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Ｉ独创性声明本人吉明所呈充的学位论文是本人在导师指章下适任的現巧工巧及取得的爾的化方巧‘论文中不包吿其他汚玻果ｔ提我所知，除了支中特别加劫标注和致谢人己经发表或損肯起的研巧成果，也不包含为获答东化师茜大学或其他敦育化巧…的学位或证书而使用巧的枯料。与我同工作骑同志对本研究所校的任巧巧献艳己在论文中巧了明靖的说巧并表示谢意。ｒ＞心反多．卷亨日期：：学位论文作蓄签名—ｉＩｉ１ＩＩＩｊＪ学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、怯居学位论文的视定，化构送交学化化文的复印件和控即：东化师苗大学有权保當并向国素有关部口或韩也文技查闽和借賴。本人授枚东北巧范大学可扭将学位巧文的全部或藍，允许用彭印、厄、缩巧或其它星制手段保存分内容编入有关数据库遥巧栓索，可臥采ｉ编学位论文。／书）（保密的学位讫丈在解巧追适用本沒权：建零指导教师签名—学位论文作者签名：Ｉｎｉ．Ｌ：（ｌＬ—日期：ｗ％日期＼学位论文作者毕业后去向：巧话：工作卓位：破編：—逼讯化址：开－＇ 学校代码：10200研究生学号：2013102119分类号：Q3密级：无硕士学位论文野生大豆抗胞囊线虫病相关SNP标记的开发及其辅助选择DevelopmentandassistedselectionofSNPmarkersforwildsoybeanresistancetosoybeancystnematode作者：娄雪指导教师：刘宝教授董英山研究员一级学科：生物学二级学科：遗传学研究方向：植物分子遗传学学位类型：学术硕士东北师范大学学位评定委员会2016年5月 摘要大豆原产于我国，是主要经济作物之一。而大豆胞囊线虫（Soybeancystnematode，SCN）病是严重降低产量的病虫害之一，因此培育抗病新品种是最为有效的防治手段。野生大豆是栽培大豆的近缘野生种，在长期的自然选择作用下，使野生大豆在不同的环境条件下都能表现出很强的适应能力，如抗逆性强，蛋白质丰富等特点，可为栽培大豆培育新型抗病品种提供重要的优异基因。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNP）作为新型的DNA分子标记能高效的利用野生大豆基因资源，提高优异基因选择效率，加快抗病种质的选育，为育种提供有效的辅助选择手段。本论文基于前期野生大豆抗胞囊线虫病QTLs定位研究结果，根据6个抗性QTLs信息，以野生大豆为实验材料，开发SNP分子标记并分析这些标记与抗性的关系，评价其在杂交后代种质筛选过程中的辅助选择效率。主要研究结果如下：1.开发了6个基于PCR的SNP标记。根据已有SNP信息中部分碱基序列在Phytomozev10.3数据库中获得目的序列，以此为模板设计等位基因PCR反应的特异引物，筛选出6组扩增效果较为理想的特异引物，6组特异引物的错配碱，基引入位置均在3末端的2，3或4位置，碱基搭配遵循强弱或强中搭配的原则。PCR产物大小200-400bp，通过1%琼脂糖凝胶电泳即可检测SNP位点的等位基因。2.评价了SNP标记的准确性。针对每个SNP位点设计测序引物，通过PCR产物直接测序方法检测供试野生大豆SNP位点基因型。将测序方法获得的结果与利用SNP标记鉴定的结果进行一致性比较，评价SNP标记的准确性，其中5组特异引物（IP1-1，IP2-1，IP5-1，G1-1，AVE3）检测结果与测序结果一致，表明开发的这5个SNP标记是准确的。3.明确了SNP标记与抗性的关系。利用开发的5个SNP分子标记鉴定了51份野生大豆种质的基因型，结合供试种质的抗病性，评价了SNP标记与抗性的关系。结果表明分子标记IP1-1和IP2-1与SCN抗性显著相关联，基因型IP1-1A和IP2-1A与抗病相关联，IP1-1T和IP2-1G与感病相关联；IP5-1、G1-1和AVE3标记与SCN抗性关联不显著。4.评价了SNP标记的辅助选择效率。应用SCN抗性相关联的SNP标记IP1-1和IP2-1鉴定了来自杂交组合绥农14/ZYD03685的33份F2植株的基因型，结合供试植株的抗病性，评价了上述2个SNP标记的辅助选择效率。发现2个分子I 标记的筛选效率都超过65%，其中引物IP1-1F1-2对大豆SCN感病资源的筛选效率可达95%，引物IP2-1R1-2对大豆SCN感病资源的筛选效率可达100%，说明开发的标记可以用于大豆抗SCN育种中抗病或感病后代材料的筛选。关键词：大豆胞囊线虫病；野生大豆；SNP分子标记；分子标记辅助选择II AbstractSoybeanisoneofthemaineconomiccrops.Soybeancystnematode(SCN)isadamagingpathogenofsoybeanthatlimitssoybeanproductionworldwide.PlantingresistantvarietiesisconsideredthemosteffectivemeansagainstSCN.Inthelong-termroleofnaturalselection,wildsoybeansunderdifferentenvironmentalconditionsshowastrongabilitiestoadapt,suchashighresistancetobioticandhightolerancetoabiotic,abundantprotein,etc,andprovideadditionalgenesforresistantvarietiesdevelopment.Singlenucleotidepolymorphisms(SNP),asthethirdgenerationofDNAmolecularmarkers,canefficientlyselectwildsoybeangeneticresources,provideanefficienttechniqueofmolecularmarker-assistedselection,andacceleratebreedingprogressinresistantvarietiesdevelopment.QTLsmappingofwildsoybeanresistancetosoybeancystnematodehavebeenconductingbyspecificlengthamplifiedfragmentsequencing,andseveralQTLlociwereidentified.Inthisstudy,wedeveloped6SNPmarkersbasingoninformationofQTLlociandevaluatedtheiraccuracy,analysedtheirassociationwithresistance,andinvestigatedtheireffiencyinmarker-assistedselection.Theresultswereasthefollowing:1.SixSNPmarkersweredeveloped.WesearchedforsequencedatabaseagainstthesequenceincludingtargetSNPlocusinPhytomozev10.3.,anddesignedallelespecificPCRprimersfortargetSNPlocus.Wesuccessfullygot6setsofspecific,primerswiththeirmismatchpositionsinthe2,3or4positionattheendof3extremity,andthebasesfollowedtheprincipleofweakorstronginthematch.SizerangeofPCRproductsforthesixSNPmarkerswas200-400bp,SNPallelescouldbeidentifiedbyagarosegelelectrophoresis.2.AccuracyofSNPmarkerswasevaluated.WeemployedSNPmarkertoidentifyeachSNPallele,meanwhilewedesignedsequencingprimes,andidentifiedSNPsallelebysequencingPCRproducts.WeinvestigatedtheirconsistencyforeachSNPlocustoevaluatetheaccuracyofeachSNPmarker.Theresultsoffivegroupsspecificprimerswereinaccordancewiththesequencingresults,indicatingtheiraccuracyinSNPgenotyping.3.AssociationofSNPmarkerswithSCNresistancewereanalysed.Wegenotyped51wildsoybeanaccessionsusingfiveSNPmarkers,andevaluatedtherelationshipbetweenSCNresistanceandSNPmarkers.WefoundthattwoSNPIII markersofIP1-1andIP2-1wereassociatedwithSCNresistance,andtheotherthreeofIP5-1,G1-1,andAVE3werenot.4.EfficiencyofSNPmarkersinmarker-assistedselectionwasevaluated.Thirty-threeF2plantsfromthecrossofSuinong14/ZYD03685wereusedforefficiencyevaluationinmarker-assistedselectionoftwoSNPmarkers(IP1-1andIP2-1)associatedwithSCNresistance.WefoundthattheefficiencyoftwoSNPmarkersinmarker-assistedselectionwereover65%.SothetwoSNPmarkerswehavegotcouldbeusedtoscreenbreedinglinesonalargescaleratherthanphenotypingtheselines,becausethatgenotypingusingSNPmarkerisfasterandneedlesslaborcomparedwithSCNresistancebioassay.Keywords:Soybeancystnematode;Wildsoybean;SNPmarker;Marker-assistedselection.IV 