真菌变应原检测发现，主要真菌变应原为链格孢属、曲霉属、毛霉菌、青霉菌、长蠕孢和芽枝霉属。Muñoz-Del-Castillo等[28]对190例CRSwNP患者行皮肤试验发现以镰刀菌属(13.7%)、青霉菌属(12.6%)、链格孢属(11.1%)等真菌变应原常见。Manning和Holman系统回顾了美国263例AFRS有168例存在真菌过敏，其中暗色丝孢菌最多见，其次为曲霉菌[29]。凌琪等[30]通过自然沉降法对合肥不同地区空气真菌检测，主要为曲霉属、毛霉属、青霉属和根霉属。根据上述文献报道，本研究选择检测过敏原ImmunoCAPm1（特异青霉）、ImmunoCAPm2（多主支孢）、ImmunoCAPm3(烟曲霉)、ImmunoCAPm5(白假丝酵母)、ImmunoCAPm6(链格孢)、ImmunoCAPm8(长蠕孢)六种真菌变应原。5.2局部tIgE和真菌sIgE与CRS的关系许多研究表明多种因素在CRS发病机制中有直接或间接的作用，同时也可以发挥协同作用。常见的致病因素主要包括微生物因素（包括细菌、真菌、衣原体和病毒等）、骨炎、纤毛损伤、多种细胞因子或炎症介质介导的炎症反应（包括血管内皮生长因子、嗜酸性粒细胞趋化因子、IL及集落刺激因子等）、哮喘、变态反应因素、免疫应答因素、鼻腔解剖结构异常（如鼻中隔偏曲、反向中鼻甲等致鼻腔及鼻窦引流障碍）、基因表达异常和环境污染等[31]。感染和变态反应认为是慢性鼻窦炎（不伴和伴鼻息肉）发病机制中的两个重要因素，但是两者之间的作用仍未完全清楚。有学者提出鼻腔存在感染与局部过敏反应存于相互平衡作用状态的Hygiene学说，从而使其在CRS发病机制中的作用引起广泛重视[32]。Albert24 等[33]发现患者鼻息肉组织中链格孢sIgE的表达水平明显高于正常组织，指出鼻息肉组织中链格孢sIgE表达与嗜酸性粒细胞的浸润程度有关。王剑疆等[34]发现鼻息肉中黑霉菌、烟曲霉和互隔交链孢霉sIgE高于正常对照组，认为真菌过敏与鼻息肉发生发展有关。何宁等[35]指出CRSwNP组织中tIgE的表达水平明显高于对照组，tIgE的表达水平与疾病的炎症程度呈正相关。Gawlik等[36]报道真菌孢子对粘膜的过敏性刺激是CRS的致病因素之一，CRS患者和健康对照组鼻腔存在链格孢，但是链格孢只在CRS患者粘膜中诱导免疫细胞产生IL-3和IL-5，这些因子促进嗜酸性粒细胞（eosinophil,EOS)炎症的发展和sIgG的产生。还有一些研究揭示真菌与EOS炎症之间的关系，Sasama等[37]将CRS和健康人外周血单核细胞（Peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs）分别暴露于真菌提取液中，发现CRS组产生大量IL-13，同时真菌sIgE表达有所增高，对照组没有上述现象。CRS鼻腔粘膜中血管细胞粘附因子1（Vascularcelladhesionmolecule-1,VCAM-1)表达增强，是导致EOS从血管迁移到组织的的重要细胞因子，而IL-13有促使VCAM-1表达的作用。因此认为，CRS的PBMCs和真菌提取液产生的大量IL-13可导致VCAM-1的高表达是引起EOS炎症的原因之一。但是有学者认为局部真菌引起的变态反应并不引起CRS[38]，因此，真菌过敏在CRS发病过程中的作用需进一步研究。本课题研究CRSsNP和CRSwNP的血清和组织tIgE及真菌sIgE表达水平，发现CRSsNP及CRSwNP的血清和组织中tIgE表达水平明显高于对照组，CRSwNP组织tIgE表达水平明高于CRSsNP，而血清两组检测无统计学差别。通过检测血清真菌sIgE阳性例数发现CRSsNP、CRSwNP及对照组之间无差别。CRSwNP组织真菌sIgE阳性例数高于CRSsNP和对照组，CRSsNP和对照组组织真菌sIgE阳性例数无差别。通过上述结果，可以得出IgE介导的I型变态反应参与CRS的发病共同过程，特别是鼻息肉的形成与局部tIgE高表达有密切关系。CRSwNP患者鼻腔局部存在真菌引起的变态反应，而CRSsNP组织中无真菌过敏，说明局部真菌变态反应是鼻息肉组织中IgE表达增高主要原因，因此仅靠血清IgE检测会忽视局部组织真菌引起的变态反应，而且组织中真菌sIgE检测可作为鼻息肉真菌变应性病因的筛查。本研究只检测六种真菌变应原，可能是其他变应原导致CRSsNP25 患者tIgE高表达的。从本研究可以看出变应性因素在CRS炎症机制中发挥重要作用，或者说在炎症反应的某个阶段有变应性因素参与。一般认为CRS是鼻腔鼻窦粘膜组织对损伤因子产生以血管为中心的免疫应答，包括血浆渗出、炎症细胞向组织浸润、组织水肿和组织重塑的过程，其中EOS炎症及释放的细胞因子是导致粘膜炎症和发展的主要机制，而真菌变应原引起的I型超敏反应产生的IgE是EOS炎症中心环节[39]。一方面，真菌引起的I型超敏反应的强度与其效应细胞（肥大细胞）表面受体FceRI有关，FceRI对真菌sIgE介导的超敏反应至关重要[39]。I型超敏反应的结果是由一个特定的真菌变应原与效应细胞表面两个或两个以上的FceRI结合，使效应细胞处于超敏状态，当超敏状态的效应细胞再次与真菌抗原接触后，更多的效应细胞被激活和形成新的介质，促使EOS浸润和脱颗粒[40]。另一方面，真菌sIgE还可使巨噬细胞分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)，GM-CSF可促进Th2释放IL-4、IL-13等活性物质，引导EOS从血管内向组织集聚，目标是粘膜组织的真菌，也可引起EOS不同程度的活化和脱颗粒。聚集的EOS大量分泌具有神经毒性和细胞毒性作用的细胞因子，如主要碱性蛋白（Majorbasicprotein,MBP）和ECP等，这些细胞因子能直接杀死真菌，还可引起上皮损伤和组织重塑，导致鼻腔粘膜水肿、鼻息肉形成，流涕等临床症状。EOS炎症引起组织肿胀导致引流障碍、上皮损伤导致黏液纤毛清除功能减弱，病原菌感染创造了适宜条件，细菌感染引起上述症状加重导致炎症恶性循环，促进CRS的发展[41]。5.3局部tIgE和真菌sIgE与NIFS的关系随着内镜技术及影像技术的进步和广泛应用，NIFS的报道也越来越多，根据目前的报道数据，NIFS占慢性鼻-鼻窦炎的比例约为6-13%[42]，每年都有大量关于该病发病机制的研究。前人的研究发现真菌感染在NIFS的发病中起到重要作用，但临床上并不是所有的患者在真菌感染后都发展为NIFS，很大一部分患者并无明显症状，或者演变为其他类型的真菌性鼻窦炎，可见真菌感染并不是该病发生的唯一因素[43]。FB与AFRS为NIFS的2个亚型，鼻窦内可检测到真菌菌丝存在，26 但病原菌并不入血，不能引起全身免疫和真菌感染，鼻腔粘膜及骨质破坏无真菌侵入，因此真菌与NIFS的关系需要进一步研究。