维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究

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学校代码：１０２８５学号：２０１４４２４７０１３－細、考ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ维生素＿唐尿病小鼠肾脏并发定保护作用的初步研究ＰｒｅｌｉｍｉｎａｒＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＥｆｆｅｃｔｙ—一？圍马书杰研究生姓名张增利ｒｎｒｎ－ｍｍ＾劳动卫生与环境卫生学专业名称职业相关性疾病硏究方向—、么共卫生学￥：所在院部ｆｉ２０１７年５月丨紋提交日期 2 苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，，艮Ｐ：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研宄所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在年月解密后适用本规定＿＿。非涉密论文论文作者签名／＞：Ｂ期：＾（７７，５２ｈ々导师签名：糾」日期＇：叫？ｒ冷 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究中文摘要中文摘要目的：本研究以糖尿病小鼠为体内模型，以人肾小球足细胞为体外模型，探讨维生素D干预对糖尿病肾脏损伤的影响及其可能机制，为糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）的防治提供新思路。方法：本研究分为三个部分。1.糖尿病小鼠模型的建立：采用小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）方法诱导糖尿病小鼠模型，以空腹血糖（fastingbloodglucose，FBG）≥11.1mmol/L为成模标准；2.维生素D干预对糖尿病小鼠肾脏损伤的影响：将造模成功的小鼠随机分为糖尿病模型组、维生素D3组（1000IU/w，一周一次肌肉注射）、二甲双胍组（0.3mg/ml，饮水给药）、联合作用组（1000IU/w+0.15mg/ml），同时设立正常对照组，实验干预周期为12周。期间持续观察五组小鼠体重变化、血糖仪监测FBG变化。12周后，小鼠活动代谢监测系统收集小鼠尿液，检测尿蛋白及尿肌酐。取各组小鼠血清检测血肌酐及血尿素氮水平。取小鼠肾脏组织采用HE染色法在光镜下观察肾脏组织病理改变，WesternBlot检测肾脏中维生素D受体（vitaminDreceptor，VDR）、-catenin、Snail、Slug、E-cadherin、Nephrin以及Vimentin的表达。三、1α,25(OH)2D3对高糖诱导的足细胞上皮间质转换（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）抑制作用：采用高糖诱导足细胞发生EMT，并同时给予1α,25(OH)2D3进行干预。CCK-8法测定细胞存活率，WesternBlot检测人肾小球足细胞中VDR、-catenin、Snail、Slug、E-cadherin、Nephrin以及Vimentin蛋白的表达水平。结果：（1）注射STZ后3-5天，小鼠即出现多饮、多食、多尿，体重减轻，活动减少，空腹血糖显著升高（P<0.01），成模率达到95%。（2）12周后，模型组小鼠体重增长缓慢，空腹血糖维持在较高的水平；维生素D3组、二甲双胍组以及联合作用组小鼠的空腹血糖水平高于正常对照组而低于I 中文摘要维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究模型组（P>0.05）。四组糖尿病小鼠的心脏系数、肝脏系数以及肾脏系数（二甲双胍组除外）显著高于正常对照组（P<0.05）；与模型组比较，维生素D3组和联合作用组小鼠的肝脏系数明显降低（P<0.05），二甲双胍以及联合作用组肾脏系数显著降低（P<0.05）。与正常对照组相比，四组糖尿病小鼠的血肌酐、蛋白尿以及尿蛋白肌酐比（ACR）显著升高（P<0.05）；经干预后，糖尿病小鼠血尿素氮水平有一定的降低，但无统计学意义（P>0.05）；与模型组比，单独维生素D3作用能够明显降低血肌酐、尿蛋白和ACR水平（P<0.05），单独二甲双胍干预后尿蛋白以及ACR明显减少（P<0.05），维生素D3与二甲双胍联合作用能够显著减少血肌酐和蛋白尿水平（P<0.05）；二甲双胍组小鼠ACR水平比维生素D3明显降低（P<0.05）。光镜HE染色显示，与正常对照组相比，模型组表现出肾小球体积增大，肾小球系膜区增宽，系膜细胞增多的病理改变。维生素D3和二甲双胍单独或联合作用均可改善上述病理改变，且联合作用组效果最佳。WesternBlot结果显示与正常对照组相比，维生素D3干预后，VDR、Nephrin蛋白水平显著上升，-catenin、Slug、Vimentin明显下调（P<0.01），E-cadherin、Snail无明显变化；给予二甲双胍后，Snail、Slug及Vimentin明显下调（P<0.01），VDR、-catenin、E-cadherin、Nephrin蛋白表达无变化；二者联合给予时，能够显著上调E-cadherin，下调-catenin、Snail的蛋白表达水平（P<0.01）。（3）CCK-8结果表明1α,25(OH)2D3干预能够有效缓解高糖导致的细胞存活率下降。WesternBlot结果显示1α,25(OH)2D3可以明显上调高糖导致的VDR、E-cadherin、Nephrin表达降低（P<0.01），显著下调-catenin、Snail、Slug及Vimentin的表达水平（P<0.01）。结论：1、采用STZ诱导的糖尿病小鼠出现多饮、多食、多尿等症状，FBG≥11.1mmol/L，说明糖尿病小鼠诱导模型建立成功。2、维生素D3能够明显减轻糖尿病小鼠血肌酐、蛋白尿及ACR水平，缓解糖尿病小鼠肾脏损伤的病理形态学改变，其机制可能与VDR蛋白表达水平下降以及EMT相关蛋白改变有关。3、1α,25(OH)2D3能够上调VDR，下调-catenin、Snail、Slug的表达，逆转高II 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究中文摘要糖诱导的足细胞EMT。因此，调节VDR可能是减缓或预防糖尿病肾病的一个靶点。关键词：维生素D3；糖尿病肾病；足细胞；上皮间质转换作者：马书杰指导教师：张增利教授III 英文摘要维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究PreliminaryStudyontheProtectiveEffectofVitaminDonDiabeticNephropathyinMiceAbstractAim:ToinvestigatewhethervitaminDcanamelioratediabeticnephropathyandtheunderlyingmechanism.Methods:Themainlyworkofthisstudycontainsthreeparts:1)Establishmentofdiabeticmicemodelinducedbystreptozotocin(STZ).C57BL/6Jmicewereinjectedintraperitoneallyby40mg/kgSTZfor5dayscontinuously.Thediabeticmicewereidentifiedbasedonfastingbloodglucose(FBG≥11.1mmol/L)4daysafterSTZinjection.2)TheimpactofvitaminDsupplementonrenalinjuryindiabeticmice.Thediabeticmicewererandomlydividedintofourgroups:modelcontrolgroup,vitaminD3group(VD3,1000IU/week,intramuscularinjectiononceaweek),metformingroup(Met,0.3mg/ml,drinkingwateradministration),combinedtreatmentgroup(VD3+Met,1000IU/week+0.15mg/ml).Meanwhile,normalcontrolgroupwithoutSTZtreatmentwassetup.Themicewerecontinuouslystudiedfor12weeks.Atthesametime,thegeneralsituationsinmicewereobservedincludingbodyweightandFBG.Attheendofthe12thweek,miceurine,serumandrenaltissuesampleswerestudied.Then24hurinaryprotein,urinecreatinine,bloodureanitrogen(BUN)andserumcreatinineweremeasured.Micerenalhistopathologicalchangeswithhematoxylin-eosin(HE)inthelightmicroscopewereobserved.WesternBlotwasusedtodetecttheexpressionlevelsofvitaminDreceptor(VDR),Slug,Snail,β-catenin,E-cadherin,NephrinandVimentininrenaltissue.3)Effectsof1α,25(OH)2D3onepithelial-mesenchymaltransition(EMT)inducedbyhighglucose(HG)inpodocyte.ThecellsurvivalratewasdeterminedwithCellCountingKit-8(CCK-8).WesternBlotanalysiswasperformedtomeasuretheproteinlevelsofVDR,Slug,Snail,β-catenin,E-cadherin,NephrinandVimentininpodocyte.IV 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究英文摘要Results:(1)ThemiceinjectedwithSTZshowedpolydipsia,polyphagia,polyuria,graduallyemaciation,andreducedactivityafter3to5days.Thesesymptomsweremostdistinguishedindiabeticgroup.FBGwassignificantlyincreased(P<0.01).(2)Attheendoftheexperiment,themiceinthemodelgroupappearedslowweightgainandFBGremainedatahighlevel.VitaminD3group,metformingroupandcombinationgroupalsoappearedsimilarsymptomsofmodelgroup,butFBGwaslowerthanthemodelgroup(P>0.05).Theheart,liverandrenalcoefficient(expectMetgroup)ofthediabeticgroupwiththeinjectionofSTZwasobviouslylargerthanthecontrolgroup(P<0.05).ThelivercoefficientwasdistinctlylowerintheVD3andVD3+Metgroup(P<0.05)，andrenalcoefficientwasdecreasedvisiblyinMetgroup(P<0.05)thanthemodelgroup.Biochemicaltestresultsshowedtheserumcreatinine,urinaryproteinexcretion,andurinaryproteincreatinineratio(ACR)indiabeticmiceincreasedsignificantlythancontrolgroup(P<0.05).BUNlevelshaveacertainreductioninallofinterventiongroup,buttherearenodifferencescomparedtocontrolgroup(P>0.05).Comparedwiththemodelgroup,vitaminD3aloneinterventiondecreasedclearlythelevelsofserumcreatinine,urinaryproteinexcretionandACR(P<0.05),MetaloneinterventiondecreasedtheurinaryproteinexcretionandACR(P<0.05).VitaminD3andmetforminjointinterventiondecreasedsignificantlyserumcreatinineandurinaryproteinexcretion(P<0.05).TheACRleveloftheMetgroupwaslowercomparedwithVD3group(P<0.05).ThelightmicroscopeHEstainingrevealedthat,themodelgroupshowedglomerularvolumeincreased,diffusemesangialmatrixandmesangialcellscomparedwiththenormalcontrolgroup.VitaminD3andmetforminaloneorcombinationadministrationbothevidentlyimprovedpathologicalchanges.Thecombinationgroupshowedsynergisticeffect.WesternBlotshowedtheexpressiondecreasedobviouslyinmodelgroupcomparedwithnormalcontrolgroupinrenaltissueofmicewithVDR,E-cadherinandNephrin(P<0.01),andtheexpressionincreasedmarkedlywith-catenin,Snail,SlugandVimentin(P<0.01).Comparedwithnormalcontrolgroup,aftervitaminD3intervention,theexpressionlevelsofVDR,Nephrinproteinweresignificantlyincreasedwhile-catenin,Slug,Vimentinlevelsclearlydecreased(P<0.01)andE-cadherin,Snailhasnosignificantchange.MetforminaloneinterventionobviouslydecreasedtheexpressionofSnail,SlugandVimentin(P<0.01),V 英文摘要维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究whilenosignificantdifferencesinVDR,-catenin,E-cadherinandNephrin.TheexpressionofE-cadherinwasimprovedafterthevitaminD3andmetformincombination,whiletheexpressionsof-cateninandSnailweredecreased(P<0.01).