来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究

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分类号：密级：＿辛七嫩摩ＨＵＡＺＨＯＮＧＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文ＭＡＳＴＥＲ’ＳＤＥＧＲＥＥＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究ＳＴＵＤＹＯＮＴＨＥＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＡＮＤＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮＯＦＡＮＯＶＥＬＣＨＲＹＳＯＶＩＲＵＳＩＳＯＬＡＴＥＤＦＲＯＭＰＥＳＴＡＬＯＴＩＯＰＳＩＳＴＨＥＡＥ研究生：周玲玲ＣＡＮＤＩＤＡＴＥ：ＬＩＮＧＬＩＮＧＺＨＯＵ兴教授２０１ＲＷＥＮＸＩＮＧＸＵＰＲＯＦＥＮＴＳＳＯ．：专业：植物病理学ＭＡＪＯＲ：ＰＬＡＮＴＰＡＴＨＯＬＯＧＹ导师ＦＩＥＬＤ：ＳＵＰＦＲＵＩＳＯＲＴＰＲＯＦＡＴＨＯＲＷＥＮＸＬＯＧＸＹ中国武汉ＷＵＨＡＮ，ＣＨＩＮＡ二零一八年六月ＪＵＮＥ２０１８， 华中农业大学硕士学位论文来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究STUDYONTHEIDENTIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFANOVELCHRYSOVIRUSISOLATEDFROMPESTALOTIOPSISTHEAE研究生:周玲玲:学号:2015301110176:指导教师:徐文兴:教授指导小组:徐文兴:教授王国平教授洪霓教授丁芳副教授王利平副教授蔡丽讲师专业名称：植物病理学研究方向：果树病理学获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2018年6月华中农业大学植物科学技术学院二零一八年六月II 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究目录摘要...............................................................................................................................iAbstract.........................................................................................................................iii缩略词表........................................................................................................................v一、文献综述..............................................................................................................11茶拟盘多毛孢与茶树轮斑病................................................................................11.1茶树轮斑病与其病原茶拟盘多毛孢..............................................................11.1.1茶树轮斑病发生和危害...........................................................................11.1.2茶树轮斑病病原.......................................................................................11.1.3茶树轮斑病防治方法...............................................................................21.2真菌病毒..........................................................................................................21.2.1真菌病毒分类...........................................................................................21.2.3真菌病毒的传播.......................................................................................31.2.4植物病原真菌弱毒现象与生物防治.......................................................31.2.5真菌病毒对寄主真菌的影响...................................................................41.3研究目的和意义..............................................................................................4二、材料与方法..........................................................................................................51研究材料................................................................................................................51.1菌株和接种植物..............................................................................................51.2培养基..............................................................................................................51.3试剂..................................................................................................................61.4载体与引物......................................................................................................82研究方法................................................................................................................92.1菌株分子鉴定..................................................................................................92.2菌株生物学性状的观察和分析....................................................................102.3菌株dsRNA的提取.....................................................................................102.4dsRNA样品的酶切验证................................................................................112.5dsRNA片段的cDNA序列克隆..................................................................12I 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2.6病毒粒体透射电镜观察................................................................................142.7菌株LI-41孢子脱毒分析...........................................................................162.8病毒粒体转染脱毒菌株LI-41-1的原生质体.............................................171.2.4带毒菌株LI-41平行转染无毒菌株......................................................172.9原始带毒和后代无毒及有毒菌株生物学性状的分析................................18三、结果与分析........................................................................................................181菌株的分子鉴定及生物学性状的观察和分析..................................................181.1菌株的分子鉴定............................................................................................181.2菌株生物学性状的观察和分析....................................................................192菌株LI-41中核酸的分析鉴定...........................................................................202.1菌株LI-41中核酸的提取及酶处理验证....................................................202.2菌株LI-41中dsRNA全长cDNA序列的克隆与分析..............................203PtCV-1病毒粒体透射电镜观察..........................................................................243.1超速离心梯度层中核酸和蛋白的分析........................................................243.2病毒粒体的透射观察和测量........................................................................254菌株LI-41后代无毒菌株和传毒菌株的检测结果...........................................264.1菌株LI-41的无毒菌株的检测结果............................................................264.2菌株LI-41传毒菌株的检测结果................................................................265PtCV-1病毒的生物学性状..................................................................................28四、结论与展望........................................................................................................32附录A菌株保守序列测序结果.............................................................................33附录BdsRNAs1–4所编码的蛋白质BLASTp分析结果.................................36附录CPtCV-1与其他病毒RdRp的系统进化分析所用的分离物信息...........40附录D硕士研究期间发表的文章.........................................................................41参考文献......................................................................................................................42致谢..............................................................................................................................47II 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究摘要茶轮斑病是危害茶树[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]生产的重要病害，严重时可导致叶片大量脱落，影响茶叶品质和产量，目前在我国茶园中广泛发生。茶拟盘多毛孢（Pestalotiopsistheae）是引起茶轮斑病的优势种。我们前期在田间分离获得了一株致病力丧失的茶拟盘多毛孢菌株LI-41，其较正常菌株表现出菌落形态异常，菌丝生长速度缓慢。本研究是针对菌株LI-41生物学性状发生变化的原因进行了探索，所得结果如下：对菌株LI-41和正常菌株（TP-2-2W）的菌丝进行双链RNA（doublestrandedRNA,dsRNA）的提取，发现LI-41菌株中含有4条dsRNA片段（dsRNA1-4），随机克隆以及末端克隆测序显示，其大小分别为3387、2831、2599和932nt，分析推测每一条dsRNA分别编码一个独立的开放阅读框（Open-ReadingFrame,ORF），依次命名为ORF1、ORF2、ORF3和ORF4。将获得的4条dsRNA序列编码蛋白采用BLASTp与登录在NCBI中的序列比对，显示该病毒ORF1-3编码蛋白与金色病毒属的胶孢炭疽菌金色病毒-1（Colletotrichumgloeosprioideschrysovirus1,CgCV-1）编码蛋白相似性最高，相似率分别为65%、48%和54%，而ORF4编码蛋白未搜到任何病毒的同源序列，我们将其命名为茶拟盘多毛孢金色病毒-1（Pestalotiopsistheaechrysovirus1,PtCV-1）。根据与已知蛋白的相似性推测，PtCV-1的ORF1编码依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase,RdRp），ORF2编码外壳蛋白（Coatprotein,CP），ORF3编码甲基转移酶，ORF4所编码的蛋白功能未知。采用蔗糖梯度超速离心法提纯PtCV-1的病毒粒体，分别从蔗糖各梯度层的病毒粒子提取核酸，结果显示在20%-50%蔗糖层均存在4条核酸链，大小与从菌丝中提取的4条dsRNA大小一致，其中50%蔗糖层中病毒含量最高。