有学者认为AFRS是一类与变应性支气管肺曲霉菌病（allergicbronchopulmonaryaspergillosis，ABPA)相关的鼻部疾病，有嗜酸性粒细胞增多、血清tIgE升高，特异性过敏性免疫反应体质等共同特点,认为变应性支气管肺曲霉菌病的某些因素是导致AFRS的病因[44]。Doellman等[45]发现AFRS患者血清及变应性黏蛋白真菌sIgE升高，在真菌培养阳性的患者中只有19%的患者血清真菌sIgE阴性，但是在鼻窦内变应性黏蛋白中检测到真菌sIgE，因此，他们认为AFRS不仅是全身变态反应，而且还可能是局部IgE介导I型超敏反应。Stewart等[46]发现AFRS患者血清中真菌sIgE和IgG明显高于非AFRS患者，指出真菌作为变应原作用于疾病而不是病原体的角色。Wise等[47]免疫组化染色发现与对照组相比，AFRS患者黏膜tIgE阳性数目明显增加，且上皮下组织高于上皮组织，同时发现窦内嗜酸性粘蛋白中检测到真菌sIgE。上述研究证实AFRS的发病原因与真菌感染后诱发的IgE介导的I型变态反应和IgG有关的III型变态反应有关[48]。为了进一步研究tIgE及真菌sIgE在非侵袭性真菌性鼻窦炎发病机制的关系，本课题探讨FB和AFRS血清和粘膜组织tIgE及真菌sIgE表达水平，各组血清和粘膜组织tIgE及真菌sIgE比较结果为：①FB及AFRS血清和组织中tIgE表达水平均明显高于对照组；②AFRS血清及组织中tIgE表达水平明显高于FB；③AFRS血清及组织中真菌sIgE阳性例数高于FB和对照组；④FB血清真菌及组织中sIgE阳性例数与对照组比较，差异无统计学意义。综上结果可以发现变AFRS为典型的IgE介导的I型变态反应，无论血清还是组织检测均发现tIgE及真菌sIgE的高表达，可能与变应性黏蛋白和鼻息肉形成有关。FB可能与IgE介导的I型变态反应有关，但是与真菌过敏无关。组织局部tIgE表达水平与AFRS严重程度有明显的相关性，可以诊断和判断预后的重要指标之一，同时可以用于区分AFRS和FB[49]。局部tIgE及真菌sIgE在AFRS发病机制中的作用有下列解释：空气中的变应原特别是真菌可诱导AFRS患者鼻窦黏膜Th2型细胞被活化并占主导地位，导致27 大量免疫活性物质的分泌[50]。真菌是鼻腔粘膜过敏反应的启动子可使人呼吸道黏膜Th2细胞活化，分泌炎性介质，如IFN-γ、IL-2、IL-4、ECP、嗜酸性粒细胞过氧化酶[51]，促使EOS细胞活化和脱颗粒，使炎症反应发生。真菌变应原也可以通过鼻粘膜的Toll受体直接激活变态反应性细胞脱颗粒[52]。最新一项研究表明，Th17和IL-17在可促进IgE的产生，可以直接影响B淋巴细胞的表达水平[53]，增强机体体液免疫反应。局部炎症反应引起黏膜水肿，鼻息肉形成，导致窦口阻塞，形成局部缺氧环境，有利于真菌感染和增殖，此时鼻腔粘膜受真菌抗原刺激的机会明显增加，导致鼻腔不断的产生变应性黏蛋白并在窦腔内不断堆积，阻塞窦口是鼻窦引流障碍，上述现象循形成恶性循环，使疾病不断加重[54]。本研究发现FB患者血清和粘膜局部tIgE的表达水平高于对照组，然而血清和粘膜真菌sIgE的阳性例数与对照组无明显差别，说明FB患者血清和局部粘膜不存在真菌的过敏反应。因此，我们认为FB的可能发病机制是鼻粘膜炎症或鼻解剖结构异常导致鼻窦引流不畅、免疫力低下等原因致真菌在鼻窦内长时间生长繁殖，在窦内相互缠绕形成团块，真菌不引起全身及局部过敏反应。tIgE的高表达说明IgE介导的I型变态反应在FB某一阶段发生作用，具体机制还需要进一步的研究。进一步研究发现各组鼻黏膜组织中真菌sIgE阳性数高于血清，特别是AFRS黏膜中烟曲霉的阳性数(12/20)明显高于血清(4/20)，而且有12例患者鼻粘膜存在2种或2种以上的真菌过敏，对于本研究结果有下列可能解释。①真菌已经被公认为吸入性过敏原，鼻窦黏膜中可同时存在一种或两种以上真菌过敏。同时病理组织检测发现的真菌种类不一定引起变态反应。②不是所有AFRS患者血清检测出真菌sIgE，烟曲霉检测结果说明即使血清检测为阴性，其在鼻窦黏膜仍然可引起过敏反应及促使鼻窦炎症反应。③20例AFRS患者组织中均发现真菌sIgE高于血清检测14例（70%）的原因，可能因为血清中真菌sIgE浓度太低而无法检测，在局部炎症组织中真菌sIgE高表达。④本研究只检测6种常见真菌抗原，但其他种类真菌抗原及非真菌抗原未纳入本研究中，需要进一步的研究分析。因缺少临床诊断方法和对疾病的认识不足，经常出现AFRS误诊现象，临床28 医生把其当成一般的鼻窦炎或真菌球治疗，手术后效果不佳。根据Bent和Kuhn提出的诊断标准，真菌变态反应是AFRS诊断依据之一，临床上通过皮肤实验或血清真菌sIgE检测来确定机体存在真菌引起的变态反应。上述方法均反映的是系统性免疫状态，临床上部分患者上述检测结果为阴性，但是有明显的过敏反应症状，说明全身变应性检测结果并不能充分反映鼻窦炎症性疾病与变态反应的相关。本研究发现发现，20例AFRS血清真菌sIgE阳性14例（70%），说明血清真菌sIgE检测并不能反应所有患者存在真菌过敏。因此，为了更好、更准确的方法诊断AFRS，通过检查组织中真菌sIgE表达水平，其对AFRS真菌过敏的诊断率可达100%。对于临床症状明显，高度怀疑为AFRS，特别是不能进行皮肤点刺实验或血清真菌sIgE阴性的患者，局部组织真菌sIgE的检测为诊断AFRS提供一种潜在的诊断方法。5.4结论1.局部IgE参与鼻窦炎症性疾病粘膜炎症的发生，特别与CRSwNP及AFRS的发病有关。2.CRSwNP和AFRS与局部真菌变态反应有关，为临床真菌脱敏治疗提供依据。3.鼻窦炎症性疾病粘膜局部tIgE和真菌sIgE检测较外周血清更敏感，为临床诊断变态反应性疾病提供一种新方法。6参考文献[1]ChenRW.EuropeanPositionPaperonRhinosinusitisandNasalPolyps2012:Updatesandhighlightsondiagnosisandtreatmentofrhinosinusitis[J].MedicalJournalofChinesePeoplesLiberationArmy,2013,38(2):87-93.[2]MacdonaldKI,J.DayreMcNallyMDPhD,EmadMassoudMBMScFRCS(C).ThehealthandresourceutilizationofCanadianswithchronicrhinosinusitis[J].Laryngoscope,2009,119(119):184-189.