目录摘要.......................................................................................................................IAbstract.......................................................................................................................III目录......................................................................................................................V引言................................................................................................................................11.1大豆胞囊线虫病概述.......................................................................................11.1.1大豆胞囊线虫病危害及分布.................................................................11.1.2大豆胞囊线虫病防治.............................................................................11.2野生大豆资源是拓宽抗病品种遗传基础的重要资源...................................11.2.1野生大豆资源价值.................................................................................11.2.2野生大豆在拓宽大豆品种遗传基础的研究进展................................21.2.3野生大豆在拓宽抗胞囊线虫病品种遗传基础的利用前景................21.3SNP分子标记在育种中的重要作用..............................................................31.3.1单核苷酸多态性（SNP）.....................................................................31.3.2SNP的特点............................................................................................41.3.3SNP分子标记在作物育种上的应用及前景........................................41.4本研究的内容、目的和意义...........................................................................51.4.1研究内容.................................................................................................51.4.2研究目的和意义....................................................................................5材料与方法...................................................................................................................62.1实验材料..........................................................................................................62.1.1野生大豆材料.........................................................................................62.2主要试剂...........................................................................................................82.2.1主要试剂................................................................................................82.3实验方法...........................................................................................................92.3.1DNA提取...............................................................................................92.3.2DNA质量检测.......................................................................................92.3.3目的序列的获得..................................................................................102.3.4SNP分子标记开发..............................................................................102.3.5提高PCR特异性条件........................................................................122.3.6PCR反应体系及产物检测..................................................................122.3.7SNP分子标记准确性评价..................................................................143.3.8SNP分子标记关联性分析..................................................................152.3.9SNP分子标记利用效率评价..............................................................15结果与分析.................................................................................................................163.1野生大豆基因组DNA的提取......................................................................163.2SNP分子标记开发........................................................................................173.2.1特异引物筛选......................................................................................173.2.2退火温度筛选......................................................................................203.3SNP标记的准确性评价................................................................................22V 3.3.1IP1-1分子标记准确性验证.................................................................223.3.2IP2-1标记的准确性评价.....................................................................243.3.3IP5-1标记的准确性评价.....................................................................263.3.4G1-1标记的准确性评价.....................................................................283.3.5AVE3标记的准确性评价....................................................................303.3.6AVE1标记的准确性评价....................................................................323.4SNP标记与SCN抗性的关联性分析..........................................................323.4.1IP1-1标记与SCN抗性的关联性.......................................................333.4.2IP2-1分子标记关联性分析.................................................................343.4.3IP5-1分子标记关联性分析.................................................................343.4.4G1-1分子标记关联性分析.................................................................353.4.5AVE3分子标记关联性分析................................................................363.5SNP标记辅助抗性选择的有效性评价........................................................373.5.1IP1-1标记辅助抗性选择的有效性评价.............................................373.5.2IP2-1标记辅助抗性选择的有效性评价.............................................38讨论.....................................................................................................................394.1等位基因特异PCR优化..............................................................................394.2特异引物中错配碱基类型与位置的影响....................................................394.3分析抗性关联SNP标记的辅助选择效率评价...........................................39结论.....................................................................................................................41参考文献.....................................................................................................................42致谢.....................................................................................................................45VI 东北师范大学硕士学位论文引言1.1大豆胞囊线虫病概述大豆原产于我国，是继水稻、玉米、小麦、棉花之后的第五大重要经济作物。