将50%蔗糖层纯化的病毒粒子进行铜网吸附后负染，经透射电镜观察，观察到了球形病毒粒子，其直径为30.1~39.8nm。将LI-41诱导产孢，挑选42个分生孢子培养后，进行PtCV-1的dsRNA检测，结果显示67%分生孢子再生后代仍含有PtCV-1。将LI-41与分生孢子再生无毒菌株（LI-41-1）对峙培养，在LI-41-1菌落边缘挑取50个菌丝块进行dsRNA检测，结果显示有6个传毒后代检测结果呈阳性，表明PtCV-1可以水平传毒给i 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文遗传背景相同的菌株。用PEG介导病毒粒子和核酸转染单孢无毒后代菌株（LI-41-1）的原生质体，然后对转染原生质体的后代菌株进行培养，分别筛选150个原生质体再生后代菌株进行dsRNA检测，结果显示，仅有5个病毒粒子转染后代菌株检测到了PtCV-1的dsRNA条带。由此推测，该病毒的核酸可能不具有侵染性，但可以通过病毒粒子和水平传毒的方式传染给无毒的分生孢子后代菌株中。比较分生孢子后代无毒菌株（LI-41-1、LI-41-2、LI-41-3）、原始带毒菌株（LI-41）、分生孢子后代带毒菌株（LI-41-V1、LI-41-V2）、病毒粒子传毒后代菌株（LI-41-1T1、LI-41-1T2、LI-41-1T3）和对峙培养传毒后代菌株（LI-41-1P-1、LI-41-1P-2、LI-41-1P-3）生物学性状表明，带毒菌株和无毒菌株菌落形态和致病力表现显著差异：带毒菌株较无毒菌株均色素增多，菌丝轮纹圈消失；菌落畸形；生长速度降低，正常菌株为6.5-6.7mm/d，带毒菌株为2.0-2.8mm/d；致病力减弱，在来源于云南和广西本地种茶叶上，无毒菌株接种引起的病斑大小分别为11.9-14.1mm和17.5-21.5mm，而带毒菌株没有引起明显的病斑。以上结果表明：PtCV-1侵染茶拟盘多毛孢可引起其菌丝畸形，生长速度减弱和致病力显著降低。本研究报道了侵染茶拟盘多毛孢的金色病毒属新成员PtCV-1，并明确该病毒可以引起茶拟盘多毛孢生长异常、生长速度和致病力减弱。据我们所知，这是国际上茶拟盘多毛孢内报道的首例真菌病毒。PtCV-1能够显著改变寄主的致病力，可望进一步应用于茶拟盘多毛孢的生防研究；PtCV-1的发现也是国际首例真菌病毒-茶拟盘多毛孢研究系统，为采用反向遗传学深入研究茶拟盘多毛孢基因功能奠定基础。关键词：产黄青霉病毒科；茶拟盘多毛孢金色病毒-1；拟盘多毛孢；弱毒特性ii 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究AbstractTeagreyblightisanimportantdiseaseofteatrees[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze],resultsinseriousdefoliation,andleadstobiglossesoftheyieldandthequalityasitseverelyoccurs.Pestalotiopsistheaeisthedominantspeciescausingtealeafspotdisease.WeisolatedaP.theaestrainLI-41atealeaf,whcihshowedabnormalcolonialmorphologyandlowergrowthrates,thanthenormalone.ThisstudyhasuncoveredthereasonforthechangesofthebiologicaltraitsofP.theaestrainLI-41,andtheresultsareasfollows:Fourdouble-strandedRNA(dsRNA)strandswereidentifiedinstrainLI-41asitwassubjectedtodsRNAextraction.Randomandterminalsequencingrevealedthattheyare3387,2831,2599and932bp,respectively.EachofthedsRNAswasconcludedtoencodeasingleopenreadingframe(ORF),seriallytermedORF1,ORF2,ORF3andORF4.Ofwhich,ORF1wasconcludedtoencodeaputativeproteinase,andORF4unknownfunctionproteinBLASTpsearchesoftheseORF-codingproteinsrevealedthattheyhadthehighestsimilaritieswiththoseofColletotrichumgloeosprioideschrysovirus1(CgCV1),andsharedtheidentitiesof65%,48%,54%,respectively,whereastheORF4-codingproteinhadnodetectableproteins.TheviruswasconcludedasanovelmemberintheChrysovirusgenus,tentativelytermedPestalotiopsistheaechrysovirus1(PtCV-1).ExtractionofnucleicacidfromeachofthesucrosefractionsrevealedthatthefourdsRNAspresentinallthefractions(10%to50%)butwiththehighestconcentractioninthe50%,andtheirpositionsmatchthosefromthemycelia.Thevirionin50%sucrosefractionweretransferedontocoppermeshandsubjectedtotransmissionelectronmicroscopyafternegativelystained,itrevealedthediameteris30.1~39.8nmLI-41wasinducedtoproduceconidia,andfiftyconidiawereculturedfordsRNAextraction.Theresultsshowedthat67%oftheconidium-generatingcolonieswereinfectedbyPtCV-1.AscontactculturedbetweenstrainsLI-41andLI-41-1(derivedfromconidium-generatingcolonyfreeofPtCV-1),andfiftysubisolateswereiii 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文excizedfromtheedgesofLI-41-1colonyfordsRNAextractionaftercultured.TheresultsshowedsixofthesubisolatespositiveforPtCV-1,indicatingthatPtCV-1canbehorizontallytransedtothestrainLI-41-1s.UsingPEG-mediatedviralparticlesornucleicacidtransfectionoftheprotoplastsofPtCV-1-freestrains(LI-41-1),150protoplastgeneratingprogeniesweresubjectedtodsRNAdetection.TheresultsshowedthatPtCV-1wasdetectedinfiveprogenarycoloniesthattransfectedbyparticlaes,suggestingthatPtCV-1canbetransmitedtootherstrainsbyparticlesbutnotbytheirnuclicacids.Comparisonofthebiologicalcharacteristicsofthevirus-freestrains(LI-41-1,LI-41-2,LI-41-3),virus-infectedparentalstrain(LI-41),virus–infectedconidium-generatingprogenystrains(LI-41-V1,LI-41-V2),virus-transfectedstrains(LI-41-1T1,LI-41-1T2,LI-41-1T3)andvirus-transfectedstrainsderivedformcontact-cultues(LI-41-1P-1,LI-41-1P-2.LI-41-1P-3)showedthattheyhadsignificantlydifferentmorphologiesandvirulences.Thevirus-infectedstrainspresentedmorepigments,absentofhyphalrings,abnormalcoloniesdecreasedgrowthrates(thevirus-freestrainsare6.5-6.7mm/d,whilethevirus-infectedstrains2.0-2.8mm/d),andattenuatedvirulences(thelesionsinducedbyvirus-freestrainsbeing11.9-14.1mm,whilebyvirus-infectedstrains1.7-4.1mm).ItsuggestedthatPtCV-1infectioncancauseabnormalcolonies,lowergrowthratesandattenuatedvirulencesofP.theae.Inthisstudy,wereportanovelchrysovirusPtCV-1,whichinfectsP.theaeresultinginabnormalmorphologies,decreaseofthegrowthrates,andattenuatedvirulences,andtoourknowledge,thisisthefirstreportofamycovirusinfectingP.theae.PtCV-1cansignificantlyattenuatethehostvirulence,whichexpectedforfurtherapplicationinbiocontrolmentofthefungaldisease.ThediscoveryofPtCV-1isalsothefirstfungus-virussystemforP.theae,whichmaybeusedinstudyingthegenomicfunctionsofthisfungusasreversegeneticapproach.Keywords:P.chrysogenumVirusfamily;Pestalotiopsistheaechrysovirus1;Pestalotiopsistheae;hypovirulenceiv 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究缩略词表Abbreviation缩略符号英文全名中文名称APSAmmoniumpersulfate过硫酸胺aaaminoacid氨基酸AmpAmpicillin氨苄青霉素bpBasepair碱基对BLASTBasiclocalalignmentsearchtool局部比对检索工具cDNAComplementaryDNA互补DNAddH20DoubledistilledH20双蒸水CPCoatprotein外壳蛋白DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMSODimethylsulphoxide二甲基亚砜dNTPDeoxyrinediaminetriphoshate脱氧核糖核苷三磷酸dsRNADouble-strandedRNA双链RNAEBEthidiumbromide溴化乙锭EDTAEthylenediaminetetraceticacid乙二胺四乙酸GenBankGeneticsequencedatabase遗传序列数据库kDaKilodalton千道尔顿LBLuria-BertanimediumLB培养基NCBINationalCenterforBiotechnologyInformation国家生物技术信息中心NBTNitrobluetetrazolium氮蓝四唑ODOpticaldensity光密度ORFOpenreadingframe开放阅读框架PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphatebufferdsaline磷酸盐缓冲液PDAPotatodextroseagar马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDBPotatodextrosebroth马铃薯葡萄糖液体培养基PEGPolyethyleneglycol聚乙二醇PCRPolymerasechainreaction多聚酶链式反应RACERapidamplificationofcDNAendscDNA末端快速扩增RdRpRNA-dependent依赖RNA的RNA聚合酶RT-PCRReverse-transcriptionpolymerasechainreaction反转录聚合酶链式反应SDSSodiumdodecylsulphate十二烷基磺酸钠TAETris-acetate-EDTAbufferTris醋酸EDTA缓冲液TEMEDTetramethylethylenediamine四甲基乙二胺TrisTrihydroxymethylaminomethane三羟基氨基甲烷dday天ntNucleotide核苷酸v 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究一、文献综述1茶拟盘多毛孢与茶树轮斑病1.1茶树轮斑病与其病原茶拟盘多毛孢1.1.1茶树轮斑病发生和危害茶[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]源自中国，是世界主要的传统非酒精饮料之一的原材料，也是一种多年生经济作物，我国主要出口商品之一。茶叶中含有多种对人体健康非常有益的活性化合物，对提高人体免疫力有很大帮助。我国的茶树栽培历史最早在《神农本草经》就有记载。茶树病害根据其为害部位分为根部、茎部、叶部和花部病害。据统计，世界主要产茶国已报道的茶树病害种类（真菌、细菌、病毒、寄生和寄生性植物、线虫）已有近500种（陈宗懋和陈雪芬1988，陈宗懋和孙晓玲2013）。据记载，我国茶树病害有近100种，其中有30多种最为常见（陈宗懋和陈雪芬1990，陈宗懋和孙晓玲2013）。茶轮斑病又称茶梢枯死病，是茶园中一种最常见的叶部病害，各地产茶区均有发生，主要为害部位是新梢和叶片，属于高温高湿型的病害，秋季发生最为严重（陈宗懋和孙晓玲2013）。病斑常常从叶尖或者叶缘开始出现，开始产生的小病斑为黄绿色，后来扩展成不规则形、半圆形，圆形的灰白相间的褐色大病斑，并逐渐扩展到茶树的其他部位，病斑上常呈现有较明显的同心轮纹圈，病健分界特别明显。严重发病的时候，常常导致扦插苗成片的枯死、大量落叶，使茶叶严重减产（陈宗懋和孙晓玲2013）。在中国湖北的许多茶园调查中发现，该病的发生尤其严重，对湖北的茶叶生产构成了巨大的潜在威胁（陈宗懋和孙晓玲2013）。1.1.2茶树轮斑病病原茶轮斑病菌病原为拟盘多毛孢（Pestalotiopsisspp.），其中茶拟盘多毛孢（P.theae）是我国茶轮斑病病原的优势种（陈宗懋和孙晓玲2013）。无性阶段的茶拟盘多毛孢，分生孢子呈褐色，纺锤形，有5个细胞，中间3个细胞大，两端细胞小，分隔处有缢缩，分生孢子顶端有2~4根附属丝，附属丝无色透明。茶轮斑1 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文病菌病病原菌生长的最适温度为28℃，高湿度条件更有助于孢子的形成和传播（陈宗懋和孙晓玲2013）。1.1.3茶树轮斑病防治方法茶轮斑病的防治方法主要有农业和化学药剂的防治，化学药剂防治效果比较好的有丙环唑、百菌清、阿米西达、世高和苯菌灵等（郭世保等2014）。