[3]FanY,FengS,XiaW,etal.Aspirin-exacerbatedrespiratorydiseaseinChina:Acohortinvestigationandliteraturereview[J].AmericanJournalofRhinology&Allergy,2012,26(1):e20-e22(3).29 [4]中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编辑委员会鼻科组.慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南(2012年,昆明)[J].中国医刊,2013，20(11):92-94.[5]KiltyS.Canadianguidelinesforrhinosinusitis:practicaltoolsforthebusyclinician[J].BmcEarNose&ThroatDisorders,2012,12(1)::1.[6]LeeS,LaneAP.Chronicrhinosinusitisasamultifactorialinflammatorydisorder.[J].CurrentInfectiousDiseaseReports,2011,13(2):159-168.[7]GreenBJ,BeezholdDH,GallingerZ,etal.AllergicsensitizationinCanadianchronicrhinosinusitispatients[J].AllergyAsthma&ClinicalImmunology,2014,10(1):1-7.[8]GoldMS,KempAS.Atopicdiseaseinchildhood[J].MedJAust,2005,182(6):298-304.[9]郭杰峰,冯家成,林丽莉,等.特异性免疫治疗对复发性鼻息肉组织中GM-CSF及IL-5的影响[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2015,30(23):2023-25.[10]BachertC,Van-BruaeneNE,ZhangN,etal.Importantresearchquestionsinallergyandrelateddiseases:3-chronicrhinosinusitisandnasalpolyposis-aGALENstudy.[J].Allergy,2009,64(4):520-33.[11]PonikauJU,SherrisDA,KernEB,etal.Thediagnosisandincidenceofallergicfungalsinusitis.[J].MayoClinicProceedings,1999,74(9):877-884.[12]DosaE,MojzesL,DócziI,etal.IDENTIFICATIONANDINCIDENCEOFFUNGALSTRAINSINCHRONICRHINOSINUSITISPATIENTS[J].ActaMicrobiologicaEtImmunologicaHungarica,2002,45(S2):337-46.[13]birovA，HamiltonRG，JacobsJB，ela1．Role0flocalimmunoglobulinEspecificforAhemariaaltematainthepathngenesisofnasalpolyposis[J]．Laryngoscope，2008，118(1):4-9．[14]ClelandEJ,MbbchAB,SamuelBoaseBMBS(Hons)PhD,etal.Thefungalmicrobiomeinchronicrhinosinusitis:richness,diversity,postoperativechangesandpatientoutcomes[J].InternationalForumofAllergy&Rhinology,2014,30 4(4):259–265.[15]GyörgyS,VeronikaF,ZsuzsannaS,etal.Mucormycosismimickssinusitisinadiabeticadult.[J].AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,2006,1084(1):520–530.[16]KatzensteinALA,SaleSR,GreenbergerPA.AllergicAspergillussinusitis:anewlyrecognizedformofsinusitis.[J].JournalofAllergy&ClinicalImmunology,1983,72(1):89-93.[17]MatsuwakiY,OkushiT,AsakaD,etal.RoleofLocalImmunoglobulinEProductioninthePathophysiologyofChronicRhinosinusitiswithNasalPolypsandAllergicFungalRhinosinusitis[J].JournalofAllergy&ClinicalImmunology,2011,127(2):AB120.[18]MartinOmanEvans,II,ChristopherAlbertCoop.Noveltreatmentofallergicfungalsinusitisusingomalizumab.[J].Allergy&Rhinology,2014,5(3):172-4.[19]ChenRW.EuropeanPositionPaperonRhinosinusitisandNasalPolyps2012:Updatesandhighlightsondiagnosisandtreatmentofrhinosinusitis[J].MedicalJournalofChinesePeoplesLiberationArmy,2013,38(2):87-93.[20]BentJP3rd,KuhnFA.Diagnosisofallergicfungalsinusitis[J].OtolaryngolHeadNeckSurg1994;111(111):580–8.[21]朴颖实,金玉兰,李雪,等.变应性真菌性鼻窦炎临床病理分析[J].中华病理学杂志,2009,38(2):95-99.[22]LeeSR，KardosKW，SchiffE，etal．Evaluationofanew，rapidtestfordetectingHCVinfection，suitableforusewithbloodororalfluid［J］.JVirolMethods，2011，172(1/2):27-31．