随着经济的快速发展，人们对生活质量的追求越来越高，畜牧业也受到了广泛的关注。因此，对大豆的需求量急剧增加，出现了供不应求的矛盾，为缓解这一矛盾，我国每年都需从国外进口大批量的大豆来满足国内人们的生产和生活。其中，造成这种局面的原因主要是大豆产量有明显的下降趋势，其中大豆胞囊线虫病就是严重降低大豆产量的主要病虫[1]害之一。1.1.1大豆胞囊线虫病危害及分布大豆胞囊线虫（Heteroderaglycines,Soybeancystnematode,SCN）病是由一种叫作大豆胞囊线虫的土传线虫引起。SCN侵入大豆的根部，与植株竞争营养物质，使根部不能正常获得养分和水分，致使根系结构发育不良，功能减弱，病害严重者甚至腐烂，最[2-4]终导致地上部分植株生长衰弱、叶片枯黄，结荚减少，甚至整株死亡。SCN分布十分广泛，从世界范围上看，在欧洲、亚洲、美洲等都有出现，特别是在美国、加拿大、巴西、日本等大豆主产国危害更为严重。在我国，该病害主要分布在三[5,6]个大豆主产区东北三省、黄淮地区、内蒙古地区，尤其在干旱、盐碱地危害更为严重。1.1.2大豆胞囊线虫病防治SCN一般可造成大豆减产量达10%～20%，严重时能接近50%～90%，乃至绝收，[7,8]每年造成的经济损失多达上亿美元。所以，对大豆胞囊线虫病的防治得到科学家们的高度重视。农业生产中采用合理轮作换茬种植、药剂防治、引入天敌防治等手段使胞囊线虫病的危害受到一定程度控制，但并未从根本上解决病害的防治工作。多年的生产实践证明，培育新型抗病品种是防治胞囊线虫病危害最为有效、流行的途径，也是大豆科[9,10]研工作者未来研究的重点目标。1.2野生大豆资源是拓宽抗病品种遗传基础的重要资源1.2.1野生大豆资源价值在植物分类学上看，大豆属(Glycine)是由Glycine亚属和Soja亚属组成。其中Glycine[11]亚属包括了26个多年生种，而Soja亚属是最重要的亚属，包括2个种，即栽培大豆(G.max)和它的近缘野生种野生大豆(G.soja)。也有人认为是3个种，即将野生大豆中百1 东北师范大学硕士学位论文粒重大于3g小于10g的命名为半野生大豆(G.Gricilis)。野生大豆之所以是重要的遗传资源受到研究者们高度重视，不仅因为其是栽培大豆的近缘野生种，两者之间不存在种间杂交障碍，也不存在种间遗传隔离；还因其自身含有许多符合人类需要的重要基因，为[12-13]培育高产、抗病的优良大豆品种提供了宝贵资源。在长期的自然选择作用下，野生大豆的遗传多样性远远多于栽培大豆，具有许多栽培大豆无法比拟的优势。第一野生大豆富含蛋白质，是一种高蛋白的植物。在进化过程中，栽培大豆的蛋白质含量明显低于野生大豆。我国栽培大豆蛋白质平均含量约为40%，而野生大豆平均含量可达45.4%，最高达到55.4%，比栽培大豆高出约5.4%。有的野生大豆蛋白质含量超过53%、含油量超过9%，是未来培育高蛋白性状不可多得的优良[14,15]品种。第二，野生大豆单株荚数较多，种子繁殖系数较高，这是提高大豆产量的最根本因素。在栽培大豆中只有极少数一部分种质能超过100个荚，超过200个荚数的品[16,17]种基本上没有，而在野生大豆中一般每株荚数可达400-500个，最多可达上千个。野生大豆具有抗逆性强、适应性广的特点。在不同的环境条件下野生大豆都能表现出很强的适应能力，包括对土壤贫瘠、涝洼、盐碱、干旱等非生物因素具有很强的耐性；对灰斑病、蚜虫、大豆胞囊线虫病、花叶病毒等病虫害也具有很好的抗性。野生大豆资源中含有丰富的稀有基因，可以筛选出符合人类生产生活的特殊种质资源。亚麻酸是有益于人类的脂肪酸，而在野生大豆中亚麻酸含量很高。研究者还筛选出高异黄酮、高含硫氨基酸等品质性状优良的珍贵品种。利用野生大豆资源育成饲料用品和果园绿肥品种等[18-20]特殊用途的品种。1.2.2野生大豆在拓宽大豆品种遗传基础的研究进展通过育种技术，人类可将野生大豆优异基因导入栽培大豆中，丰富了栽培大豆的遗传多样性。因此，野生大豆资源是拓宽栽培大豆遗传基础的重要资源。杜莉莉等以栽培大豆和滩涂野大豆杂交组合(N23674×BB52)为亲本，并逐代筛选其耐盐性，得到了较为[21]理想的耐盐植株后代。雷勃钧等利用花粉管通道导入野生大豆总DNA技术，选育出[22]高蛋白、高脂肪品系D90-1217。付连舜等利用种间杂交和回交方法选育出抗大豆花[23]叶病毒病的高产植株。杨光宇等以野生大豆为材料选育出抗旱、耐盐碱的吉育59；[24]早熟、抗食心虫、高蛋白的吉林小粒4号。孙寰等（1983）以野生大豆为材料研究大豆细胞质不育系，获得具有栽培大豆表现型和野生大豆表现型的不育系及同型保持系[25]。1.2.3野生大豆在拓宽抗胞囊线虫病品种遗传基础的利用前景早在70年代中期，我国就开展SCN抗病资源筛选工作，得到多份免疫材料，并在此基础上培育出大量抗不同SCN生理小种的新品种和品系。这些抗病品种应用于生产实践，大幅度减低了SCN危害造成的损失。然而，少数抗源在大豆育种中的利用导致2 东北师范大学硕士学位论文抗病品种遗传基础日趋狭窄。袁翠平等（2009）对我国推广的有系谱记载的25个抗病[26]品种的抗病基因来源追溯发现，其中21个品种（87%）抗病基因来自北京小黑豆。据统计，2011年美国多家商业育种公司推荐的1880份抗病品种中（https://netfiles.uiuc.edu/tjw/www/cover.htm），1579份品种的抗病基因只来自PI88788（84%），52份只来自Peking（2.8%），210份来自NSG（11.2%），另外39份品种的抗病基因来自CystX，PI88788和Peking、PI437654等（2.1%）。常年种植这些抗性遗传基[27]础狭窄的抗病品种，无疑会加快生理小种的变异，给大豆生产带来巨大潜在风险。我国野生大豆资源分布广泛，数量多，类型丰富，已保存7600多份野生大豆种质，[28]占世界保存野生大豆资源的90%以上，在优异基因发掘和利用方面具备无可比拟的资源优势；此外，SSR分子标记分析和基因序列分析均表明野生大豆具有比栽培大豆更为[29,30]丰富的多样性。因此，野生大豆作为提供大豆胞囊线虫病抗性基因的主要来源有其不可替代的优势。随着对胞囊线虫抗病机理深入的研究，结合先进的实验手段，利用野生大豆培育新型SCN抗病品种在未来一定会取得新的突破。1.3SNP分子标记在育种中的重要作用人们在长期育种工作中发现，传统的育种方法培育新品种周期长，一个稳定的新品种一般需要近十年的时间。随着分子生物学和生物信息学的快速发展，分子标记被大量应用，尤其在分子育种中，为常规育种提供了高效、快速的鉴定手段，大大缩短了育种周期。根据分子标记所用的生物学技术不同可分为以下四种类型：基于Southern杂交的分子标记、基于PCR技术的分子标记、PCR技术和限制性酶切技术结合的分子标记和[31]单核苷酸多态性标记（SingleNucleotidePolymorphism，SNP）四大类。随着分子生物学技术经过十几年的发展，拟南芥和水稻等高等植物基因组测序的完成，科学家逐渐将关注点转移到发现基因组序列差异上。研究发现基因序列的差异多是单核苷酸的差异，因此单核苷酸多态性的应用与开发成为研究者们关注的焦点。SNP标[32]记有助于区分不同的群体，个体表型差异和个体对病害的抗、感性等。另外，不同种间SNP差异还可以用来解释种间亲缘关系和生物进化的历程等。SNP在农学上的应用，对作物遗传育种和品种改良等方面无疑是注入了新的生命力，大幅度提高了优异基因选[33]择效率，同时加快抗病种质的选育，具有广阔的应用前景。1.3.1单核苷酸多态性（SNP）SNP是指由单个核苷酸碱基的改变而导致的DNA多态性。其中主要包括单个碱基的缺失、插入、转换（C/T，A/G）及颠换（C/A，C/G，A/T，G/T）四种形式。从原则上分析，单个核苷酸碱基的改变可以是A、T、G、C四种中的任意一种，而事实上突变[34]处的碱基改变多发生在T和C之间。其中转换类型变异大约占2/3，其它三种变异形3 东北师范大学硕士学位论文式发生几率相似。可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是最容易发生突变的位点，[35]其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。1.3.2SNP的特点SNP遗传稳定性高，位点丰富且分布广泛。SNP是继RFLP、SSR之后的第三代新型的DNA分子标记，它的突变率较低，但较稳定，是一种更为高效、实用的分子标记。在人类基因组中，SNP的频率为大约每1000bp出现1个，在人类30亿碱基中出现超过[36][37]300多万个SNPs。在其它哺乳类动物中SNP的频率为每500～1000bp出现1次。[38]在玉米基因组中，SNP的频率为大约每57bp出现1个。在水稻基因组中，SNP的频[39]率约为每232个碱基就出现1个。SNP具有二态性特点，易于基因分型。SNP一般由2个碱基组成，3个和4个碱基时很少，所以在筛选SNP时，只是确定碱基非此即彼，而且可以估计出群体中等位基[40]因的频率。1.3.3SNP分子标记在作物育种上的应用及前景目前，SNP标记已经开展了广泛的研究，有大量SNP分子标记相继被开发。无论[41-43][44,45]是拟南芥、水稻、玉米等植物中，还是小鼠、果蝇等动物中均有发现。获得SNP分子标记的关键是SNP位点的发掘，近几年，SNP位点挖掘手段不断更新，使得SNP[46-48]分子标记技术应用领域得以拓宽，在番茄、柚、苹果等作物中也得到开发和利用。在作物遗传育种中，SNP技术多用于连锁图谱的构建、优良品种筛选、群体分析、基因定位与克隆等方面。如Bhattramkki等（2002）以SNPPyrosequncing检测技术绘制出玉米EST遗传图谱。相继SNP技术在小麦、水稻等农作物遗传图谱构建方面都有所[49]突破。吴金峰等（2014）以甘蓝为实验材料，结合SNP技术与SSR标记，成功将群[50]体划分为3个生态位。Yang等（2004）以番茄为实验材料证明了与果实颜色基因座[51]连锁的2个SNP。Brunner等（2003）开发了基于PCR技术的大麦家系叶锈病抗病[52]相关SNP标记，可用于筛选优良的大麦品种。大豆基因组较庞大，已经有很多SNP相继被发现，平均大约每272bp就出现一个SNP。Jeong等（2002）用等位特异PCR反应分析了与基因Rsv1和Rsv3紧密连锁的SNP，[53]并将这些SNP进行了检测和分型。Hofmann等（2002）筛选出与基因Rhg1、Rhg4[54]连锁的SNP标记，可用于区分抗病、感病种质。Zhu等（2003）以25份栽培大豆为[55]材料发现了280个SNP位点，并分析了发生频率和特点。Lam等（2010）通过全基[56]因组测序发现了近63万个SNP位点。Li等（2009）分析rhg1基因序列筛选出37个[57]SNP位点。袁翠平等（2007）利用等位基因特异PCR方法开发了Rhg4基因的5个[58]SNP分子标记。随着分子生物学新技术的出现，越来越多的SNP被逐一发现，更多新的SNP分子标记也将逐渐诞生。4 东北师范大学硕士学位论文到目前为止，SNP分子标记已经被广泛应用在主要农作物中，为育种工作者提供了极大的便利，提高育种效率，缩短育种年限。