小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用

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分类号：S432.2学校代码：10712UDC：632研究生学号：2013060058密级：公开2017届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用学科专业：植物病理学研究方向：植物免疫研究生朱晓果指导教师：康振生教授郭军教授完成时间：2017.09中国陕西杨凌 Classificationcode:S432.2Universitycode:10712UDC:632Postgraduatenumber:2013060058Confidentialitylevel:PublicDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2017FUNCTIONALCHARACTERIZATIONOFGENESINVOLVEDINMAPKSIGNALINGPATHWAYINSTRIPERUSTANDTHEIRAPPLICATIONINWHEATBREEDINGFORRUSTRESISTANCEMajor:PlantPathologyResearchfield:PlantImmunityNameofPostgraduate:ZhuXiaoguoAdviser:ProfessorKangZhenshengProfessorGuoJunDateofsubmission:2017.9YanglingShaanxiChina 本研究由国家“973”计划项目（2013CB127700）、“111”创新引智计划（B07049）、现代农业产业技术体系（CARS-3-1-11）、农业部行业专项（200903035-02）以及国家自然科学基金项目（30930064和31371889）支持。 研宄生学位（毕业）论文的独创性声明本人声明：所呈交的博士学位（毕业）论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定如果违反此规定一切后果与法律责任均》，，由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材一工料。与我同作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：￡１时间：２年月日朱＾〇丨７＂对导师指导研究生学位（毕业）论文的承诺本人承诺：我的博士研究生所呈交的博士学位（毕业）论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。？：身十７ 关于研宄生学位（毕业）论文使用授权的说明本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。人意西北农林技大本同科保或向关部或机构送交论文的纸版和电论文被学存国家有门质子版允许查阅和借阅；，同意西北农林科技大学将本学位（毕业）论文的全或分内容授权汇编录入《国博部部中士位论文全文数据。》进行出版相关权益学库，并享受人保证业工在（或者）西北后表者用本离开作调离农林科技大学发或使本学，毕，工一位（业）论文及成技名否毕其相关的作果时将以西北农林大学为署单位，则，科第，愿意按人民共和作权法等有关规定受处理承担法任。《中华国著》接并律责任何收和保论文各版的他位和人包括研究生人经论文存管本种本其单个本未本）（者的同意不有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的作导师，得行为否则按违背《人民共和国著作权法》等关规定处理追究法律责任。，，中华有并（保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描保、汇）复制手段存编论文研曰究生签名：时间：月年１１；朱：日师签名间：导时士年月＂？ 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用摘要由小麦专化型条形柄锈菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici）引起的小麦条锈病是小麦生产上的一种重要的真菌病害。目前，生产上主要通过抗病品种的应用并辅以药剂来防治该病害。然而，由于小麦条锈菌毒性的频繁变异产生新的毒性小种，导致现有小麦品种的抗病性降低；同时化学药剂的大量使用容易造成环境污染。因此，寻找新的抗病策略及创制新的持久抗病材料对小麦条锈病的持久控制具有重要的理论和实践意义。寄主诱导的基因沉默（Host-InducedGeneSilencing,HIGS）技术是在RNA干扰（RNAinterference,RNAi）技术可提高植物抗病性的基础上发展起来的，它既可以从反向遗传学方向鉴定植物专性寄生病原菌的基因功能，又可以通过构建HIGS载体培育转基因抗病作物，因而成为一种全新的了解植物病原物与寄主互作和控制病害的工具。然而，利用HIGS技术实现小麦对条锈病高效持久抗性的研究尚未见报道。本研究在小麦条锈菌全基因组测序的基础上，对真核生物中进化上保守的一类MAPK级联途径激酶基因开展研究，明确了它们在小麦条锈菌侵染、定殖及致病中的作用；并在此基础上，构建了小麦条锈菌中MAPKK基因PsFUZ7的RNAi载体，利用HIGS技术赋予了小麦对条锈菌的稳定持久的抗病性。获得的主要结果如下：1.对小麦条锈菌全基因组数据库进行深入分析，获得七个FUS3/Kss1类MAPK级联途径候选基因。其中包括：PsUBC2（adaptorprotein）、PsKPP4（MAPKKK）、PsFUZ7（MAPKK）、PsKPP2、PsKPP6和PsCRK1（MAPK）、PsPRF1（Transcriptionfactor,TF）。转录表达分析表明，除PsKPP2外，其余相关基因在小麦条锈菌侵染前期均上调表达，暗示这6个MAPK相关基因可能在病菌前期的侵染定殖和菌丝蔓延过程中发挥着重要的作用。酵母双杂交实验表明，MAPK级联途径基因的相互作用在小麦条锈菌中是保守的。利用病毒介导的基因瞬时沉默（Virus-InducedGeneSilencing，VIGS）技术发现，瞬时沉默PsKPP4、PsFUZ7、PsKPP6、PsCRK1和PsPRF1基因后，条锈菌致病力均有不同程度的减弱，但沉默PsFUZ7后的表型最为显著，说明这些基因不同程度参与到调节小麦条锈菌生长发育和致病性的过程中，而PsFUZ7可能处于其核心位置。2.前期VIGS结果表明PsKPP4基因可能在侵染过程中发挥重要作用，因此我们对PsKPP4激酶基因进行进一步的功能分析。通过生物信息学分析发现PsKPP4有典型的磷酸化位点。酵母双杂交实验发现PsKPP4中的SAM（SterilealphaMotif）结构域在PsKPP4与PsUBC2的互作中发挥着重要作用。原生质体定位结果证实PsKPP4激酶蛋白定位于细胞质中。PsKPP4能够部分恢复稻瘟菌突变体mst11附着胞的形成及致病性， 说明PsKPP4有一定的功能保守性。酵母中过表达PsKPP4基因后对外界胁迫的抗性与对照相比有所提高。在烟草中表达PsKPP4可以抑制BAX诱导产生的细胞程序性死亡过程（PCD），表明它们具有潜在的抑制植物防卫反应的功能。利用VIGS瞬时沉默PsKPP4后，条锈菌致病力减弱，产孢量下降。这些结果表明PsKPP4是条锈菌重要的致病因子，是MAPK级联途径参与到调控菌丝发育和致病性过程中的重要基因。3.序列分析发现转录因子PsPRF1是一个具有HMG结构域的蛋白。进一步研究发现它可以诱导植物和酵母菌的细胞坏死，并且具有核酸酶的活性。推测PsPRF1功能可能是一方面调节真菌自身的凋亡；另一方面参与到降解植物DNA的过程当中。PsPRF1的具体功能还需要进一步的实验探索。4.生物信息学分析表明PsFUZ7是一个典型的MAPK激酶，有着保守的磷酸化位点。互补实验发现，小麦条锈菌PsFUZ7能够部分恢复稻瘟菌突变体mst7附着胞的形成及致病性。酵母中过表达PsFUZ7后，酵母细胞呈现纺锤状且发生凝聚，并对外界胁迫的抗性显著高于对照，而且细胞核呈弥散状。用U0126抑制剂处理小麦条锈菌夏孢子后，孢子芽管的萌发受到抑制；接种到小麦叶片后，条锈菌产孢减少且不易散开。利用VIGS瞬时沉默PsFUZ7后，小麦条锈菌致病力明显减弱。组织学观察发现，沉默植株中条锈菌的菌丝在生长发育不同的时间点均受到抑制。5.根据功能分析结果选取PsFUZ7作为靶标基因构建小麦稳定的HIGS转基因材料。利用pAHC25-PsFUZ7系统构建RNAi载体，通过基因枪轰击方法得到小麦转基因株系。在阳性植株上接种小麦条锈菌进行抗病性鉴定，结果发现小麦条锈菌扩展能力和产孢量显著降低，小麦叶片产生坏死现象。证明携带HIGS载体的转基因植物可以产生siRNA干扰PsFUZ7靶基因，从而限制真菌生长并降低其致病力。