(3)1α,25(OH)2D3interventioneffectivelyalleviatedcellsurvivalreductioninducedbyHG.WesternBlotshowedthatcomparedwithnormalcontrolgroup,HGobviouslyincreased-catenin,Snail,SlugandVimentinexpressionswhiledecreasedVDR,E-cadherinandNephrinexpressionsinpodocyte.However,1α,25(OH)2D3significantlyinhibited-catenin,Snail,SlugandVimentinexpression(P<0.01)andpartiallyrestoredVDR,E-cadherinandNephrinexpressioninHG-stimulatedpodocyte(P<0.01).Conclusion:1.TheSTZ-induceddiabeticmicemodelwassuccessfullyestablished,withexhibitionofpolydipsia,polyphagia,polyuriaandFBG≥11.1mmol/L.2.VitaminD3significantlyreducedserumcreatinine,proteinuria,urinaryproteincreatinineratiolevel,andimprovedrenalpathologicalchangesindiabeticmice.Meanwhile,thelevelofVDRexpressionandEMT-relatedproteinwerechanged,whichsuggestedthatthesemolecularmightplayanimportantroleinthedevelopmentofDN.3.1α,25(OH)2D3significantlyalleviatedtheupregulationof-catenin,SnailandSluginducedbyHG,whileimprovedtheexpressionofVDRandreversedHG-inducedEMTinpodocyte.Thus,modulatingVDRmightbeatargetforthetreatmentandpreventionofDN.Keywords:VitaminD3;DiabeticNephropathy;Podocyte;Epithelial-MesenchymalTransitionWrittenbyShujieMaSupervisedbyProfessorZengliZhangVI 目录前言..............................................................................................................................1第一部分糖尿病小鼠模型的建立..............................................................................41材料与方法...........................................................................................................41.1材料.............................................................................................................41.2实验方法.....................................................................................................62结果...................................................................................................................72.1小鼠一般状况.............................................................................................72.2小鼠成模率.................................................................................................72.3小鼠空腹血糖变化情况.............................................................................72.4小鼠体重变化情况.....................................................................................73讨论...................................................................................................................8第二部分维生素D干预对糖尿病小鼠肾脏损伤的影响.............................................91材料与方法...........................................................................................................91.1材料.............................................................................................................91.2实验方法....................................................................................................112结果.................................................................................................................142.1小鼠一般情况...........................................................................................142.2小鼠体重变化...........................................................................................142.3小鼠空腹血糖变化...................................................................................152.4小鼠脏器系数变化...................................................................................162.5小鼠血尿素氮、血肌酐及尿蛋白与肌酐比水平...................................162.6小鼠肾脏病理切片结果...........................................................................172.7小鼠肾脏组织EMT相关蛋白表达的变化.............................................183讨论.................................................................................................................22第三部分1α,25(OH)2D3对高糖诱导的足细胞上皮间质转换抑制作用................251材料与方法.........................................................................................................25 1.1主要仪器和试剂.....................................................................................251.1.2主要仪器和试剂..................................................................................261.2方法.........................................................................................................262结果.................................................................................................................282.11α,25(OH)2D3作用剂量的确定................................................................282.21α,25(OH)2D3对足细胞EMT相关蛋白的影响......................................283讨论.................................................................................................................32结论............................................................................................................................35参考文献........................................................................................................................36综述维生素D和上皮间质转化...............................................................................44研究生期间科研经历及发表的文章............................................................................60中英缩略语对照表........................................................................................................61致谢............................................................................................................................62 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究前言前言维生素D在佝偻病研究中被发现，因此也称为抗佝偻病维生素。它是机体必需的一种脂溶性维生素。目前自然界存在的已知的种类有维生素D2、D3、D4、D5，其中最常见的有维生素D2（麦角骨化醇）以及维生素D3（胆钙化醇）。通常我们所说的维生素D，主要指维生素D3。一般认为维生素D3自己本身并无活性，必须先后经过肝脏、肾脏的两次羟化才能转化为其活性形式1,25二羟基维生素D3（1,25(OH)2D3），然后随血液循环到达全身各处发挥其生理作用[1]。维生素D的经典生理作用是调节机体的钙磷代谢。除此之外，还发现它与糖尿病、自身免疫疾病、心血管疾病、肿瘤等疾病的发生发展有一定的关系[2,3]，这就是其非经典作用。糖尿病是由遗传和环境因素相互作用所引起的以血液中葡萄糖水平长期升高为基本特征的代谢性疾病。因胰岛素分泌和（或）胰岛素作用的缺陷，引起碳水化合物、蛋白质和脂肪等代谢异常。长时间的病变可引起多系统损害，导致一系列微血管（眼睛、肾脏、神经）和大血管（心脏、大脑）的慢性并发症。流行病学研究表明在糖尿病患者中，大约有30-40%的病人发展为DN，是最严重的并发症之一，并且是引发终末期肾脏衰竭（end-stagerenalfailure，ESRG）的首要原因[4]。早期DN的主要病理变化表现为肾小球肥大，肾小球基底膜增厚和系膜区域细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的逐渐积累。晚期变化是肾小球和肾小管的间质性纤维化，最终导致蛋白尿和肾衰竭[5]。糖尿病肾病的病变进程主要表现为从正常水平的蛋白尿到微量白蛋白尿，再到大量白蛋白尿的过程[6]。糖尿病肾病蛋白尿的产生与肾小球滤过屏障的结构遭到破坏和（或）功能受损有着十分密切的关系。肾小球滤过膜由脏层上皮细胞、基底膜（glomerularbasementmembrane，GBM）和内皮细胞组成。脏层上皮细胞即足细胞，是一种覆盖在肾小球基底膜外侧的高度分化的特殊类型的上皮细胞，在维持肾小球滤过屏障的完整性中发挥重要作用。近年来的研究表明足细胞受损在糖尿病肾病和蛋白尿中扮演至关紧要的作用[7]。越来越多的数据证明糖尿病肾病更像是一种“足细胞病”[8]。越来越多的证1 前言维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究据表明，足细胞功能障碍（如足突消失和表型改变）在肾小球滤过功能和蛋白尿发病方面起关键作用。动物模型和糖尿病患者研究数据显示，几个裂孔隔膜（slitdiaphragm，SD）相关蛋白（例如，Nephrin和podocin）的平移或缺失加重足细胞功能障碍，导致大量蛋白尿和先天性肾病综合征[9]。