然而，在国内SNP分子标记的开发还是处于起步阶段，基础性的研究较多，与实践生产结合较少，稳定性不高，尤其是受环境影响较大的性状。但随着分子生物技术的不断更新，研究人员持久的努力，SNP分子标[59,60]记必将在作物育种方面取得更大的突破。1.4本研究的内容、目的和意义1.4.1研究内容前期以绥农14/ZYD03685（抗胞囊线虫病亲本）杂交组合F2群体（137个个体）为试验材料，采用SLAF技术开展了多态性标签开发和抗性QTL定位研究。本论文在已经获得的QTLs信息基础上，开发基于PCR的SNP标记，筛选抗胞囊线虫病关联的SNP标记，用于分子标记辅助选择。具体内容如下：（1）选用遗传变异较大的抗、感野生大豆资源各4-8份为实验材料，根据已经获得的SNP信息，开发基于PCR的SNP标记。（2）利用开发的SNP标记对51份野生大豆种质资源进行基因型鉴定，结合抗病性，评价SNP标记与抗性的关系，筛选出抗性关联的SNP标记。（3）以杂交组合绥农14/ZYD03685的33份F2后代为实验材料，将有效的SNP标记应用于分子标记辅助选择，评价其选择效率。1.4.2研究目的和意义本研究开发的SNP标记，旨在应用于分子标记辅助选择，为分子育种提供快速高效的抗病材料鉴定技术。5 东北师范大学硕士学位论文材料与方法2.1实验材料2.1.1野生大豆材料以51份野生大豆种质资源为实验材料（表2-1）开发SNP分子标记。利用开发的分子标记，对来自杂交组合绥农14/ZYD03685的33份F2后代（表2-2）进行SNP基因型鉴定，结合其对胞囊线虫病的抗性，评价SNP标记辅助选择效率。上述实验材料由本课题组提供。表2-151份野生大豆种质资源名称、来源及其对大豆胞囊线虫的抗性材料名称来源抗性ZYD01185吉林磐石抗病ZYD06143辽宁铁岭县抗病ZYD02695辽宁庄河县抗病ZYD01196吉林盘锦抗病ZYD00847吉林德惠抗病ZYD03073山西介休县抗病ZYD01647辽宁开原县敏感ZYD00209黑龙江绥滨县抗病ZYD02498辽宁凌源县抗病ZYD01895辽宁铁岭县抗病ZYD00432黑龙江宝清县抗病ZYD02356辽宁丹东市抗病ZYD02259辽宁宽甸县抗病ZYD02182辽宁清原县抗病ZYD01907辽宁法库县抗病ZYD01126吉林双辽抗病ZYD01922辽宁新民县敏感6 东北师范大学硕士学位论文ZYD02173辽宁清原县抗病ZYD00211黑龙江绥滨县抗病ZYD00321黑龙江庆安县敏感ZYD03906陕西宝鸡抗病ZYD03022山西古交区抗病ZYD02505辽宁凌源县敏感ZYD00276黑龙江铁力县抗病ZYD02398辽宁彰武县抗病ZYD02542辽宁喀左县敏感ZYD00303黑龙江铁力县敏感ZYD02585辽宁义县抗病ZYD00168黑龙江甘南县抗病ZYD02171辽宁清原县抗病ZYD00509黑龙江宾县抗病ZYD06162辽宁铁岭县敏感ZYD03154山西河津县抗病ZYD00659黑龙江双城县抗病ZYD02798宁夏陶乐马太沟抗病ZYD02631辽宁凤城县抗病ZYD03623河南原阳抗病ZYD02260辽宁宽甸县抗病ZYD01639辽宁开原县抗病ZYD02502辽宁凌源县抗病ZYD01683辽宁开原县抗病ZYD02404辽宁彰武县敏感ZYD03142山西永济县敏感ZYD01672辽宁开原县敏感ZYD02709辽宁东沟县抗病ZYD02411辽宁阜新县抗病ZYD02996山西太原市抗病7 东北师范大学硕士学位论文ZYD03174山西芮城县敏感ZYD01015吉林双阳抗病ZYD01060吉林汪清抗病ZYD02002辽宁营口抗病表2-2绥农14/ZYD03685杂交组合33份F2后代及其对大豆胞囊线虫的抗性编号抗性编号抗性13Y018抗病13Y142抗病13Y039敏感13Y144敏感13Y040敏感13Y145敏感13Y041敏感13Y155抗病13Y043敏感13Y158抗病13Y072敏感13Y160敏感13Y074敏感13Y162抗病13Y075敏感13Y165敏感13Y076敏感13Y166敏感13Y077敏感13Y171敏感13Y103敏感13Y172敏感13Y120抗病13Y173敏感13Y130敏感13Y209敏感13Y131敏感13Y211敏感13Y134敏感13Y226敏感13Y138抗病13Y237抗病13Y140敏感[61]抗性分级参照SchmittandShannon（1992）的方法，HR：高抗（IP≤10），MR：中抗（1060）。2.2主要试剂2.2.1主要试剂CTAB、Tris-HCl、EDTA、β-巯基乙醇、NaCl、水饱和酚、异戊醇、异丙醇、氯仿、RNaseA、无水乙醇、冰乙酸、NaOH、核酸染料、2×TransStartFastPfuPCRSuperMix、2×TaqPlusPCRMasterMix、琼脂粉、ddH2O、MarKerⅠ、MarkerⅡ、1kbplusDNALadder、λDNA/HindⅢ、离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒（北京鼎国）等。8 东北师范大学硕士学位论文2.3实验方法2.3.1DNA提取采用常规CTAB法提取野生大豆根部基因组DNA，具体实验操作如下：（1）试验种子经过严格挑选，取籽粒饱满、无病虫害的野生大豆种子5-10粒，对种子预先进行机械微破皮处理，处理后的种子先用5%次氯酸钠溶液灭菌10min，再用灭菌水充分冲洗3-5遍。每个样品分别种于装有2/3体积无菌蛭石的塑料钵柱中。黑暗条件下培养，待苗出土后移至光照下培养。（2）取幼苗根部组织先用清水冲洗干净，之后用吸水纸处理干根部表面水滴。（3）称取处理干净的根部组织5g，装到用液氮预冷过的研钵中，研磨至粉末状。研磨过程中不断加入液氮，保持样品一直处于液氮环境下。（4）将研磨好的粉末转移到灭过菌的2.0mL离心管中，加入800μL65℃预热过的CTAB缓冲液。上下颠倒至充分混匀。（5）65℃水浴加热1h，期间每隔10min轻轻倒转摇动一次。（6）水浴后取出离心管，冷却至室温。向管内加入10μLRNase，充分混匀，37℃保温30min。（7）冷却至室温，在通风橱内加入800μL的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻轻上下颠倒摇动15-20min，充分混匀。（8）室温下12000rmp/min，10min，用去尖枪头转移上清液至另一新的2.0mL离心管中。（9）重复（7）-（8）步骤。在通风橱内加入800μL的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻轻上下颠倒摇动15-20min，充分混匀。室温下12000rmp/min，10min，用去尖枪头转移上清液至另一新的2.0mL离心管中。（10）加入上清液两倍体积的无水乙醇（-20℃预冷30min），轻轻混匀。-20℃冰箱静置20min。（11）12000rmp离心10min，弃上清。加入1mL76%乙醇洗涤两次（其中一次过夜）。洗涤后将DNA风干（也可放在无菌操作台内吹干）。（12）待DNA风干后，加入30μL的1×TE缓冲液（pH=8.0）溶解。（13）检测DNA浓度和质量，-20℃保存，备用。CTAB提取缓冲液：2%CTAB、1%β-巯基乙醇、100mmol/LTris-HCLpH7.5、500mmol/LEDTApH8.0、250mmol/LNaCl溶液。2.3.2DNA质量检测（1）质量检测：取2μL的6×Loadingbuffer，加入2μL的DNA原液，再用纯净水补充至12uL，将二者充分混匀,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，于110V恒压电泳50min，检测并记录。9 东北师范大学硕士学位论文（2）浓度测定：取上述2μL的DNA原液，用NanoDrop2000c检测DNA浓度。根据测定的浓度将DNA原液分别稀释至约30μg/μL备用，剩余的DNA原液放置-80℃冰箱保存。2.3.3目的序列的获得根据获得的QTLs信息（图1），在每个QTL中选择1个SNP信息（图2），运用所获得的部分碱基序列在Phytomozev10.3数据库中进行Blast查找该SNP位点前后约400-500个碱基，共约900bp。图2-1QTLs信息图2-2SNP序列信息（星号标记处为SNP位点的等位基因）2.3.4SNP分子标记开发在表2-1中随机选取4-8份抗、感野生大豆种质为实验材料，开发基于PCR技术的SNP分子标记，即等位基因特异PCR技术（AS-PCR）。根据获得的约900bp的DNA序列，用Primer5.0设计引物，在每一个突变位点设计两条特异引物，一条通用引物，用于两次PCR扩增。并通过对上述选定的实验材料的序列测定，评价开发的SNP分子10 东北师范大学硕士学位论文标记的分型准确性。（1）特异PCR基本原理：针对每一个SNP位点分别设计两条特异引物即引物1和引物2，一条公共引物即引物3。其中引物1与正常等位基因互补，引物2与突变碱基互补。对每一个样品分别进行两次扩增反应即PCR1和PCR2。只在PCR1中有特异条带的样品为纯合正常基因型，只在PCR2中有特异条带的样品为纯合突变基因型，在PCR1和PCR2两次反应中都有特异条带的样品为杂合型，若在两次PCR中均无带的样品为其它突变类型或分型失败。扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，可以简单、快速的确定扩增产物结果，从而确定该样品的基因型。PCR扩增情况模式图（图2-3至2-6），IP1-1R为公共引物，IP1-1F1-1为特异引物1，与SNP位点等位基因A匹配。IP1-1F1-2为特异引物2，与SNP位点等[62,63]位基因T匹配。图2-3纯合型TT图2-4纯合型AA图2-5杂合型AT图2-6其他突变类型11 东北师范大学硕士学位论文（2）带型检测：对于每个样品进行两次PCR扩增，扩增产物分别用琼脂糖凝胶检测就可以快速的确定其SNP类基因型，简单、方便、成本低。不同基因型样品的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中的检测模式图（图2-7）。图2-7凝胶电泳检测模式图2.3.5提高PCR特异性条件（1）退火温度：特异PCR扩增产物的特异性与PCR参数以及PCR反应体系中的各组分用量都密切相关。如退火温度较低，易扩增非特异性条带，出现假阳性；退火温度过高，扩增效果较弱，易出现假阴性。因此，在本实验中，为了获得效果较理想的特异条带，对于每一个SNP分子标记都设定了温度梯度筛选。参照引物设计软件Primer5.0和引物合成单提供的退火温度至下5℃设定梯度PCR，筛选出扩增特异条带的退火温度度。（2）错配碱基类型及位置：，在常规PCR中，反应条件适宜时，若引物3末端碱基与模板匹配则能扩增出产物，，反之则不能扩增出产物。而在实际应用中则不是，若只有3末端单个碱基不与模板匹配，不能阻止产物延伸。前人研究表明，在特异引物3末端第2，3或4的位置引入错配碱基，可获得较为理想的特异产物。碱基错配类型可分为3类:C/T和G/A为强错配碱基类型；C/A和G/T为弱错配碱基类型；A/A、C/C、G/G和T/T为中等错配碱基类型。，特异引物设计时，3末端碱基搭配一般遵守强弱搭配，或者中中搭配的原则，以便获得[64]扩增效果较为理想的特异产物。因此，特异引物的设计除了遵守常规引物设计的基本原则外，还应该考虑等位基因PCR引物的特殊原则。本实验中设计特异引物时，在引，入错配碱基位置方面，首先考虑在引物3末端第2，3或4的位置引入错配碱基。在错配碱基搭配方面，首先选择强的错配碱基类型与弱的错配碱基类型搭配（C/T或G/A和C/A或G/T），其次为强的错配碱基类型与中的错配碱基类型搭配（C/T或G/A和A/A、C/C、G/G或T/T）。2.3.6PCR反应体系及产物检测针对每个样品的同一SNP位点，需要进行两次PCR即PCR1和PCR2。