为验证脱靶现象（Off-target），生物信息学分析小麦和小麦条锈菌转录组中存在的1-3nt错配的潜在靶标，并挑选最可能的基因进行定量分析。结果显示，这些基因在转基因株系中的表达量并未出现明显的下调，证明选取的这段序列是控制小麦条锈菌的理想靶标。本研究为全面深入研究小麦条锈菌的致病机理奠定了基础，并初步揭示了RNAi技术可以应用于小麦与小麦条锈菌互作的体系中来，为小麦条锈菌的持续防治提供了新的策略。本策略在小麦条锈病上的突破将推动小麦抗锈病的种质创新，并为HIGS技术在植物防控真菌病害的运用中提供了重要的理论依据和技术支撑。关键词：小麦条锈菌；MAPK级联通路；致病机理；RNAi；小麦抗病性 FUNCTIONALCHARACTERIZATIONOFGENESINVOLVEDINMAPKSIGNALINGPATHWAYINSTRIPERUSTANDTHEIRAPPLICATIONINWHEATBREEDINGFORRUSTRESISTANCEABSTRACTItisevidentthatobligatebiotrophicpathogenPucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst)posesasignificantthreattowheatproductionworldwideandjeopardizesglobalfoodsecurity.Currently,theapproachestomanagethisdiseaserelyoncultivarresistancecoupledwithfungicideapplication.However,drivenbyagreaterneedforwheatproduction,thenecessityforenvironmentalprotection,theconstantevolutionofvirulenceinPst,andthelossofnaturalresistanceinwheatcultivars,innovativealternativeapproachesfordurablecontrolofwheatstriperustarerequiredtobeestablished.Apowerfulgenetictool,RNAinterference(RNAi),aconservedeukaryoticmechanismperformingacrucialroleingeneregulation,hasbeenusedtoenhancecropresistancebysilencingcriticalgenes.Basedonthis,host-inducedgenesilencing(HIGS)hasbeeneffectivelydevelopedandwidelyused.Mitogen-activatedproteinkinase(MAPK)cascadesregulateavarietyofcellularprocessesinresponsetoextracellularandintracellularstimuli.Inthisstudy,wecharacterizedthefunctionsofgenesinvolvedinMAPKpathwayofPst.TheMAPKkinasegene,PsFUZ7,whichwasshowntoplayanimportantroleinPstvirulencebyregulatinghyphalmorphologyanddevelopment,wasselectedasRNAitarget.TheseresultsindicatedthattheexpressionofPsFUZ7-RNAiconstructsintransgenicwheatplantsconfersstronganddurableresistancetoPst,alongwithasevererestrictionofPstdevelopment.Theresultswereobtainedasfollows.1.SevenFUS3/Kss1cascadecandidategeneswereobtainedbyusingbioinformaticstechniquefromthegenomedatabaseofPst,includingPsUBC2(adaptorprotein),PsKPP4(MAPKKKhomologousgene),PsFUZ7(MAPKKhomologousgene),PsKPP2,PsKPP6,PsCRK1(allareMAPKhomologousgenes),andPsPRF1(transcriptionfactor).qRT-PCRassayshowedthatsixMAPK-relatedgeneswereup-regulatedattheearlystageofPstinfectionexceptPsKPP2,suggestingthatthesixgenesmayplayanimportantroleintheearlystageofinfectionandmycelialgrowtheffect.Yeasttwo-hybridassayindicatedthattheinteractionbetweenPsUBC2-PsKPP4,PsKPP4-PsFUZ7,PsFU7-KPP6/CRK1exist,indicatingthattheinteractionofMAPKcascadepathwaygenewasconservedinPst.Virus-inducedgenesilencing(VIGS)resultindicatedthatPsKPP4,PsFUZ7,PsKPP6,PsCRK1andPsPRF1playsanimportantroleinmycelialgrowthanddevelopmentwhich eventuallyleadstoasignificantinhibitionofurediagenerationandvirulenceofPst.Theseresultsstrengthentheviewthatthefivegenesmayhaveimportantrolesinpathogenesis.Inaddition,thephenotypeofsilencingPsFUZ7wasthemostsignificant,suggestingthatPsFUZ7maybeatthecoreofthesignalcascadepathwayinPst.2.Inthisstudy,wechoosePsKPP4geneasanimportantcandidategenetoperformfurtherfunctionalanalysis.SequenceanalysisindicatedthatPsKPP4hadtypicalphosphorylationsites.Yeasttwo-hybridassayshowedthatSAMdomaininPsKPP4playsanimportantroleintheinteractionbetweenPsKPP4andPsUBC2.Subcellularlocalizationassay,indicatedthatthePsKPP4waslocalizedinthecytoplasmofwheatprotoplasts.PsKPP4canpartiallycomplementtheMagnaportheoryzaemst11mutantinappressoriumformationandplantinfection,indicatingthatPsKPP4hassomefunctionalconservationamongdifferentspecies.OverexpressionofPsKPP4geneinyeastimprovedtheresistanceofyeastcellstoexternalstresscomparedwiththecontrol.Intobacco,expressionofPsKPP4byusingthePVXexpressionsystemcaninhibitthePCDinducedbyBAX,thatis,itmayinhibittheHRresponseofpathogensandplantinteractions,indicatingthattheyhavethepotentialtoinhibittheplantdefenseresponse.VIGSassayshowedthatsilencingofPsKPP4genecanreducethepathogenicityofPst.TheseresultsindicatedthatPsKPP4isanimportantpathogenicityfactorofPst,andisinvolvedintheregulationofmycelialgrowthandpathogenicity.3.WehavefurtherfoundthatPsPRF1proteinwithHMGdomainhasanucleaseactivityandcaninducenecrosisinplantsandyeasts.OurresultssuggestthatPsPRF1mayregulateitsownapoptosisontheonehandandontheotherhandsmaybeinvolvedinthedegradationofplantDNA.Furtherexperimentsareneededtobeperformedtorevealtheunderlyingmechanism.4.WeselectedPsFUZ7asthekeycandidatekinasegeneforfunctionalanalysis.SequenceanalysisindicatedthatPsFUZ7isatypicalMAPKkinasewithaconservedphosphorylationsite.PsFUZ7partiallycomplementstheMagnaportheoryzaemst7mutantinappressoriumformationandplantinfection,indicatingthatPsFUZ7hassomefunctionalconservationamongdifferentspecies.OverexpressionofPsFUZ7infissionyeastresultsinmorphologicalchangesandanincreasetoenvironmentalstress.Inaccordancewiththeseinvivodata,invitroassaysrevealedthatstriperusturediosporestreatedwiththeinhibitorgerminateatalowerrateandproduceahigherfrequencyofabnormallydifferentiatedandclearlydistortedgermtubesorsphericalstructuresalongthemycelialapexthancontrols.VIGSassayrevealedthatsilencingofPsFUZ7leadstoasignificantinhibitioninmycelial growthanddevelopment,indicatingthatPsFUZ7playsanimportantroleinvirulenceofPst.5.TotestwhetherthestableexpressionofPsFUZ7silencingconstructscanconferresistancetoPst,thePsFUZ7sequencewasintroducedintoHIGSpAHC25system,andtransformedintoTriticumaestivumL.cv.Xinong1376(XN1376)byparticlebombardment.ThepositiveplantswereidentifiedbymolecularbiologydetectionmethodssuchasSouthernblotandPCR.TransgenicwheatlinescarryingHIGSconstructscanproduceandprocesssiRNAmoleculeswhichefficientlydown-regulatePsFUZ7inPst,andalsoaffecttheexpressionofsomerelatedgenesinPstandwheat.HistologicalobservationsshowedthatthegrowthoftheinternodehyphaeinthewheatcarryingtheRNAivectorwasstrictlylimitedcomparedtothecontrolandinducednecrosisinthehostplant.BioinformaticsanalysiswasperformedtoscreensimilarsequenceofPsFUZ7inwheatstriperust,wheat,barleyandhuman,inordertoavoidofftargeteffect.Inaddition,12potentialcandidateswith1-3ntmismatcheswerequantitativelyanalyzedfromthetransgeniclinesofwheatandPst.Theresultsshowedthattheexpressionofthesegeneswasnotsignificantlydown-regulated,anditwasprovedthattheselectedsequenceisanidealtargetforcontrollingwheatstriperust.ThisstudyindicatedthatHIGSisapowerfulstrategytoengineertransgenicwheatresistanceagainsttheobligatebiotrophicpathogenPstandhaspotentialasanalternativenovelapproachtodurablecontrolofwheatstriperust.TheapplicationofHIGSindurablecontrolofwheatstriperustwillspeedupthewheatgermplasminnovationandprovidessolidtheoreticalbasisandtechnicalsupportforthecontrolofplantfungaldiseases.KEYWORDS:Pucciniastiiformisf.sp.tritici(Pst);MAPKcascadepathway;pathogenesis;RNAi;wheatresistance 目录第一章文献综述.......................................................................................................................11.1小麦条锈病概况...........................................................................................................11.1.1小麦条锈病的危害.............................................................................................11.1.2小麦条锈病的生物学特性及流行规律.............................................................21.1.3小麦条锈菌侵染过程与致病机理研究.............................................................31.2小麦品种抗性及病原菌变异.......................................................................................41.2.1小麦条锈菌变异.................................................................................................41.2.2小麦品种抗病性丧失.........................................................................................51.3植物对病原菌的免疫机理...........................................................................................61.4真菌MAPK信号通路进展研究.................................................................................71.4.1酵母MAPK信号途径.......................................................................................81.4.2植物病原真菌FUS3/KSS1途径.....................................................................