足细胞上皮-间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）被认为是足细胞损伤的起始过程，可以增强足细胞的运动，并导致蛋白尿和肾小球纤维化[10]。在高糖浓度环境下，比如糖尿病患者中，涉及到足细胞EMT的发生[11-13]。足细胞的形态由扁平的圆形或椭圆形的正常上皮细胞向纺锤体形、梭形的间质细胞转变[14]，从而导致足细胞的完整性受损以及肾小球滤过屏障的破坏，最终导致蛋白尿[15]。EMT是上皮细胞向间质细胞转变的一个过程。在EMT过程中，伴随着间质标记物的上调，上皮标志物下调。上皮细胞失去细胞间以及细胞基质间的连接，细胞极性发生变化，细胞骨架重组，获得间质细胞的表型。EMT是一个高度可调控性、可塑性、可逆转性的过程，包括四个关键步骤：（1）上皮细胞粘附丧失；（2）SMA重新表达和肌动蛋白重组；（3）肾小管状基底膜破裂；（4）增强细胞迁移和侵袭。因此，在某些情况下，间质细胞向上皮细胞转变的发生，能够使间质细胞获得上皮细胞的表型[16]。目前研究认为Wnt/-catenin信号通路是涉及到EMT的其中一种信号途径[17]。Wnts是一种分泌型糖蛋白家族，在器官形成、干细胞体内平衡、肿瘤以及肾脏疾病中发挥重要作用。Wnts与其细胞膜受体Frizzled和共受体LRP5/6结合，诱导一系列下游信号传导涉及Dishevelled，axin，腺瘤病综合症大肠杆菌和糖原合酶激酶-3（GSK-3β），使β-连环蛋白（-catenin）脱磷酸化，导致其从细胞浆进入细胞核，与T细胞因子TCF/淋巴增强子结合因子LEF结合刺激Wnt靶基因的转录[18]。近期大量流行病学研究的数据显示，全球糖尿病的发病率呈持续增加的趋势。相似地，由于阳光照射缺乏和补充不足而导致维生素D缺乏也逐年增加。越来越多的流行病学资料研究表明人体血清维生素D水平与糖尿病之间存在一定的关联。Meta分析表明维生素D缺乏的糖尿病患者更容易发展为糖尿病肾病[19]。微量白蛋白尿是早期肾脏疾病的一个众所周知的指标[20]，维生素D治疗可以阻止或改善糖尿病患者的蛋白尿水平[21,22]。最近大量细胞培养和动物模型研究以及少数体内人类研究证据表明维生素D缺乏促进糖尿病大血管和微血管并发症的发生2 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究前言和发展[23]。几项研究表明，维生素D通常会降低氧化应激和炎症[24]，从而潜在地降低慢性肾衰（chronicrenalfailure，CRF）的风险。其中大部分资料证明维生素D能够降低糖尿病肾病的发病率[19,25]。维生素D受体（vitaminDreceptor，VDR）分布于身体的许多组织器官，并且在足细胞中表达。足细胞是维生素D发挥肾脏保护作用的关键点。维生素D可防止足细胞损伤和丢失，促进裂孔隔膜蛋白的表达，并维持肾小球滤过屏障的完整性[26]。动物实验表明补充维生素D能够减缓足细胞受损程度，减少蛋白尿的产生[27,28]。帕立骨化醇通过抑制Wnt/-catenin信号传导改善阿霉素诱导肾病导致的蛋白尿和肾损伤[29]。1,25(OH)2D3能够诱导正常细胞以及肿瘤细胞中上皮标志的表达，抑制其间质标志的表达[30]。维生素D化合物通过抑制细胞核内β-catenin的聚集促进VDR和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达来抑制肾小管上皮细胞EMT[31]。用维生素D类似物或过表达人近端肾小管上皮细胞VDR可以抑制TGF-β1促进的EMT[32]。Nolan等表明在慢性肾脏疾病导致的缺氧条件下，帕立骨化醇抑制TGF-β1诱导的肾小管EMT[33]。尽管多篇文献报道维生素D具有肾脏保护作用，但其在糖尿病肾病中的具体保护机制尚未明确证实。3 第一部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第一部分糖尿病小鼠模型的建立近年来，糖尿病已经成为影响全球人类生存和生活的一种慢性非传染性疾病。我国的糖尿病人口处于急剧增长的态势，患病率从30年前的0.67%飙升至如今的11.6%，增加了17倍[34]。糖尿病对患者的危害更多的是在其引发的并发症，而非糖尿病本身。糖尿病及其并发症的发病病因和发病机理尚未完全明确，预防和治疗方法有待于进一步完善。因此，建立能够模拟人类糖尿病特征的理想实验动物模型对于深入研究糖尿病有十分重要的意义。目前，糖尿病动物模型的建立方法分为转基因型、遗传自发型和诱导型两种。近年来国外糖尿病的研究，动物模型大多采用遗传自发相关模型，如BB鼠、NOD鼠、db/db鼠、NYS鼠[35]等，来源困难且价格昂贵。诱发的方法主要有一侧肾脏切除、胰腺切除、化学药物诱导如链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）和四氧嘧啶、病毒感染、高脂饮食等。化学药物诱导糖尿病模型方法简便且易于操作，费用低，应用广泛。由于四氧嘧啶对小鼠的毒性以及机体损伤较严重，目前在大鼠和小鼠中常用STZ诱导糖尿病模型[36]。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物健康雄性C57BL/6J小鼠，6-8周龄，17-19g，SPF级别，由上海斯莱克实验动物中心提供。小鼠饲养于苏州大学SPF级小鼠动物房，室温（23±2）℃，相对湿度50%-60%，自由饮水摄食（造模期间人为禁食14-16h），光照时间按照正常的昼夜规律进行。本研究通过苏州大学动物伦理委员会批准。1.1.2试剂维生素D3注射液：上海通用药业股份有限公司；注射用茶油：江西金海棠药用油业有限公司，赣食药准字20050003；柠檬酸（Citricacidmonohydrate）：国药集团化学试剂有限公司；4 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第一部分柠檬酸三钠（Trisodiumcitratedihydrate）：天津市大茂化学试剂厂；氯化钠注射液（0.9%NaCl）：国家准字H43020320，湖南金健药业有限责任公司；多聚甲醛溶液：批号20140702，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇：批号20161116，永华化学科技（江苏）有限公司；链脲佐菌素（streptozotocin）：货号S0130-streptozotocin，Sigma-Aldrich公司，美国。1.1.3试验器械罗氏血糖仪卓越型：ACCU-CHEKPerforma，德国；震荡混匀器：型号USV-1，北京优晟联合科技有限公司；电子天平：YP1002N，上海菁海仪器有限公司；分析天平：SartorIUs，BSA124S，德国；低速离心机：ZOHKLA，KDC-40，中国；实验室pH计：EL20型，梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；双重蒸馏水仪：BSZ-2型，上海博通有限公司；可调微量移液器：eppendorf，德国；制冰机：SIM-F140AY65，SANYO，日本；海尔冰箱：BCD-206TS，青岛海尔股份有限公司；所需一次性注射器、促凝管、冻存管、烧杯、剪刀、镊子等均由苏州大学实验器材材料中心提供。1.1.4常用试剂配制（1）维生素D3注射液：取6.5ml茶油于15ml离心管中，全程避光将1ml的维生素D3（VD3，1ml/30万IU）注射液溶于茶油中，充分混匀，移液枪头残留的VD3打出并洗净。更换枪头后，吸取1ml的含有VD3的茶油，与盛装VD3的玻璃安瓿瓶中残留的VD3充分混匀，后移至上述15ml离心管中，吹打5-6次后，将残留在枪头的液体充分打出。再次更换枪头后，仍取1ml溶于茶油的VD3溶液于盛装VD3的玻璃安瓿瓶中，重复上述步骤。待充分混匀后，得到剂量为4万IU/ml的混合注射液，此VD3与茶油混合注射液需现用现配。（2）STZ柠檬酸盐缓冲液：取柠檬酸（FW210.14）2.1g加入100ml双蒸水中配制成A液；取柠檬酸三钠（FW294.10）2.94g加入100ml双蒸水中配制成B5 第一部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究液。4℃保存。临实验时，将上述A液与B液按照1:1的比例充分混合摇匀。混匀后使用pH计测定pH值，以确保pH值在4.2-4.5之间，以此在最大程度上保证STZ的活性。若pH不在此范围内，可用A液或B液进行调节。缓冲液配置好后需进行过滤，过滤后可4℃冷藏保存。再次使用时需再次测定pH值。（3）4%多聚甲醛固定液：按照1:9的稀释倍数，将40%的多聚甲醛溶液10ml，加入90ml双蒸水中，震荡混匀，即可得到4%多聚甲醛固定液。1.2实验方法1.2.1配制STZ注射液准确称取STZ粉末，注意全程避光。将称量的STZ粉末和已经精确调节pH配制好的柠檬酸盐缓冲液置于冰盒上。在临使用前将二者充分混合摇匀，并在尽量短的时间内（半小时内）完成注射。1.2.2建立糖尿病小鼠模型随机将50只小鼠分为正常组（6只）和糖尿病组（44只），两组小鼠均给予相同的普通饲料喂养。待适应性喂养一周后，开始进行糖尿病模型的建立。造模前两组小鼠均禁食、不禁水12-14h。糖尿病组小鼠按剂量40mg/kg多次腹腔注射STZ，正常组腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH4.2-4.5）。连续注射5天，以最后一次注射5天后，测量小鼠尾静脉血空腹血糖（FBG）值≥11.1mmol/L者为糖尿病小鼠模型。待空腹血糖稳定一周后，进行下一步试验。1.2.3小鼠一般情况监测糖尿病小鼠模型建模前称量小鼠体重，在建模结束后再次称量小鼠体重。观察建模前后小鼠体重变化。记录糖尿病模型小鼠与正常组小鼠血糖、毛发、饮食、饮水等方面的变化。1.2.4统计方法采用SPSS18.0统计软件进行数据统计处理。计量资料以均数±标准差（X±SD）表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。6 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第一部分2结果2.1小鼠一般状况正常组小鼠精神状态表现良好，行为动作敏捷，反应迅速，毛发整洁有光泽；模型组小鼠出现典型的糖尿病症状，即多饮、多食、多尿，反应迟钝，毛发散乱、毛色暗淡，整洁度下降，小便酸臭等现象，无死亡现象。2.2小鼠体重变化情况与建模前相比，正常组小鼠体重显著增加。注射STZ一周后，模型组小鼠体重显著降低（P<0.05）（如表1-1所示）。表1-1小鼠体重变化情况正常组模型组建模前20.74±0.7620.40±0.96***#建模后22.25±0.6619.21±0.95#注：***表示建模后与正常组相比P<0.001；表示模型组建模前后相比P<0.05。2.3小鼠空腹血糖变化情况正常组小鼠空腹血糖建模前后无显著变化，建模后，模型组小鼠空腹血糖显著高于正常组（P<0.01）及建模前自身空腹血糖（P<0.01）（表1-2所示）。表1-2小鼠空腹血糖变化情况正常组模型组建模前5.85±0.885.76±0.77**##建模后5.57±0.3117.03±0.42##注：**表示建模后与正常组相比P<0.01；表示模型组建模前后相比P<0.01。2.4小鼠成模率44只雄性小鼠多次注射剂量为40mg/kg的STZ柠檬酸盐缓冲液，在最后一次注射5天后取尾静脉血，测量空腹血糖值≥11.1mmol/L总共有42只，有2只小鼠空腹血糖值未达到11.1mmol/L，造模过程中未出现动物死亡。据此计算其成模率为95%（成模率=空腹血糖≥11.1mmol/L的未死亡动物数/实验动物总数）。7 第一部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究表1-3小鼠成模情况数量（只）百分数（%）成模4295未成模25死亡00合计441003讨论由于糖尿病人群研究的种种困难，糖尿病动物模型的建立是最有效的研究途径。综合国内外学者的研究结果表明：使用STZ建立糖尿病动物模型比较成功，可重复率较高，而且对动物损伤最小。STZ是一种从链脲佐菌素属中分离出的广谱抗生素，曾在临床上用来治疗胰腺癌[37]、杀菌。它可以高度选择性地直接破坏胰岛β细胞，从而影响β细胞代谢，进而抑制胰岛素分泌，最终导致血液中葡萄糖浓度持续升高，形成糖尿病。STZ建立的糖尿病动物模型在实验中常用于筛选降血糖药物。这种糖尿病模型的实验动物的空腹血糖处于一个动态变化的过程。在降血糖药物筛选中，选择动态变化过程中空腹血糖水平维持在较高水平的时段作为观察窗，有助于对降血糖药物效果的判断以及筛选。课题组前期研究结果表明小剂量多次腹腔注射较大剂量一次性腹腔注射小鼠成模率高，对小鼠造成的伤害较轻，死亡率低。故本实验采用小剂量多次腹腔注射STZ建立糖尿病模型。实验结果表明注射STZ后小鼠出现明显的多饮、多食、多尿，体重减轻现象，空腹血糖明显升高，均≥11.1mmol/L。更重要的是C57BL/6J小鼠比其他种属鼠类对STZ的反应可靠敏感[38]，较以往所用的db/db或ob/ob小鼠容易获得，建模方法操作简便，费用较低。与糖尿病病人的代谢特征相似，较好地模拟了糖尿病的发病过程，是糖尿病实验研究中能普遍应用的较理想的糖尿病动物模型。8 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第二部分第二部分维生素D干预对糖尿病小鼠肾脏损伤的影响近年来，随着经济发展，人口老化以及生活方式的改变，糖尿病已经成为影响全球人类的一种主要健康问题。据估计，现在全球共有约4亿的糖尿病患者，其中三分之一来自中国，约1.14亿人[39]。并且糖尿病已成为全球致死和致残的主要原因之一[40]。糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一，且已成为慢性肾病和终末期肾病最主要的原因之一[41,42]。其病变累及肾小球、肾血管和肾间质，最终可导致肾衰，极大地降低患者的生活质量，严重威胁人类的生命健康。维生素D是人类生长发育所必需的一种脂溶性维生素，其经典生理作用是调节钙磷代谢。随着科学研究的不断深入，越来越集中于维生素D的“非经典作用”。现已有研究表明维生素D除能够调节细胞增殖分化、参与氧化应激、炎症和免疫反应外，还能够调节胰岛素抵抗[43]。目前，流行病学调查结果显示全球所有年龄段人群维生素D缺乏已成为一个主要的公共卫生健康问题，以我国人群维生素D缺乏的状况尤为严重[44]。同时，有国外学者报道，敲除维生素D受体的小鼠更容易出现高血糖性的肾脏损伤[45]。因此本部分的研究旨在探究维生素D补充对于糖尿病小鼠肾脏损伤的影响，以便为维生素D的临床应用提供新的思路与指导。本课题组前期研究结果显示维生素D的干预剂量为1000IU/w，是作用于小鼠的最大无毒副作用剂量。本部分实验模拟糖尿病患者的体内情况，制作糖尿病小鼠模型，同时采用此剂量维生素D对糖尿病小鼠进行干预处理，为维生素D用于糖尿病防治提供实验数据。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物第一部分成模C57BL/6J小鼠24只，同批次健康雄性C57BL/6J小鼠6只，均为SPF级别，由上海斯莱克实验动物中心提供。饲养于苏州大学SPF级实验动物房，室温（23±2）℃，相对湿度50%-60%，自由饮水摄食，光照时间按照正常的昼夜规律进行。9 第二部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究本研究通过苏州大学动物伦理委员会批准。