[23]VasconcellosC,PereiraCQ,SouzaMC,etal.Identificationoffungispeciesintheonychomycosisofinstitutionalizedelderly.[J].AnaisBrasileirosDeDermatologia,2013,88(3):377-380.[24]张会孝,吴晓康,王静,等.乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒四种传染病的同步快速31 检测[J].中国国境卫生检疫杂志,2010,20(1):6-10.[25]文利平.2013年全国变态反应学术会议纪要[J].中华临床免疫和变态反应杂志,2014,8(1):83-85.[26]ChenRW.EuropeanPositionPaperonRhinosinusitisandNasalPolyps2012:Updatesandhighlightsondiagnosisandtreatmentofrhinosinusitis[J].MedicalJournalofChinesePeoplesLiberationArmy,2013,38(2):87-93.[27]HoddesonEK,WiseSK.TheRoleofIgEProductioninthePathophysiologyofRhinitisandRhinosinusitis[J].CurrentAllergy&AsthmaReports,2011,11(3):230-235.[28]NeuroniAC,FraefelM,RiedlR.Fungalsensitizationinnasalpolyposis.[J].JournalofInvestigationalAllergology&ClinicalImmunology,2009,19(1):6-12.[29]ManningSC,HolmanM,.Furtherevidenceforallergicpathophysiologyinallergicfungalsinusitis.[J].Laryngoscope,1998,108(10):1485–1496.[30]凌琪，王晏平,王莉,舒莹,等.合肥城区空气真菌浓度的时空分布特征[J].生物多样性,2008,16(2):175-180.[31]KorkmazH,ÖcalB,TatarEÇ,etal.Biofilmsinchronicrhinosinusitiswithpolyps:iseradicationpossible?[J].Europeanarchivesofoto-rhino-laryngology:officialjournaloftheEuropeanFederationofOto-Rhino-LaryngologicalSocieties(EUFOS):affiliatedwiththeGermanSocietyforOto-Rhino-Laryngology-HeadandNeckSurgery,2014,271(10):2695-2702.[32]YazdanbakhshM;KremsnerPG;vanReeR.Allergy,parasites,andthehygienehypothesis[J].Science,2002,296(5567):15-23.[33]AlbertS,HamiltonRG,JacobsJB,etal.RoleoflocalimmunoglobulinEspecificforAlternariaalternatainthepathogenesisofnasalpolyposis[J].Laryngoscope,2008,118(1):4-9.[34]王剑疆,张丹梅,任金龙,等.鼻息肉组织中真菌sIgE水平调查[J].中华临床免疫和变态反应杂志,2011,05(2):117-119.32 [35]何宁,梁建平,陈俊,等.鼻息肉组织总IgE表达与IgE介导Ⅰ型变态反应的关系[J].中国临床新医学,2012,05(8):699-702.[36]GawlikR,CzeciorE,JarząbJ,etal.FrequencyofIgE-dependenthypersensitivitytomouldsinpatientswithchronicrhinosinusitiswithpolyps.[J].PostepyDermatologiiIAlergologii,2014,31(3):159-63.[37]JanS,SherrisDA,Seung-HeonS,etal.Newparadigmfortherolesoffungiandeosinophilsinchronicrhinosinusitis.[J].CurrentOpinioninOtolaryngology&Head&NeckSurgery,2005,13(1):2-8.[38]LiJY，FangSY．Allergicprofilesinunilateralnasalpolypsofbilateralchronicrhinosinusitis[J]．AmJRhino，2008，22(2):111-114．[39]AnneK,GunnarL,RanP,etal.Exposuretobirchpollenininfancyanddevelopmentofatopicdiseaseinchildhood.[J].JournalofAllergy&ClinicalImmunology,2002,110(1):78–84.[40]CorsoED,SilviaBaroniMD,DanielaLucidiMD,etal.Nasallavagelevelsofgranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactorandchronicnasalhypereosinophilia[J].InternationalForumofAllergy&Rhinology,2015,5(6):557–562.[41]JuanM,PengZ,YafengL,etal.TheDevelopmentofNasalPolypDiseaseInvolvesEarlyNasalMucosalInflammationandRemodelling[J].PlosOne,2013,8(12):e82373-e82373.[42]NicolaiP,TomenzoliD,BerlucchiM,etal.Endoscopictreatmentofsphenoidaspergilloma[J].ActaotorhinolaryngologicaItalica:organoufficialedellaSocietàitalianadiotorinolaringologiaechirurgiacervico-facciale,1998,18(1):23-9.