101.5RNAi介导的基因沉默...............................................................................................141.5.1小干涉RNA（siRNA）的来源......................................................................141.5.2siRNA沉默复合体的形成...............................................................................151.5.3siRNA对下游基因调节...................................................................................151.5.4RNAi在农作物改良种的应用.........................................................................161.6本研究的目的和意义.................................................................................................17第二章小麦条锈菌MAPK信号通路基因鉴定...................................................................192.1引言.............................................................................................................................192.2试验材料.....................................................................................................................192.2.1植物材料...........................................................................................................192.2.2菌株...................................................................................................................202.2.3质粒载体...........................................................................................................202.2.4分子生物学试剂...............................................................................................202.2.5主要仪器...........................................................................................................202.3方法..............................................................................................................................212.3.1小麦条锈菌的繁殖与收集...............................................................................212.3.2小麦条锈菌夏孢子萌发与样品采集...............................................................212.3.3小麦条锈菌夏孢子及接种条锈菌叶片总RNA的提取及纯化..................212.3.4生物信息学分析小麦条锈菌MAPK候选基因.............................................222.3.5MAPK信号通路候选基因的克隆...................................................................22 2.3.6Real-timePCR分析..........................................................................................242.3.7酵母转化...........................................................................................................242.3.8病毒介导的基因沉默实验...............................................................................252.4结果..............................................................................................................................282.4.1小麦条锈菌基因组中MAPK候选基因的鉴定及克隆.................................282.4.2小麦条锈菌MAPK候选激酶基因的转录表达水平特征分析.....................292.4.3酵母双杂验证MAPK候选基因之间互作....................................................302.4.4VIGS沉默实验................................................................................................312.5讨论..............................................................................................................................33第三章小麦条锈菌关键激酶基因PsKPP4及PsKPP6功能分析......................................353.1引言..............................................................................................................................353.2试验材料......................................................................................................................353.2.1植物材料...........................................................................................................353.2.2菌株...................................................................................................................353.2.3质粒载体...........................................................................................................363.2.4分子生物学试剂...............................................................................................363.3方法..............................................................................................