具体反应体12 东北师范大学硕士学位论文系和运行参数见表2-3，2-4，2-5。表2-3PCR1扩增体系组分体积μLDNA(30μg/μL)22×FastPfuPCR12.5SuperMix公共引物1特异引物11ddH2O8.5总体积25表2-4PCR2扩增体系组分体积μLDNA(30μg/μL)22×FastPfuPCR12.5SuperMix公共引物1特异引物21ddH2O8.5总体积2513 东北师范大学硕士学位论文表2-5PCR扩增程序（30个循环）温度时间94℃5min94℃30s退火温度30s72℃2kb/1min72℃10min12℃保存（4）PCR产物检测：扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，于100V恒压电泳40min，观察结果并记录。2.3.7SNP分子标记准确性评价为了验证SNP分型效果的准确性，本实验针对每一个SNP位点均设计一对测序引物，测序产物约300-600bp，且突变位点应位于测序产物中间位置，防止位于两侧边缘测序结果不准确。选取在PCR1和PCR2检测结果中特异条带较理想的样品。用相应的测序引物进行扩增。测序PCR体系如表2-6。扩增参数参照表2-5表2-6PCR扩增体系组分体积μLDNA(30μg/μL)42×FastPfuPCR25SuperMix公共引物2特异引物22ddH2O17总体积5014 东北师范大学硕士学位论文扩增产物先用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，将有特异条带的样品测序。测序由库美生物科技有限公司或北京华大基因公司完成。2.3.8SNP分子标记关联性分析以51份野生大豆种质资源为实验材料见表2-1，利用每个突变位点已经筛选出的两条特异引物，一条通用引物，针对每个样品都用高保真酶2×FastPfuPCRSuperMix分别进行两次PCR扩增，反应体系见表2-3和表2-4，扩增体系见表2-5，产物分别用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。分析每个样品两次PCR带型检测结果确定其基因型，并结合该实验材料对大豆胞囊线虫病的抗性，评价SNP分子标记与抗性的关联程度。2.3.9SNP分子标记利用效率评价选用来自杂交组合绥农14/ZYD03685的33份F2后代为实验材料，利用与抗胞囊线虫病相关联的SNP分子标记对其进行基因型鉴定，PCR体系见表2-3和表2-4，扩增体系见表2-5，分析扩增产物琼脂糖带型检测结果。结合其对胞囊线虫病的抗性，评价SNP标记辅助选择效率。15 东北师范大学硕士学位论文结果与分析3.1野生大豆基因组DNA的提取本试验是采用CTAB法提取野生大豆种质资源基因组DNA。随机选取部分提取的DNA原液用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，结果如图3-1。通过凝胶电泳图可以看出，大多数材料基因组DNA主带集中、清晰，可以用于后续的PCR反应。图3-1野生大豆基因组DNA电泳检测图注：样品次为ZYD06143，ZYD01970，ZYD00847，ZYD0298，ZYD02002，ZYD00168，ZYD02356，ZYD02695，ZYD03073，ZYD03623，ZYD02798，ZYD01639，ZYD02542，ZYD00321，ZYD03154，ZYD01196，ZYD01060，ZYD02259，ZYD00303用NanoDrop2000c（Bio-RAD公司）检测基因组DNA的浓度和质量，这51份野生大豆种质DNA浓度较高，变化范围为246.7~1086ng/uL（表3-1）；DNA质量较好，A260/280值分布在1.8~2.0区间，表明没有RNA和蛋白质的污染。根据检测出的DNA浓度，用纯净水将样品DNA原液浓度稀释至30ng/uL，-20℃下保存备用。16 东北师范大学硕士学位论文表3-151份野生大豆种质的DNA浓度及A260/280值编号浓度ng/uL260/280编号浓度ng/uL260/280ZYD01185573.11.91ZYD03154684.11.99ZYD061431086.81.82ZYD00659525.62.0ZYD02695495.11.98ZYD02798396.41.89ZYD011961068.41.88ZYD02631311.71.97ZYD008472871.95ZYD03623251.71.97ZYD03073588.21.99ZYD02260475.91.92ZYD01647294.11.95ZYD01639353.82.0ZYD00209340.12.0ZYD02502518.62.0ZYD02498295.41.95ZYD01683701.41.99ZYD01895618.91.85ZYD02404490.41.98ZYD00432360.71.80ZYD03142270.61.92ZYD02356494.12.0ZYD01672541.51.96ZYD02259888.91.87ZYD02709323.51.89ZYD02182318.11.94ZYD02411505.31.86ZYD01907722.11.95ZYD02996359.61.98ZYD01126300.61.92ZYD03174303.91.96ZYD01922251.81.91ZYD01015611.31.98ZYD02173256.91.97ZYD01060912.32.0ZYD00211268.11.96ZYD02002557.32.0ZYD00321246.71.88ZYD00303805.81.97ZYD039067791.98ZYD02585324.21.98ZYD03022303.72.0ZYD001685451.8ZYD02505621.51.97ZYD02171355.41.91ZYD00276253.61.86ZYD005092922.0ZYD02398273.41.93ZYD06162684.61.87ZYD02542456.41.913.2SNP分子标记开发3.2.1特异引物筛选本试验参照前人总结出的特异引物设计基本原则，以在Phytomozev10.3数据库中获得的约900bp的DNA序列为模板设计特异引物，针对检测到的每一个SNP位点都设计了6-12个PCR特异引物，期望筛选出最佳特异引物组合，从而能够准确鉴定供试种，质的基因型。设计引物时，分别在特异引物3末端第2、3或4的碱基位置引入错配碱基，然后分别检测它们的分型效果。在实验过程中，针对每一个SNP位点，设计与正常基因匹配的3条下游引物和与突变基因匹配的3条下游引物，它们都共用一个上游引物，共3组扩增引物（每组包括一条与正常基因匹配的引物，一条与突变基因匹配的引17 东北师范大学硕士学位论文物，一条公共引物）。若3组下游引物均没有扩增出特异条带，可再对该SNP位点设计与正常基因匹配的3条上游引物和与突变基因匹配的3条上游引物，它们都共用一个下游引物，共3组检测引物。多次检测，筛选出扩增特异条带较为理想的特异引物，引物序列见表3-2，用于后续实验材料基因型的鉴定。引物均由库美生物科技有限公司合成。表3-2引物序列,,QTLs引物名称引物序列（5>>3）退火SNP扩增片段温度℃位点长度（bp）IP1-1IP1-1F1-1CCACCATATATGTT283TACTACACACCA60AIP1-1F1-2CCACCATATATGTTTACTACACAAAT57TIP1-1R1ACTCTGTACCCAAATGGTCAAGTIP1-1F1TCCGATACGAAAG355GCTGTGIP1-1R1-1GAGATTTAATGTTACTTCTTCTATTTAT55AIP1-1R1-2GAGATTTAATGTTACTTCTTCTATTGCA56TIP1-1R1-3GAGATTTAATGTTACTTCTTCTATGTCT56AIP1-1R1-4GAGATTTAATGTTACTTCTTCTATTTAA55TIP2-1IP2-1F1AGGGATTTGAGGA330GGAGGTTTGIP2-1R1-1AGAAGTTTTGCGAGCCAAAAAC62GIP2-1R1-2AGAAGTTTTGCGAGCCAACCAC64GIP2-1R1-3AGAAGTTTTGCGAGCCAAAAAT61AIP2-1R1-4AGAAGTTTTGCGAGCCAACTAT60AIP2-1R1-5AGAAGTTTTGCGAGCCAACATT60AIP5-1IP5-1F1AATGGCTAAATCA246AAACTTACCGAIP5-1R1-1GCGGAGGATGCCAAAAATC54GIP5-1R1-2GCGGAGGATGC18 东北师范大学硕士学位论文IP5-1R1-3CAAACCTC56GCGGAGGATGCCIP5-1R1-4AAAAATT64AGCGGAGGATGCCAAACAGT61AG1-1G1-1F1CCTCCGTTTTCCT381CGTAAGCCG1-1R1-1CTACCAACCCACTTCAACAGAAGGA60TG1-1R1-2GTACCAACCCACTTCAACAGAATAT58AG1-1F1-1AGAGCCTGATGCT265GGAGAT57TG1-1F1-2AGAGCCTGATGCTGGATCA56AG1-1F1-3AGAGCCTGATGCTGGCGCT58TG1-1F1-4AGAGCCTGATGCTGGAGAA55AG1-1R1AAACCCTAGTTCCTTTCACTTTCAVE1A1F1AAGCCTCCTTAGT250GTGCTCATCA1R1-1GGATACTAGTCATCTGTTTTGGGT59AA1R1-2CAGGATACTAGTCATCTGTTTTAAGG59CA1R1-3GGATACTAGTCATCTGTTTTGTGT56AA1R1-4CAGGATACTAGTCATCTGTTTTCAGG60CA1R1-5GGATACTAGTCATCTGTTTTAAGT56AA1R1-6CAGGATACTAGTCATCTGTTTTGGGG61CAVE3A3F1GAATAAGGGTTGTG113ACTTGTGAGGA3R1-1TGAGAGGACATTGTC58TTTATCCCTAA3R1-2TGAGAGGACATTGTC56TTTATTTCGCA3F2CTGTTGAGTAGGT310TCCAAGATAAT19 东北师范大学硕士学位论文A3R2-1GAGAGGACATTGTCTTTATTCAT57AA3R2-2GAGAGGACATTGTCTTTATTACG59CA3R2-3GAGAGGACATTGTCTTTATTGCT58AA3R2-4GAGAGGACATTGTCTTTATCCCG61C注：表中带有下划线碱基为引入的错配碱基，斜体碱基为突变碱基，引物名称中加粗字体为分型效果较为理想的特异引物，用于后期基因型鉴定。3.2.2退火温度筛选在等位基因特异PCR中，其扩增产物的效果与PCR反应的程序以及PCR反应体系中的各组分用量都密切相关。在本试验中，采用的是PfuPCRMix，因此没有研究PCR反应体系各组分用量的影响。通过调整退火温度来筛选能够扩增出特异条带的引物。参照引物设计软件Primer5.0和引物合成单提供的退火温度至下5℃设定梯度PCR，筛选出扩增特异条带的退火温度。以其中一个SNP（IP2-1）分子标记的退火温度为例进行详细说明。20 东北师范大学硕士学位论文图3-2引物IP2-1不同退火温度分型结果电泳检测注：泳道1：ZYD02996，泳道2：ZYD02411，泳道3：ZYD01060，泳道4：ZYD02002，泳道5：ZYD00303，泳道6：ZYD02585，泳道7：ZYD00168。A图：退火温度为65℃，B图：退火温度为64℃，C图：退火温度为63℃图3-2为分子标记IP2-1的特异引物R1-2在不同退火温度下的筛选结果，引物R1-2与突变基因G匹配，因此可检测出基因型为GG的样品。