[43]程清峰,薛金梅,冀永进.真菌性鼻-鼻窦炎的研究进展[J].临床医药实践,2015,(06):442-445.[44]MS,Schubert,DW,Goetz.Evaluationandtreatmentofallergicfungalsinusitis.I.Demographicsanddiagnosis[J].Parking,1998,48(3):395-402.33 [45]DoellmanMS,DionGR,WeitzelEK,etal.Immunotherapyinallergicfungalsinusitis:Thecontroversycontinues.Arecentreviewofliterature[J].Allergy&Rhinology,2013,4(1)::e32–e35.[46]StewartAE,HunsakerDH.Fungus-specificIgGandIgEinallergicfungalrhinosinusitis[J].OtolaryngologyHead&NeckSurgery,2002,127(4):324-32.[47]WiseSK,AhnCN,LathersDM,etal.Antigen-specificIgEinsinusmucosaofallergicfungalrhinosinusitispatients[J].AmericanJournalofRhinology,2008,22(5):451-6.[48]AbbaszadeganA,NabavizadehM,HoseiniYekaniA,etal.ComparisonofEndodonticTreatmentResultsYieldedfromUsingNormalSalinewithIKIFinalRinseorNaOClIrrigation:A30-MonthFollow-upStudy[J].IranEndodJ,2013,08(04):171-176.[49]RyanMW,MarpleBF.Allergicfungalrhinosinusitis:diagnosisandmanagement[J].CurrentOpinioninOtolaryngology&Head&NeckSurgery,2007,15(1):18-22.[50]SchubertMS.Allergicfungalsinusitis:pathophysiology,diagnosisandmanagement[J].MedicalMycology,2009,1(8):324-330(7).[51]ShatkinJS,DelsupeheKG,ThistedRA,etal.Mucosalallergyintheabsenceofsystemicallergyinnasalpolyposisandrhinitis:ameta-analysis[J].OtolaryngologyHead&NeckSurgery,1994,111(5):553-6.[52]BeilWJ,MceuenAR,SchulzM,etal.Selectivealterationsinmastcellsubsetsandeosinophilinfiltrationintwocomplementarytypesofintestinalinflammation:ascariasisandCrohn'sdisease[J].Pathobiology,2002,70(6):303-13.[53]MilenaM,GennadiyD,ChristinW,etal.Interleukin-17ApromotesIgEproductioninhumanBcells[J].JournalofInvestigativeDermatology,2010,130(11):2621-8.[54]AmberL,BradleyM.Theroleoffungiinchronicrhinosinusitis[J].OtolaryngologicClinicsofNorthAmerica,2005,38(6):1203–1213.34 附录一个人简历姓名：刘言军性别：男出生年月：1987年6月籍贯：安徽省界首市教育背景2005年9月-2008年6月安徽省界首市第一中学高中2008年9月-2013年6月安徽医科大学临床医学专业本科2013年9月-2016年6月安徽医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科学硕士发表文章刘言军,方平,高潮兵,等．鼻内镜下不同类型脑脊液鼻漏修补术的临床分析[J].安徽医科大学学报,2016,54(4):6-605.所获奖励2014年-2015年安徽医科大学研究生校内奖学金35 致谢时光飞逝，即将告别三年硕士研究生的生活，回想三年的点点滴滴，奋斗、辛苦、甜蜜、感动、收获和泪水，三年积累成人生中不可遗忘的宝贵经历。我在安医度过了8年的校园生活，这片神圣的校园里记载了我的青春记忆，它给我带来太多的感动、感恩，它见证了我的成长与蜕变。在此呈上我最诚挚的感谢，感谢一路上所有关心、支持、帮助我的老师，同学，耳鼻咽喉科的兄弟姐妹和我的家人。首先衷心感谢我的导师方平教授，您严谨的治学态度，渊博的专业知识，为人谦和，平易近人，处处为患者考虑的仁者之心以及您的人格魅力，对我的影响是我这一生最大的收获。您不仅教会我如何做研究，更教会我如何做人，如何做一名好医生。研究生三年，所发表论文，均由您亲自指导完成，您不厌其烦，逐字修改；本课题从选题到论文完成，同样倾注了您大量心血。虽然不舍得离开您的身边去工作学习，但请您放心，在新的工作岗位中，我一定发扬您的严谨工作态度，以及一切以患者利益为中心的精神，努力工作。成为值得让您骄傲的学生。对您的感谢及感恩是千言万语也不足以表达的。感谢在我的临床实践和课题实施过程中曾给予严格、无私、高质量教导的杨克林、沙群、刘业海、邱建新、江立琦、张文继、陆地红、吴开乐、童步升、高潮兵等主任及咽喉头颈外科全体老师，感谢喉镜中心的朱红梅老师，谢谢您在工作及生活中给予我的帮助、关心及指导。感谢汪东师兄在该课题研究、实验过程以及临床工作中给予我的帮助与鼓励；感谢各位师兄师姐和诸位同学在临床工作中对我的帮助，谢谢你们为我创造了良好的生活环境和积极向上的学习氛围，能与你们度过愉快的三年是我极大的荣幸。感谢我的家人，谢谢你们对我的关心和爱护，你们是我生活的动力。感谢参与我论文评审和答辩的各位尊敬的老师，衷心地祝大家一生平安、幸福安康！