但化学药剂会使植物病原真菌形成抗药性，且会造成环境污染进而影响人类和动物的健康。因此，生物防治可望在今后的茶树病害防治中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。1.2真菌病毒真菌病毒是可以在真菌、卵菌等中自由复制的病毒类群。只有一小部分真菌病毒可以长时间侵染真菌寄主，引起寄主弱毒现象，导致寄主致病力衰退（Buck1986,Ghabrialetal1998）。关于真菌病毒的发现，最早是在栽培的双胞蘑菇上发现的一种对经济影响重大的新病害，通过在电子显微镜下观察发现3种病毒与这种新病害有关，这也是对于真菌病毒的首次报道（Hollings1962）。随后，在Penicilliumfuniculosum中发现了一种能产生dsRNA的病毒。Banks等研究发现，匐枝青霉病毒（Penicilliumstoloniferumvirus，PsV）和绳状青霉病毒（Penicilliumfuniculosumvirus，PfV）也都是dsRNA病毒（EllisLFandKleinschmidtWJ.1967）。1.2.1真菌病毒分类目前，根据真菌病毒基因组的核酸类型，我们可以将真菌病毒分为正单链RNA病毒（positivesingle-strandedRNA,+ssRNA）、负单链RNA病毒（negativesingle-stranded,-ssRNA）、双链RNA病毒（doublestrandedRNA,dsRNA）、和环状单链DNA病毒（singlecircularstrandedDNA,ssDNA）（Ghabrialetal2015）。目前，真菌病毒主要分14个科。其中2个为逆转录RNA病毒科、5个为ssRNA病毒科、最多的为dsRNA病毒，有7个科（刘忱2016，蔡婷2015）。2013年，首次发现一种能够进行体外传染ssDNA病毒Sclerotiniasclerotiorum2 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究hypovirulence-associatedDNAvirus1（SsHADV-1）（Yuetal2013）。dsRNA病毒的7个科包括产黄青霉病毒科，双分体病毒科，呼肠孤病毒科，单分体病毒科，内源RNA病毒科，巨大双分RNA病毒科（Megabirnaviridae）和Quadriviridae（Ghabrialetal2015）。到目前为止，金色病毒科（Chrysoviridae）只有一个金色病毒属（Chrysovirus）（Ghabrial2011）。该属的模式种为Penicilliumchrysogenumvirus(PcV）（Castonetal2003）。该病毒dsRNA1编码RdRp，dsRNA2编码CP，而dsRNA3和dsRNA4分别编码P3和P4，但后两者的功能现还未知（Castonetal2003）。PcV病毒具有等距的（球状的）、无膜包被的病毒粒体，核衣壳是由60个单体蛋白亚基排列而成的正二十面体（Castonetal2003）。真菌病毒粒子包含线状、杆状、棒状、有囊膜的杆状、正二十面体球形等多种结构表型，其中正二十面体球形居多。还有一些是无蛋白外壳包裹的裸露核酸（Pearsonetal2009,Ghabrialetal2015）。1.2.3真菌病毒的传播真菌病毒主要通过水平和垂直的形式在寄主中传播（Nuss2005,Anagnostakisetal1998），真菌病毒的垂直传播指病毒通过孢子传到下一代菌株。水平传播是指病毒在两个遗传背景很近的菌丝之间的传播。而相比前两者，利用原生质体的方法对病毒传播途径的意义重大，因为它可以打破生殖隔离，让两个遗传背景很远的真菌之间传播病毒成为可能（Vander1995）。例如，可以通过原生质体融合将禾谷镰刀菌中的禾谷镰刀菌病毒（Fusariumgraminearumvirus，FgV1）转染到板栗疫病菌中（Leeetal2011）。有些真菌病毒还可以体外传播，如：SsHADV-1的病毒粒体可以直接侵染核盘菌且不需要传播介体（Yuetal2010）。1.2.4植物病原真菌弱毒现象与生物防治植物病原真菌的弱毒现象（Hypovirulence）是研究人员在研究欧洲栗疫病溃疡病斑自我愈合时发现的一种科学现象。弱毒现象就是指能传染给正常菌株并使其出现毒力减弱的现象，被侵染的菌株被称为弱毒菌株（Grente1965,GrenteandSauret1969）。后来弱毒现象越来越受到人们关注，弱毒菌株被相继发现。越来3 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文越多的研究者开始利用弱毒现象来对植物病害进行生物防治。如Cryphonectriahypovirus1（CHV1），致使板栗疫病菌致病力减弱，能治愈树干上的病斑。在欧洲成功防治板栗疫病，成为病毒生物防治的经典案例（Nuss1992）。SsHADV-1病毒粒体能够直接侵染核盘菌，对植物起到保护和治疗病害的效果，因其独特的体外侵染能力，具有良好的生物防治前景（Yuetal2013）。但真菌病毒病原寄主间的不亲和性使真菌病毒的传播受到限制，进而影响利用真菌病毒进行的生防应用（NewhouseandMacDonald1991）。1.2.5真菌病毒对寄主真菌的影响侵染真菌的真菌病毒有些可以与寄主形成共生关系，有些会使真菌呈现弱毒力。如vanDiepeningen等证明dsRNA病毒对曲霉菌没有显著影响（VanDiepeningenetal2006）。相反，交链格孢（Alternariaalternata）EGS35-193菌株上的一个dsRNA病毒，能引起寄主细胞病变（Aokietal2009）；禾谷镰孢（F.graminearum）China-9菌株上的dsRNA病毒Fusariumgraminearumviruschina9（FgV-ch9）能使寄主真菌出现弱毒力。（XieandJiang2014,Ghabrialetal2015）。也有一些真菌病毒侵染真菌可以让寄主真菌致病力增加，如从水稻纹枯病菌D122菌株中的真菌病毒RsRV2，能使寄主真菌的致病力增强（张美玲等2015）。与动、植物病毒分子互作研究相比，真菌病毒与寄主真菌的分子互作的研究则相对落后。迄今为止，真菌病毒与寄主真菌之间只有3个互作系统，分子互作研究主要有：CHV1（Cryphonectriahypovirus1）与栗疫病菌（C.parasitica）的互作系统（Segers2007,SunQetal2009,Dengetal2008,Dengetal2007,Faruk2008,Jacob-Wilketal2006）；SsDRV（SclerotiniasclerotiorumhypovirulenceassociatedDNAvirus1）与核盘菌（S.sclerotiorum）的互作系统；真菌病毒与白纹羽菌（R.necatrix）的互作系统，锌离子也可以介导病毒在白纹羽菌中水平传播，克服了菌丝营养体不亲和性的水平传播（Lietal2008,Zhuetal2013）。1.3研究目的和意义茶是我国主要出口商品之一，具有重要的经济价值。而茶轮斑病严重危害茶叶的产量和品质。真菌病毒作为一种重要的生防资源，已经应用于板栗疫病的防治（李波和姜道宏2016）。本研究针对表现弱致病力的茶拟盘多毛孢开展研究，4 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究探究引起其致病力下降的病毒种类，有望为采用真菌病毒控制茶轮斑病挖掘生防资源。此外，茶树起源于我国，具有3000多年的栽培历史，侵染的真菌及真菌病毒与茶树在长期的协同进化中，可能蕴含丰富的进化信息。前期我们实验室从茶刺盘孢菌内发现了国际第一例线性dsRNA病毒，该病毒处于从+ssRNA病毒至dsRNA病毒及裸露病毒到衣壳蛋白包被病毒的过渡状态，且是迄今为止最长的病毒粒子，对深入认识RNA病毒的形态、进化和分子特性具显著的意义（Jiaetal2017）。但目前对茶树病原真菌病毒研究不多，仅有一例茶树病原真菌病毒研究（Jiaetal2017）。因此，开展茶拟盘多毛孢真菌病毒研究，可望丰富茶树真菌病毒知识，深入认识病毒提供有益信息，并为建立真菌病毒-茶拟盘多毛孢菌互作研究系统提供材料和奠定理论基础。二、材料与方法1研究材料1.1菌株和接种植物供试菌株：茶轮斑病菌菌株LI-41和TP-2-2W，供试菌株LI-41是从感染茶轮斑病的茶叶片上分离而来，TP-2-2W是本实验室保存的菌株。以上菌株均于培养基25℃条件下培养，25%的甘油保存于-70℃。供试植物：茶叶（铁观音茶叶，以及来自云南和广西的本地茶叶）。1.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂（Potatodextroseagar,PDA）培养基：蒸馏水1L加入马铃薯200g煮20min，双层纱布过滤后加入葡萄糖40g和琼脂30g，分装成小瓶，121℃高压蒸汽灭菌15min后备用。水琼脂培养基：16g琼脂，蒸馏水定容到1L，121℃高压蒸汽灭菌15min后备用。LB（Luria-Bertani）培养基：10g蛋白胨，5g酵母浸膏，5gNaCl调至pH7.0，补水至1000mL，固体培养基加17g琼脂。5 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文YEPD液体培养基：3.0gYeastExtract，10gPeptone，20gDextrose，蒸馏水定容到1L，121℃高压灭菌15min，室温保存。TB3培养基：3gYeastExtract，3g酸水解酪蛋白，200g蔗糖，蒸馏水定容到1L，121℃高压灭菌15min，4℃保存。BottomAgar：3gYeastExtract，3g酸水解酪蛋白，200g蔗糖，10g琼脂，蒸馏水定容到1L，121℃高压灭菌15min。TopAgar：3gYeastExtract，3g酸水解酪蛋白，200g蔗糖，15g琼脂，蒸馏水定容到1L，121℃高压灭菌15min。1.3试剂50×TAEBuffer(pH8.5)：称取Tris242g和Na2EDTA·2H2037.2g于1L烧杯中，加入约600mL去离子水充分搅拌混勾。然后加入57.1mL冰醋酸，加去离子水定容至1L，室温保存待用。工作浓度为1×TAEBuffer。6×LoadingBuffer(pH7.0)：称取0.44gEDTA于50mL烧杯，加入约30ml去离子水充分溶解。加入18mL甘油，用NaOH调pH至7.0，最后加入溴酚蓝0.025g，定容至50mL，室温保存。提取dsRNA所用试剂：β-ME（Promega公司）、SDSbuffer、Bindingbuffer，Washbuffer均为本实验室配方。DsRNA纯化：DNaseI和S1核酸酶均购于Takara生物工程有限公司。RT-PCR所用试剂：M-MLV反转录酶（Promega公司）、6碱基随机引物、RNA酶抑制剂（RecombinantRnaseInhibitor，RRI）、rTagDNA聚合酶和dNTPs均购于Takara生物工程有限公司。目标片段的回收和克隆：DNA凝胶回收试剂盒、TA克隆用试剂盒pMD18-TVectorCloningKit（Takara生物工程有限公司）。氨苄青霉素（Amp）（Amersco，USA）：用灭菌的双蒸水将药品配制为终浓度50mg/mL，注意用细菌过滤器过滤除菌，-20℃保存备用。用于基因克隆的菌株EscherichiacoliDH5α由本实验室保存。其它各种化学试剂为国产分析纯。STCbuffer：100g蔗糖，50mL0.5MTris-HCl（PH8.0），3.6755gCaCl2•2H2O，6 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究蒸馏水定容到500mL，121℃高压灭菌15min，4℃保存。PTC：40gPEG8000，STC溶液定容到100mL，可在65℃水浴锅中加速溶解，用细菌过滤器除菌后4℃保存。1.2MKCl溶液：称量KCl固体89.46g并补水到1L，搅拌溶解后121℃高压灭菌15min。原生质体buffer：100mgLysingenzymefromTrichodermaharzianum，10mg蜗牛酶，加入1.2M的KCl补足到10ml，振荡30min后4000r/min离心6min，吸取上清液过滤除菌待用。2%磷钨酸钠负染液：20g的磷钨酸钠溶于1L的去离子水中，NaOH溶液调pH至6.8，避光4℃保存。30%(W/V)Acr-Bis：称取29g丙烯酰胺(Acrylamide)和1g甲叉双丙烯酰胺（Bis-Acrylamide），溶于约60mL去离子水，充分溶解后定容至100mL，并用0.45um过滤器过滤除菌，于棕色瓶中4℃保存。10%(W/V)过硫酸铵(APS)：称取0.1gAPS溶于1mL去离子水，于4℃保存。保存时间不能超过2周，会失去催化作用。10%(W/V)SDS：称取10gSDS，去离子水定容至100mL。1mol/LTris-HCl：121.1gTris，浓盐酸调pH至6.8，双蒸水定容至1L。1.5mol/LTris-HCl：181.7gTris，浓盐酸调pH至8.8，双蒸水定容1L。5×SDS-PAGE上样缓冲液：1mol/LTris-HCl（pH=6.8）1.25mL，SDS0.5g溴酚蓝25mg，甘油2.5mL，双蒸水定容到5mL。l0×Tris-GlyciueBuffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)：称取30.2gTris，188g甘氨酸和10gSDS于1L烧杯中，加入约800mL去离子水充分揽拌溶解，定容至1L后室温保存备用。工作浓度为1×Tris-GlycineBuffer。SDS-PAGE胶染色液：分别量取225mL水，225mL甲醇和50mL冰醋酸，置于500mL烧杯中，然后加入0.25g考马斯亮蓝G-250，充分混匀后，室温保存待用。SDS-PAGE胶脱色液：分别量取225mL水，225mL甲醇和50mL冰醋酸，充分混匀后，室温保存待用。7 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文1.4载体与引物病毒克隆与测序所用的载体为pMD18-T（TaKaRa公司），具有氨苄青霉素的抗性。所用的引物见表2.1。所有引物均由上海生工合成。