1.1.2试剂维生素D3注射液：上海通用药业股份有限公司；一抗（E-cadherin，Vimentin，β-catenin，Snail，Slug，Nephrin，VDR，GAPDH）：Abcam，Cellsignalingtechnology，美国；二抗(Anti-Mouse、Anti-rabbit)：Cellsignalingtechnology，美国；注射用茶油：江西金海棠药用油业有限公司，赣食药准字20050003；盐酸二甲双胍片：批号国药准字H32021625，江苏苏中药业集团股份有限公司；无水乙醇：产品批号：20161116，永华化学科技（江苏）有限公司；Western及IP细胞裂解液：碧云天P0013，中国；蛋白酶抑制剂(Phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF)：Roche,瑞士；BCA蛋白浓度测定试剂盒：碧云天P0012，中国；5×上样缓冲液(10ml):1.2ml0.5MTris(pH6.8)，5ml甘油，2ml10%SDS，0.5mlβ-巯基乙醇，溴酚蓝0.01g溶于1ml蒸馏水，0.3ml蒸馏水；Tris-base：Amresco0497；Glycine：Amresco0167；SDS：Amresco0227；SDS-PAGE电泳液：碧云天P0014A，中国；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒：碧云天P0012A，中国；PVDF膜(PVDFMembranesforWesternBlotting)：Millipore，美国；显影液(ImmobilonECL)：Millipore，美国；无钙镁PBS配制：1000ml双蒸水，NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4•12H2O3.48g，KH2PO40.2g，pH为7.4；自封袋：货号：92314405S，国药集团化学试剂有限公司。1.1.3常用试剂配制（1）维生素D3注射液、甲醛固定液见第一部分（2）盐酸二甲双胍片混合液：取盐酸二甲双胍片研磨成粉末，天平准确称取粉末30mg，溶于100ml小鼠饮用水中，即得到剂量为0.3mg/ml的盐酸二甲双胍10 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第二部分片混合液。常温保存。其余试剂配制同第一部分。1.1.4实验仪器实验所需一次性注射器、促凝管、烧杯、剪刀、镊子等均由苏州大学实验材料中心提供；全自动五类血液学分析仪：型号CELL-DYN3700，美国雅培公司；罗氏血糖仪卓越型：ACCU-CHEKPerforma，德国；血糖试纸：ACCU-CHEKPerforma，德国；超声波破碎仪：VCX130PB，SONICS，美国；24孔小型低温离心机：Eppendorf，德国；电子称：Sartorius,BSA124S，德国；双重蒸馏水仪：BSZ-2型，上海博通；超低温冰箱：MDF-U53V，SANYO，日本；酶标仪：MolecularDevices，FilterMaxF5，美国；恒温金属孵育器：Eppendorf，ThermoStartPlus，美国；小型垂直电泳仪：BIO-RAD，美国；制冰机：SIM-F140AY65，SANYO，日本；化学发光成像仪：GeneCompanyLimitde，美国。1.2实验方法1.2.1不同药物对糖尿病小鼠的干预处理（1）将已经成模的C57BL/6J小鼠24只，随机分为4组：模型组、维生素D3（VD3）干预组、二甲双胍组、联合作用组（维生素D3+二甲双胍组），每组6只小鼠，同品系同批次健康小鼠6只作为空白对照组。同组小鼠同笼饲养，保证饮水充足，勤换垫料，同组小鼠间利用尾部标记法进行区分标记。（2）任意选取成模小鼠中的其中1组小鼠作为VD3干预组，配制好后的维生素D3注射液浓度为40000IU/ml即40IU/μl，以1000IU/w的剂量计算，每只小鼠的注射体积为25μl。采用肌肉注射法于小鼠双后肢轮流注射给药；模型组注射同体积茶油作为溶剂对照；二甲双胍组，使用饮水法给药，将配制好的盐酸二甲双胍片混合液添入小鼠饮水壶内，每日固定同一时间更换新的水壶，同时加入新11 第二部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究配制的盐酸二甲双胍片混合液；联合作用组给药方法同上，但二甲双胍剂量减半，即0.15mg/ml；空白对照组小鼠不做额外处理，同样条件下正常饲养。实验干预周期为期12周，每周固定同一时间称量小鼠体重、给药。1.2.2主要技术路线实验干预周期为12周，具体技术路线图见图2.1所示。12周后小鼠首先进行代谢与行为学的监测，监测时间为24h。期间收集小鼠的尿液，经过滤除去杂质后保存于－80℃冰箱备用。称重后小鼠眼球取血，收集于促凝管中，待血液分层后（约半小时）3000g/10min离心机离心，取上层血清于1.8ml冻存管内，－80℃冰箱保存备用。收集血液后，小鼠乙醚麻醉并颈椎脱臼处死，解剖分离出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏并称重，除肾脏外，其余内脏组织置于4%甲醛固定保存。两侧肾脏组织去除肾包膜后，一侧肾脏放于4%甲醛内固定，另一侧肾脏放于冻存管中－80℃冰箱暂存。图2.1主要技术路线图1.2.3小鼠一般状况第一次注射VD3前称量小鼠基础体重，之后在VD3干预的实验过程中每周一次同一时间称量小鼠体重，同时注意观察小鼠的毛色、精神状态、垫料潮湿度以12 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第二部分及饮水摄食量的变化。1.2.4小鼠空腹血糖检测实验干预处理周期内，每周同一时间采用剪尾法检测小鼠空腹血糖，检测前禁食不禁水12h。检测前对小鼠尾部进行消毒，然后用剪刀剪尾取血，弃掉第一滴血，顺尾部从上到下挤出微量血液于血糖试纸的芯片上，利用血糖仪读数并记录数值。检测完毕后对小鼠尾部进行消毒并止血。1.2.5病理切片小鼠肾脏在4%甲醛固定液中固定1周，经梯度脱水透明、浸蜡包埋后切片，将制好的切片进行脱蜡、脱苯、复水、染色、脱水、透明、封固完成HE染色，晾干并常温保存，使用病理显微镜观察记录组织病理变化及拍照。1.2.6肾脏组织中总蛋白的提取取40mg左右肾脏组织置于1.5mlEppendorf管中，然后加入200μl含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰浴，超声细胞破碎仪匀浆。将裂解后的组织匀浆4℃下15000rpm离心30min，取上清分装于1.5mlEppendorf管中并存放于－20℃保存。运用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白样品的蛋白含量，并用生理盐水将所有样品调至相同浓度。然后在样品中按照5:1比例加入5×上样缓冲液，混匀，99℃煮沸10min，使蛋白质变性。1.2.7Westernblot检测蛋白水平制胶、上样：洗净玻璃板，双蒸水冲洗，无水乙醇脱脂，放置烘箱中烘干。配制10%Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺分离胶与5%浓缩胶，插入10孔分齿梳。待浓缩胶聚合后，小心移出分齿梳，加入1×电泳缓冲液，按次序上样，左侧第一孔加入marker，最后一孔加入适量的1×上样缓冲液。电泳：样品在浓缩胶中时电压为60V，待样品进入分离胶压缩为一条直线后电压调为90V。继续电泳直至预染分子量标准显示不同分子量蛋白已经分开，即待指示剂溴酚蓝跑到凝胶底部时停止电泳。转膜：将硝酸纤维素膜侵入甲醇溶液中，纯化3-5min。电泳结束后将硝酸纤维素膜盖于胶上转移到转移夹中，330mA转移90min，转移全程冰上进行。封闭、孵育抗体、显影：转膜结束后根据条带分子量裁膜，室温下5%脱脂奶粉封闭孵育1h。封闭结束后，将膜及相应稀释后的一抗放入自封袋中封口，4℃13 第二部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究摇床过夜。孵育完成后，室温下用PBST洗膜3次，每次10min。然后按照1:2000的比例稀释相应的二抗，室温摇床孵育1h，之后取出膜室温下用PBST洗膜3次，每次10min。将ECL底物显色A、B发光液按1:1混合，每张膜上滴上适量ECL底物显色发光液，通过化学发光成像系统曝光适当时间，显影、拍照，用分析软件对目的蛋白的灰度值进行定量分析。抗体稀释倍数一抗名称WesternBlot稀释倍数厂家E-cadherin1:1000CellSignalingTechnology-catenin1:1000CellSignalingTechnologyVDR1:500CellSignalingTechnologyNephrin1:700AbcamVimentin1:1000CellSignalingTechnologyGAPDH1:1000CellSignalingTechnologySnail1:500CellSignalingTechnologySlug1:1000CellSignalingTechnology1.2.8统计方法采用SPSS13.0统计软件进行数据统计分析处理。计量资料以均数±标准差表示（X±SD）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1小鼠一般情况正常对照组小鼠12周后体重显著增加，精神状态良好，动作敏捷，反应迅速，毛色光滑，无死亡现象；模型组小鼠出现多饮、多食、多尿，反应迟钝，毛色暗淡，小便酸臭等现象；维生素D3组、二甲双胍组以及联合作用组小鼠也出现了类似模型组的表现，但程度较模型组减轻。2.2小鼠体重变化如图2.2中所示，在注射STZ一周后小鼠平均体重出现了明显的差异。与正常对照组相比，注射STZ组（模型组、维生素D3组、二甲双胍组、联合作用组）小鼠平均体重出现显著下降（P<0.05）。在第二周糖尿病小鼠血糖稳定后进行不同药物干预，糖尿病小鼠平均体重均有所回升。在干预第六周后，维生素D3组和二14 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第二部分甲双胍组两组小鼠平均体重增加较模型组以及联合作用组快。正常对照组小鼠平均体重在整个实验周期内一直处于平稳上升的趋势。图2.2小鼠体重变化2.3小鼠空腹血糖变化表2-1各组小鼠空腹血糖TimeCtrlModelVD3MetVD3+Met(week)15.57±0.3117.03±0.4217.10±0.9819.9±0.5718.80±0.7827.57±0.8424.30±3.0621.7±0.9017.33±2.3020.03±3.1647.05±1.6223.52±3.6223.77±5.5722.93±5.0420.92±4.0865.85±0.8820.07±5.4618.33±4.0014.72±2.9617.85±3.0386.68±0.6723.90±3.3220.13±4.8719.68±3.8821.07±3.60107.86±0.7723.35±6.5119.72±4.4121.18±5.1020.37±3.35127.33±0.0722.28±6.1820.83±2.9216.64±2.3520.52±5.26如表2-1所示，小鼠空腹血糖测试结果表明：注射STZ一周后，糖尿病小鼠（模型组、维生素D3组、二甲双胍组、联合作用组）空腹血糖显著高于正常对照组（P<0.01）。在空腹血糖稳定一周后，用不同药物进行治疗，结果发现维生素D3组、二甲双胍组和联合作用组三组小鼠空腹血糖低于模型组，但无统计学差异（P>0.05）。二甲双胍组小鼠空腹血糖低于维生素D3组和联合作用组，差异无统计学意义（P>0.05）。在整个干预周期内，正常对照组小鼠空腹血糖波动较小、比较平稳。15 第二部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究2.4小鼠脏器系数变化如表2-2所示，与正常对照组相比，四组糖尿病（模型组、维生素D3组、二甲双胍组和联合作用组）小鼠的心脏系数以及肝脏系数显著升高，且差异具有统计学意义（P<0.05）；其中与模型组比较，维生素D3组和联合作用组小鼠的肝脏系数明显降低（P<0.05）。除二甲双胍组外，模型组、维生素D3组以及联合作用组小鼠的肾脏系数较正常对照组明显升高，且具有统计学差异（P<0.05）。经过二甲双胍以及二者联合治疗后，肾脏系数明显低于模型组（P<0.05）。其他脏器系数无明显变化。表2-2各组小鼠脏器系数heartLiverspleenlungkidneyCtrl0.51±0.023.83±0.120.21±0.020.54±0.051.12±0.05***Model0.77±0.055.57±0.260.22±0.010.60±0.041.81±0.04**#*VD30.72±0.084.91±0.140.23±0.030.60±0.021.71±0.11***#&#&Met0.73±0.035.76±0.130.25±0.010.53±0.011.31±0.09**#*VD3+Met0.77±0.024.81±0.160.21±0.020.60±0.011.63±0.14#&注：*表示与对照组相比P<0.05，表示与模型组相比P<0.05，表示与VD3组相比P<0.05，表示与Met组相比P<0.05。2.5小鼠血尿素氮、血肌酐及尿蛋白与肌酐比水平如图2.3A、B所示，4组糖尿病小鼠血尿素氮水平均高于正常对照组，但无统计学差异（P>0.05）。模型组以及二甲双胍组小鼠血肌酐水平显著高于正常对照组，且差异有统计学意义（P<0.05）。维生素D3组与联合作用组小鼠血肌酐水平对比模型组组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），二甲双胍组与模型组比较血肌酐差异不明显。与二甲双胍组比，联合作用组小鼠血肌酐水平显著下降（P<0.05）。图2.3C所示，四组糖尿病小鼠24h尿蛋白水平均高于正常对照组。在用药物治疗12周后，维生素D3组二甲双胍组及联合作用组两组小鼠尿蛋白水平显著低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）,药物治疗组（维生素D3组、阳性对照组、联合作用组）三组之间小鼠尿蛋白水平无统计学意义（P>0.05）。如图2.3D所示，糖尿病小鼠尿蛋白肌酐比明显高于正常对照组，且差异有统计学意义（P<0.01）。除联合作用组外，维生素D3组和二甲双胍组两组小鼠尿蛋16 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第二部分白肌酐比显著低于模型组（P<0.05）。二甲双胍组小鼠尿蛋白肌酐比明显低于维生素D3组（P<0.05）。而联合作用组尿蛋白肌酐比高于阳性对照组（P<0.05）。图2.3小鼠血液、尿液生化指标检测#&注：*表示与对照组相比P<0.05，表示与模型组相比P<0.05，表示与VD3组相比P<0.05，表示与Met组相比P<0.05。2.6小鼠肾脏病理切片结果如图2.4所示，正常对照组肾小球体积正常，肾小管结构完整清晰，肾小管上皮细胞排列完整，无明显病理改变。模型组出现肾小球体积肥大，肾间质局灶性炎性细胞浸润，肾小管明显扩张，肾小管上皮细胞明显脱落。经过不同药物治疗之后，糖尿病病理改变出现不同程度的减轻。单独给予维生素D3、二甲双胍后，肾脏病理改变减轻。同时给予维生素D3和二甲双胍较模型组病理改变显著减轻，有协同现象。