36 综述局部免疫球蛋白E在鼻-鼻窦炎症性疾病中的表达摘要鼻及鼻窦炎症性疾病为临床常见疾病，相关发病机制并不是很清楚，在患者鼻分泌物及粘膜常可检测到免疫球白E(immunoglobulinE,IgE)表达增高。研究发现，局部IgE可能参与鼻-鼻窦炎症性疾病的发病，通过检测鼻及鼻窦粘膜IgE的表达水平，进一步探究其在这类疾病中相关的发病机制。通过对鼻及鼻窦粘膜研究发现众多细胞因子、炎症介质和炎性细胞有助于鼻-鼻窦炎症性疾病发病过程，其中IgE在这些疾病中发挥重要作用。耳鼻喉科临床常用的真菌变应原检测方法有体内实验（皮肤实验）和体外实验（血清免疫学检测，如采用ImmunoCAP100系统检测血清真菌SIgE），但上述方法均反映的是系统性免疫状态,临床上部分患者上述检测结果为阴性，但是有明显的过敏反应症状，说明全身变应性检测结果并不能充分反映鼻及鼻窦炎症性疾病与变态反应的相关。很多学者发现鼻粘膜产生IgE，皮肤点刺实验和血清特异性IgE检测可能无法反映粘膜IgE水平的增高。鼻粘膜产生的IgE逐渐被视为促进鼻腔鼻窦炎症的重要因素。1IgE的来源早在1970年Tse等[1]怀疑鼻粘膜局部产更好鼻腔生某种变应性反应素（后来被证实为IgE）在鼻分泌物中的含量明显高于血清，当时并不能证明局部IgE是由鼻黏膜产生还是由血浆渗入或局部淋巴组织中B细胞结合IgE转移至鼻腔。Eckl-Dorna等[2]研究血源性浆细胞和B细胞产生特异性IgE的作用，在一系列阳性选择分离实验中发现，血液循环中特异性IgE不是血液中IgE生成细胞产生。这一结果表明几乎所有的血清IgE由局部黏膜产生，然后转移到血液中。随后的研究37 文献指出鼻腔鼻窦黏膜可产生IgE，Gevaert等[3]证实鼻息肉组织次级淋巴组织和淋巴滤泡结构中存在丰富的B和T细胞，发现IgE在这些淋巴组织中存在集聚。除了上述组织外，在鼻腔鼻窦组织中存在免疫球蛋白重链转换所需的相关介质，其中包括白细胞介素（IL）-4、IL-13及B细胞激活复合膜相偶联的CD40[4]。这些细胞因子与B细胞表面的CD40配子结合，触发B细胞疫球蛋白重链恒定区基因重组，通过调节抗体类别转导机制产生特异性IgE抗体[5]。以前认为，免疫蛋白类转换只发生在淋巴结和脾脏的生化中心，然而，现在的研究提供令人信服的证据表明鼻腔组织也可存在免疫球蛋白类转换。有文献指出鼻黏膜分泌局部IgE是弥漫性的，不局限于具体某个解剖部位，下鼻甲与鼻窦粘膜IgE的分泌差别不大，但上皮下分泌明显高于上皮。这些文献表明，局部IgE在鼻腔鼻窦粘膜组织产生具有可行性和可能性。2IgE在变应性鼻炎的局部表达很多文献指出，通过对变应性鼻炎（AR)患者鼻腔分泌物及鼻组织检测，发现局部IgE表达明显增高，说明IgE介导的I型变态反应与AR的发病机制有密切的关系。变应原（各种微生物、粉尘、尘螨、真菌菌丝及化学物质等）穿过鼻腔粘膜上皮屏障进入机体，经抗原呈递细胞处理后激活人体局部免疫系统产生IgE抗体，后者CH2和CH3结构域与肥大细胞或嗜碱性细胞表面的Fc受体（FcεRI)结合，使鼻腔粘膜对该种过敏原处于致敏状态。机体致敏状态可维持数月甚至更长时间，当鼻腔粘膜与相同抗原再次接触后，IgE抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物作用于肥大细胞或嗜碱性细胞膜，使cAMP浓度降低，使细胞膜和细胞质稳定性降低，促使相应的生物活性物质释放，包括白三烯、组胺、前列腺素及嗜酸性细胞趋化因子（ECF-A)等。这些介质作用于鼻腔粘膜的神经和血管，可使腺体分泌增多，粘膜组织水肿，继而可出现鼻痒、喷嚏、鼻分泌亢进、鼻粘膜肿胀等临床症状[6]。在一项研究中表明，长期对花草粉和屋尘螨过敏的患者下鼻甲活检中发现了花草粉特异性IgE[7]。Smurthwaite等[8]在AR患者下鼻甲黏膜中发现能够产生特异性IgE的细胞，如IgE阳性的肥大细胞、浆细胞和B细胞，为特异性IgE由局部38 黏膜产生提供了证据。Cameron等[9]发现IL-4在AR表达水平较高，意味着AR鼻粘膜为类别转导机制提供了良好的环境。因此，T细胞和肥大细胞产生并释放的IL-4和IL-3可能调节局部IgE的产生，上述细胞还携带DNA重组和IgE合成所必要的CD40配体[10]。Pawankar等[11]证明变应原可刺激肥大细胞表面的FcεRI上调促使其更容易与IgE交联偶联，促使更多的肥大细胞被激活和脱颗粒，分泌大量细胞因子和炎症介质加重鼻腔局部症状。传统上皮肤点刺实验和血清IgE检测是区分AR和非AR的主要方法，然而部分具有典型过敏病史的患者检测结果却是阴性，但鼻腔分泌物和局部鼻粘膜IgE处于高水平表达。Rondon等[12]报道对屋尘螨皮肤点刺实验和血清特异性IgE检测均阴性的AR和非AR两组患者进行鼻腔冲洗，发现两组鼻腔冲洗液屋尘螨特异性IgE阳性率分别为76%和12%，证实了上述研究。3IgE在鼻息肉组织中的表达鼻息肉的发病机制尚未有明确的理论提出，但是很多研究表明鼻息肉组织中IgE的表达水平明显增高，指出鼻息肉与IgE介导的局部超敏反应有关。Balsalobre等[13]报道鼻息肉组织中总IgE和特异性IgE的表达水平明显高于对照组组织，同时指出鼻息肉组织中IgE与组织中IL-5的表达水平呈正相关。Wei等[14]研究鼻息肉患者血清和组织中特异性IgE的表达水平，发现36.7%的鼻息肉组织中检测出特异性IgE的存在，而且所有鼻息肉组织中特异性IgE阳性的患者血清均为特异性IgE阳性和过敏症状，作者认为患者局部组织IgE是过敏症状的主要原因。Patadia等[15]指出IgE可使巨噬细胞分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），GM-CSF促进嗜酸性粒细胞（ESP）大量的活化和增殖并向炎症组织的趋化和聚集，导致粘膜炎症反应并形成鼻息肉。很多学者指出鼻息肉可能与局部真菌变态反应有关，同时很多文献证实鼻息肉组织中存在真菌特异性IgE。Albert等[16]发现患者鼻息肉组织中链格孢特异性IgE的表达水平明显高于正常组织，指出鼻息肉组织中链格孢特异性IgE的表达与嗜酸性粒细胞的浸润程度有关。他们认为无论患者全身过敏反应是否阳性，鼻腔局部组织IgE介导过敏反应可以作为重要的致病因素导致鼻息肉发生。王剑疆等[17]39 发现鼻息肉中黑霉菌、烟曲霉和互隔交链孢霉特异性IgE高于正常对照组，认为真菌过敏与鼻息肉发生发展有关。他们研究发现鼻息肉组织中真菌特异性IgE检测阳性率高于全身过敏检测结果且更加敏感，可作为鼻息肉患者真菌抗原的筛查。然而，真菌引起的超敏反应在鼻息肉形成的作用仍存在争论，部分学者提出了不同观点，Li等[18]将双侧鼻窦炎伴单侧鼻息肉的患者作为研究对象，发现鼻息肉侧鼻腔粘膜真菌特异性IgE表达水平与对侧相比没有明显差别，认为真菌局部变应性反应鼻息肉发病的主要病因。