................................363.3.1小麦条锈菌的培养...........................................................................................363.3.2小麦条锈菌夏孢子萌发与样品采集...............................................................363.3.3小麦条锈菌夏孢子及接种条锈菌叶片总RNA的提取及纯化..................363.3.4生物信息学分析小麦条锈菌关键激酶基因...................................................363.3.5酵母转化...........................................................................................................363.3.6酵母过表达.......................................................................................................363.3.7抑制剂处理.......................................................................................................373.3.8稻瘟突变体互补...............................................................................................373.3.9Westernblotting.................................................................................................423.3.10小麦条锈菌组织学处理.................................................................................433.3.11原生质体定位.................................................................................................443.3.12农杆菌介导的PVX诱导表达......................................................................453.4结果.............................................................................................................................473.4.1PsKPP4和PsKPP6的蛋白结构分析..............................................................473.4.2保守位点功能分析...........................................................................................523.4.3亚细胞定位.......................................................................................................483.4.4裂殖酵母中过表达激酶基因...........................................................................48 3.4.5抑制剂处理实验...............................................................................................503.4.6稻瘟突变体互补实验.......................................................................................503.4.7农杆菌介导的诱导表达...................................................................................523.4.8VIGS沉默实验.................................................................................................533.5讨论.............................................................................................................................56第四章小麦条锈菌基因PsPRF1功能分析..........................................................................594.1引言.............................................................................................................................594.2试验材料.....................................................................................................................594.2.1植物材料...........................................................................................................594.2.2菌株...................................................................................................................594.2.3质粒载体...........................................................................................................604.2.4分子生物学试剂...............................................................................................604.3方法..............................................................................................................................604.3.1小麦条锈菌的培养...........................................................................................604.3.2原生质体定位...................................................................................................604.3.3酵母过表达.......................................................................................................604.3.4病毒介导的基因沉默实验...............................................................................604.3.5农杆菌介导的PVX病毒诱导表达...............................................................604.3.6同位素检测小片段...........................................................................