通过测序知道泳道5、7是基因型为GG的样品，泳道1、2、3、4、6是基因型为AA的样品。PCR结果表明，在65℃退火温度下（图3-2A）7个样品都可以扩增出目标条带，没有检测出差异条带，但条带的明亮程度有一定的区别。在64℃退火温度下（图3-2B）只有泳道5和7的样品可以扩增出目标条带，而其它泳道均无目标条带。在63℃退火温度下（图3-2C）同样所有样品均能扩增出目标条带，无法检测出特异性。根据检测结果只有64℃退火温度下的扩增效果符合预期，在65℃和63℃条件下的退火温度均无法分辨不同的基因型。因此最终确定分子标记IP2-1特异引物R1-2的最适退火温度为64℃。经多次筛选比较，最终获得特异引物的退火温度见表3-2。21 东北师范大学硕士学位论文3.3SNP标记的准确性评价3.3.1IP1-1分子标记准确性验证经过多次筛选最终获得两条分型效果较理想的特异引物IP1-1F1-1和IP1-1F1-2见表3-2，两者分别能扩增出不同的特异条带，可以作为互补引物。其中引物IP1-1F1-1是在，，突变位点3末端第三个位点处引入C/T强错配类型，引物IP1-1F1-2是在突变位点3末端第二个位点处引入A/G强错配类型。根据已经获得QTL信息分析可知IP1-1位点发生A/T颠换，引物IP1-1F1-1与碱基A匹配，而引物IP1-1F1-2与碱基T匹配。将两次PCR反应产物分别用1%的琼脂糖凝胶检测如图3-3，只在含有引物IP1-1F1-1的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为AA纯合型，只在含有引物IP1-1F1-2的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为TT纯合型，而在两次PCR反应中均能扩增出特异条带的样品基因型为AT杂合型见表3-3。图3-3IP1-1引物基因型鉴定电泳检测图注：A图：引物IP1-1F1-1电泳检测结果，B图：引物IP1-1F1-2电泳检测结果。样品依次为：ZYD02585，ZYD02996，ZYD02171，ZYD0614722 东北师范大学硕士学位论文表3-3IP1-1引物基因型鉴定结果编号第一次PCR第二次PCCR基因型（IP1-1F1-1）（IP1-1F1-2）ZYD02585++ATZYD02996+-AAZYD02171++ATZYD06147-+TT注：+表示有特异条带；-表示无特异条带为验证两条特异引物的准确性，用IP1-1分子标记的测序引物（表3-4）对6份野生大豆基因组DNA进行PCR扩增，反应体系为50uL。取6uL的PCR扩增产物进行1%的琼脂糖检测，发现在这6份野生大豆种质中均扩增出特异条带，并与预期长度一致约587bp，将这些PCR产物测序。将测序结果输入Bioedit软件中，与从Phytomozev10.3数据库中获得的DNA序列进行比对，分析有效测序片段显示（图3-4），只有特异引物IP1-1F1-1检测出目的条带的样品，其测序结果在该SNP位点处碱基为A，符合预期基因型AA。而只有特异引物IP1-1F1-2检测出目的条带的样品，其测序结果在该SNP位点处碱基为T，符合预期基因型TT。可见IP1-1标记能够准确分型。图3-4IP1-1分子标记测序结果比对23 东北师范大学硕士学位论文表3-4测序引物序列，，引物名称引物序列（5>>3）产物大小（bp）IP1F1TTCCGATACGAAAGGCTGTG587IP1R1AACTCTGTACCCAAATGGTCAAGTIP2F1AGGGATTTGAGGAGGAGGTTTG545IP2R1TTTTTTTCTAACCTTGGCTGCTIP5F1ATGCCAATGCGTTACCATAGAA338IP5R1CCATTGTGTTGTTTGAGAGCGAG1FTTACCTCCGTTTTCCTCGTAAGCC565G1RGATAACCAAAAATCACAGTCCCATAAAAVE1FCAGGGAGATTGATGGGAAGA630AVE1RTGAAAGAGTTGTGGTTAAAAAGATTAVE3F2CCACTATTACAAGATTGTCCCAGC599AVE3R2TGCTAAGTAAAGACCAAAAGTGCC3.3.2IP2-1标记的准确性评价经过多次筛选最终获得分子标记IP2-1的两条特异引物为IP2-1R1-2和IP2-1F1-3见表3-2，两者分别能扩增出不同的特异条带，可以作为互补引物。其中引物IP2-1R1-2，是在突变位点3末端第三个位点处引入C/T强错配类型，引物IP2-1R1-3是在突变位点，3末端第四个位点处引入A/G强错配类型。根据已经获得QTL信息分析可知IP2-1位点发生A/G转换，引物IP2-1R1-2与碱基G匹配，而引物IP2-1R1-3与碱基A匹配。将两次PCR反应产物分别用1%的琼脂糖凝胶检测如图3-5，只含有引物IP2-1R1-2的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为GG纯合型，只在含有引物IP2-1R1-3的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为AA纯合型，而在两次PCR反应中均能扩增出特异条带的样品基因型为AG杂合型见表3-5。24 东北师范大学硕士学位论文图3-5IP2-1引物基因型鉴定电泳检测图注：A图：引物IP2-1R1-2电泳检测结果，B图：引物IP2-1R1-3电泳检测结果。样品依次为：ZYD06162，ZYD02996，ZYD03174，ZYD01015，ZYD01060，ZYD02002表3-5IP2-1引物基因型鉴定结果编号第一次PCR第二次PCCR基因型（IP2-1R1-2）（IP2-1R1-3）ZYD006162+-GGZYD02996-+AAZYD03174+-GGZYD01015+-GGZYD01060-+AAZYD02002-+AA注：+表示有特异条带；-表示无特异条带25 东北师范大学硕士学位论文为验证两条特异引物的准确性，用IP2-1分子标记的测序引物（表3-4）对9份野生大豆基因组DNA进行PCR扩增，选取扩增出特异条带，并与预期长度一致约545bp的PCR产物测序。将测序结果输入Bioedit软件中，与从Phytomozev10.3数据库中获得的DNA序列进行比对，分析有效测序片段显示（图3-6），只有特异引物IP2-1R1-2检测出目的条带的样品，其测序结果在该SNP位点处碱基为G，符合预期基因型GG。而只有特异引物IP2-1R1-3检测出目的条带的样品，其测序结果在该SNP位点处碱基为A，符合预期基因型AA。可见IP2-1标记能够准确分型。图3-6IP2-1分子标记测序结果比对3.3.3IP5-1标记的准确性评价多次筛选获得分子标记IP5-1的两条特异引物为IP5-1R1-2和IP5-1R1-3见表3-2，两者分别能扩增出不同的特异条带，可以作为互补引物。其中引物IP5-1R1-2是在突变，，位点3末端第三个位点处引入C/T强错配类型，引物IP5-1R1-3是在突变位点3末端第四个位点处引入A/G强错配类型。根据已经获得QTL信息分析可知IP5-1位点发生A/G转换，引物IP5-1R1-2与碱基G匹配，而引物IP5-1R1-3与碱基A匹配。将两次PCR反应产物分别用1%的琼脂糖凝胶检测如图3-7，只在含有引物IP5-1R1-2的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为GG纯合型，只在含有引物IP5-1R1-3的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为AA纯合型，而在两次PCR反应中均能扩增出特异条带的样品基因型为AG杂合型见表3-6。26 东北师范大学硕士学位论文图3-7IP5-1引物基因型鉴定电泳检测图注：A图：引物IP5-1R1-2电泳检测结果，B图：引物IP5-1R1-3电泳检测结果。样品依次为：ZYD02631，ZYD01196，ZYD01185，ZYD03154，ZYD02996，ZYD01015表3-6IP5-1引物基因型鉴定结果编号第一次PCR第二次PCCR基因型（IP5-1R1-2）（IP5-1R1-3）ZYD02631+-GGZYD02996-+AAZYD03154++AGZYD01015-+AAZYD01196-+AAZYD01185+-GG注：+表示有特异条带；-表示无特异条带27 东北师范大学硕士学位论文为验证两条特异引物的准确性，用IP5-1分子标记的测序引物见表3-4对7份野生大豆基因组DNA进行PCR扩增，选取扩增出特异条带，并与预期长度一致约338bp的PCR产物测序。将测序结果输入Bioedit软件中，与从Phytomozev10.3数据库中获得的DNA序列进行比对，分析有效测序片段显示（图3-8），只有特异引物IP5-1R1-2检测出目的条带的样品，其测序结果在该SNP位点处碱基为G，符合预期基因型GG。而只有特异引物IP5-1R1-3检测出目的条带的样品，其测序结果在该SNP位点处碱基为A，符合预期基因型AA。可见IP5-1标记能够准确分型。图3-8IP5-1分子标记测序结果比对3.3.4G1-1标记的准确性评价多次筛选获得分子标记G1-1的两条特异引物为G1-1R1-1和G1-1R1-2见表3-2，两者分别能扩增出不同的特异条带，可以作为互补引物。其中引物G1-1R1-1是在突变位，，点3末端第二个位点处引入A/T中错配类型，引物G1-1R1-2是在突变位点3末端第三个位点处引入C/T强错配类型。根据已经获得QTL信息分析可知G1-1位点发生A/T颠换，引物G1-1R1-1与碱基T匹配，而引物G1-1R1-2与碱基A匹配。将两次PCR反应产物分别用琼脂糖凝胶检测如图3-9，只在含有引物G1-1R1-1的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为TT纯合型，只在含有引物G1-1R1-2的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为AA纯合型，而在两次PCR反应中均能扩增出特异条带的样品基因型为AT杂合型见表3-7。28 东北师范大学硕士学位论文图3-9G1-1引物基因型鉴定电泳检测图注：A图：引物G1-1R1-1电泳检测结果，B图：引物G1-1R1-2电泳检测结果。样品依次为：ZYD02411，ZYD02996，ZYD01015，ZYD01060，ZYD02002，ZYD00303表3-7G1-1引物基因型鉴定结果编号第一次PCR第二次PCCR基因型（G1-1R1-1）（G1-1R1-2）ZYD002411+-TTZYD02996+-TTZYD01015+-TTZYD01060-+AAZYD02002-+AAZYD00303-+AA注：+表示有特异条带；-表示无特异条带29 东北师范大学硕士学位论文为验证两条特异引物的准确性，用G1-1分子标记的测序引物（表3-4）对9份野生大豆基因组DNA进行PCR扩增，选取扩增出特异条带，并与预期长度一致约565bp的PCR产物测序。将测序结果输入Bioedit软件中，与从Phytomozev10.3数据库中获得的DNA序列进行比对，分析有效测序片段显示（图3-10），只有特异引物G1-1R1-1检测出目的条带的样品，其测序结果在该SNP位点处碱基为T，符合预期基因型TT。而只有特异引物G1-1R1-2检测出目的条带的样品，其测序结果在该SNP位点处碱基为A，符合预期基因型AA。可见G1-1标记能够准确分型。图3-10G1-1分子标记测序结果比对3.3.5AVE3标记的准确性评价多次筛选获得分子标记AVE3的两条特异引物为A3R2-1和A3R2-2见表3-2，两者，分别能扩增出不同的特异条带，可以作为互补引物。