17 第二部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究ControlModelVD3MetVD3+Met图2.4各组小鼠肾脏病理切片（400×）2.7小鼠肾脏组织EMT相关蛋白表达的变化2.7.1维生素D3对E-cadherin、Vimentin表达的影响图2.5维生素D3对E-cadherin、Vimentin表达的影响Westernblotting条带及各蛋白灰度值半定量后的柱状图，E-cadherin分子量#135kDa，Vimentin分子量57kDa；*表示与对照组相比P<0.05，表示与模型组&相比P<0.05，表示与VD3组相比P<0.05，表示与Met组相比P<0.05。18 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第二部分如图2.5所示，与正常对照组相比，模型组小鼠肾脏组织中上皮细胞标志物E-cadherin的表达明显降低（P<0.01），间质细胞标志Vimentin表达显著升高（P<0.001）。这说明在高糖环境下，血中葡萄糖浓度的升高能够显著抑制E-cadherin的表达、上调Vimentin的表达。维生素D3、二甲双胍分别单独作用时，E-cadherin的表达没有上升，但显著抑制了Vimentin的表达（P<0.001）。两者联合作用时，能够明显促进E-cadherin的表达（P<0.001），对Vimentin的作用不明显。2.7.2维生素D3对肾组织中Nephrin表达的影响Nephrin是一种跨膜蛋白，在足细胞裂孔隔膜上特异性表达。Westernblotting结果表明：与正常对照组比，四组糖尿病小鼠Nephrin均低表达；维生素D3干预后，Nephrin蛋白表达有一定升高；二甲双胍组以及联合作用组对Nephrin作用不明显（图2.6）。图2.6维生素D3对肾组织中Nephrin表达的影响Westernblotting条带及各蛋白灰度值半定量后的柱状图，Nephrin分子量85kDa；*表示与对照组相比P<0.05，#表示与模型组相比P<0.05，&表示与VD3组相比P<0.05，表示与Met组相比P<0.05。19 第二部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究2.7.3维生素D3对肾脏EMT相关转录因子表达的影响图2.7维生素D3对β-catenin、Snail、Slug表达的影响Westernblotting条带及各蛋白灰度值半定量后的柱状图，β-catenin分子量92#kDa，Snail分子量29kDa，Slug分子量30kDa；*表示与对照组相比P<0.05，&表示与模型组相比P<0.05，表示与VD3组相比P<0.05，表示与Met组相比P<0.05。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白分子，为探讨维生素D3对糖尿病肾病的保护作用是否通过Wnt/β-catenin信号通路来实现的。本部分实验首先检测维生素D3对肾脏组织中β-catenin蛋白表达水平的影响。Westernblotting检测结果表明，模型组、维生素D3组以及二甲双胍组β-catenin表达水平显著高于正常对照组（P<0.001）；二甲双胍组β-catenin表达无变化；给予维生素D3治疗后，维生素D3组以及联合作用组的β-catenin蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。Snail、Slug是上皮-间质转化过程中的转录因子，Snail、Slug表达量增加，并向胞核聚集是发生EMT的特征之一。在该实验中选用转录因子Snail和Slug为20 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第二部分EMT标志物。WesternBlot结果表明：模型组Snail、Slug表达量显著高于正常对照组（P<0.001）；经过不同疗法治疗后，除维生素D3单独作用对Snail影响不显著外，维生素D3、二甲双胍以及两者联合应用均能明显降低Snail及Slug的表达（P<0.01）（图2.7）。2.7.4维生素D3延缓肾脏损伤过程中VDR变化维生素D3主要是通过与其相对应维生素D受体(VitaminDReceptor,VDR)结合来实现发挥其生物学效应的生理功能。因此，本实验检测了肾脏组织中VDR的表达水平。WesternBlot结果发现，糖尿病小鼠肾脏组织中VDR水平显著低于正常组（P<0.01）；经过维生素D3干预后，VDR蛋白水平显著上升；而二甲双胍对VDR的作用影响不明显（图2.8）。图2.8维生素D3对肾脏组织中VDR表达的影响Westernblotting条带及各蛋白灰度值半定量后的柱状图，VDR分子量48#&kDa，*表示与对照组相比P<0.05，表示与模型组相比P<0.05，表示与VD3组相比P<0.05，表示与Met组相比P<0.05。21 第二部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究3讨论随着全球经济快速发展，物质生活水平提高，生活方式以及饮食结构的改变，糖尿病是二十一世纪影响人类健康的主要流行病之一。糖尿病的发病病因错综复杂，受遗传因素与环境因素两者的共同影响。流行病学资料显示，2013年全球约有3.71亿成年人患有糖尿病，其中中国的糖尿病患者人数居全球之首，约为1.139亿人，糖尿病前期也就是血糖存在糖耐量异常的人群约为4.934亿人[34]。糖尿病对患者的健康危害，更多是在并发症，而非糖尿病本身。DN是1型和2型糖尿病的严重且常见的并发症，其可导致高达约三分之一的糖尿病患者发展成ESRD[42]。蛋白尿是糖尿病肾病的一个临床指标，同时也是肾脏疾病进展的一个独立危险因素[46]。过去的调查一般集中在肾小球系膜上，假定肾小球系膜基质增加是DN发病机制中的中心病变。然而，这些变化不容易解释患者如何发展蛋白尿。最近的研究有了新的发现，肾小球足细胞在DN发病机制中发挥关键作用[47-49]。目前的证据表明足细胞结构和功能异常发生在糖尿病肾病的早期。涉及DN中足细胞功能障碍的多种机制包括晚期糖基化，氧化应激，肾素-血管紧张素-醛固酮系统，肿瘤生长因子-β等[50]。然而，对于DN有害的相对危害因素还没有充分阐明。进一步的研究可能为预防和治疗DN提供一个有前途的新见解和有效的策略。维生素D的活性谱比其对钙和磷酸盐代谢和骨生理学的影响广泛得多[51,52]。维生素D参与免疫，血管功能，心肌细胞健康，胰岛素抵抗和肾素-血管紧张素系统（RAS）的调节[53,54]。最近的流行病学研究揭示了维生素D及其类似物在CKD患者，特别是DN中抗蛋白尿活性的作用[55]。维生素D的肾脏保护作用也已在大量肾病动物模型[29]，特别是在DN动物模型中证明[45,56]。相当多的证据表明足细胞损伤在DN的发生和进展中起重要作用。当其受高糖、氧化应激等刺激时，可以异常激活Wnt/-catenin信号通路[15]。Wnt/-catenin信号传导的激活导致足细胞去分化和间充质转变，损害足细胞完整性并破坏肾小球滤过屏障，导致蛋白尿[57,58]。足细胞中NephrinmRNA及蛋白表达的降低早于其超微结构的改变和蛋白尿的出现，是肾小球足细胞损伤的早期标志物[59]。从小鼠体重和空腹血糖变化情况来看，小鼠注射STZ一周后，与正常对照组相比，体重出现显著的下降。体重暂时性下降的原因可能是小鼠STZ暴露早期的应激反应。空腹血糖明显高于正常对照组，提示我们已成功建立糖尿病小鼠模型。22 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第二部分在糖尿病小鼠血糖稳定后，用维生素D3注射液、二甲双胍干预后，糖尿病小鼠体重出现回升，与正常对照组体重增长无显著差异。与模型组相比，维生素D3组和二甲双胍组两组体重增加量较高，而联合作用组体重增加量不明显。这表明维生素D3可以改善糖尿病导致的体重增加缓慢，能够改善糖尿病患者的营养状况。于此同时，维生素D3组、二甲双胍组和联合作用组三组空腹血糖低于模型组，二甲双胍组空腹血糖低于维生素D3组和联合作用组，虽然维生素D3降血糖作用不及二甲双胍，但是说明维生素D3在一定程度上可以调节血糖，这与Al-Badr、Jones的研究结果一致[53,54]。本实验中，经过维生素D3、二甲双胍的治疗，糖尿病小鼠的24h尿蛋白排泄量以及尿蛋白肌酐比均有不同程度的改善，也不同程度减轻了肾小球肥大，肾间质局灶性炎性细胞浸润，肾小管明显扩张，肾小管上皮细胞排列紊乱、脱落等病理损害。以上结果表明维生素D3对STZ诱导的糖尿病造成的肾脏损伤有一定的保护作用。在糖尿病肾病的早期，Nephrin的低表达和蛋白尿密切相关[60]。这与我们的研究结果一致，实验中发现糖尿病小鼠Nephrin的表达水平下降，伴随着蛋白尿的增多；维生素D3干预后，Nephrin蛋白水平有一定的上调，但二甲双胍以及联合作用组其表达水平无变化。这一结果说明维生素D3可以通过上调Nephrin，从而减轻足细胞受损程度，减轻蛋白尿。本次研究中发现糖尿病小鼠肾脏组织中-catenin、Snail、Slug蛋白表达水平显著升高，这表明Wnt/-catenin信号通路已经被激活，同时模型组上皮细胞标志物E-cadherin明显降低、间质细胞标志物Vimentin表达显著升高，VDR明显降低。当用维生素D3干预后，可以显著抑制蛋白-catenin、Vimentin、Slug的表达，上调VDR水平的表达，E-cadherin、Snail变化不明显。二甲双胍组Snail、Slug、Vimentin显著降低，VDR、E-cadherin变化不大。联合作用组E-cadherin明显上调，Snail、Slug、Vimentin显著降低，VDR表达水平无明显改变。以上蛋白表达水平的变化结果表明维生素D3可能通过与其受体VDR相结合，减少Slug、-catenin进入细胞核，抑制Vimentin表达。另一方面，Nephrin表达量增加，也降低-catenin由细胞质进入细胞核的机会，从而维持裂孔隔膜和足细胞结构的完整性，抑制EMT的发生，防止肾脏病变进一步加重。综上所述，维生素D3可以调节糖尿病鼠的血糖，通过上调Nephrin，减轻足23 第二部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究细胞损伤，改善尿蛋白排泄以及尿蛋白肌酐比；下调-catenin、Vimentin、Slug，抑制EMT的发生，减轻肾小球硬化及肾脏纤维化进程，从而防止或延缓糖尿病肾病的发生和发展，但其具体的肾脏保护机理还有待于进一步研究。24 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第三部分第三部分1α,25(OH)2D3对高糖诱导的足细胞上皮间质转换抑制作用在发展中国家，DN是糖尿病严重的微血管并发症，其也是终末期肾病（Endstagerenaldisease，ESRD）的主要原因[61]。足细胞是存在于肾小球毛细血管外的肾小球基底膜上的终末分化的上皮细胞。临床研究表明足细胞损失有助于DN的进展[62]。Yamaguchi提出了DN患者足细胞的损失是通过上皮间质转换（EMT）造成的新解释[63]。对于许多常见的肾小球疾病如DN，EMT可能是导致足细胞功能障碍、蛋白尿、以及肾小球硬化的一种潜在途径[64]。EMT将会促进足细胞运动，并最终导致足细胞的精细三维架构的破坏，从而损伤肾小球滤过屏障功能[65]。因此，足细胞EMT在足细胞损失中可能起重要作用，其代表了DN的新型早期机制。有研究发现，VDR敲除的糖尿病小鼠更容易由于肾小球基底膜的增厚以及足细胞的凋亡而发生严重的蛋白尿和肾小球硬化。体外实验表明，维生素D能够通过抑制足细胞中乙酰肝素酶的表达减轻蛋白尿[28]。帕立骨化醇，一种维生素D类似物，可以缓解人近端肾小管上皮细胞EMT[66]。在前一部分研究中我们已经发现维生素D可以改善蛋白尿，延缓EMT进程。但在足细胞中维生素D对EMT抑制作用尚不清楚。为了研究这一问题，我们在这一部分用高糖诱导人肾足细胞发生EMT，然后用1α,25(OH)2D3干预足细胞EMT过程，观察其对足细胞的作用，期望能够进一步研究维生素D对糖尿病肾病保护作用的可能机制。1材料与方法1.1主要仪器和试剂1.1.1实验仪器超净工作台：苏州净化SW-OJ-3F，中国；二氧化碳培养箱：Thermo，美国；倒置生物显微镜：OLYPUSCKX41，日本；离心机：Eppendorf，德国；25 第三部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究细胞计数仪：Invitrogen，美国；可调式微量移液器：Eppendorf，德国；一次性细胞培养皿：Corning，美国；恒温水浴锅：DKB-2215型，上海精密仪器设备；低温离心机：Eppendorf，德国；24孔小型低温离心机：Eppendorf，德国；电子称：Sartorius，BSA124S，德国；双重蒸馏水仪：BSZ-2型，上海博通；酶标仪：MolecularDevices，FilterMaxF5，美国；恒温金属孵育器：Eppendorf，ThermoStartPlus，美国；小型垂直电泳仪：BIO-RAD，美国；化学发光成像仪：GeneCompanyLimitde，美国。1.1.2主要仪器和试剂同第一部分人肾小球足细胞hPC：上海锐聪科技发展有限公司；1α,25(OH)2D3(1,25-dihydroxyvitaminD3，1,25(OH)2D3)：Sigma，美国；胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS）：GIBCO，美国；DMEM/HIGHGLUCOSE培养基：Hyclone，美国；DMEM/RPMIMediumModified培养基：Hyclone，美国；CellCountingKit-8(CCK-8)：同仁化学研究所，日本；胰酶细胞消化液：碧云天，中国；青霉素-链霉素溶液：碧云天，中国；无水乙醇：产品批号：20161116，永华化学科技（江苏）有限公司；无钙镁PBS配制：1000ml双蒸水，NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4•12H2O3.48g，KH2PO40.2g，pH为7.4。1.2方法1.2.1细胞培养将人肾小球足细胞hPC置于含10%胎牛血清的高糖培养基、RPMI培养基中，在37℃，含5%CO2恒温孵育箱中培养。26 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第三部分1.2.2CCK-8法检测细胞存活率3取对数生长期的hPC细胞，2×10个/皿接种于96孔培养板中，37℃、5%CO2培养箱培养12h，待细胞贴壁后弃去培养液，然后加入含不同浓度1α,25(OH)2D3（1,25D3）的培养基200μl。实验分为4组：单纯HG组，葡萄糖浓度为25mmol/L；1,25D3与DMEM/HIGHGLUCOSE联合培养组，1,25D3的浓度分别1nmol/L，10nmol/L，100nmol/L；每组均设6个复孔，在1,25D3加入24h、48h、72h、96h后，于每个时间点每孔加入10μlCCK-8，37℃培养箱继续孵育1h，用酶联免疫检测仪450nm波长检测各孔吸光度OD值，细胞存活率=实验组OD/对照组OD×100%。1.2.3Westernblotting检测蛋白水平实验分为四个组：Ctrl组、HG组、HG+10nM1,25D3组、HG+100nM1,25D35组。取对数生长期的hPC细胞，接种于100mm细胞培养皿中5×10，置于37℃，含5%CO2培养箱培养过夜，待细胞贴壁后弃去培养基。