................604.3.7蛋白表达及纯化...............................................................................................624.4结果.............................................................................................................................624.4.1PsPRF1序列分析..............................................................................................624.4.2亚细胞定位.......................................................................................................634.4.3PsPRF1在酵母中过表达诱导坏死..................................................................644.4.4植物中瞬时表达PsPRF1能引起植物坏死..................................................654.4.5PsPRF1蛋白中保守结构域负责诱导坏死......................................................654.4.6PsPRF1具有核酸酶功能..................................................................................664.4.7PsPRF1功能结构域验证..................................................................................674.4.8VIGS沉默实验.................................................................................................684.5讨论.............................................................................................................................69第五章小麦条锈菌重要激酶基因PsFUZ7的功能分析.....................................................705.1引言.............................................................................................................................705.2试验材料.....................................................................................................................715.2.1植物材料...........................................................................................................71 5.2.2菌株...................................................................................................................715.2.3质粒载体...........................................................................................................715.2.4分子生物学试剂...............................................................................................715.3方法.............................................................................................................................715.3.1小麦条锈菌的繁殖与收集...............................................................................715.3.2小麦条锈菌夏孢子萌发与样品采集...............................................................715.3.3小麦条锈菌夏孢子及接种条锈菌叶片总RNA的提取及纯化..................715.3.4生物信息学分析小麦条锈菌关键激酶基因...................................................715.3.5原生质体定位...................................................................................................715.3.6酵母转化...........................................................................................................715.3.7酵母过表达.......................................................................................................715.3.8抑制剂处理.......................................................................................................715.3.9稻瘟突变体互补...............................................................................................725.3.10病毒介导的基因沉默实验.............................................................................725.3.11小麦条锈菌组织学处理.................................................................................725.3.12农杆菌介导的PVX诱导表达......................................................................725.4结果..............................................................................................................................725.4.1PsFUZ7蛋白结构分析.....................................................................................725.4.2稻瘟突变体互补实验.......................................................................................735.4.3裂殖酵母中过表达PsFUZ7基因...................................................................745.4.4抑制剂处理实验...............................................................................................755.4.5VIGS沉默实验.................................................