Pratt等[19]通过DNA体外扩增--多聚酶链反应（PCR）对鼻息肉组织中能与IgE抗原结合的基因序列V区进行扩增，组织217个基因序列中有31个独立基因序列与真菌抗原有关，突变分析显示只有5个独立序列有明确抗原选择，即局部IgE的表达受真菌抗原选择的影响不大，即鼻息肉中大部分IgE并不是与真菌相关的特异性IgE。有学者发现金黄色葡萄球菌超抗原在鼻息肉形成有密切关系，金黄色葡萄球菌超抗原及其介导的特异性IgE可使淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞大量释放细胞因子及炎症介质，导致鼻腔粘膜慢性炎症发生和诱导鼻息肉形成。Park等[20]发现鼻息肉中存在金黄色葡萄球菌肠毒素特异性IgE阳性细胞高表达，且其表达水平与IL-10的表达水平呈正相关。Wang等[21]指出金黄色葡萄球超抗原与T细胞的TCRVβ谱偏移有关，认为TCRVβ偏移是鼻息肉形成原因之一。Foreman等[22]研究进一步证实金黄色葡萄球菌肠毒素sIgE可作为独立因素促进Th2细胞活化。4IgE在变应性真菌性鼻窦炎粘膜中的表达变应性真菌性鼻窦炎（AFRS）是否为IgE仍然存在争论，但是大量文献指出AFRS局部粘膜存在IgE。临床上通过皮肤点刺实验或体外过敏检测确定全身过敏状态作为诊断AFRS的诊断方法之一，AFRS患者通过全身过敏检查可出现真菌和非真菌抗原阳性反应，提示全身对这些抗原过敏[23]。血清特异性IgE阴性的AFRS患者，局部特异性IgE可以为阳性，Chang等[24]检查14例AFRS患者血清烟曲霉特异性IgE无阳性反应，但是85.7%患者鼻窦组织中对烟曲霉特异性IgE有阳性结果。Wise等[25]通过研究AFRS鼻窦粘膜中IgE的水平，发现AFRS患者鼻窦粘膜中IgE40 分泌细胞和IgE特异性抗原有较高的表达水平。Matsuwaki等[26]证明AFRS手术后鼻窦中变应性黏蛋白内存在真菌sIgE，同时患者血清中也检测出真菌sIgE，并指出局部IgE与AFRS患者鼻窦粘膜水肿、息肉及变应性黏蛋白形成的过程中发挥重要作用。Ahn等[27]指出AFRS局部鼻腔鼻窦组织产生和分泌tIgE和sIgE，此外，鼻腔组织分泌局部IgE不只一个部位，包括鼻窦和鼻甲。上述研究表明AFRS患者鼻腔局部产生IgE，但是临床上脱敏治疗不能完全缓解临床症状，说明局部IgE在AFRS的作用还需要进一步探讨。5局部IgE的应用尽管皮肤点刺实验和血清学特异性IgE检测在已经广泛应用，但是上述方法只能反映全身的过敏状态，并不能反应局部的IgE表达水平。局部IgE在鼻-鼻窦慢性炎症疾病中的表达有关可以阐述下述现象：1.部分患者皮肤点刺实验和（或）血清学特异性IgE为阳性，但是没有明显的临床症状，说明其鼻腔局部并未出现明显的变态反应；2.很多怀疑是AR或AFRS的患者，但皮肤点刺实验和（或）血清特异性IgE检测为阴性；3.虽然IgE在鼻-鼻窦慢性炎症疾病中的发病机制目前还需要进一步研究，但是局部鼻粘膜产生IgE已成为共识，针对上述疾病局部IgE的临床治疗可成为潜在的方法之一；4.鼻-鼻窦炎症性疾病的发病原因是多病因，多种免疫及炎症介质等因素相互作用，多步骤的复杂过程导致的最终结果，针对局部IgE的研究，有助于解释鼻-鼻窦炎症性疾病的致病原因。6参考文献[1]TseKS,WicherK,ArbesmanCE.IgEantibodiesinnasalsecretionsofragweed-allergicsubjects[J].JournalofAllergy,1970,46(6):352-358.[2]Eckl-DornaJ,IPreeJ.Reisinger,etal.Themajorityofallergen-specificIgEinthebloodofallergicpatientsdoesnotoriginatefromblood-derivedBcellsorplasmacells[J].Clinical&ExperimentalAllergy,2012,42(9):1347–1355.[3]GevaertP,HoltappelsG,JohanssonSGO,etal.OrganizationofsecondarylymphoidtissueandlocalIgEformationtoStaphylococcusaureusenterotoxinsin41 nasalpolyptissue[J].Allergy,2005,60(1):71-9.[4]BacharierLB,GehaRS.MolecularmechanismsofIgEregulation[J].JournalofAllergy&ClinicalImmunology,2000,105(2):S547-58.[5]OzdemirC,AkdisM,AkdisCA.Tregulatorycellsandtheircounterparts:mastersofimmuneregulation[J].Clinical&ExperimentalAllergyJournaloftheBritishSocietyforAllergy&ClinicalImmunology,2009,39(5):626-639.[6]田从哲,杜锦朵,肖二彬.鼻息肉中IgE、GM-CSF与嗜酸性粒细胞浸润的关系及意义[J].医学研究与教育,2006,23(3):47-48.[7]KleinjanA,GodthelpT.AllergenbindingtospecificIgEinthenasalmucosaofallergicpatients[J].JournalofAllergy&ClinicalImmunology,1997,99(4):515–521.[8]SmurthwaiteL,WalkerSN,WilsonDR,etal.PersistentIgEsynthesisinthenasalmucosaofhayfeverpatients[J].EuropeanJournalofImmunology,2001,31(12):3422–3431.[9]CameronLA,DurhamSR,JacobsonMR,etal.ExpressionofIL-4,CepsilonRNA,andIepsilonRNAinthenasalmucosaofpatientswithseasonalrhinitis:effectoftopicalcorticosteroids[J].JournalofAllergy&ClinicalImmunology,1998,101(3):330-6.