表2.1病毒扩增所用的引物和接头Table3.1PrimersandadaptorsusedinvirusamplificationProductPrimernamePrimersequences(5'-3')Positionslength（bp）05RACE-3RTCGATCGATCATGATGCAATGCNNNNNRandomoligoforreversetranscription/05RACE-3CGATCGATCATGATGCAATGCHomologousto05RACE-3RT/(P)-RACE-OLIGOGCATTGCATCATGATCGATCGAATTCTTTAdaptorforRACEclonging/AGTGAGGGTTAATTGCC-(NH2)ORACE-1GGCAATTAACCCTCACTAAAGComplementarytoRACE-OLIGO/ORACE-2TCACTAAAGAATTCGATCGATCComplementarytoRACE-OLIGO/(P)-pC3-T7loopGGATCCCGGGAATTCGGTAATACGACTCAdaptorforRACEclonging/ACTATATTTTTATAGTGAGTCGTATTApC2CCGAATTCCCGGGATCCComplementarytopC3-T7loop/M13-48GAGCGGATAATTTCACACAGGForwardprimerforidentificaionofinsertsinpMD18-Tplasmid/M13-47CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACReverseprimerforidentificaionofinsertsinpMD18-Tplasmid/PtCV1-RNA1-F1CCCAAACCATTGTACAAAACGHomologoustodsRNA1atpositions721~742518PtCV1-RNA1-R1TGGAAAGACACCTTGAGCATComplementarytodsRNA1atpositions1219~1239PtCV1-RNA2-F1GGTGCCATTGAGTGTCTTTCAHomologoustodsRNA2atpositions1477~1498174PtCV1-RNA2-R1TCGCACAGTCGTCACAGATAComplementarytodsRNA2atpositions1631~1651PtCV1-RNA3-F1ATGGGGAGCGATGATAGGCTTHomologoustodsRNA3atpositions1496~1517730PtCV1-RNA3-R1TCCAGGCTTTATCATTCCCTComplementarytodsRNA3atpositions2206~2226Pt1CV1-RNA3-5'RACE-1TGCTCTAATATCCACTCACCComplementarytodsRNA35′terminiatpositions384~404404Pt1CV1-RNA3-5'RACE-2AGCACACTTAGCATCTGGAAComplementarytodsRNA35′terminiatpositions192-212212PtCV1-RNA3-3'RACE-1CTGGTGTTTGACAATTTTGATHomologoustodsRNA33′terminiatpositions2235~2256364PtCV1-RNA4-RACE-1AGGCACCGTCAGAACAAAAComplementarytodsRNA45'terminiatpositions227~247247PtCV1-RNA4-3'RACE-1TATCCTGAAGAACGGTCGGAAHomologoustodsRNA43'terminiatpositions701~722230PtCV1-RNA1-5'RACE-1GGCATTACGATTGCGAACAAComplementarytodsRNA15'terminiatpositions232~252252PtCV1-RNA1-3'RACE-1TGAGAAGGTGCTGGATATGGHomologoustodsRNA13′terminiatpositions2856~2876535PtCV1-RNA3-5'RACE-1ATAGCTGTATGATGTGTCTCComplementarytodsRNA35′terminiatpositions749~769769PtCV1-RNA2-5'RACE-2TGCCTTCTGTATCGTGCTTCComplementarytodsRNA25′terminiatposition503~523523PtCV1-RNA2-3'RACE-1TAGCCTTTGAGCAAGGGAAAHomologoustodsRNA23′terminiatpositions2288~23085438 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究2研究方法2.1菌株分子鉴定茶轮斑病菌株的分离、纯化：将茶叶片先在75%乙醇中浸泡约30sec，取出2后用无菌水清洗2次，切取茶叶片上病健交界处约0.25cm的小块，均匀摆放到PDA培养基上（每皿5块），密封置于25℃培养箱中培养。将分离得到的菌株接种于水琼脂上，采用单根菌丝顶端切取法进行纯化。将纯化的病原菌接种到PDA培养基上，25℃下黑暗培养，在培养过程中记录观察菌落形态。病原菌基因组DNA的提取：将菌株接种在铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上进行25℃暗培养，待5d后收集菌丝。采用CTAB法提取基因组DNA，具体步骤如下：①用灭菌过的手术刀片刮取菌丝0.15g置于研钵中，加液氮研磨。将研磨的粉末转入提前备好的1mL抽提缓冲液（2%CTAB、100mmol/LpH8.0Tris-HCl、20mmol/LEDTA、1.4mol/LNaCl，使用前加入0.2%β-ME）中，颠倒混匀。然后置于65℃的水浴锅中水浴15min，12000r/min离心15min；②取上清，加入等体积的Tris酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡混匀，12000r/min离心15min；③取上清，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），振荡混匀12000r/min离心15min；取上清，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，放置于-20℃静置30min以使DNA充分沉淀，12000r/min离心10min；④弃上清将沉淀用75%乙醇充分洗涤两遍；⑤将沉淀放在超净工作台上将酒精吹干，然后加入50µL的灭菌去离子水溶解，-20℃保存备用。保守序列的扩增：以基因组DNA为模板进行ITS序列的PCR扩增，所用引物为ITS（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。ITS序列PCR扩增体系25µL：10×PCRbuffer（含Mg2＋）2.5µL，2.5mmol/LdNTPs0.5µL，10µmol同源和互补引物各0.5µL，TaqDNA聚合酶0.2µL，cDNA模板2µL，去离子水18.8µL。PCR扩增程序：94℃预变性4min；进入循环：94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸90s9 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文ec，共35个循环；72℃延伸10min。电泳检测：制备1.2%琼脂糖凝胶，180V电泳30min左右，0.5µg/mLEB溶液中染色10min，置于凝胶成像仪（BIO-RAD）进行拍照保存，然后进行结果分析。将获得的测序结果在NCBI网站上进行Blast分析。结合菌落形态、颜色、长势及孢子的形态和测序结果对病原菌进行鉴定。2.2菌株生物学性状的观察和分析菌落形态的观察：菌株经过活化后，用打孔器打取菌落边缘菌丝块，移至含20mLPDA培养皿中央，菌丝面向下紧贴培养基。将接种后的培养皿置于25℃恒温黑暗培养7d。观察菌株的菌落形态。每个菌株设5个重复。观察菌落形态。菌落生长速度：25℃下活化菌株LI-41和TP-2-2W，待菌丝长到约2-3cm时，打取菌落边缘菌丝块，移至含有20mLPDA的培养皿中央,含菌丝面向下紧贴培养基。将接种后的培养皿分别密封置于25℃下恒温培养，每间隔24h测定记录一次菌丝的长度，每组设5个重复。菌落致病力测定：将供试的菌株分别接种于PDA平板，25℃下恒温培养6天，用灭菌的直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌丝块。采集大小均一、新鲜无破损的供试铁观音茶叶片（C.sinensiscv.Tieguanyin），接种前先用蒸馏水冲洗叶片表面，并擦干叶片表面，然后规律放置于铺有湿润无菌纱布的方形托盘中。用金刚砂轻微摩擦叶片中间，然后接种菌丝块，每片叶片接种一个菌丝块，每个菌株设5个重复，用保鲜膜覆盖接种盘保湿25℃培养。每24h观察记录发病情况。2.3菌株dsRNA的提取采用本实验室前期（YangFan2017）所建立的方法来提取dsRNA，具体步骤如下：1)活化菌株，在菌落边缘挑取若干菌丝块，接种到铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上，每个培养皿接种4个菌丝块，均匀分布在培养皿中，于25℃下恒温黑暗培养6d后备用；10 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究2)取800μLSDSbuffer至2mL离心管中，加入10μLβ-ME；从培养皿上刮取0.3-0.5g菌丝，液氮研磨后迅速加入准备好的SDSbuffer中，剧烈震荡匀浆；3)65℃水浴15min，室温最大转速（14000r/min）离心5min；加入1.5倍体积（1050μL）Bingingbuffer颠倒混匀，室温，13000r/min离心15min；4)吸取上清至新离心管，加入0.5倍体积的无水乙醇并摇晃混匀，将混匀后的上清-乙醇溶液加入吸附柱中；室温12000r/min离心30sec弃滤液；5)加700μLWashingbuffer至吸附柱中，室温12000r/min离心30sec，弃滤液；6)加入750μL80%乙醇至吸附柱中，室温12000r/min离心30sec，弃滤液；7)重复步骤6；8)最大转速离心1min除去吸附柱中残留的乙醇，将吸附柱转移至新的离心管中，工作台中开盖放置3min晾干乙醇；向吸附柱中央硅膜滴加50μL65℃预热的DEPC溶解dsRNA，最大转速离心1min回收dsRNA，-80℃保存备用。2.4dsRNA样品的酶切验证将dsRNA样品分别用DNaseI、S1核酸酶处理，除去样品中的DNA与单链RNA。DNaseI处理体系：9.8μLdsRNA样品，0.2μLRNA酶抑制剂RRI（40U/μL），lμLDNaseI，2μL10×DNaseIbuffer，7μLDEPC处理的水。37℃水浴1h。S1核酸酶处理体系：10μLdsRNA样品，4μL5×S1核酸酶buffer，1μLS1核酸酶，5μLDEPC处理的水。37℃水浴1h。上述将dsRNA样品分别用DNaseI、S1核酸酶处理反应完成后，均要进行纯化处理，方法如下：将处理完的样品加入180μLDEPC处理的水进行稀释，然后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:l）充分混匀，12000r/min离心15min，取上层（水层）移至另一微量离心管中；再加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）充分混匀，12000r/min离心15min，取上层（水层）移至另一微量离心管中；加入等体积异丙醇，1μL核酸助沉剂，-20℃放置30min后12000r/min离心15min回收沉淀，用80%的乙醇清洗沉淀，室温干燥，溶于10μLDEPC处理的水11 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。2.5dsRNA片段的cDNA序列克隆将经S1核酸酶处理后的dsRNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色10min，在蓝光切胶仪上分别切下含有dsRNA病毒基因组各个片段的琼脂糖亮带，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，称重后用未外开的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，最终回收的dsRNA溶液体积为30μL左右。DNA琼脂糖凝胶回收：紫外灯下快速切取含有目标片段的琼脂糖凝胶，放入已灭菌的1.5mLEp管中，用北京道普生生物公司凝胶回收试剂盒回收DNA。利用随机引物05RACE-3RT合成cDNA第一条链：取11μL（约50ng）已纯化的dsRNA加入4μLDMSO和1μL05RACE-3RT（30um/μL）混匀后于95℃处理10min，使dsRNA充分变性后立即置于冰上冷却5min。然后在变性液中依次加入5μLM-MLV5×Reactionbuffer，1μLRNA酶抑制剂（RRI，40U/μL），2μLdNTP（10mM），1μLM-MLV（200U/μL）用移液器吸打混匀后先置于42℃水浴1.5h用于合成第一条链。反转录完成后，进行RNA的降解和cDNA复性合成第二条链向上述25μL反转录体系中依次加入2.5μL1M的NaOH，65℃水浴处理1h。反应完成后室温下冷却，再加入2.5μL1M的Tris-HCl（pH8.0），2.5μL1M的盐酸混匀后于65℃水浴处理1h。然后，用PCR产物纯化试剂盒回收纯化水浴样品（具体方法见第三章1.2.4）。进行过柱回收纯化后，加入40uL去离子水溶解。之后依次加入2μLdNTP（10mM）、1μLTaq酶、5μL10×Taq酶buffer（Mg2+）混匀后置于68℃水浴1h，进行补平反应即合成第二条链。结束后置于-20℃保存备用。PCR反应的扩增：取200uLPCR管，在冰上依次加入2μLdNTP（2.5mmol/L）、1μLTaq酶、2.5μL10×PCRbuffer，2μL特异性引物05RACE-3补水至总体积为25μL。PCR循环条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸90min，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR反应完成后，使用1%的琼脂糖进行凝胶电泳检测RT-PCR扩增结果。将病毒基因组片段连接到T-克隆载体上并转化大肠杆菌，重组质粒鉴定（具体方法见附录A）后12 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究即可送给上海生工进行序列的测定。大片段dsRNA中间部分序列的cDNA克隆：大片段dsRNA中间部cDNA的序列是运用随机引物进行反转录RT-PCR克隆获得的。具体方法如下：1）取约100ng的dsRNA约8μL，加入2μL随机引物于96-98℃变性10min后迅速放入冰水浴中3-5min。2）在变性的dsRNA中依次加入4μL5X反转录反应缓冲液、1μLdNTP（10mmol/L）、0.5μLRNase抑制剂、0.5μL反转录酶及4μLDEPC水，混合均匀后37℃水浴1.5h，所得cDNA于-20℃保存备用。3）取200μLPCR管，在冰上依次加入2μLdNTP（2.5mmol/L）、1μLTaq酶、2.5μL10xPCRbuffer，各1μL特异性的端内引物，21μL的cDNA，补水至总体积为25μL。4）PCR循环条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性30sec，退火温度根据引物设定，退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。5）PCR反应完成后，使用1%的琼脂糖进行凝胶电泳检测RT-PCR扩增结果。将病毒基因组片段连接到克隆载体并转化大肠杆菌，重组质粒鉴定后即可送给上海生工进行序列的测定。dsRNA末端序列克隆本试验中所用引物见表2.1，由于从菌丝中提取的dsRNA在S1核酸酶的作用下可能存在缺失，因此病毒克隆末端所用的核酸来源于核酸的直接切胶回收，或者是对病毒粒子进行核算抽提。下面采用核酸的直接切胶回收方法进行dsRNA末端克隆，具体步骤如下：DsRNA的3′-末端加接头连接反应：1)将直接切胶回收的dsRNA（约200ng）与1μLRACE-OLIGO（30μM）混匀，沸水浴10min，迅速置于冰上5min，瞬时离心后加入：PEG6000（50%）17μL；10×T4RNALigaseBuffer5μL；RRI（40U/μl）2μL；0.1%BSA3μL；T4RNALigase（40U/μL）2μL，混匀后于5-15℃反应16-18h，加DEPC处理水补齐至200μL，加入等体积氯仿抽提，吸取上清后加入等体积的异丙醇沉淀，离心后75%乙醇清洗沉淀，晾干后加14μLDEPC处理水溶解沉淀。13 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文2)逆转录在溶解的dsRNA-RACE-OLIGO复合溶液中加入1μLORACE-1，沸水浴10min，迅速置于冰上5min，瞬时离心后按以下体系进行反应：M-MLV5×ReactionBuffer5μL；dNTPMixture（10mMeach）2μL；M-MLV(200U/μl)1μL；RRI（40U/μl）1μL；DEPC-water1μL；混匀后42℃反应1.5h，沸水浴终止反应。3)巢氏PCR第一轮扩增，体系如下：10×LATaqBufferII（Mg2+Plus）2.5μL；dNTPMixture（2.5mMeach）8.0μL；O5RACE-20.5μL；dsRNA5’-末端引物1/dsRNA3’-末端引物10.5μL；TaKaRaLATaq（5U/μl）0.5μL；cDNA2.0μL；ddH2O8.5μL；总体系25μL。PCR完成后，取3μL电泳检测是否有目标条带，如果有符合预期的条带，则将剩余产物全部电泳回收，进行连接、转化和测序。如果无目标条带，则进行下一轮PCR扩增。