................................................765.5讨论.............................................................................................................................80第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程......................................................................826.1引言.............................................................................................................................826.2试验材料.....................................................................................................................836.2.1植物材料、菌株及质粒载体...........................................................................836.2.2常用试剂...........................................................................................................836.2.3主要仪器...........................................................................................................836.3方法.............................................................................................................................836.3.1PsFUZ7干涉载体的构建.................................................................................836.3.2基因枪介导法转化小麦...................................................................................836.3.3对转基因小麦后代阳性植株的分子检测.......................................................876.3.4Northernblot......................................................................................................88 6.3.5Southernblot......................................................................................................916.3.6生物量检测.......................................................................................................926.3.7透射样品的制备...............................................................................................936.3.8WGA-Alexa488荧光染色...............................................................................946.3.9条锈菌的沉默效率检测...................................................................................946.4结果.............................................................................................................................946.4.1pAHC25-PsFUZ7干涉载体的构建.................................................................946.4.2T0代转基因植株的PCR检测.........................................................................956.4.3筛选出的L65和L91株系T3代分子鉴定...................................................966.4.4T2代转基因小麦室内生物学抗病性鉴定......................................................976.4.5L65和L91株系T3代的室内抗病性鉴定及分子生物学分析.....................976.4.6小麦条锈菌接种于L65和L91株系后的细胞组织学观察........................1006.4.7小麦条锈菌MAPK通路基因及小麦抗病蛋白的转录水平表达...............1016.4.8小麦条锈菌与小麦之间“分子对话”.............................................................1026.5讨论...........................................................................................................................103第七章全文的总结和展望...................................................................................................105参考文献.................................................................................................................................106附录.....................................................................................................................................117致谢.......................................................................................................................................123个人简介.................................................................................................................................124 第一章文献综述1第一章文献综述1.1小麦条锈病概况1.1.1小麦条锈病的危害谷类作物包括玉米（ZeamaysL.），水稻（OryzasativaL.），小麦（TriticumaestivumL.，TriticumdurumL.等），黑麦(SecalecerealL.)，大麦（HordeumvulgareL.）和燕麦（AvenasativaL.）是人类食物，动物饲料和生物能源的主要来源(Zhaoetal.2016)。小麦作为其中主要的组成部分，发挥着不可或缺的作用。全球大约有215万公顷小麦，每年产量约达6.3亿吨，提供了20%人类所需的热量，预计到2050年，发展中国家地区对小麦的需求将增加60％(Braunetal.2010)。因此，保护这些粮食作物免受生物和非生物胁迫的破坏对于世界粮食安全显得至关重要。