其中引物A3R2-1是在突变位点3，末端第二个位点处引入A/G强错配类型，引物A3R2-2是在突变位点3末端第三个位点处引入A/G强错配类型。根据已经获得QTL信息分析可知AVE3位点发生A/C颠换，引物A3R2-1与碱基A匹配，而引物A3R2-2是与碱基C匹配。将两次PCR反应产物分别用琼脂糖凝胶检测如图3-11，只在含有引物A3R2-1的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为AA纯合型，只在含有引物A3R2-2的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为CC纯合型，而在两次PCR反应中均能扩增出特异条带的样品基因型为AC杂合型见表3-8。30 东北师范大学硕士学位论文图3-11AVE3引物基因型鉴定电泳检测图注：A图：引物A3R2-1电泳检测结果，B图：引物A3R2-2电泳检测结果。样品依次为：ZYD01185，ZYD02996，ZYD01060，ZYD02171，ZYD00303，ZYD02798，ZYD00509表3-8AVE3引物基因型鉴定结果编号第一次PCR第二次PCCR基因型（A3R2-1）（A3R2-2）ZYD01185+-AAZYD02996-+CCZYD01060-+CCZYD02171+-AAZYD00303-+CCZYD02798+-AAZYD00509-+CC注：+表示有特异条带；-表示无特异条带31 东北师范大学硕士学位论文为验证两条特异引物的准确性，用AVE3分子标记的测序引物见表3-4对8份野生大豆基因组DNA进行PCR扩增，选取扩增出特异条带，并与预期长度一致约599bp的PCR产物测序。将测序结果输入Bioedit软件中，与从Phytomozev10.3数据库中获得的DNA序列进行比对，分析有效测序片段显示（图3-12），只有特异引物A3R2-1检测出目的条带的样品，其测序结果在该SNP位点处碱基为A，符合预期基因型AA。而只有特异引物A3R2-2检测出目的条带的样品，其测序结果在该SNP位点处碱基为C，符合预期基因型CC。可见AVE3标记能够准确分型。图3-12AVE3分子标记测序结果比对3.3.6AVE1标记的准确性评价多次筛选获得分子标记AVE1的两条特异引物为A1R1-1和A1R1-2见表3-2，两者，分别能扩增出不同的特异条带，可以作为互补引物。其中引物A1R1-1是在突变位点3，末端第三个位点处引入G/T中错配类型，引物A1R1-2是在突变位点3末端第四个位点处引入A/C中错配类型。根据已经获得QTL信息分析可知AVE1位点发生A/C颠换，引物A1R1-1与碱基A匹配，而引物A1R1-2与碱基C匹配。将两次PCR反应产物分别用琼脂糖凝胶检测，只在含有引物A1R1-1的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为AA纯合型，只在含有引物A1R1-2的PCR体系中能扩增出特异条带的样品基因型为CC纯合型，而在两次PCR反应中均能扩增出特异条带的样品基因型为AC杂合型。为验证两条特异引物的准确性，用AVE1分子标记的测序引物见表3-3对4-6份野生大豆基因组DNA进行PCR扩增，选取扩增出特异条带，并与预期长度一致约630bp的PCR产物送测序。将测序结果输入Bioedit软件中，与从Phytomozev10.3数据库中获得的DNA序列进行比对，分析有效测序片段显示，测序结果无法与目的DNA序列比对出有效片段，因此不能度确定该位点的基因型。猜测可能是引物特异性较弱，无法扩增出目的条带，也可能存在其他相似突变位点。可见AVE1标记不能够准确分型。3.4SNP标记与SCN抗性的关联性分析本论文开发的5个SNP标记均能准确的鉴定供试野生大豆种质的基因型（2.3部分）。32 东北师范大学硕士学位论文利用这5个SNP标记对遗传变异较大的51份野生大豆种质进行了分型，结合野生大豆种质对SCN的抗性，探讨SNP标记与SCN抗性的关联性。3.4.1IP1-1标记与SCN抗性的关联性利用SNP标记IP1-1对51份野生大豆材料（见表2-1）进行基因型鉴定（图3-13）。图3-13IP1-1PCR产物电泳检测图注：样品依次为ZYD00847，ZYD00509，ZYD01015，ZYD01185，ZYD02542，ZYD01672分析PCR带型检测结果，统计51份野生大豆种质中：基因型为AA的有33份，基因型为TT的有15份，基因型为AT的有2份，另外有1株两条引物均没有检测出目的条带，可能为其它突变类型，也可能为DNA降解或实验操作失败。51份野生大豆资源中有37份表现为对胞囊线虫抗病，有11份表现为对胞囊线虫感病，IP1-1标记SNP位点基因型在抗病种质和感病种质的分布见表3-9。37份抗病种质中，有30份种质基因型为AA，占81.1%，7份种质的基因型为TT，占18.9%；11份感病种质中，有3份种质基因型为AA，占27.2%，有8份种质的基因型为TT，占72.7%。2采用2*2独立测验模型分析，得χ>3.84，P<0.05，表明AA基因型和TT基因型在抗、感材料中分布表现为0.05水平显著差异，因此分子标记IP1-1与大豆SCN抗性相关联。表3-9IP1-1标记SNP位点基因型在抗、感种质中的分布引物基因型抗病感病P份数频率份数频率IP1-1F1-1AA3081.1%327.2%0.0007IP1-1F1-2TT718.9%872.7%2χ0.05,1=3.8433 东北师范大学硕士学位论文3.4.2IP2-1分子标记关联性分析利用分子标记IP2-1的两条特异引物对51份野生大豆材料（见表2-1）进行基因型鉴定，PCR扩增电泳检测，得到长度约330bp的单一特异条带如图3-14。图3-14IP2-1PCR产物电泳检测图注：样品依次为ZYD02996，ZYD02411，ZYD01060，ZYD02002，ZYD00303，ZYD02585，ZYD00168，H2O分析PCR带型检测结果，统计51份野生大豆种质中：基因型为AA的有34份，基因型为GG的有13份，基因型为AT的有4份。51份野生大豆资源中有36份表现为对胞囊线虫抗病，有11份表现为对胞囊线虫感病，IP2-1标记SNP位点基因型在抗病种质和感病种质的分布见表3-10。36份抗病种质中，有30份种质基因型为AA，占81.1%，6份种质的基因型为GG，占16.7%；11份感病种质中，有4份种质基因型为AA，占36.4%，有7份种质的基因型为GG，占63.6%。2采用2*2独立测验模型分析，得χ>3.84，P<0.05，表明AA基因型和GG基因型在抗、感材料中分布表现为0.05水平存在差异，因此分子标记IP2-1与大豆SCN抗性相关联。表3-10IP2-1标记SNP位点基因型在抗、感种质中的分布引物基因型抗病感病P份数频率份数频率IP2-1R1-2GG616.7%763.6%0.002IP2-1R1-3AA3083.3%436.4%2χ0.05,1=3.843.4.3IP5-1分子标记关联性分析利用分子标记IP5-1的两条特异引物对51份野生大豆材料（见表2-1）进行基因型34 东北师范大学硕士学位论文鉴定，PCR扩增电泳检测，得到长度约246bp的单一特异条带如图3-15。图3-15IP5-1PCR产物电泳检测图注：样品依次为ZYD01015，ZYD00509，ZYD02798，ZYD02709，ZYD02411，ZYD00303，ZYD02002，ZYD03022分析PCR带型检测结果，统计51份野生大豆种质中：基因型为AA的有23份，基因型为GG的有23份，基因型为AT的有4份，另外有1株两条引物均没有检测出目的条带，可能为其它突变类型，也可能为DNA降解或实验操作失败。51份野生大豆资源中有35份表现为对胞囊线虫抗病，有11份表现为对胞囊线虫感病，IP5-1标记SNP位点基因型在抗病种质和感病种质的分布见表3-11。35份抗病种质中，有19份种质基因型为AA，占54.2%，16份种质的基因型为GG，占45.7%；11份感病种质中，有4份种质基因型为AA，占36.4%，有7份种质的基因型为GG，占63.6%。2采用2*2独立测验模型分析，得χ>3.84，P<0.05，表明AA基因型和GG基因型在抗、感材料中分布表现为0.05水平存在差异，因此分子标记IP5-1与大豆SCN抗性相关联。表3-11IP5-1标记SNP位点基因型在抗、感种质中的分布引物基因型抗病感病P份数频率份数频率IP5-1R1-2GG1645.7%763.6%0.299IP5-1R1-3AA1954.2%436.4%2χ0.05,1=3.843.4.4G1-1分子标记关联性分析利用分子标记G1-1的两条特异引物对51份野生大豆材料（见表2-1）进行基因型鉴定，PCR扩增电泳检测，得到长度约381bp的单一特异条带如图3-16。35 东北师范大学硕士学位论文图3-16G1-1PCR产物电泳检测图注：样品依次为ZYD02798，ZYD02171，ZYD00168，ZYD02002，ZYD01060，ZYD01895，ZYD02695，ZYD00659分析PCR带型检测结果，统计51份野生大豆种质中：基因型为AA的有28份，基因型为TT的有19份，基因型为AT的有4份。51份野生大豆资源中有36份表现为对胞囊线虫抗病，有11份表现为对胞囊线虫感病，G1-1标记SNP位点基因型在抗病种质和感病种质的分布见表3-12。36份抗病种质中，有23份种质基因型为AA，占63.9%，13份种质的基因型为TT，占36.1%；11份感病种质中，有6份种质基因型为TT，占54.5%，有5份种质的基因型为AA，占45.5%。2采用2*2独立测验模型分析，得χ<3.84，P>0.05，表明AA基因型和TT基因型在抗、感材料中分布差异不显著，因此分子标记G1-1与大豆SCN抗性不相关。表3-12G1-1标记SNP位点基因型在抗、感种质中的分布引物基因型抗病感病P份数频率份数频率G1-1R1-1TT1336.1%654.5%0.275G1-1R1-2AA2363.9%545.5%3.4.5AVE3分子标记关联性分析利用分子标记AVE3的两条特异引物对51份野生大豆材料（见表2-1）进行基因型鉴定，PCR扩增电泳检测，得到长度约310bp的单一特异条带如图3-17。36 东北师范大学硕士学位论文图3-17AVE3PCR产物电泳检测图注：样品依次为H2O，ZYD00509，ZYD01060，ZYD02171，ZYD00303，ZYD02798，ZYD02002，ZYD03022，ZYD02260，ZYD02411，ZYD02173分析PCR带型检测结果，统计51份野生大豆种质中：基因型为AA的有17份，基因型为CC的有29份，基因型为AT的有2份。另外有3株两条引物均没有检测出目的条带，可能为其它突变类型，也可能为DNA降解或实验操作失败。51份野生大豆资源中有35份表现为对胞囊线虫抗病，有11份表现为对胞囊线虫感病，AVE3标记SNP位点基因型在抗病种质和感病种质的分布见表3-12。35份抗病种质中，有11份种质基因型为AA，占31.4%，24份种质的基因型为CC，占68.5%；11份感病种质中，有6份种质基因型为AA，占54.5%，有5份种质的基因型为CC，占245.5%。采用2*2独立测验模型分析，得χ<3.84，P>0.05，表明AA基因型和CC基因型在抗、感材料中分布差异不显著，因此分子标记AVE3与大豆SCN抗性不相关。表3-12AVE3标记SNP位点基因型在抗、感种质中的分布引物基因型抗病感病P份数频率份数频率AVE3-1R2-1AA1131.4%654.5%0.166AVE3-1R2-2CC2468.5%545.5%3.5SNP标记辅助抗性选择的有效性评价本论文开发的6个SNP标记中，有2个标记IP1-1和IP2-1与抗性相关联。利用IP1-1和IP2-1两个标记对33份来自绥农14/ZYD03685的F2后代进行基因型鉴定，并结合这些F2后代的抗病性评价标记辅助选择的有效性。