4)巢氏PCR第二轮扩增，体系如下：10×LATaqBufferII（Mg2+Plus）5.0μL；dNTPMixture（2.5mMeach）8.0μL；O5RACE-30.5μL；dsRNA5’-末端引物2/dsRNA3’-末端引物20.5μL；TaKaRaLATaq（5U/μL）0.5μL；巢氏PCR第一轮产物（稀释10-50倍）2.0μL；ddH2O8.5μL，总体系25μL。PCR完成后，取3μL电泳检测，则将剩余产物回收，连接PMD18-T后转化大肠杆菌。阳性菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。2.6病毒粒体透射电镜观察a)样品的超速梯度离心1）活化携带病毒的菌株，挑取菌丝块置于PDB中，25℃，放在摇床120r/min,培养6-8d；2）挑取菌丝用蒸馏水清洗3次，取菌丝约30g左右，按照4mL/g的比例加入0.1M的磷酸钠缓冲液（pH7.4）（缓冲液要提前放到4℃冰箱进行预冷）；3）用匀浆机将菌丝打碎，倒入三角瓶中置于冰上，加入0.5%（V/V）巯基乙醇；4）高速离心，12096g，30min；取上清，超速离心，110000g，4℃离心1h；弃上清，收集沉淀，加入1mL0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.4），将沉淀悬浮，置14 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究于冰上；转入到1.5mL的灭菌EP管中，4℃离心10min，去除杂质，取上清，即为病毒粒子粗提液；5）配蔗糖梯度溶液，蔗糖溶液的浓度分别是20%、30%、40%、50%、60%（W/V），共5个浓度梯度，用剪去尖端的1mL枪头从高浓度开始一滴一滴沿壁加入到12mL超速专用离心管，操作一定要缓慢，保持浓度之间的平衡，形成梯度（2.0mL/梯度），放置4℃冰箱备用；6）取500μL病毒粒子粗提液轻轻加到蔗糖梯度溶液的表面，称重配平好后，50000g，4℃离心3h；7）离心完毕后，小心收集每一层蔗糖梯度溶液（约2.0mL），进行脱糖；8）脱糖完毕后，加入300µL0.1M磷酸钠缓冲液，收集沉淀，即为病毒粒子提取液，可用于病毒粒子观察，结构蛋白分析。b)超速梯度离心介质中的核酸分析取200uL的病毒粒体悬浮液，加入300μLDEPC处理的水稀释，然后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：l）充分混匀，12000r/min离心15min取上层（水层）移至另一离心管中；再加入等体积的氯仿：异戊醇（24：l）充分混匀，12000r/min离心15min，取上层（水层）移至另一微量离心管中；加入等体积异丙醇，1μL核酸助沉剂，-20℃放置1h后12000r/min离心15min回收沉淀，用80%的冷乙醇清洗沉淀，室温干燥溶于10μLDEPC处理的水中。最后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其中条带。c)超速梯度离心介质中的蛋白分析1）使用1.5mm玻璃板安装垂直电泳槽，并用琼脂糖凝胶对玻璃板外缘进行封闭；2）制备10%浓度分离胶,缓慢灌入两个玻璃板间隙中，直至离玻璃板上部边缘3-4cm，并加入少许正丁醇以去除分离胶表面的气泡。10%分离胶具体配方如下：去离子水4.0ml，30%Acrylamide3.3mL，1.5MTris-HCI（pH8.8）2.5mL，10%SDS0.1mL，10%APS0.1mL，TEMED4.0μL总共10μL；3）分离胶凝固后（约30min），弃正丁醇，并用去离子水反复冲洗以去除残留正丁醇，并用吸水纸吸干玻璃板间的剩余水。制备5%浓缩胶，灌入两个玻璃板之间的剩余空间，并插入1.5mm齿宽的梳子。5%浓缩胶具体配方如下：去离15 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文子水4.1mL，30%Acrylamide1.0mL，1.0MTris-HC（lpH6.8）0.75mL，10%SDS0.06mL，10%APS0.06mL，TEMED6.0μL，共6mL；4）待浓缩胶凝固后（约30min），加入1×SDS-PAGE电泳缓冲液，小心拔去梳子，用注射器小心吸走点样孔内的残渣，以备点样，每孔可加样品15-30μL制备的蛋白样品。预染蛋白Marker只需加5μL；5）80V电泳至浓缩胶底部时，增大电压至100V，继续电泳直至分离胶底部或合适位置（根据预染蛋白Marker条带位置判断电泳时间）；6）拆卸电泳槽并剥离胶板，将凝胶置于考马斯亮蓝蛋白染色液染色。蛋白染色需要置于水平摇床缓慢摇动2-3h，然后用蛋白脱色液进行脱色，直至条带清晰，拍照保存。d)病毒粒体的透射电镜观察和分析将纯化的病毒粒体溶液滴于铜网上吸附3min，再将铜网置于吸水滤纸上晾干2min，最后将铜网置于负染液中负染3min，再晾干2min即可用于电镜的观察。将观察到的病毒粒体用软件ImageJ进行病毒粒体长度的测量。病毒粒体的去包膜处理及电镜观察：病毒粒体提取过程中，用TA缓冲液（含终浓度为0.5%Tween-20）悬浮超速离心之后的病毒粒体，室温放置4h后，将该液体溶液吸附于铜网上，负染之后用于透射电镜的观察。随后将观察到的电镜病毒用软件ImageJ进行病毒长度和宽度的测量。2.7菌株LI-41孢子脱毒分析病斑菌株LI-41产孢：将菌柄接于含有PDA的培养皿中，密封置于25℃条件下自然生长，就会出现很多黑色孢子液，挑取少量孢子液于无菌水中稀释，将稀释的孢子滴于载玻片上观察孢子大小、结构和形态。用无菌水稀释孢子，稀释到在40X显微镜下观察，一个视野只有1-2个孢子。将孢子稀释液均匀涂于PDA培养基上，密封于25℃下暗培养24h，挑取单一的菌丝于另一新的PDA培养基上，密封置于25℃条件下培养。脱毒菌株的检测：提取培养的各孢子脱毒菌丝的dsRNA（见第三章），之后用S1核酸酶处理（见第三章），最后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测病毒条带。16 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究2.8病毒粒体转染脱毒菌株LI-41-1的原生质体参照（YooS-D2007，吴明德2012，王光辉2010，KanematsuandArakawa2004）的方法进行原生质体的制备和病毒粒子的转染：1）在铺有玻璃纸的PDA平板上培养脱毒菌株的菌丝，25℃下培养48h；2）手机玻璃纸上幼嫩菌丝，以0.5g菌丝/10mL原生质体buffer的比例将二者混合，在摇床上30℃，90r/min摇2-3小时（可以在原生质体buffer中加入AMP防止细菌污染）；3）用三层无菌擦镜纸过滤酶解混合物到无菌的50mL离心管中，用1.2M的KCl尽可能多的将原生质体冲洗下来；室温4000r/min离心6min；5）弃上清液，加入10mLSTCBuffer轻微的重新悬浮，4000r/min离心6min；6）弃去上清液，加入1mLSTCBuffer轻微的重新悬浮，尽量重新悬浮到2-5x107protoplasts/ml；7）将病毒粒子的样品（30%蔗糖梯度的病毒粒子）加入到含有200μL原生质体的50mL离心管中混合均匀，室温下静置20min，不要摇动；8）加入1-1.25mL40%PTC到管中，翻转混合均匀，室温静置20min，不要摇动；加入5mLTB3(含50μg/ml氨苄青霉素)，室温摇过夜；10）将摇过夜的原生质体4000r/min离心6min，弃去上清液，剩余大约1mL的残液将剩余物悬浮；11）融化10mLBottomAgar并冷却后转移到含有已复生原生质体的50mL离心管中，加入氨苄青霉素到终浓度50μg/mL，快速到平板；12）2-3天后平板上会长出单菌落的转化子，挑取转化子到PDA上培养；13）转染菌株的有毒检测：提取培养的各转化子菌丝dsRNA（见第三章），之后用S1核酸酶处理（见第三章），最后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测病毒条带。2.9带毒菌株LI-41平行转染无毒菌株1)将带毒菌株LI-41的菌丝块接种于倒有PDA培养基玻璃皿的一端，玻璃皿另一端接种无毒菌株的菌丝块；2）将上述接种好的培养基放25℃培养箱培养，带毒菌株LI-41和无毒菌株17 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文会各自向接近对方的方向生长，培养时间根据不同菌株而异，保证带毒菌株和无毒菌株有充分的接触时间，但时间也不宜太久；3）培养结束后，沿最远离LI-41的位置挑取菌丝块，每皿挑取4-5个菌丝块，进行重新培养，然后将重培养的菌丝铺玻璃纸培养，提取RNA检测。2.10原始带毒和后代无毒及有毒菌株生物学性状的分析对所获得的原始带毒和后代无毒及有毒菌株进行菌株形态的观察、生长速度的测定，致病力的分析（方法见1.2.2）。三、结果与分析1菌株的分子鉴定及生物学性状的观察和分析1.1菌株的分子鉴定从茶叶片内分离获得一个真菌菌株LI-41，通过提取的真菌的DNA，然后进行该菌株ITS序列的PCR扩增，得到大小约为530bp的DNA扩增产物（图3.1）。对扩增产物进行回收和序列测定，获得该菌株的ITS序列（附录A），经BLASTn序列相似性比对结果显示，LI-41与茶拟盘多毛孢（P.theae）菌株相似性高达99%（登录号KX757712，score926，querycover97%，Evalue0.0）。且该菌株与我们前期分离保存的TP-2-2W的ITS序列之间的相似性为96.05%，因此该两种菌株被鉴定为遗传背景不同的茶拟盘多毛孢。图3.1菌株TP-2-2W和LI-41ITS基因片段的PCR扩增产物电泳分析Fig.3.1PCRamplificationofITSofstrainsTP-2-2WandLI-4118 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究1.2菌株生物学性状的观察和分析菌株形态学的观察：相比前期保存的正常菌株TP-2-2W菌丝浓密，菌落白色，有明显的轮纹圈且生长速度正常（图3.2A）；而菌株LI-41菌丝稀薄，菌落畸形，无轮纹圈，生长缓慢（图3.2A）。菌株生长速度的测定：根据菌丝的生长速度测定结果显示，正常菌株TP-2-2W的生长速度较菌株LI-41的快，约为9mm/d，而菌株LI-41的生长速度为0.23mm/d（图3.3A）。菌株致病力的测定：在有伤接种的情况下，菌株LI-41的致病力明显弱于TP-2-2W（图3.2B），在接种6d后测量得到TP-2-2W和LI-41的病斑直径分别为0.9cm和0.18cm，致病力显著差异。在无伤接种的情况下，菌株TP-2-2W的致病力较弱，而LI-41的则无致病力（图3.2B）。测得TP-2-2W的病斑直径为0.2cm，LI-41的病斑直径为0cm。由此表明，菌株LI-41在有伤条件下致病力较弱，在无伤条件下无致病力（图3.3B）。ABwoundedunwoundedwoundedunwounded图3.2茶拟盘多毛孢TP-2-2W和LI-41的菌落形态（A）和致病力分析（B）Fig.3.2Colonymorphology(A)andvirulenceassessment(B)ofstrainsTP-2-2WandLI-4119 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文AB图3.3茶拟盘多毛孢TP-2-2W和LI-41的菌丝生长速度（A）和致病力柱状图（B）Fig.3.3Bargraphyofgrowthrates(A)andvirulences(B)ofstrainsTP-2-2WandLI-412菌株LI-41中核酸的分析鉴定2.1菌株LI-41中核酸的提取及酶处理验证对提取的菌株LI-41和TP-2-2W的核酸进行DNaseI、S1核酸酶处理，琼脂糖凝胶电泳后发现，只有菌株LI-41中有4条dsRNA条带，大小在930-3400之间，分别命名为dsRNA1-dsRNA4（图3.4）。2.2菌株LI-41中dsRNA全长cDNA序列的克隆与分析对菌株LI-41的4条dsRNA条带琼脂糖凝胶电泳后，对4条dsRNA条带切胶纯化回收，经过随机克隆以及末端克隆后，得到4条dsRNA带的全长cDNA序列，dsRNA1的大小为3387nt，dsRNA2的大小为2831nt，dsRNA3的大小为2599nt，dsRNA4的大小为932nt。在GenBank中相应序列登陆号为MH323409–MH323412。其中dsRNA1-dsRNA4各编码一个独立的开放阅读框为ORF1-ORF4（图3.5）。经BLASTp搜索显示，dsRNA1-4序列编码蛋白与胶孢炭疽菌金色病毒（Colletotrichumgloeosporioideschrysovirus1，CgcV-1，accessionnos.KT581957.1）20 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究具有最高的相似率，其中，ORF1-ORF3分别与CgcV-1的RNA-directedRNA-polymerase,RdRp；accessionnos.KT581957.1）外壳蛋白（coatprotein,CP；accessionnos.KT581958.1）和假定蛋白酶（putativeprotease,PP；accessionnos.KT581959.1）具有65%（Maxscore1383、Totalscore1521、Querycover96%、Evalue0）、48%（Maxscore597、Totalscore597、Querycover69%、Evalue0）、54%（Maxscore949、Totalscore949、Querycover94%、Evalue0）的一致率。但dsRNA4编码蛋白没有比对到相似的病毒蛋白序列，但与GammaproteobacteriabacteriumHGW-Gammaproteobacteria-14蛋白序列有一定的相似性，一致率为35%（Maxscore44.7、Totalscore44.7、Querycover39%、Evalue0）。利用HHpred对病毒的dsRNA4的ORF同源搜索来预测蛋白功能显示，dsRNA4构成ORF的第1-84个氨基酸编码的蛋白质与DNA-directedRNApolymeraseIsubunit（probability:25.61;E-value:69;ss:1.7;Cols:19;TargetLength:123）有同源性；第84-138个氨基酸编码的蛋白质与HypotheticalUPF0166proteinPH1503（probability:21.84;E-value:200;ss:3.4;Cols:53;TargetLength:127）和HypotheticalproteinTM0021（probability:29.37;E-value:140;ss:3.8;Cols:53;TargetLength:114）有同源性；第138-171个氨基酸编码蛋白质与HypotheticalproteinTM0021（probability:21.09;E-value:63;ss:0.5;Cols:17;TargetLength:36）有同源性（见附录B）。因为克隆测序显示dsRNA1-3与胶孢炭疽菌金色病毒（Colletotrichumgloeosprioideschrysovirus1,CgCV-1）具有48-65%的相似率，推测该病毒为一个新的金色病毒，又因为该病毒的寄主为茶拟盘多毛孢，所以命名为茶拟盘多毛孢金色病毒-1（Pestalotiopsistheaechrysovirus1,PtCV-1）。对PtCV-1的RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）和产黄青霉病毒科的15个dsRNA病毒的RdRp保守序列进行系统进化树的构建、分析表明：PtCV-1和CgCV-1聚在一个分支（图3.6B），所用相关病毒信息见附录C。在对PtCV-1的dsRNA5′末端和3′末端序列分析发现，dsRN1-dsRNA4的5′末端和3′末端非编码区末端碱基高度保守，保守碱基序列分别为“G/TA/TTAAAAA/GTA/GCAAAA/GCG/TC/T6T/AATTTTTATCCTG”和“TTAAGCG”（图3.6A）。