然后加入含不同浓度1,25D3（10，100nM）的高糖培养基10ml，RPMI培养基（Ctrl）以及高糖培养基对照组（HG）加入含等浓度无水乙醇的10%胎牛血清RPMI培养基和高糖培养基；处理48h。结束后，用PBS清洗3遍，用细胞刮将细胞刮下，置于1.5mlEppendorf管中，2000rpm离心10min。吸掉PBS，将细胞放置－80℃冰箱。将上述收集好的细胞样品加入150μl含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取细胞总蛋白，冰浴超声30s，待细胞充分裂解后，4℃，15000rpm离心10min去除细胞碎片，上清即为细胞总蛋白溶液。然后将上清转移至1.5mlEppendorf管中。蛋白定量按照BCA试剂盒说明书用标准蛋白制作标准曲线，依据标准曲线对蛋白样品进行定量。将定量好的总蛋白按体积比5:1加入1×上样缓冲液，99℃煮沸10min，置于－20℃冰箱保存。取30-50μg蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%分离胶），同时加入5μl蛋白分子量标准参照物以确定所检测蛋白带的位置。电泳时起始电压为60V，待样品至分离胶时提高电压至90V，当指示剂溴酚蓝至凝胶底部时停止电泳；再于电转仪上在330mA、90min的条件下将蛋白样品湿转到PVDF膜上。室温下用5%脱脂奶粉进行封闭1小时，之后加入稀释后的一抗，4℃过夜；用PBST洗膜3次，每次10min；再在室温摇床上孵育按照1:2000稀释后的二抗，1小时，用PBST27 第三部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究洗膜三次，每次10min；用化学发光成像系统显色、拍照。1.2.4统计学方法各实验至少重复三次，采用SPSS13.0统计软件进行统计分析处理。计量资料以均数±标准差表示（X±SD）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.11α,25(OH)2D3作用剂量的确定图3.1不同浓度1α,25(OH)2D3对足细胞活力的影响细胞存活率的实验结果显示，24h时，不同浓度1α,25(OH)2D3处理对足细胞影响不大；但在48h时，10nM、100nM1α,25(OH)2D3处理组细胞存活率与对照组相比虽无统计学差异，但存活率有一定的增加；72h时，1α,25(OH)2D3处理后的细胞生长受到抑制；96h时，1nM、10nM的1α,25(OH)2D3对细胞生长影响不大，100nM抑制细胞的存活，既能达到相应生物学效应，又不会影响细胞的正常增殖过程。因此，本部分后期实验均采用10nM、100nM的1α,25(OH)2D3进行干预48h，检测1α,25(OH)2D3对足细胞的影响。2.21α,25(OH)2D3对足细胞EMT相关蛋白的影响2.2.11α,25(OH)2D3对足细胞中E-cadherin、Vimentin表达的影响如图3.2所示，Westernblot结果表明，与正常组相比，高糖导致足细胞上皮标志E-cadherin表达降低以及间质标志Vimentin的表达增加（P<0.001）。而28 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第三部分1α,25(OH)2D3可以显著上调E-cadherin表达，下调Vimentin（P<0.001）。图3.21α,25(OH)2D3对足细胞中E-cadherin、Vimentin表达的影响Westernblotting条带及各蛋白灰度值半定量后的柱状图，E-cadherin分子量#135kDa，Vimentin分子量57kDa；*表示与对照组相比P<0.05，表示与模型组相&比P<0.05，表示与10nM1,25D3组相比P<0.05。2.2.21α,25(OH)2D3对足细胞特异性标志物Nephrin的影响如图3.3所示，Westernblot结果显示，高糖培养的足细胞Nephrin蛋白表达水平显著低于正常对照组（P<0.01）；经过不同浓度1α,25(OH)2D3处理后，Nephrin表达出现不同程度的明显上调（P<0.001），以10nM1α,25(OH)2D3升高程度最为明显。29 第三部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究图3.31α,25(OH)2D3对足细胞Nephrin表达的影响Westernblotting条带及各蛋白灰度值半定量后的柱状图，Nephrin分子量85#&kDa；*表示与对照组相比P<0.05，表示与模型组相比P<0.05，表示与10nM1,25D3组相比P<0.05。2.2.31α,25(OH)2D3对足细胞EMT相关转录因子的影响如图3.4所示，将足细胞用不同因素刺激48h后，Westernblot结果显示增加葡萄糖浓度，-catenin、Snail、Slug蛋白水平明显增加（P<0.05）。在用1α,25(OH)2D3处理后，不同浓度的1α,25(OH)2D3均可以使蛋白-catenin、Snail、Slug表达水平显著降低（P<0.01），100nM1α,25(OH)2D3组Slug表达无变化。30 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第三部分图3.41α,25(OH)2D3对足细胞相关转录因子的影响Westernblotting条带及各蛋白灰度值半定量后的柱状图，-catenin分子量92#kDa，Snail分子量29kDa，Slug分子量30kDa；*表示与对照组相比P<0.05，表&示与模型组相比P<0.05，表示与10nM1,25D3组相比P<0.05。2.2.41α,25(OH)2D3对足细胞VDR表达的影响与正常对照组相比，高糖刺激后足细胞中蛋白VDR的表达水平有一定下调。1α,25(OH)2D3可以显著上调VDR（P<0.05），并且随着1α,25(OH)2D3浓度的增加VDR蛋白表达也随之增加，呈现一定的剂量-效应关系（P<0.001）（图3.5）。31 第三部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究图3.51α,25(OH)2D3对足细胞VDR表达的影响Westernblotting条带及各蛋白灰度值半定量后的柱状图，VDR分子量48kDa；#&*表示与对照组相比P<0.05，表示与模型组相比P<0.05，表示与10nM1,25D3组相比P<0.05。3讨论足细胞损伤与蛋白尿的发生密切相关，是各种肾脏疾病发生和发展的重要因素[67]。足细胞损伤在DN进展中扮演重要作用是广泛接受的[42,68,69]。DN存在不同形式的足细胞损伤，如细胞凋亡，脱落和EMT。足细胞的EMT促进DN[11,70]。目前研究认为TGF/Smad，ILK和Wnt/β-catenin参与导致细胞EMT的信号通路[71-73]。Wnt/β-catenin信号通路主要参与细胞分化调控，特别是在恶性肿瘤细胞中，影响肿瘤细胞的侵袭和迁移[74]。β-catenin是一种多功能蛋白，是经典Wnt信号传导的关键因素[75]。在正常情况下，游离β-catenin被磷酸化和被蛋白酶体降解。当32 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究第三部分Wnt信号激活时，大多数β-catenin没有发生磷酸化，导致β-catenin在细胞质中积累，与T细胞核转录因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）结合进入细胞核，调节涉及多种生理机制靶基因的表达[72]。Wnt/β-catenin通路激活Snail基因[76]。Snail的高表达可以减少E-cadherin表达，减少上皮细胞之间的粘附，参与EMT[77]。另一方面，Snail的高表达与β-catenin相互作用，进一步激活Wnt信号[76]并激活靶基因导致EMT。研究发现维生素D能够阻止糖尿病肾病足细胞损伤[78]。1,25(OH)2D3的生物学效应由细胞内的特异性VDR介导。VDR在不同类型的细胞中均表达，包括血管平滑肌细胞，淋巴细胞，成骨细胞，和心肌细胞。近肾小球器官的黄斑斑块中，肾小球壁上皮细胞和足细胞中也存在VDR[79,80]。而且，研究表明1,25(OH)2D3与细胞的增殖、分化、迁移和侵袭有关[43]。YouliWang等用转基因小鼠提供了VDR在DN发病机制中的直接证据，特别是足细胞损伤[45]。1,25(OH)2D3通过诱导编码细胞粘附和负责上皮表型的极性蛋白质的一系列靶基因，抑制关键的EMT诱导物来抑制EMT[30]。在EMT过程中，足细胞丢失了一些正常的上皮标志物，但获得间充质标记[63,70,81]。在本研究中，检测了上皮细胞标志物E-cadherin、nephrin，间质标记Vimentin。本部分实验结果表明高糖环境下，上皮标志E-cadherin、nephrin表达降低，间质标志Vimentin表达升高，说明高糖导致足细胞发生EMT。这些结果与以前的研究一致[11,82]。nephrin是构成肾小球裂孔隔膜的主要蛋白，维持足细胞完整性以及保持肾小球裂孔隔膜的正常功能。以前的一项研究报道，nephrin的表达降低与蛋白尿的发生密切相关[83]。此外，目前的研究用Transwell实验证明足细胞的屏障功能的葡萄糖浓度依赖性损伤。这些观察结果表明，高葡萄糖诱导的EMT导致功能性蛋白质的丧失，这又损害了裂孔隔膜的完整性，并导致异常的肾小球血流。这一过程可能是蛋白尿发展的重要机制。再者，高糖导致足细胞VDR表达下降以及诱导转录因子-catenin、Snail、Slug的表达，经1α,25(OH)2D3干预后，阻止了-catenin、Snail、Slug的表达，缓解了足细胞EMT进程。本研究结果表明VDR与高糖导致的足细胞EMT有关，用1α,25(OH)2D3干预后，能够抑制EMT。在DN中，Wnt/-catenin信号的激活，足细胞中-catenin的特异性活化导致蛋白尿，相反地，其特异性缺失减少了足细胞损伤和蛋白尿[84,85]。值得注意的33 第三部分维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究是，-catenin被认为是细胞内的主开关，其将来自多个途径的信号输入整合并控制EMT相关的转录组[10]。最新的研究证据表明，抑制-catenin可以预防DN中足细胞的EMT[84,86]。根据这些发现，我们的研究进一步支持-catenin参与足细胞中高葡萄糖诱导的EMT。最近，在不同的研究中研究了VDR和-catenin之间的关系。但VDR对糖尿病足细胞中-catenin表达的作用仍有待阐明。在本研究中，我们发现足细胞在高糖环境中发生了EMT。此外，高糖诱导足细胞中VDR的低表达和-catenin的过度表达。1,25(OH)2D3能够阻止足细胞中高糖诱导的EMT和-catenin过表达。总之，本次研究证明了VDR和-catenin参与糖尿病足细胞的EMT。VDR通过足细胞中-catenin的活化来介导高葡萄糖诱导的EMT。1,25(OH)2D3可能抑制糖尿病足细胞EMT，从而为其在DN的管理和预防方面提供新见解。34 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究结论结论本课题利用STZ诱导糖尿病小鼠模型发现：1、维生素D3能够明显降低糖尿病导致的小鼠血肌酐、蛋白尿及ACR水平的升高；显著缓解糖尿病小鼠肾脏损伤的病理形态学改变，与二甲双胍联合应用效果最佳。2、维生素D3可能通过上调VDR蛋白表达水平，进而上调E-cadherin和Nephrin的表达，下调-catenin的表达，从而达到保护肾脏的作用。3、1α,25(OH)2D3能够上调高糖导致的VDR蛋白水平下降，下调-catenin、Snail、Slug的表达，进而缓解高糖诱导的足细胞EMT。35 参考文献维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究参考文献[1]MichigamiT.[VitaminDmetabolismandaction].Clinicalcalcium.2007;17(10):1493-8.[2]VanBelleTL,GysemansC,MathieuC.VitaminDanddiabetes:theoddcouple.Trendsinendocrinologyandmetabolism:TEM.2013;24(11):561-8.[3]LipsP.VitaminDphysiology.Progressinbiophysicsandmolecularbiology.2006;92(1):4-8.[4]LoefflerI,WolfG.Epithelial-to-MesenchymalTransitioninDiabeticNephropathy:FactorFiction?Cells.2015;4(4):631-52.[5]KanwarYS,WadaJ,SunL,etal.Diabeticnephropathy:mechanismsofrenaldiseaseprogression.Experimentalbiologyandmedicine(Maywood,NJ).2008;233(1):4-11.[6]TharauxPL,HuberTB.HowIsProteinuricDiabeticNephropathyCausedbyDisturbedProteostasisandAutophagyinPodocytes?Diabetes.2016;65(3):539-41.[7]WidmannTJ,DahmannC.WinglesssignalingandthecontrolofcellshapeinDrosophilawingimaginaldiscs.Developmentalbiology.2009;334(1):161-73.[8]KimJJ,LiJJ,JungDS,etal.Differentialexpressionofnephrinaccordingtoglomerularsizeinearlydiabetickidneydisease.JournaloftheAmericanSocietyofNephrology:JASN.2007;18(8):2303-10.[9]TryggvasonK.Unravelingthemechanismsofglomerularultrafiltration:nephrin,akeycomponentoftheslitdiaphragm.JournaloftheAmericanSocietyofNephrology:JASN.1999;10(11):2440-5.[10]LiuY.Newinsightsintoepithelial-mesenchymaltransitioninkidneyfibrosis.JournaloftheAmericanSocietyofNephrology:JASN.2010;21(2):212-22.[11]LvZ,HuM,ZhenJ,etal.Rac1/PAK1signalingpromotesepithelial-mesenchymaltransitionofpodocytesinvitroviatriggeringbeta-catenintranscriptionalactivityunderhighglucoseconditions.Theinternationaljournalofbiochemistry&cellbiology.2013;45(2):255-64.