3.5.1IP1-1标记辅助抗性选择的有效性评价以33份野生大豆F2后代及其抗病性为试验材料见表2-2，利用开发的与抗性相关37 东北师范大学硕士学位论文联的分子标记IP1-1对这33份材料进行了基因型鉴定（见表3-13），并结合33份材料的SCN抗性评价标记辅助选择效率。在引物IP1-1F1-1鉴定出的7份AA基因型材料中，包括5份抗病材料，该标记评价抗病的准确率为71.4%（5/7）；在引物IP1-1F1-2可以鉴定出的20份TT基因型材料中，包括19份感病材料，因而该标记用于评价感病的准确率达95%（19/20）。表3-13IP1-1标记SNP位点基因型在33份F2后代中的分布引物基因型抗病抗病筛感病感病筛份数选效率份数选效率IP1-1F1-2TT171.4%1995%IP1-1F1-1AA523.5.2IP2-1标记辅助抗性选择的有效性评价以33份野生大豆F2后代及其抗病性为试验材料见表2-2，利用开发的与抗性相关联的分子标记IP2-1对这33份材料进行了基因型鉴定（如表3-14），并结合33份材料的SCN抗性评价标记辅助选择效率。在引物IP2-1R1-2能鉴定出的20份GG基因型材料中，全部为感病材料，可见该标记评价感病的准确率为100%（20/20）。在引物IP2-1R1-3鉴定出的9份AA基因型材料中，有6份为抗病材料，因而该标记用于评价抗病的准确率达66.7%（6/9）。表3-14IP2-1标记SNP位点基因型在33份F2后代中的分布引物基因型抗病抗病筛感病感病筛选效率选效率IP2-1R1-2GG066.7%20100%IP2-1R1-3AA6338 东北师范大学硕士学位论文讨论4.1等位基因特异PCR优化等位基因特异PCR反应非常灵敏，其扩增产物的效果与PCR反应的程序以及PCR反应体系中的各组分用量都密切相关。退火温度对SNP位点分型的准确性影响很大，在不同的退火温度下，可导致同一特异引物是否能够准确鉴定不同的基因型。因此本试验重点通过多次筛选、调整PCR退火温度使同一样品在一组互补引物中可以扩增出带型相反的特异条带。在不影响特异性前提下，采用统一的PCR反应体系和反应程序，根据各自片段长度设置相应的延伸时间。4.2特异引物中错配碱基类型与位置对SNP分型准确性的影响前人研究表明，在特异引物3，末端第2，3，4的位置引入错配碱基，可获得较为理想的特异产物。碱基错配类型可分为3类:C/T和G/A为强错配碱基类型；C/A和G/T为弱错配碱基类型；A/A、C/C、G/G和T/T为中等错配碱基类型。一般遵守强弱搭配，或者中中搭配的原则。参照前人总结出的特异引物设计基本原则，本研究最终筛选到6组特异引物，它们的错配碱基均在3，末端第2，3，4的位置，碱基搭配也是首选强弱搭配原则。不同分子标记其错配碱基位置和碱基搭配类型都有所不同，这可能与氢键、碱基堆积力等有关。因此针对每一个分子标记都设计了多条特异引物，期望获得最理想的扩增效果。4.3抗性关联SNP标记的辅助选择效率评价分子标记辅助选择是分子育种的重要环节，而分子标记与目标性状的关联程度（或连锁程度）则直接关系到分子标记辅助选择的效率。本研究开发了5个SNP分子标记，其中标记IP1-1、IP2-1与SCN抗性显著相关，而IP5-1、G1-1、AVE3标记与抗性相关不显著。利用与SCN抗性相关联的分子标记IP1-1和IP2-1对33份杂交后代材料进行基因型鉴定，评价标记辅助选择效率。其中引物IP1-1对感病种质材料的筛选效率为95%，对抗病材料资源的筛选效率可达71.4%，引物IP2-1对感病材料的筛选效率可达100%，对抗病种质材料的筛选效率为66.7%。在这两个标记中对感病材料的筛选效率均达到90%以上，与抗病标记结合使用，可以用来淘汰育种材料中的感病材料，为分子育种提供辅助选择手段。而两个分子标记对抗病材料的筛选效率较低，其中引物IP1-1R1-3对抗病材料的筛选效率为66.7%。在评价分子标记辅助效率有效性中，材料总数达到统计数量39 东北师范大学硕士学位论文评价意义，但其中抗病材料数目有限，略微偏低，可能造成得到的分子标记对抗病材料的辅助筛选效率存在一定误差。40 东北师范大学硕士学位论文结论1.根据本课题组已经获得的抗大豆胞囊线虫QTLs信息开发了6个基于PCR的SNP标记（IP1-1，IP2-1，IP5-1，G1-1，AVE1，AVE3），其中5个标记（IP1-1，IP2-1，IP5-1，G1-1，AVE3）可以准确地对供试野生大豆种质进行基因型鉴定。2.以51份遗传变异较大的野生大豆种质为试验材料，分析了开发的5个SNP分子标记与SCN抗性的关联性，其中SNP标记IP1-1和IP2-1与抗性显著关联，而其它3个SNP标记IP5-1、G1-1和AVE3与抗性关联不显著。3.应用与抗性相关联的分子标记IP1-1和IP2-1，对33份来自杂交组合绥农14/ZYD03685的F2后代进行基因型鉴定，评价了SNP标记辅助选择的有效性。其中引物IP1-1F1-1对大豆SCN抗病资源的筛选效率可达71.4%，引物IP1-1F1-2对大豆SCN感病资源的筛选效率可达95%；引物IP2-1R1-3对大豆SCN抗病资源的筛选效率可达66.7%，引物IP2-1R1-2对大豆SCN感病资源的筛选效率可达100%。表明开发的标记具有一定的选择效率，可用来初步筛选大豆SCN抗病或感病材料，为分子育种提供辅助选择手段。41 东北师范大学硕士学位论文参考文献[1]刘维志.植物病原线虫学.北京:中国农业出版社,2000,281-282.[2]OkadaT.ThehatchingresponsesofthesoybeancystnematodeHeteroderaglycinesIchinoche(Tylenchida:Heteroderidae)[J].AppliedEntomologyZoology.1971,6:91-3.[3]RiggsRD,SchmidtDP.ComPletecharacteriZationoftheraceschemeforHeteroderaglxcines[J].Nemato.1988,20:392-5.[4]陈景生，李肖白，李泽宇.大豆胞囊线虫生理分化与致病性变异研究进展[J].中国农学通报.2010,26(12):261-265.[5]于宝泉,高林.大豆胞囊线虫病发生和防治研究进展[J].大豆科技.2012,3:29-33.[6]段玉玺,吴刚.植物线虫病害防治[M].北京:中国农业科技出版社,2002,2-10.[7]CookDE,LeeTG,GuoX,etal.CopynumbervariationofmultiplegenesatRhg1mediatesnematoderesistanceinsoybean[J].Science.2012,338(6111):1206-9.[8]NatarajanS,TavakolanM,AlkharoufNW,etal.BioinformationSCNProDB:Adatabasefortheidentificationofsoybeancystnematodeproteins[J].Bioinformation.2014,10(6):387-9.[9]BuxTonEW.RootexudatesfrombananaandtheirrelationshiptostrainsoftheFusariumcausingpanamawilt[J].AnnalsofAppliedBiology.2010,2(50):269-82.[10]李肖白,刘冰,朱长明,等.富锦市大豆胞囊线虫危害现状及其防治措施[J].黑龙江农业科学,2008(3):82-83.[11]DongYS，ZhaoLM，LiuB,etal.ThegeneticdiversityofcultivatedsoybeangrowninChina[J].Genetik.2004,108(5):931-6.[12]李福山，常汝镇，舒世珍.中国的大豆属植物[J].大豆科学.1983,13:109-15.[13]DongYingshan，ZhaoLimei，SunHuan，etal.ThegeneticdiversityofannualwildsoybeansgrowninChina[J].TheoreticalandApplied2001,103(1):98-103.[14]BaekDVJ,ShinC.TheimpactofmicroRNAsonproteinoutput[J].Nature.2008,455:64-71.[15]徐豹,邹淑华,庄炳昌,等.野生大豆(G.soja.)种子贮藏蛋白组份11S/7S的研究[J].作物学报.1990,16(3):235-41.[16]王克晶,李福山.我国野生大豆(G1soja)种质资源及其种质创新利用[J].中国农业科技导报,2000,2(6):69-72.[17]王克晶,李向华,等.国家基因库野生大豆(Glycinesoja)资源最近十年考察与研究[J].植物遗传资源学报.2012,13(4):507-514.[18]吴倩,张磊,黄志平,等.转录组测序及其在野生大豆基因资源发掘中的应用[J].大豆科学.2013,32(6):845-851.[19]王克晶,李向华.中国野生大豆(Glycinesoja)遗传资源主要形态、遗传变异和结构[J].植物遗传资源学报.2012,13(6):917-928.[20]GuoJ,LiuY,WangY,etal.Populationstructureofthewildsoybean(Glycinesoja)inChinaimplicationfrommicrosatelliteanalyses[J].Annalsofbotany.2012,110(4):777-85.[21]杜莉莉,於丙军.栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代耐盐性、农艺性状与籽粒品质分析[J].中国油料作物学报,2010,32(1):77-82.[22]雷勃钧,卢翠华,钱华,等.导入外源总DNA获得优质高蛋白和双高大豆新品系[J].大豆科学,1995,(3)203-208.42 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东北师范大学硕士学位论文致谢时光如歌，岁月如梭，三年的硕士生活弹指间已接近尾声，对于即将离开校园，步入社会的我，三年的生活是宝贵的回忆与经历。尤记得刚踏入校园时的手足无措，对实验室新事物的好奇无知，到今天的轻车熟路，这无疑是我在科研道路上一次质的飞跃，也磨炼了耐性，享受到了努力中的快乐。感恩师生情，面对这样一个充满未知的新环境，一个来自普通学校的我，有着深深的自卑和彷徨，但当我真正踏入刘宝教授实验室时，丝毫未感觉到孤独，刘老师慈祥的微笑，亲切的关怀使我很快融入到这个大家庭中。在这个大家庭中，我学习到了先进的实验技术，掌握了基本的实验技能，这为后期能顺利完成毕业论文奠定坚实的理论和实践基础，在此表示深深的感谢。研究生的第二年，我来到了吉林省农业科学院董英山研究员的科研团队，本论文是在董老师的细心关怀与帮助下完成的。董老师严谨的科研态度，专业的科研知识，以及对科研的无私奉献深深的感染了我。带着无限的感恩，真诚的感谢董老师给予我的支持与帮助。在此期间还要特别感谢袁翠平老师，无论是从实验的选题、实施、论文撰写等方面袁老师都给予了我莫大的帮助。论文能够顺利完成离不开袁老师的辛勤付出与真诚帮助，袁老师实事求是的科研精神，身体力行的工作态度不仅帮助我顺利完成硕士论文，也将在我未来的人生路上产生深远的影响。在此怀着一颗感恩的心对袁老师真诚的说一声谢谢老师，您辛苦了。还要感谢在实验和生活中给予指导和帮助的赵洪锟老师，庞劲松老师，刘晓东老师，王玉民老师、姜丽丽老师。十分感谢小伙伴赵勇、于金凤、赵丽楠等同学的热心帮助。感谢所有照顾、帮助、关怀过我的老师和同学们，愿大家一生平安。最后，还要感谢我的家人，是你们支持我选择远方，不畏风雨兼程；是你们教会我坚强，学会宽容。未来的路我会继续努力，成为你们心中的骄傲。45