21 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图3.4菌株LI-41中dsRNA片段电泳检测Fig.3.4ElectrophoreticanalysisofthedsRNAsegmentsfromstrainLI-41泳道1，DNA分子量标记；泳道2和3，LI-41未经处理的dsRNA,经DNase1和S1核酸酶处理的LI-41；泳道4，TP-2-2W的DNALane1.DNAandmarker;Lane2and3,dsRNAofLT-3-1fromuntreatedLI-41treatedbyDNase1andS1nuclease;Lane4,DNAofTP-2-2W图3.5病毒基因组模式图Fig.3.5AschematicdiagramsofthegneticorganizationofdsRNA1todsRNA422 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究图3.6PtCV-1dsRNAs链的末端比对及假定RdRp进化树分析Fig.3.6TerminalsequenceanalysisandphylogeneticanalysisofputativeRdRpofPtCV-1.A:4条dsRNA链的末端比对序列5'和3'末端序列的联配；B:PtCV-1与其他病毒RdRp的系统进化分析。所用的分离物信息见附录C的表1。A:Alignmentofthe5'-and3'-terminasequencesofthecodingstrandsofdsRNAs1to4ofPtCV-1;B:PhylogeneticanalysisofRdRpofPtCV-1andotherviruses.23 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文3PtCV-1病毒粒体透射电镜观察3.1超速离心梯度层中核酸和蛋白的分析利用（10%-50%）蔗糖梯度超速离心的方法对PtCV-1病毒进行提取，并对每一蔗糖梯度层的病毒粒子进行核酸的提取检测，结果分析显示，在以10%为蔗糖梯度的10%-50%蔗糖梯度层中，PtCV-1病毒核酸主要分布于40%-50%蔗糖层，在50%的蔗糖梯度层浓度最高（图3.7）。利用SDS-PAGE分析PtCV-1病毒蛋白结果显示，在40%和50%的蔗糖梯度层病毒蛋白浓度最高（图3.8）。通过核酸和蛋白条带可推测该病毒粒子主要集中在40%和50%的蔗糖梯度层。通过蛋白指纹图谱分析，结果分析显示蛋白P150产生6条肽段，且与dsRNA2和RNA3的开放阅读框内的对应氨基酸序列相吻合，氨基酸的覆盖率分别为5.8%和5.9%（表3.1）。推测P150应该是dsRNA2和RNA3的开放阅读框编码的两条蛋白条带聚集在一起。图3.7蔗糖梯度离心后核酸提取物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig.3.7AgarosegelelectrophoresisofthedsRNAsextractedfromPtCV-124 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究图3.8SDS-PAGE分析菌株LI-41中的病毒蛋白Fig.3.8SDS-PAGEanalysisofViralproteinofLI-41表3.1PtCV-1的结构蛋白P150的指纹图谱分析Table3.1SimmaryofthepeptidemassfingerprintinganalysisofP150ofPtCV-1AminoacidObservedCalculatedORFs±deltaAminoacidsequenceIonscorepositionMassMassORF212-211327.62271326.63910.9VVQQFQEYMR5733-481855.86301584.88221e+02ESTIGIWYMVLGDTDR75360-3711431.62121430.63564.1e+03GYLMSQESVMMR18440-4511454.66311453.67595.8e+03NGYMELLDTELR29ORF3190-1991147.58981146.60674e+02TLVAEIMSQR27231-2451784.68351783.69963.3GSMDNYYDFVDSDTR56312-3201121.58021120.591714IPTPVEFYR49592-6061804.84831803.86796.8e+02ISFVAYTLEEEYQGR483.2病毒粒体的透射观察和测量将用50%蔗糖梯度提纯的病毒粒体进行负染铜网，透射电镜观察到病毒粒体为球形（图3.9），测定了58个病毒粒子，测得其直径为30.1~39.8nm。25 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图3.9病毒粒子透射电子显微镜（TEM）图像Fig.3.9Transmissionelectronmicroscopy(TEM)imagesofviruslikeparticlesandhistogramoftheparticles4菌株LI-41后代无毒菌株和传毒菌株的检测结果4.1菌株LI-41的无毒菌株的检测结果将菌株LI-41的分生孢子稀释涂在水琼脂培养基上培养，挑取得到42个孢子后代菌株提取dsRNA，结果显示有14个后代菌株不含dsRNA条带（图3.10A）。为了更进一步证明该菌株已经不带毒，利用该病毒的dsRNA序列设计两对引物对该批菌株进一步采用RT-PCR进行了检测分析，结果显示除了含有dsRNA的菌株分别扩增出了174bp和730bp大小的目标条带外，其它菌株均呈阴性（图3.10B、C）。因此，有以上数据显示：PtCV-1的单孢后代的不带毒率为33%，后代带毒率为67%。为了确定后代单孢菌株是LI-41的子代菌株，又将后代菌株测定了ITS序列（图3.10D），结果显示该菌株的ITS序列与原始菌株LI-41大致一致，均为茶拟盘多毛孢（附录A）。由此可以证明LI-41有14个菌株为后代不带毒菌株。选取其中的3株脱毒菌株（命名为LI-41-1、LI-41-2和LI-41-3）用于后续实验。4.2菌株LI-41传毒菌株的检测结果利用DNaseI和S1核酸酶处理dsRNA经PEG介导转染后代无毒菌株LI-41-1的原生质体。然后选取150个后代再生菌株进行dsRNA分析，结果显示26 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究没有菌株转染成功（图3.11），推测可能利用PtCV-1的核酸不具侵染性。同时，也采用PEG介导病毒粒子转染LI-41-1的原生质体。同样提取150株转染后代菌株提取dsRNA发现，其中有5株都含有PtCV-1的4条dsRNA核酸条带（图3.12），命名为LI-41-1T-1至LI-41-1T-5，传毒率为3.3%。在对带毒菌株LI-41平行转染后代无毒菌株LI-41-1和TP-2-2W的检测中，LI-41平行转染无毒菌株LI-41-1检测到6株都含有PtCV-1的4条dsRNA核酸条带，命名为LI-41-P-1至LI-41-P-6，传毒率为12%(图3.13)。而带毒菌株LI-41平行转染菌株TP-2-2W的检测中，没有检测到dsRNA核酸条带。说明PtCV-1病毒更易于转染亲本后代菌株，对非亲本菌株可能没有侵染能力。Derivativesubisolatesofsingleconidiumcultures图3.10提取dsRNA（A）以及RT-PCR（B、C）检测脱毒菌株病毒携带情况和脱毒菌株LI-41的ITS序列的扩增Fig.3.10ViralidentificationofstrainswithextractionofdsRNA(A)、RT-PCR(B、C)andAmplificationofITSsequencesofvirusfreestrainofLI-41(D)ProtoplasttransfectionstrainProtoplasttransfectionstrainMMM图3.11PEG介导核酸转染无毒菌株LI-41-1的原生质体再生菌株病毒检测Fig.3.11Viralidentificationoftheprotoplast-generatingstrainswithPEGmediateddsRNAtransfectionintoprotoplastsofLI-41-127 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文ProtoplasttransfectionstrainM图3.12PEG介导病毒粒子转染菌株LI-41-1的原生质体再生菌株病毒检测Fig.3.12Viralidentificationoftheprotoplast-generatingstrainswithPEGmediateddsRNAtransferfectionintoprotoplastsofLI-41-1ProtoplasttransfectionstrainM图3.13原始带毒菌株LI-41和无毒菌株LI-41-1的对峙培养后代菌株病毒检测Fig.3.13viralidentficationofstrainsfromconatct-cultureofLI-41andLI-41-15PtCV-1病毒的生物学性状将单孢脱毒菌株（LI-41-1、LI-41-2和LI-41-3）、单孢后代带毒菌株（LI-41-V1、LI-41-V2）、转染PtCV-1再生菌株（LI-41-1T1、LI-41-1T2、LI-41-1T3）、平行传毒成功菌株（LI-41-1P-1、LI-41-1P-2、LI-41-1P-3）和带毒亲本菌株LI-41在PDA基上进行暗培养，培养5d后，菌落形态表现显著差异：相比LI-41，无毒后代菌株呈现隆起的同心轮纹圈，且分泌色素减少，菌落生长正常；而转染28 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究PtCV-1病毒后，菌落形态恢复至与带毒亲本LI-41相似，包括菌株轮纹圈消失，色素增加，菌落畸形等（图3.14）。进而对该批菌株进行生长速度的测定，结果显示3个无毒后代菌株（LI-41-1、LI-41-2和LI-41-3）相比LI-41生长速度变快（1.2-1.3cm/d），而转染PtCV-1后，转染PtCV-1再生菌株（LI-41-1T1、LI-41-1T2、LI-41-1T3）和平行传毒成功菌株（LI-41-1P-1、LI-41-1P-2、LI-41-1P-3），以及单孢后代带毒菌株（LI-41-V1、LI-41-V2）的生长速度变慢（0.17-0.43cm/d）（图3.14）。通过选取云南和福建两个地方的本地茶叶对以上菌株的致病力进行比较，结果显示，3个后代无毒菌株（LI-41-1、LI-41-2和LI-41-3）相比LI-41致病力增强（云南茶叶病斑大小：11.9-14.1mm；福建茶叶病斑大小：17.5-21.5mm）；而转染PtCV-1后，转染PtCV-1再生菌株（LI-41-1T1、LI-41-1T2、LI-41-1T3）和平行传毒成功菌株(LI-41-1P-1、LI-41-1P-2、LI-41-1P-3)，以及单胞后代带毒菌株（LI-41-V1、LI-41-V2）的致病力减弱（云南茶叶病斑大小：2.0-4.3mm；福建茶叶病斑大小：0-1.35mm）（图3.15）。通过两种类型茶叶致病力可以看出，含有PtCV-1病毒的菌株均比无毒菌株表现弱致病力，虽然不同茶叶之间致病力存在差异，但不影响实验分析结果。29 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文图3.13LT-41及其后代菌株的菌落形态Fig.3.13ColonymorphologyofstrainsLT-41anditsprogenies图3.14LI-41及其后代的菌株生长速度Fig.3.14growthratesofstrainLI-41anditsprogenies30 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究ABⅠLI-41LI-41-V1LI-41-V3LI-41-1LI-41-2LI-41-3CDLI-41-1T1LI-41-1T2LI-41-1T3LI-41-1P-1LI-41-1P-2LI-41-1P-3ABⅡLI-41LI-41-V2LI-41-V3LI-41-1LI-41-2LI-41-3CDLI-41-1T1LI-41-1T2LI-41-1T3LI-41-1P-1LI-41-1P-2LI-41-1P-3图3.15LI-41-1及其后代的致病力的致病力分析Fig.3.15VirulenceanalysisofstrainsLI-41-1anditsprogenies.Ⅰ：接种来自云南的本地种茶叶；Ⅱ：接种来自广西的本地种茶叶I:thelocalvarityofteafromYunnan;II:thelocalvarityofteafromGuangxiA：单孢无毒后代；B、C、D：带毒亲本，单孢带毒后代及传毒后代A:virus-freestrains；B、C、D:virus-infectedstrains31 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文四、结论与展望本研究菌株LI-41分离自茶树轮斑病的病斑，根据真菌ITS序列分析表明，该菌株是茶拟盘多毛孢。菌株LI-41的菌落与正常的菌株存在显著的形态差异，表现无轮纹圈，有黄色色素沉淀，菌落畸形。通过提取LI-41菌株菌丝的dsRNA，发现该菌株中含有4条dsRNA片段，大小分别为3387nt、2831nt、2599nt和932nt，推测每一条dsRNA编码一个独立的ORF，依次命名为ORF1至ORF4。其中，ORF1-3编码蛋白与CgCV-1相似性最高，相似率分别为65%，48%和54%，而第四个ORF编码蛋白与已知病毒蛋白无同源性。推测ORF1-3分别编码RdRp、CP和PP，而ORF4所编码的蛋白功能未知。采用RdRp序列进化树分析显示dsRNA1-4属于一个新的金色病毒（暂时命名为PtCV-1）基因组成分。用蔗糖梯度超速离心法提纯PtCV-1的病毒粒体，显示该病毒粒子主要存在于50%的蔗糖梯度中。透射电镜观察显示PtCV-1呈球形病毒粒子，测得其直径为30.1~39.8nm。PtCV-1可以通过分生孢子传至后代，传毒率为66%（检测了42个后代菌株）；还可以通过水平对峙培养的方式传至单孢后代无毒菌株，传毒率12%（检测了50个后代菌株）。采用纯化的核酸和病毒粒子转染无毒菌株原生质体显示，PtCV-1不能通过核酸转染（检测了150个原生质体再生菌株）但能通过病毒粒子传染至无毒菌株细胞，但转染率很低，仅为3.3%（检测了150个原生质体再生菌株）。采用获得的无毒菌株和带毒菌株（包括亲本菌株、水平转染后代及分生孢子和原生质体转染再生后代）进行生物学性状分析，表明PtCV-1侵染茶拟盘多毛孢LI-41菌株引起其菌落色素增多、轮纹圈消失、菌丝畸形、生长速度减弱和致病力显著降低。本研究从茶树重要的病原真菌-茶拟盘多毛孢真菌内鉴定了一个新的金色病毒-PtCV-1，并明确了全长基因组、病毒粒子形态及其生物学特性。该病毒是国际上在茶拟盘多毛孢内鉴定的首例真菌病毒，也是首个明确可以引起寄主致病力衰退的金色病毒。PtCV-1能够显著改变寄主的致病力，可望为应用真菌病毒防治茶拟盘多毛孢引起的病害提供生防材料，并提供了国际首例真菌病毒-茶拟盘多毛孢研究系统，为采用反向遗传学深入研究茶拟盘多毛孢基因功能奠定基础。32 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究附录A菌株保守序列测序结果1.