[12]WangC,LiuX,KeZ,etal.MesangialmediumfromIgAnephropathypatients36 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综述维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究综述维生素D和上皮间质转化一些研究证实活性维生素D衍生物1α，25-二羟基维生素D3（1,25(OH)2D3）和上皮间质转化（EMT）之间的相互调节。因此，1,25(OH)2D3通过诱导编码细胞粘附的多种靶基因和负责上皮表型的极性蛋白质并通过抑制关键的EMT诱导物来抑制EMT。直接和间接调控机制都会调解这些效应。相反，某些主要EMT诱导剂通过抑制编码高亲和力维生素D受体介导1,25(OH)2D3效应的VDR基因的转录抑制1,25(OH)2D3作用。因此，1,25(OH)2D3信号的强度与EMT的诱导之间的平衡抵消了每种情况下的细胞表型。在这里，我们回顾了目前对1,25(OH)2D3和EMT之间相互作用所涉及的基因和机制的理解。1.维生素D系统哺乳动物维生素D的形式是激素原维生素D3（胆钙化醇），其从饮食中获得或主要是皮肤中的7-脱氢胆固醇通过紫外线B照射合成。维生素D3必须先后经过肝脏、肾脏的两次羟化才能转化为其活性形式1α，25-二羟基维生素D3（1,25(OH)2D3），这是最活跃的维生素D3代谢物[1-4]。1,25(OH)2D3是基因表达的主要调控子，通过与核受体超家族的维生素D受体（VDR）的转录因子结合发挥其作用。视黄醇X受体是同一家族成员的另一个VDR异源二聚体，其以配体依赖的方式调节基因表达。普遍认为，在没有1,25(OH)2D3异二聚体的情况下，与其靶基因（维生素D反应元件）的特异性序列结合，动员组蛋白脱乙酰基酶复合物的活性转录辅阻遏物，从而将染色质维持在转录抑制状态。1,25(OH)2D3诱导VDR的构象变化，导致辅阻遏物的释放和共激活因子和染色质重组体的结合。它们一起介导染色质开放并允许RNA聚合酶II转录机制和转录起始的进入[1,5-8]。1,25(OH)2D3是具有许多调节作用的多效激素。其经典作用调节钙和磷的动态平衡以及骨矿化[2,9]。1981年发现1,25(OH)2D3诱导骨髓白血病细胞分化和抑制黑素瘤细胞增殖，这一重大发现增加了研究者将1,25(OH)2D3作为抗癌剂的兴趣[10,44 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究综述11]。随后的观察表明，1,25(OH)2D3诱导分化和凋亡，并抑制不同来源的癌细胞和几种癌症动物模型中癌细胞的增殖，迁移，侵袭和血管生成[1,4,13-16]。然而，由于其治疗剂量引起的高钙血症效应，使癌症患者1,25(OH)2D3的应用受到限制，从而督促人们开发几种维持抗肿瘤特性但具有较少的血钙作用的类似物。目前，许多临床试验正在使用1,25(OH)2D3或其类似物，单独或与其他抗癌剂联合应用对抗多种肿瘤[1,3,4,12]。2.上皮至间质转化上皮间质转化（EMT）是上皮细胞转化为间充质细胞的过程。它发生在生理上的几个发育情况中如胚层形成和神经嵴迁移等。在成年人中，它在某些特定的病理条件下激活如伤口愈合、纤维化和癌症进展[13,14]。在EMT期间，上皮细胞失去细胞间和细胞外细胞基质连接，从顶尖–基底极性到前后极性的改变，重组其细胞骨架，并重新编码基因表达，其特征在于上皮细胞基因标志的下调和间充质细胞基因的激活。该过程产生可以降解细胞外基质的运动性个体细胞，从而形成迁移和侵袭性表型[14-17]。EMT是一种高度调节、可塑性和可逆过程。因此，在某些特定条件下，间充质细胞向上皮细胞转移（MET），使间充质细胞获得上皮细胞状态[18-21]。典型的EMT基因重组主要由关键转录因子编排，包括锌指类蛋白SNAIL1和SNAIL2，双锌指和同源结构域因子ZEB1和ZEB2以及基本螺旋-环-螺旋家族TWIST1和E47，都是熟知的EMT转录因子（EMT-TF）。它们是E-钙粘蛋白（E-cadherin）（由CDH1编码）的阻遏物，其是粘附连接的主要成分，并且是维持上皮状态所必需的。因此，认为E-cadherin下调是EMT的标志。除了建立EMT诱导剂，最近已经证明其他转录因子如FOXC2，Goosecoid，KLF8，TCF4（也称为E2-2），SIX1，HMGA2，Brachyury和PROX1可以诱导或调节EMT[14-17,20]。转录因子的表达和/或活动，如在几个信号转导通路起重要作用的转化生长因子（TGF-β）信号通过对细胞外的信号作出反应，诱导和控制EMT。每个转录因子对EMT的贡献取决于所涉及的细胞或组织类型以及启动EMT的信号通路。此外，EMT-TF通常表现出表达和功能合作的相互控制[14-16,18,19]。45 综述维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究3.1,25(OH)2D3抑制EMT3.1．1,25(OH)2D3诱导表达上皮标志物1,25(OH)2D3能够诱导几种正常细胞和癌细胞上皮分化。因此，它可以增加几乎所有类型细胞粘附结构成分的表达，这些结构对于获得和维持上皮表型是至关重要的。值得注意的是，我们发现在人类结肠癌细胞中1,25(OH)2D3的强促分化效应与关键粘附分子E-cadherin的表达增加有关。这伴随着-catenin从细胞核到与E-cadherin相互作用的细胞膜上粘附连接处的再分配，从而异常激活大多数结肠癌以及结肠致癌作用中的Wnt/-catenin信号通路，促使结肠癌发生[26]。在人类结肠癌细胞中，1,25(OH)2D3也诱导紧密连接闭锁元件蛋白表达，克拉丁蛋白-1，克拉丁蛋白-2，克拉丁蛋白-7，克拉丁蛋白-12，闭锁小带-（ZO-）1和ZO-2，桥粒芯胶黏蛋白网蛋白，焦点粘附成分整合素α3和桩蛋白，中间丝角蛋白-13的组成成分以及与肌动蛋白细胞骨架相关的蛋白质，如长春新碱，丝氨酸A和埃兹蛋白[22-28]。有趣的是，1,25(OH)2D3下调钙粘蛋白-17[29]，其诱导细胞增殖，在结肠癌细胞中具有抗原和前体作用[30]。min/+用1,25(OH)2D3或类似物治疗小鼠Apc结肠癌模型能够减少息肉数量和负荷，同时增加E-cadherin水平，降低小肠和结肠中-catenin核定位和-catenin靶基min/+因Tcf1、Myc和Cd44的表达[31]。相反，Vdr缺乏的Apc小鼠肿瘤大小和病变中Wnt/-catenin通路的活性均增加[32,33]。用维生素D3或1,25(OH)2D3类似物治疗时，在其他小鼠和大鼠结肠发育不良、癌症模型和结肠炎相关瘤中，观察到类似的的结果[34-36]。此外，1,25(OH)2D3增加并恢复了硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型结肠上皮中Zo-1，闭锁蛋白和克拉丁蛋白-1的正常水平，保护小鼠免受肠粘膜损伤和上皮屏障破坏[23]。相反，在这个模型中Vdr缺乏会增强-/-DSS效应，因为Vdr小鼠用DSS处理后，结肠上皮中的紧密连接被严重破坏并打开，并发展为比野生型动物更严重的结肠炎[29]。这些数据表明1,25(OH)2D3通过维持紧密连接的稳定性和结构完整性有助于体内平衡和结肠上皮的愈合能力[37]。值得注意的是，随机，双盲，安慰剂对照临床试验显示，每日800IU维生素D3治疗结直肠腺瘤患者6个月，可增加正常出现的直肠粘膜中E-cadherin表达[38,39]。46 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究综述3.2．1,25(OH)2D3抑制EMT-TFs的表达有研究报道1,25(OH)2D3调节诱导EMT的某些转录因子的表达以及影响EMT诱导物上皮表型的几种调节剂的表达。1,25(OH)2D3通过转录间接机制增加了假定的肿瘤抑制性的组合蛋白H3赖氨酸27脱甲基酶的Jumonji结构域3（JMJD3）的表达。在人类结肠癌细胞中，1,25(OH)2D3促进JMJD3介导的高粘性上皮表型的诱导，抗增殖作用，基因调控作用和Wnt/-catenin通路的拮抗作用[40]，此外，JMJD3消耗可以上调SNAIL1，ZEB1和ZEB2，增加间充质标志物纤连蛋白和LEF1的表达，并下调上皮蛋白E-cadherin，克拉丁蛋白-1，克拉丁蛋白-7。因此，JMJD3和SNAIL1RNA表达与人类结肠癌患者的样本相反[40]。由JMJD3消耗诱导产生ZEB1与两种靶向ZEB1RNA的microRNAs，miR-200b和miR-200c的下调相关，抑制ZEB1蛋白表达[41]。1,25(OH)2D3直接诱导由CST5基因编码的组织蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶抑制剂D的表达。VDR与1,25(OH)2D3诱导的CST5启动子的结合伴随着NCOR2抑制因子的释放和组蛋白H4乙酰化的增加[42]。半胱氨酸蛋白酶抑制剂D介导1,25(OH)2D3在人结肠癌细胞中抗增殖和促分化作用。此外，在培养的人结肠癌细胞中，异位半胱氨酸蛋白酶抑制剂D表达抑制细胞增殖，迁移，非贴附性生长和Wnt/β-catenin通路，减少异种移植小鼠的肿瘤发展[42]。半胱氨酸蛋白酶抑制剂D抑制SNAIL1，SNAIL2，ZEB1和ZEB2，而诱导E-cadherin和其他粘附蛋白如闭锁蛋白和p120-链蛋白的表达。因此，在人结肠直肠癌中半胱氨酸蛋白酶抑制剂D和E-cadherin的表达直接相关，而半胱氨酸蛋白酶抑制剂D的缺失与微弱的肿瘤分化有关[42]。值得注意的是，比较半胱氨酸蛋白酶抑制剂D-过表达和模拟转染的人结肠癌细胞的转录组学和蛋白质组研究表明，“细胞粘附，细胞连接和细胞骨架”是包括更多的半胱氨酸蛋白酶抑制剂D调节的基因和蛋白质的基因类别之一[43]。Swami等人表明乳腺癌细胞中1,25(OH)2D3使半胱氨酸蛋白酶抑制剂D抑制组织蛋白酶L的表达下调[44]，而张等人描述了组织蛋白酶L的沉默抑制细胞侵袭和迁移，肌动蛋白细胞骨架重塑，以及乳腺和肺癌细胞中SNAIL1表达的增加与TGF-β促进的EMT相关[45]。最近，有研究阐述了1,25(OH)2D3对几种EMT-TFs表达的影响。1,25(OH)2D3抑制非小细胞肺癌细胞中SNAIL1和ZEB1的表达，伴随着E-cadherin表达的增加，47 综述维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究波形蛋白（vimentin）下调，维持上皮形态和抑制细胞迁移[46]。低血钙1,25(OH)2D3类似物MART-10通过下调SNAIL1和SNAIL2来抑制乳腺癌和胰腺癌细胞EMT、细胞迁移和侵袭。此外，MART-10抑制乳腺癌细胞中TWIST1的表达[47,48]。Findlay等人报道1,25(OH)2D3抑制人结肠癌细胞中的SNAIL1和SNAIL2[49]。Kaler等人发现结肠癌细胞刺激肿瘤相关巨噬细胞分泌白介素-（IL）1β，反过来促进Wnt/β-catenin信号，稳定SNAIL1蛋白，拮抗结肠癌细胞中TRAIL诱导的凋亡[50]。他们还发现1,25(OH)2D3通过抑制巨噬细胞释放IL-1β，下调结肠癌细胞中SNAIL1蛋白的表达[50]。同样，Zhang等表示乳腺癌细胞中的肿瘤相关巨噬细胞诱导EMT，癌细胞中VDR高表达消除巨噬细胞促进E-cadherin损失，α-SMA上调，细胞迁移和侵袭增加[51]。此外，1,25(OH)2D3减弱TGF-β1对细胞运动的增强作用和人支气管上皮细胞中SNAIL1，N-cadherin和vimentin的表达[41]，并抑制TGF-β1刺激的EMT在大鼠肺上皮细胞中[52]。基质金属蛋白酶（MMPs）是一种锌依赖性蛋白酶家族，它会降解细胞外基质和基底膜的成分。MMPs受特异性抑制剂的调节：金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）。MMP活性增加通常与EMT相关，并赋予癌细胞侵袭性。与其对EMT的抑制作用一致，1,25(OH)2D3下调前列腺，乳腺，胰腺和鳞状细胞中MMP2，MMP9和MMP13的分泌，增加前列腺和乳腺癌细胞中TIMP1和TIMP2的活性[47,48,53-55]。此外，1,25(OH)2D3降低了人支气管上皮细胞中TGF-β1诱导的MMP2和MMP9的增加[56]。通过这些机制，1,25(OH)2D3抑制癌细胞降解细胞外基质并侵入周围组织的能力，从而可以减少肿瘤细胞转移潜能。最近的研究已经建立起了EMT诱导和上皮细胞获得干细胞的分子和功能性状之间联系。由于干细胞可以自我更新和分化，这些干细胞相关性质赋予癌细胞肿瘤起始能力，这可能对传播期间的癌细胞存活和解剖学上远端的转移灶癌细胞的建立至关重要[15-21]。有趣的是，Pervin等人发现操纵VDR水平调节关键EMT相关蛋白的表达，并决定了乳腺癌细胞的干细胞特征。因此，这些细胞中VDR的过表达上调E-cadherin，下调SNAIL1，TWIST1和MMP9，并降低细胞形成悬浮球的能力。相反，VDR沉默有相反的效果[57]。48 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究综述3.3．1,25(OH)2D3抑制纤维化除了癌症进展之外，其他病理过程如器官纤维化可以再次激活EMT。该过程发生在创伤或炎性损伤后的某些上皮组织中，其特征在于细胞外基质过度沉积和纤维结缔组织增加。在这方面，EMT是修复程序的一部分并且起源于成纤维细胞和其它组织再生的相关细胞。然而，疾病是发展的，器官主要由活化的成纤维细胞和细胞外基质组成，最终可能导致器官衰竭。EMT诱导因子TGF-β也参与纤维化过程[13,19,58]。刘团队的几项研究表明，维生素D化合物通过抑制肾小管上皮细胞EMT减轻肾间质纤维化。这些化合物降低胶原和纤连蛋白沉积，下调SNAIL1，α-Sma，β-catenin，TGF-β1及其I型受体的表达，减少β-catenin核定位，并保持发展成间质性纤维化小鼠梗阻性肾病模型肾脏中Vdr和E-cadherin水平。此外，用维生素D化合物或过表达人近端肾小管上皮细胞VDR可以消除由TGF-β1促进的EMT[59-61]。有趣的是，将1,25(OH)2D3类似物帕立骨化醇与群多普利联用，一种用作慢性肾脏疾病标准疗法的血管紧张素转换酶抑制剂，导致阻塞性肾病小鼠模型中肾纤维化的增加减少[62]。另外，Nolan等表明帕立骨化醇在常见的与慢性肾脏疾病有关的缺氧条件下抑制TGF-β1诱导的肾小管EMT[63]。1,25(OH)2D3对肝纤维化中也有缓解效果。肝星状细胞在肝纤维化中起着中心作用，如在损伤诱导的活化中它们增殖并分泌许多细胞外基质组分。维生素D化合物减少细胞外基质沉积并改善大鼠和小鼠模型中的肝纤维化[64,65]。此外，1,25(OH)2D3抑制细胞增殖并下调肝星状细胞中的细胞周期蛋白D1和α1I型胶原表达[64]。Potter等人报道了1,25(OH)2D3下调α1型胶原蛋白由VDR结合到人COL1A1基因启动子的近端Sp1位点和远端维生素D应答元件介导[66]。值得注意的是，Ding等的研究显示在肝星状细胞中配体激活的VDR拮抗TGF-β1依赖的肝纤维化基因的转录[65]。TGF-β1在基因组中改变配体活化的VDR结合位点，促进VDR与抗纤维化基因调节区的SMAD3位点结合，其降低SMAD3占据这些位点，导致基因的转录沉默和抑制纤维化[65]。因此，VDR配体通过调节TGF-β1的组织反应来抑制纤维化。