[10]BaarsEW,NieropAFM,SavelkoulHFJ.SeasonalAllergicRhinitisandSystemsBiology-OrientedBiomarkerDiscovery[J].BiomarkersinDiseaseMethodsDiscoveries&Applications,2014,12(6):1-18.[11]PawankarR,OkudaM,YsselH,etal.NasalmastcellsinperennialallergicrhiniticsexhibitincreasedexpressionoftheFcepsilonRI,CD40L,IL-4,andIL-13,andcaninduceIgEsynthesisinBcells[J].JournalofClinicalInvestigation,1997,99(7):1492-1499.[12]RondónC,CampoP,López-BlancaN,etal.LocalAllergicRhinitis:IsThereaRoleforSystemicAllergyImmunotherapy[J].CurrentTreatmentOptionsin42 Allergy,2015,2(1):1-10.[13]BalsalobreL,PezatoR,Perez-NovoC,etal.EpitheliumandstromafromnasalpolypmucosaexhibitsinverseexpressionofTGF-β1ascomparedwithhealthynasalmucosa[J].Journalofotolaryngology-head&necksurgery=LeJournald'oto-rhino-laryngologieetdechirurgiecervico-faciale,2013,42(1):29.[14]Chih-YenW,Sheen-YieF.Tissue-specificimmunoglobulinEinhumannasalpolyps[J].AnnalsofOtologyRhinology&Laryngology,2005,114(5):386-389.[15]PatadiaM,DixonJ,ConleyD,etal.EvaluationofthepresenceofB-cellattractantchemokinesinchronicrhinosinusitis[J].AmericanJournalofRhinology&Allergy,2010,24(1):11-16.[16]AlbertS,HamiltonRG,JacobsJB,etal.RoleoflocalimmunoglobulinEspecificforAlternariaalternatainthepathogenesisofnasalpolyposis[J].Laryngoscope,2008,118(1):4-9.[17]王剑疆,张丹梅,任金龙,等.鼻息肉组织中真菌sIgE水平调查[J].中华临床免疫和变态反应杂志,2011,05(2):117-119.[18]LiJY，FangSY．Allergicprofilesinunilateralnasalpolypsofbilateralchronicrhinosinusitis[J]．AmJRhino，2008,22(2):111-114．[19]PrattE，CollinsAM，SewellWA，etal．AntigenselectioninIgEantibodefromindividualwithchronicrhinosinusitiswithnasalpolyps[J].AmJRhinolAllergy,2010,24(6):416-421.[20]ParkYK,SeoST,KimEH,etal.RoleofStaphylococcusAureusExotoxinsinChronicRhinosinusitiswithNasalPolyp[J].KoreanJournalofOtorhinolaryngology-HeadandNeckSurgery,2010,53(4):221-227.[21]WangM,ShiP,ChenB,etal.Theroleofsuperantigensinchronicrhinosinusitiswithnasalpolyps.[J].Oto-rhino-laryngology,2008,70(2):97-103.[22]ForemanA,HoltappelsG,PsaltisAJ,etal.AdaptiveimmuneresponsesinStaphylococcusaureusbiofilm-associatedchronicrhinosinusitis[J].Allergy,2011,43 66(11):1449-1456.[23]MartinOmanEvans,II,ChristopherAlbertCoop.Noveltreatmentofallergicfungalsinusitisusingomalizumab[J].Allergy&Rhinology,2014,5(3):172-4.[24]Yu-TuanC,Sheen-YieF.Tissue-specificimmunoglobulinEinmaxillarysinusmucosaofallergicfungalsinusitis[J].Rhinology,2008,46(3):226-30.[25]WiseSK,AhnCN,LathersDM,etal.Antigen-specificIgEinsinusmucosaofallergicfungalrhinosinusitispatients[J].AmericanJournalofRhinology,2008,22(5):451-6.[26]MatsuwakiY,OkushiT,AsakaD,etal.RoleofLocalImmunoglobulinEProductioninthePathophysiologyofChronicRhinosinusitiswithNasalPolypsandAllergicFungalRhinosinusitis[J].JournalofAllergy&ClinicalImmunology,2011,127(2):AB120.[27]AhnCN,WiseSK,LathersDMR,etal.Localproductionofantigen-specificIgEindifferentanatomicsubsitesofallergicfungalrhinosinusitispatients[J].OtolaryngologyHead&NeckSurgery,2009,141(1):97-103.44