用通用引物ITS1和ITS4扩增的保守序列LI-41的序列比对>LI-41TGTGGCTTGAGCTTCTAACTCCCACCCATGTGACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAGGTTACCTGGTACCTGGAGACAGGTTACCCTGTAGCAGCTGCCGGTGGACTACTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATTTACAGTTATGTAATTCCTGAAATACAACGGCGGATCTGTGGTATCCTCTGAGCGTAGTAAATTATTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCAGCTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCGGGAGGAAA2.5个脱毒菌株用通用引物ITS1和ITS4扩增的保守序列>LI-41-1GTTGGCTTCAGCTTCTAACTCCCACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAGGTTACCTGGTACCTGGAGACAGGTTACCCTGTAGCAGCTGCCGGTGGACTACTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATTTACAGTTATGTAATTCCTGAAATACAACGGCGGATCTGTGGTATCCTCTGAGCGTAGTAAATTATTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCAGCTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGTCGGAGGAATAT33 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文>LI-41-2ATCGGCTTTGAGTTTTCTACTCCCACCCATGTGACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAGGTTACCTGGTACCTGGAGACAGGTTACCCTGTAGCAGCTGCCGGTGGACTACTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATTTACAGTTATGTAATTCCTGAAATACAACGGCGGATCTGTGGTATCCTCTGAGCGTAGTAAATTATTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCAGCTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA>LI-41-3GTGGTCTTGGAGTTCTACTCCCACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAGGTTACCTGGTACCTGGAGACAGGTTACCCTGTAGCAGCTGCCGGTGGACTACTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATTTACAGTTATGTAATTCCTGAAATACAACGGCGGATCTGTGGTATCCTCTGAGCGTAGTAAATTATTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCAGCTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCGGAGGAATA>LI-41-4ATGTCCTGGGAGCTTCTACTCCCACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAGGTTACCTGGTACCTGGAGACAGGTTACCCTGTAGCAGCTGCCGGTGGACTACTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATA34 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究AGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATTTACAGTTATGTAATTCCTGAAATACAACGGCGGATCTGTGGTATCCTCTGAGCGTAGTAAATTATTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCAGCTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCGGGAGGAA>LI-41-5GTGGCTGAGTTCTACTCCCACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAGGTTACCTGGTACCTGGAGACAGGTTACCCTGTAGCAGCTGCCGGTGGACTACTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATTTACAGTTATGTAATTCCTGAAATACAACGGCGGATCTGTGGTATCCTCTGAGCGTAGTAAATTATTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCAGCTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGAA35 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文附录BdsRNAs1–4所编码的蛋白质BLASTp分析结果dsRNATotalCoverageIdentityGenBankSpeciesProteinorputativeproteinsEvalueNo.score(%)(%)accessionno.RNA1Colletotrichumgloeosporioideschrysovirus1RNA-dependentRNApolymerase1508100065ALW95408.1Fusariumoxysporumchrysovirus1RNA-dependentRNApolymerase109678062ABQ53134.1Bipolarismaydischrysovirus1RNA-dependentRNApolymerase83398040ARM36035.1Helminthosporiumvictoriae145SvirusRNA-dependentRNApolymerase82698040YP_052858.1Verticilliumdahliaechrysovirus1RNA-dependentRNApolymerase74196037ADG21213.1AmasyacherrydiseaseassociatedchrysovirusRNA-dependentRNApolymerase73498037CAH03664.1PenicilliumchrysogenumvirusRNA-dependentRNApolymerase72896037YP_392482.1Wuhaninsectvirus30hypotheticalprotein72796039APG76049.1Isariajavanicachrysovirus1RNA-dependentRNApolymerase72199037YP_009337840.1Macrophominaphaseolinachrysovirus1RNA-dependentRNApolymerase71698037ALD89090.1AspergillusfumigatuschrysovirusRNA-dependentRNApolymerase71199036CAX48749.1Cryphonectrianitschkeichrysovirus1RNA-dependentRNApolymerase69182040ACT79255.136 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究Grapevineassociatedchrysovirus-1RNA-dependentRNApolymerase68187038ADO60926.1Brassicacampestrischrysovirus1RNA-dependentRNApolymerase66295036AKU48197.1Raphanussativaschrysovirus1RNA-dependentRNApolymerase62494035AFE83590.1PerseaamericanachrysovirusRNA-dependentRNApolymerase405871.00E-11929AJA37498.1Anthuriummosaic-associatedvirusRNA-dependentRNApolymerase405861.00E-11930ACU11563.1Shuangaochryso-likevirus1RNA-dependentRNApolymerase264941.00E-6925ASA47445.1Hubeichryso-likevirus1RNA-dependentRNApolymerase258762.00E-6827APG76013.1RNA2Colletotrichumgloeosporioideschrysovirus1coatprotein64872048ALW95409.1Bipolarismaydischrysovirus1putativecapsidprotein361603E-10733ARM36036.1Helminthosporiumvictoriae145Svirusputativecapsidprotein358605E-10633YP_052859.1Amasyacherrydiseaseassociatedchrysovirusputativecoatprotein285522E-7834YP_001531162.1Fusariumoxysporumchrysovirus1coatprotein257243E-7657ABQ58816.1Wuhaninsectvirus30hypotheticalprotein265602E-7228APG76051.1Isariajavanicachrysovirus1capsidprotein250592E-6630YP_009337889.1Macrophominaphaseolinachrysovirus1capsidprotein247623E-6528ALD89091.2Penicilliumchrysogenumvirusmajorcapsidprotein224591E-5727YP_392483.137 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文Aspergillusfumigatuschrysoviruscapsidprotein219621E-5528CAX48751.2Verticilliumdahliaechrysovirus1capsidprotein214616E-5427ADG21214.1Cryphonectrianitschkeichrysovirus1capsidprotein210618E-5327ACT79252.1Brassicacampestrischrysovirus1putativeviralcoatprotein167591E-3826AKU48196.1Raphanussativaschrysovirus1putativecoatprotein160532E-3624AFE83591.1ColletotrichumsimmondsiihistoneH4.140.461.337KXH35884.1RNA3Colletotrichumgloeosporioideschrysovirus1putativeprotease948990.00E+0054ALW95410.1Bipolarismaydischrysovirus1protein3432951.00E-13534ARM36037.1Helminthosporiumvictoriae145SvirusHv145SV-protein3426955.00E-13334YP_052860.1Amasyacherrydiseaseassociatedchrysovirusputativeprotease356903.00E-10630YP_001531161.1Wuhaninsectvirus30hypotheticalprotein349965.00E-10429APG76050.1Macrophominaphaseolinachrysovirus1P4302952.00E-8628ALD89093.2Grapevinechrysovirusputativeprotease290926.00E-8227AFX73020.1Cryphonectrianitschkeichrysovirus1putativecysteineprotease285993.00E-8027ADG27459.1Penicilliumchrysogenumvirushypotheticalprotein282945.00E-7928YP_392485.1Verticilliumdahliaechrysovirus1ovariantumorprotease279966.00E-7829ADG21216.138 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究Aspergillusfumigatuschrysovirushypotheticalprotein265961.00E-7227CAX48755.1Cryphonectrianitschkeichrysovirus1OTUproteinase241961.00E-6426ABI20757.1Isariajavanicachrysovirus1putativeprotease213922.00E-5424YP_009337841.1Grapevineassociatedchrysovirus-3hypotheticalprotein171483.00E-4230ADO60935.1Solanumtuberosumuncharacterizedprotein150756.00E-3423XP_015160825.1Medicagotruncatulaprotease,putative146612.00E-3326AES99813.1Raphanussativaschrysovirus1putativeprotease192812.00E-3222AFE83592.1CapsicumannuumAuxin-responsiveproteinIAA13134702.00E-2823PHT85658.1Medicagotruncatulaprotease,putative108482.00E-2125AES99810.1Capsicumannuumuncharacterizedprotein104405.00E-2025XP_016568113.1hypotheticalproteinTrifoliumsubterraneum73.6186.00E-1030GAU14371.1TSUD_249090Anthuriummosaic-associatedvirusp9867.8229.00E-0825ACU11566.1Brassicacampestrischrysovirus1putativeviralprotease51.2150.01225AKU48195.1GammaproteobacteriabacteriumhypotheticalproteinRNA442.4390.1741PKM23163.1HGW-Gammaproteobacteria-14CVV10_00545hypotheticalproteinGossypiumbarbadense37.7547.80E+0031PPD81271.1GOBAR_DD2180339 