维生素D类似物在肾纤维化中抑制TGF-β途径的另一种机制：马沙骨化醇通过将VDR和SMAD3磷酸酶PPM1A之间的复合物聚集到TGFB1启动子来阻断TGF-β1表达的自身诱导，引起SMAD3去磷酸化并从启动子释放，从而减弱TGFB1基因表达[67]。大量证据表明，维生素D化合物通过抑制EMT和/49 综述维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究或TGF-β促纤维化作用来保护不同组织的器官纤维化。4.转录因子SNAIL1和SNAIL2抑制VDR基因表达并抑制1,25(OH)2D3作用细胞对1,25(OH)2D3的反应主要依赖于VDR表达水平。VDR蛋白表达在几乎所有正常人类细胞类型和组织中以及几种起源的癌细胞系和肿瘤中[7,68]。值得注意的是，升高的VDR表达与高度肿瘤分化，结节转移消失以及低分化的结肠癌预后良好有关[69-71]，淋巴结转移的晚期发展，以及延长乳腺癌无病存活期[51,72]，并且改善了前列腺和非小细胞肺癌和黑素瘤中的整体存活[73-75]。然而，某些癌细胞系不表达VDR并且对1,25(OH)2D3无反应。因此，在一部分黑素瘤和结肠癌，乳腺癌，肺癌和卵巢肿瘤中观察到VDR下调[51,70,73,76-78]，这可能妨害用维生素D、1,25(OH)2D3或其类似物治疗的反应。有研究发现SNAIL1通过与人类VDR基因启动子中的三个E盒结合抑制VDR的表达。此外，SNAIL1可以降低VDRRNA的半衰期[79]。结果，人结肠癌细胞中SNAIL1过度表达阻断E-cadherin表达的诱导，1,25(OH)2D3促进上皮表型的获得。SNAIL1还消除1,25(OH)2D3对细胞增殖、迁移的抑制作用和1,25(OH)2D3类似物EB1089在异种移植小鼠中的抗肿瘤作用[79,80]。除了SNAIL1，其家族成员SNAIL2在人结肠癌细胞中，通过人类VDR基因启动子相同的E盒抑制VDR基因表达，通过1,25(OH)2D3诱导上皮表型。此外，SNAIL1和SNAIL2对VDR基因启动子有协同抑制作用[81]。值得注意的是，在76%的结肠肿瘤中SNAIL1和/或SNAIL2RNA均上调，并与VDRRNA表达减少显著相关。结肠肿瘤中SNAIL1RNA过表达减少了与肿瘤相邻的正常组织中的VDRRNA表达，这表明SNAIL1表达结肠癌细胞分泌信号，调节相邻细胞中VDR表达[82]。SNAIL因子抑制VDR基因不排除结肠癌。已经表明，SNAIL1和SNAIL2下调VDR基因表达，证明1,25(OH)2D3在人骨肉瘤和乳腺癌细胞中的抗肿瘤作用[83,84]。人VDR基因启动子的两个近端E盒在大鼠和小鼠中是不表达的，而最远端的盒仅部分表达，具有一个碱基取代。Bai等发现SNAIL1仅结合到大鼠Vdr启动子的最近端的E盒。因此，在这些组织中观察到SNAIL1和Vdr水平之间的反相关[85]。deFrutos等人表明持续激活的SNAIL1在转基因小鼠中抑制成骨细胞中Vdr50 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究综述基因表达。这种下调阻断了Vdr介导的破骨细胞分化因子Rankl的诱导，抑制破骨细胞发生的诱饵Rankl受体的骨保护素。因此，SNAIL1介导的成骨细胞中Vdr基因下调由于破骨细胞形成受损，减少了破骨细胞群体。在肾小管上皮细胞中促炎细胞因子TNFSF12促进EMT期间，VDR也发生下调，促进了E-cadherin的损失[86]。类似地，由TNF-α介导的VDR抑制使乳腺癌细胞对TGF-β1诱导的EMT敏感。值得注意的是，1,25(OH)2D3拮抗TNF-α诱导的VDR损失，抑制TGF-β1诱导的乳腺癌细胞迁移能力的增加，并抑制小鼠原位乳腺癌模型中的肺转移[51]。5.结论细胞结局和表型受细胞外信号的严格调控。1,25(OH)2D3和EMT-TFs在上皮细胞表型中具有相反的作用并相互拮抗。1,25(OH)2D3诱导上皮分化，同时抑制几种EMT诱导物的表达。相反，在SNAIL1和SNAIL2与VDR基因抑制和1,25(OH)2D3对上皮分化的阻断作用相关联的情况下，上皮细胞中关键EMT-TFs的表达促进间质表型的获得。因此，双负反馈回路在1,25(OH)2D3和EMT诱导剂之间运行，这可能有助于由细胞外信号指示表型的完全获得。该循环可以首先放大信号，并且一旦处理完成就能稳定细胞结局。因此，1,25(OH)2D3/VDR和SNAIL转录因子家族之间的平衡决定了细胞结局，其不平衡可能解释了EMT过程的可逆性。值得注意的是，上皮和间质表型之间的转变由EMT-TFs和某些microRNAs，如ZEB/miR-200和SNAIL1/miR-34之间相似的双负反馈环路调控[18,87-89]。EMT对癌症进展和器官纤维化的影响以及1,25(OH)2D3对EMT的抑制作用，已经开启了使用VDR激动剂治疗这些疾病的可能性。然而，经常与疾病进展阶段相关的几种类型的癌症中发现VDR表达的下调限制了维生素D复合物对高危人群和肿瘤进展早期阶段患者治疗的适用性。参考文献[1]DeebKK,TrumpDL,JohnsonCS.VitaminDsignallingpathwaysincancer:potentialforanticancertherapeutics.NaturereviewsCancer.2007;7(9):684-700.[2]CampbellFC,XuH,El-TananiM,etal.TheyinandyangofvitaminDreceptor(VDR)signalinginneoplasticprogression:operationalnetworksand51 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研究生期间科研经历及发表的文章维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究研究生期间科研经历及发表的文章参与的科研项目及经历：1.国家自然科学基金专项基金项目，名称：万物生长靠太阳：维生素D与健康（81220001）。2.国家自然科学基金专项基金项目，名称：维生素D在糖尿病发生和发展中的作用（81372981）。3.中国营养学会营养科研基金-帝斯曼专项科研基金项目，名称：维生素D补充对维生素D缺乏的老年Ⅱ型糖尿病患者体内炎症因子影响的研究。4.苏州大学大学生课外学术科研基金项目，名称：高剂量维生素D对糖尿病小鼠血脂异常的改善作用（KY2015721B），项目负责人。5.苏州大学大学生课外学术科研基金项目，名称：维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症的保护作用（KY2016839B），项目负责人。发表的文章：Shu-jieMa,Jian-rongWang,Jin-jiangHeetal.ProtectiveEffectof1,25(OH)2D3onGlutamate-InducedCytotoxicityinHT-22Cell.第一作者，中国科技论文在线60 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究中英缩略语对照表中英缩略语对照表英文缩写英文全称中文全称DMdiabetesMellitus糖尿病DNdiabeticNephropathy糖尿病肾病ESRDendstagerenaldisease终末期肾病FBGfastingBloodGlucose空腹血糖STZstreptozotocin链脲佐菌素VD3vitaminD3维生素D3VDRvitaminDreceptor维生素D受体FBSfetalbovineserum胎牛血清PBSphosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液1α,25(OH)2D31α,25dihydroxyvitaminD活性维生素Depithelial-mesenchymalEMT上皮间质转换transitionGBMglomerularbasementmembrane肾小球基底膜ECMextracellularmatrix细胞外基质SDslitdiaphragm裂孔隔膜CRFchronicrenalfailure慢性肾衰61 致谢维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究致谢时光荏苒，转眼间，三年的研究生学习生活就要结束了，而入学仿佛还是昨天的事情，初来乍到时的场景犹历历在目。回忆起这三年的点点滴滴，感慨不已，欣慰之余而又庆幸无比。值得欣慰的是，我这三年的时间学到了许多受益无穷的东西。庆幸的是我来到了一个很好的环境，遇到了很多的良师益友，给我了很多的指引和帮助，使我能够顺利地完成学业。值此毕业论文完成之时，学生时代即将结束之际，向曾经在学习、生活等方面给予我帮助、关心和支持的他们表示最衷心的感谢。还记得第一次来苏大的场景。那是第一次来到这个“上有天堂、下有苏杭”之称的苏州。三月下旬，北方还是寒冷的冬天，一片光秃秃。而苏州却是万物复苏之际，一条条的河流，沿岸两侧散发着春意、长满嫩芽的摇曳着柳条的柳树，一座座的桥，一条条干净、整洁、行驶有序的马路。当时在想，怎么会有一个如此美丽、魅力的城市，满眼的绿色，满心的欢喜，还有复试的忐忑。在这宝贵的三年的研究生生活中，首先我要感谢我的导师——张增利教授。“授人以鱼，不如授之以渔”，张老师正是这样以言传身教来教导着我们。现在的我能站在苏大的校园内，享受着学术氛围的熏陶，感受着“养天地正气，法古今完人”校训的精髓，完全是张老师帮助与努力的结果。为了我能成为苏大的一名学生，张老师费了很大的努力，才让我有继续深造的机会。还记得张老师经常说的话：学生只要想要上学、学习，我都一定尽自己最大的努力去满足学生学习的心愿。最深的谢意献给我的导师张增利教授。我知道，我所掌握的言语并不能确切地表达我对张老师的感激之情。是张老师给了我一片广阔的天空，让我有了可以展翅翱翔的空间。张老师在学术上给了我方向，生活中给了我温暖，行动上给了我勇气，处世上给了我榜样。在我失败的时候，张老师给我打气、鼓励我。张老师无论在什么时候都给了我最大的信任，用他的言传身教，使我学到了许多书本上没有的东西，这也是我获得的最宝贵的财富。同时，感谢我的另一位导师，也是我的师母——李冰燕研究员。对于李老师62 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究致谢有太多太多的感谢。课题设计中，帮我指出其中的缺点和不足，明确重点部分，整理梳理整个实验设计思路。实验中帮我解决、善后遇到的各种问题，第一时间提出宝贵的意见，帮我联系解读病理切片结果的专业老师。渊博的专业知识、严谨的治学态度、勇于创新的思想、丰富的科研经验以及平易近人的作风是我学习、进步的标榜。在此特别感谢两位导师的辛勤培养和谆谆教导，以及在学习和生活中无微不至的关怀，你们教会我的所有，都深深地感染了我，将使我终生受益，是我学习的楷模，激励我在今后的人生中自强不息、勇攀高峰，将会是我今后人生道路中一笔巨大的无限财富。感谢温柔善良、善解人意的博士后蒋菲老师，在这里叫你一声师姐。与你的第一次联系是通过电话，真正见面是接你去我的宿舍。虽然和你相处只有一年的时间，但是在这一年里，在你的指导和帮助下，使我顺利地解决了实验中遇到的问题；和你一起做实验很开心，同时能学到很多东西；生活中的小困惑、忧伤，在你的开导下，也会一消而散；和你的每次谈心都很愉快，就像是和自家大姐姐说话，很轻松、也很放松，感觉有说不完的话。感谢与你在一起的时光，值得永远回忆。在繁忙的实验生活中别忘了抽个时间，让自己轻松一睛，永远坚持一颗年轻快乐的心。感谢郭建峰师兄在考研道路上给予的指导和帮助。在那个时候多亏有了师兄的考研宝典以及提供的考研信息，我才能有幸在考研大军的道路上坚持下来，最终一路来到苏州大学，成为苏大的一份子。更幸运的是，在你的引领下，遇到了张老师和李老师。同时感谢师兄在本课题前期的工作中做出很大的贡献，并且对本实验的造模剂量的选用都给予了重要的指导和建议。最怀念的还是师兄烧烤的手艺，课题组无人能及，获得经过一轮一轮的师兄师姐师弟师妹们认证的可以堪称是“专业烧烤20年”的称号。感谢我的师姐齐娜娜、刘利芝。学霸的娜姐，在我进实验室的第一天就教我小鼠的肌肉注射、腹腔注射以及皮下注射，怎么给小鼠剪毛，接下来是小鼠的解剖，各个脏器所在的位置，剥离组织的习惯性顺序以及注意要点，还有让人一时难以接受的取脑和眼球取血，此时觉得身为小鼠真是可怜，但是想到它们能够奉献自己的一生为科学事业献身，顿时觉得无比高尚。率性、干脆利落的利芝姐，第一次看你做细胞实验时，心里默默觉得这个师姐好厉害，各种液体的稀释，各63 致谢维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究种试剂比例，以及各种试剂、耗材存放的位置，都一一随口说来。你教我怎么做细胞实验、蛋白定量，怎么报账，怎么在材料系统买试剂、耗材，怎么和试剂商沟通，跟着你学会了很多很多的以前完全不了解的事情和东西。还和你逛了苏州园林卡上的留园、拙政园、虎丘、狮子林、耦园、动物园；第一次去宝带桥的惶恐和不安，在回去的路上，尾随着一个男生走过下午五六点建筑工地所在的道路；晚上的金鸡湖很美丽，别有一番诗韵，初夏的晚风有点凉，咱俩不得不早早结束行程。现在往回看的话，我们俩一起出去嗨的时光比较多。感谢我的同门潘国涛、郭飞飞和侯永凤。在你们的帮助下，我才能顺利的处理动物的解剖。潘国涛继承了郭建峰师兄的眼球取血，每次我们课题组的动物实验都由他负责眼球取血这部分。飞飞“宝宝”解剖器官组织的手法很娴熟，尤其他对数学、化学问题特别在行，遇到这些问题，问飞飞就可以了，保证给你讲解的特别明白，让你一听就懂，茅塞顿开。机灵古怪的“猴”同学，在一起的八年时光就要结束了。感觉本科还是昨天的事，谁曾想已经过去五年了，连三年的研究生生涯也要接近尾声。感谢这三年有你的陪伴，让我的研究生生活不再孤单、单调。每次遇到实验中的问题、生活中的不开心，你都会帮我解决，用你自己的方式开导我、安慰我，让我不再钻牛角尖，用全新的心情迎接下一个未知的到来。感谢“小天使”徐淼师妹、纪敏涛师弟。在我课题实验的后期，多亏你俩的全力帮助，我才能抽出较多的时间去准备为了工作的考试，让我没有后顾之忧。你俩做实验的节奏很好，理解能力以及学习能力都很棒。尤其是你们做实验时的认真、仔细，让我很是佩服。再次感谢你俩为我论文的完成做出的贡献！感谢本实验室的杨勇师兄，王萍师姐，张孟希，李金成、李晓印师弟和沈燕、郭轶、叶梦璇、李孟阳师妹，感谢和我一起做实验的王浩、刘心瑒、王文杰等本科生，感谢他们对我实验的帮助，感谢他们创造的欢乐和谐环境，感谢他们带来阳光灿烂般的春天气息。感谢医学部公共卫生学院实验平台中心的王爱清老师、宁萍老师、蔺瑶老师、万建美老师等对实验测试提供的帮助；感谢劳环卫教研室的肖卫老师，田海林老师，陶莎莎老师等对本课题设计提出的宝贵意见；感谢SPF级实验动物房的所有老师，感谢院办公室的所有老师，感谢他们的支持和帮助。感谢我的爸爸妈妈，感谢我的兄弟姐妹，感谢深爱我的朋友，我知道如果没64 维生素D对糖尿病小鼠肾脏并发症保护作用的初步研究致谢有他们的持续的、无条件的理解、支持和包容，我不能毫无忧虑的远赴他乡求学，继续深造，也就没有我的今天，我也知道我永远都无法完全回报他们的爱，所以我希望顺利地完成学业，争取更大的成功，给他们一点欣慰，为他们打造一片温馨而和谐的属于我们大家庭的天地。海洋可以阻隔彼此，却阻隔不了彼此的思念；距离可以拉开你我，却拉不开VD课题组真挚的情谊；时间可以淡忘过去，却忘不了朝夕相处的美好情谊，忘不了利芝姐、郭轶师妹的厨艺以及大家一起吃火锅、包饺子、烧烤的美好时光。我们做不到铭记历史，那就尽自己最大的努力做到铭记过去的每一个美好。65 苏州大学硕士学位论文（钟對立）ｊＩ苏州大学研究生院统一印制＾；－－；