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文附录CPtCV-1与其他病毒RdRp的系统进化分析所用的分离物信息表1PtCV-1用于序列比对和RdRps的系统发育分析的有关金色病毒科病毒分离物的信息Tablet.1InformationonthevirusisolatesbelongingtoChrysoviridaeusedforsequencealignmentandphylogeneticanalysisoftheirRdRpsabVirusnameAbbreviationGenBankAcc.no.FGPestalotiopsistheaechrysovirus1PtCV1MH323409CMagnaportheoryzaechrysovirus1MoCV1AB560761CTCAspergillusmycovirus1816AsV1816ABX79996CTCHelminthosporiumvictoriae145SvirusHvV145SYP_052858CTCTolypocladiumcylindrosporumvirus2TCV2CBY84993CTCFusariumgraminearumdsRNAmycovirus-2FgV2ADW08802CTCFusariumgraminearumdsRNAmycovirus-2FgV-ch9ADU54123CTCVerticilliumdahliaechrysovirus1VdCV1ADG21213.1CCAmasyacherrydisease-associatedchrysovirusACD-CVYP_001531163CCPenicilliumchrysogenumvirusPcVYP_392482CCCryphonectrianitschkeichrysovirus1CnV1-BS321ACT79258CCCryphonectrianitschkeichrysovirus1CnV1-BS122ACT79255CCAspergillusfumigatuschrysovirusAfuCVCAX48749CCSaccharomycescerevisiaevirusL-BCScVL-BCNP_042581TTaF,Family;T,Totiviridae;C,Chrysoviridae.bG,Genus;T,Totivirus;C,chrysovirus;TC,Tentativechrysovirus.40 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究附录D硕士研究期间发表的文章1.JiaHengxia,DongKaili,ZhouLingling,WangGuoping,HongNi,JiangDaohong,&XuWenxing*.AdsRNAviruswithfilamentousviralparticles.NatureCommunications.2017,8:168;2.YanHe,LiCai,LinglingZhou,ZuokunYang,NiHong,GuopingWang,ShifangLi*,WenxingXu*.Deepsequencingrevealsthefirstfabavirusinfectingpeach.ScientificReports.2017,7:11329;3.LinglingZhou,HuafengYou,ChuanXu,MengmengYang,DejiangNi,NiHong,GuopingWang,LiCai,WenxingXu*.IdentificationofanovelchrysovirusinPestalotiopsistheae.（Inpreparation）.41 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文参考文献[1]陈宗懋，陈雪芬．世界茶树病原名录．茶叶科学，1988，(2)：65-76[2]陈宗懋，陈雪芬．茶树病害的诊断和防治．上海上海科学技术出社，1990，2[3]陈宗懋，陈雪芬．茶业可持续发展中的植保问题．茶叶科学,1999，(1):1-6[4]陈宗懋，陈雪芬．世界茶树病虫区系分析．茶叶科学，1989．(1)：13~22[5]陈宗懋，孙晓玲．茶树主要病虫害简明识别手册．北京：中国农业出版社，2013[6]郭世保，陈俊华，史洪中．几种杀菌剂对茶轮斑病菌的室内毒力及田间药．贵州农业科学，2014，(10)：130-132[7]王光辉．禾谷镰刀菌AMT1基因的功能研究．西北农林科技大学，2010[8]吴明德．葡萄孢属植物病原菌真菌病毒研究．华中农业大学，2012[9]AnagnostakisSL,ChenB,GeletkaLM,NussDL.Hypovirustransmissiontoascosporeprogenybyfield-releasedtransgenichypovirulentstrainsofCryphonectriaparasitica.Phytopathology,1998.88(7):598-604[10]AokiN,MoriyamaH,KodamaM,ArieT,eraokaTT.Anovelmycovirusassociatedwithfourdouble-strandedRNAsaffectshostfungalgrowthinAlternariaalternate.VirusRes,2009,140(2):179-187[11]BanksGT,AlE.Virusesinfungiandinterferonstimulation.Nature,1968,218(5141):542-545[12]BlumC,GötschS,HeinzeC.Duplicationsinthe3′terminiofthreesegmentsofFusariumgraminearumvirusChina.ArchVirol,2017,162(3):897-900[13]BiellaS,SmithML,AistJR,CortesiP,MilgroomMG.Programmedcelldeathcorrelateswithvirustransmissioninafilamentousfungus.ProcBiolSci,2002,269(1506):2269-2276[14]CastonJR,GhabrialSA,JiangD,RivasR,AlfonsoC.Three-dimensionalstructureofpenicilliumchrysogenumvirus：Adouble-strandedRNAviruswithagenuineT=1capsid.JMolBiol,2003,331(2):417-43142 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华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文[26]Jacob-WilkD,TurinaM,VanAlfenNK.Mycoviruscryphonectriahypovirus1elementscofractionatewithtrans-golginetworkmembranesofthefungalhostcryphonectriaparasitica.JVirol,2006,80(13):6588-6596[27]JiaH,DongK,ZhouL.AdsRNAviruswithfilamentousviralparticles.NatureCommun,2017,8(1):168[28]KanematsuS,ArakawaM,OikawaY,OnoueM,OsakiH,NakamuraHI,kedaK,Kuga-UetakeY,NittaH,SasakiA,SuzakiK,YoshidaK,MatsumotoN.Areoviruscauseshypovirulenceofrosellinianecatrix.Phytopathology,2004,94(6):561-568[29]LiH,FuY,JiangD,etal.Down-regulationofsclerotiniasclerotiorumgeneexpressioninresponsetoinfectionwithsclerotiniasclerotiorumdebilitation-associatedRNAvirus.VirusRes,2008,135(1):95-106[30]LIUS,XIEJ,CHENGJ,etal.FungalDNAvirusinfectsamycophagousinsectandutilizesitasatransmissionvector.PNatlSci,2016,113(45):12803–12808[31]LeeKM,YuJ,SonM,LeeYW,KimKH.Transmissionoffusariumbothmycovirusviaprotoplastfusioncauseshypovirulenceinotherphytopathogenicfungi.PLoSOne,2011,6(6):e21629[32]NussDL.Hypovirulence:mycovirusesatthefungal–plantinterface.NatRevMicrobiol,2005,3(8):632–642[33]NewhouseJR,MacdonaldWL.Theultrastructureofhyphalanastomosesbetweenvegetativelycompatib.Canadianjournalofbotany=Journalcanadiendebotanique,1991,69(3):602-614.[34]PearsonMN,BeeverRE,BoineB,ArthurK.Mycovirusesoffilamentousfungiandtheirrelevancetoplantpathology[J].MPlantPathol,2009,10:(1):115-128[35]SunQ,ChoiGH,NussDL.AsingleargonautegeneisrequiredforinductionofRNAsilencingantiviraldefenseandpromotesviralRNArecombination.PNatlAcadSciUSA,2009,106(42):17927-17932[36]SaupeSJ.Moleculargeneticsofheterokaryonincompatibilityinfilamentousascomycetes.MicrobiolMolBiolRev,2000,64:489-50244 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究[37]SegersGC,ZhangX,DengF,SunQ,NussDL.EvidencethatRNAsilencingfuctionsasanantiviraldefensemechanisminfungi.PNatlSci,2007,104(31):12902-12906[38]TurinaM,RostagnoL.Virus-inducedhypovirulenceincryphonectriaparasitica：Stillanunresolvedconundrum.JPlantPathol,2007,89(9):165-78[39]VanDiepeningenAD,DebetsAJM,HoekstraRF.DynamicsofdsRNAmycovirusesinblackaspergilluspopulations.FungalGeneBiol,2006,43(6):446-452[40]VanderL,HarmsenMC,GoSJ,WesselJGH.Double-strandedRNAmycovirusesinmyceliumofpleurotusostreatus.FEMSMicrobiol.Lett.1995,125:51-56[41]WangL,WangY,CaoH,HaoX,ZengJ,YangY,WangX.Transcriptomeanalysisofananthracnose-resistantteaplantcultivarrevealsgenesassociatedwithresistancetocolletotrichumcamelliae.PLoSOne,2016,11:148-535[42]XieJT,JiangDH.Newinsightsintomycovirusesandexplorationforthebiologicalcontrolofcropfungaldiseases.AnnuRevPhytopathol,2014,52:45-68[43]YooSD,ChoYH,SheenJ.Arabidopsismesophyllprotoplasts:aversatilecellsystemfortransientgeneexpressionanalysis.NatProtoc,2007,2(7):1565-1572.[44]YuX,HillmanBI.Ageminivirus-relatedDNAmycovirusthatconfershypovirulencetoaplantpathogenicfungus.ProcNatlAcadSciUSA.,2010,107(18):8387-8392.[45]YangFan,WangGP,XuWX,HongNi.Arapidsilicaspincolumn-basedmethodofRNAextractionfromfruittreesforRT-PCRdetectionofviruses.J.Virol.Methods,2017,247:61-67[46]YuX,LiB,FuY,XieJ,ChengJ,GhabrialSA,LiG,YiX,JiangD.ExtracellulartransmissionofaDNAmycovirusanditsuseasanaturalfungicide.ProcNatlAcadSci,2013,110(4):1452-145745 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文[47]ZhuW,WeiW,FuY,ChengJ,XieJ,LiG,YiX,KangZ,DickmanMB,JiangD.Asecretoryproteinofnecrotrophicfungussclerotiniasclerotiorumthatsuppresseshostresistance.PLoSOne,2013,8(1):e5390146 来源于茶拟盘多毛孢的一个新金色病毒的鉴定及生物学特性的研究致谢以梦为马，万事尽头，终将如意!回望三年的科研心路，最应该感谢的就是我的导师徐文兴教授。感谢笔记本里那厚厚的一扎扎老师亲笔的实验指导手稿、感谢熬到凌晨过后的实验分析、感谢多次手把手的操作指导、感谢事无巨细的关心、感谢修改错误的语重心长、感谢每天一问查漏补缺、感谢出差的小礼物、感谢……。再多的感谢只想说一句“老师，您辛苦了!”。研究生三年来，在我的实验瓶颈期，无论我的实验做的有多糟糕，徐老师从未对我失去耐心，而是想法设法的一遍遍悉心的指导再指导，并不断给我加油打气，才让我能够坚持下来。我想说，徐老师兢兢业业，捧着一颗真心的对待实验和工作的态度，和春风化雨，温润如玉的性格深深的触动着我们，值得我们学习。感谢本实验室的王国平教授和洪霓教授，是你们为我们创造了如此优越的科研平台，让我们能够专心的进行实验研究。同时也感谢本实验室的王利平副教授、丁芳副教授和蔡丽讲师在实验和生活上给予的关心和帮助。感谢谢甲涛老师在病毒全长克隆中给予的帮助。感谢植病教研室的侯明生教授、李国庆教授、董五辈教授、黄俊斌教授、肖炎农教授、罗朝喜教授、付艳苹教授、谢卡斌教授、李博教授等在本论文的开题、中期考核中给予的指导和帮助。老师们无私的奉献精神以及对科研的严谨态度都深深地感染着我，谢谢老师们。感谢本实验室的杨作坤、AttaUrRehmau、温少华、翟立峰、傅敏、黄煌等博士研究生；感谢何艳、郑亚洲、陈晓忍、张雪娇、张方鹏、刘森、蒋晶晶、程桥、文立红、张晓康、张鹏飞、钱艳杰、陈婕、向均、刘华珍、白晴、项周、王利华、王雁翔等师兄师姐；高晓雯、罗慧慧、郭嘉姝、张永乐、宋学芳、彭宇鸿、杜亚敏、李娇娇、李扬、贾瑾、胡旺成等师弟师妹。隆重感谢杨萌萌同学和荚恒霞师姐，可以说我的实验除了我的导师，就是在他们的帮助下完成的，是他们帮助我一步步走向成功阶梯，如果说荚师姐是领路人，那杨萌萌同学就是我爬梯的扶手，在此深表感谢。诚挚感谢董凯莉、赵梓茜、尤华峰、潘慧、徐川、孔令红、等师弟师妹在实验中给予的大力支持与帮助。47 华中农业大学2018届硕士研究生学位（毕业）论文温馨感谢杨岳昆、牛炳棵、杨萌萌、徐国亮、赵飞飞、李柳、郭雅双、秦士娇、刘亚帅等这些同一级小伙伴们，是他们让我在华农的天空看见彩虹。快乐感谢打球小分队-李龙辉、肖峰、沈量、王世玲、徐国亮、赵飞飞等，是他们让我实验的劳累中，体验生命的活力。感谢白岩松、感谢海子，是他们告诉我“以梦为马，万事尽头，终将如意”，让我在困惑和迷茫中咬牙坚持。用以后的岁月用心感谢我的父母，是他们让我对以上的感谢成为可能，衷心祝福爸爸妈妈福寿安康，笑口常开。最后感谢所有遇见，因为无数的遇见，所以不断地改变；因为遇见所以美丽。周玲玲2018年6月于武汉48