然而，近年来由于气温升高，灌溉和肥料成本增加，产量停滞，以及新的毒性病原菌和害虫出现，给小麦的生产及粮食安全带来了巨大的威胁。在各种生物和非生物胁迫中，由条形柄锈菌中的小麦专化型锈菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici，Pst）侵染小麦引起的小麦条锈病破坏性极强(Singhetal.2011)，历史上多次爆发大流行，给小麦生产史上带来了重大的损失(Zhaoetal.2016)。小麦条锈菌主要发病是在在小麦叶片上，同时其他类的禾本科植物如黑麦、大麦和禾草也可称为其寄主。在适宜条件下，小麦条锈病主要为害小麦叶片，也可侵染叶鞘、茎秆及穗部。小麦受到侵染后，在叶片表面出现褪绿斑，后期产生疱状夏孢子堆，裸露后呈现橙黄色。小麦条锈病的流行范围广泛，在世界范围内包括美国（特别是西北），东亚（主要包括中国西北和西南地区），南亚（印度和尼泊尔主要地区），大洋洲（澳大利亚和新西兰），东非（埃塞俄比亚，肯尼亚），阿拉伯半岛（也门）和西欧（东英格兰）等主要的小麦生产国家和地区普遍发生(Wellings2011;Zhaoetal.2016)。在条锈菌平常流行的年份小麦的产量损失达到0.1%-5%，而在大流行的年份带来的产量损失可高达当年产量的50%-60%（表1-1）(Wellings2011)。我国作为世界上小麦条锈病危害面积最大的高发区域，建国以来，在多个年份发生了全国各个主要麦区爆发了多次条锈病大流行，小麦产量损失高达及时亿斤(Wanetal.2004)。涉及西北，西南和华北的冬小麦生长区以及中国西北部的春小麦生长区，包括陕甘宁、豫晋冀、云贵渝、青藏川等高纬度或高海拔的地区(Wanetal.2004)。 2小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用表1-1条锈病主要流行历史回顾及严重性与损失评估(Wellings2011)。Table1Historicalreviewofmajorstriperustepidemicswithcommentsonseverityandlosses(Wellings2011).1.1.2小麦条锈病的生物学特性及流行规律归于担子菌门中的小麦条锈菌是柄锈菌属中的一类真菌，是严格的专性寄生病原菌，能够通过特异的营养分化器官--吸器从活体寄主小麦等的组织中吸收养分，并产生后代(Zhaoetal.2016)。目前发现的专性寄生病原菌主要有以下几个特征：可以分化出特异的侵染结构，比如气孔下囊等；一些酶类，如裂解酶等的分泌受到限制；通过碳水化合物和含蛋白质的区域区分病原物和寄主胞膜；减弱寄主的防卫反应；有着用于营养吸收和代谢的变态结构，如吸器(MendgenandHahn2002)。锈菌的生活史较其它真菌更为复杂，不仅表现在其专性寄生的特性上，更为特别的是它的转主寄生的特性。转主寄生是锈菌特有的需要在两种不同的寄主上生活才能完成其生活史的一种特有现象。美国学者Jin等(2010)及中国学者赵杰等(2013)都曾独立在室内接种及自然条件下证实了小檗可以作为小麦条锈菌的转主寄主。这些研究进一步证明了小麦条锈菌属于全型锈菌（eu-formrust），即需要经过5个发育阶段，分别产生性孢子（Pycniospore）、锈孢子（Aeciospore）、夏孢子（Urediospore）、冬孢子（Teliospore）和担孢子（Basidiospore）五种孢子形态。小麦条锈菌的有性阶段包括性孢子和锈孢子的发育形成均在转主寄主小檗上完成，而夏孢子、冬孢子和担孢子等无性阶段主要在小麦上完成。小麦条锈菌是以夏孢子世代在小麦上完成侵染循环，初侵染来源于转主寄主 第一章文献综述3小檗上产生的锈孢子或者在禾谷类作物越冬或者越夏后的夏孢子。随后，夏孢子经气流传播到感病植物上，在麦类作物的一个生长季节中重复产生、循环侵染，造成小麦条锈病的流行，带来生产上的危害。麦类生长后期，产生能够抵抗不良环境能力的冬孢子，冬孢子在杂草上越冬后萌发产生担孢子。担孢子随风传播到小檗，侵染小檗后在叶片上产生性孢子和锈孢子。至此，小麦条锈菌完成了其全部生活史（图1-1）(Zhengetal.2013)。小麦条锈菌生活史的完善为深入研究条锈病的流行规律和毒性变异机制提供了重要依据。图1-1小麦条锈菌在不同阶段及不同寄主上的生活过程(Zhengetal.2013)。Fig.1-1Thelifeprocessofwheatstriperustindifferentstagesanddifferenthosts(Zhengetal.2013).1.1.3小麦条锈菌侵染过程与致病机理研究条锈菌夏孢子在小麦上的侵染过程主要分为：侵入期、扩展期和发病期。夏孢子经风媒或其他途径降落在感病小麦叶片后，遇到合适的温度（7-10℃）和湿度（水膜存在或100%相对湿度），就会萌发产生芽管(Germtube)(王晨芳2008)。之后芽管沿着小麦叶脉表面到达气孔，侵入气孔后产生气孔下囊（vesicle）。之后形成初生侵染菌丝和吸器母细胞，并特化为吸器深入寄主细胞内，获得营养。吸器在吸收营养过程中并不刺破寄主细胞膜，仅使其在侵入部位产生凹陷。初生吸器吸收营养后继续生长产生更多的侵染菌丝和吸器，经4-5天后，即可扩展为大面积的菌落。之后菌丝在小麦表皮下聚集成堆，14天左右夏孢子堆成熟且突破小麦表皮，继而释放出新的夏孢子(成玉林2015)。 4小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用小麦条锈菌的菌丝可以在小麦组织内不断扩展，直到侵入到整个叶片组织。并且可以在侵入点产生夏孢子堆，同时外缘菌丝可以继续向四周扩展，形成新的一轮孢子堆。夏孢子的大量持续生成也是小麦条锈病爆发流行的一个重要内在原因。对小麦条锈菌侵染小麦过程的深入了解，为我们展开寄主和病原菌互作过程中生化和分子的研究，及进一步明确小麦条锈菌的致病机理奠定了基础。然而，由于锈菌专性寄生的特性限制了锈菌稳定遗传转化体系的建立，导致人们对小麦条锈菌生长关键基因的研究及对小麦条锈菌致病机制的探索严重的滞后。近年来，Guo(2011)利用异源互补技术，将小麦条锈菌中的PsMAPK1基因互补进入赤霉菌和稻瘟菌的同源基因突变体中，明确了PsMAPK1基因功能具有保守性，能够调节小麦条锈菌侵染寄主植物过程，并在菌丝发育过程中发挥着重要作用。而由大麦条纹花叶病毒（BSMV，Barleystripemosaicvirus）作为载体，介导的基因沉默即VIGS技术的出现，为专性寄生菌基因功能的研究开辟了新的道路(Chengetal.2015;Yinetal.2011)。目前，VIGS体系已成功建立并广泛应用于专性寄生菌白粉及锈菌功能的研究。Cheng(2015)利用VIGS技术鉴定了一个新的蛋白激酶PsSRPKL，证明了其作为重要的致病性因子在真菌的生长和响应环境的胁迫中发挥着重要的作用，对小麦条锈菌的毒力有着显著的贡献。随后，Liu等(2016)利用VIGS系统敲低PsSOD1的表达降低了小麦条锈病的毒力，通过清除宿主派生的ROS助于小麦条锈菌的侵染。另外，随小麦条锈菌全基因组测序的完成(Zhengetal.2013)，也为人们深入研究小麦条锈菌基因功能及揭示小麦条锈菌的致病分子机制提供了可能。然而，另一方面，虽然借助于各种技术对小麦条锈菌的探索一步步深入，但是如何更加有效的控制小麦条锈仍是有待解决的问题。1.2小麦品种抗性及病原菌变异目前，小麦条锈病的防治主要依赖于化学防治及抗性品种的种植(Chen2014)。化学防治虽然是行之有效的重要措施之一，但自杀菌剂等化学药剂问世以来，人们对其危害环境及人类健康的担忧从未间断。因此，小麦抗病品种的选育及广泛种植，是目前病害防治中最为经济安全且对环境友好的策略。但是，由于条锈菌在自然条件下极易发生变异，持续不断出现新的小种，使现有小麦抗病品种抗锈性很快“丧失”，从而失去农艺和经济价值。1.2.1小麦条锈菌变异小麦条锈菌能够频繁的发生致病性变异，这是造成小麦现有品种抗条锈能力“丧失”的主要原因。小麦条锈菌不断发生致病性变异的途径主要包括基因突变/染色体畸变、异核重组作用和有性生殖(康振生等2015)。突变是条锈菌致病性变异的一个重要途径，其中包括基因的改变，及染色体的畸变等。大多数突变的产生是发生在细胞分裂时，在遗传基因复制时候产生了不可逆转的错 第一章文献综述5误，另外也可能是由于受到化学辐射等引起(康振生等2015)。1932年，Gassner等首次证实了小麦条锈菌可以在一定条件下通过突变诱导产生新的生理小种，出现突变的机率在1.6×10-5和2.0×10-5之间(GassnerandStraib1933)。随后，通过人工射线、化学诱变、生物诱变等方法也被证实可以诱导小麦条锈菌突变从而获得新的致病菌系(商鸿生等1994;黄丽丽等2005;姚秋燕等2006;张如佳等2007)。异核现象是指菌丝体中的单个细胞中同时存在含有两种或多种不同遗传物质的细胞核现象(HansenandSmith1932)。条锈菌不同生理小种之间的菌丝或芽管可以融合而交换和重新组装细胞核。1955年，在小麦杆锈菌中最先发现了由异核作用产生的锈病新致病型(Nelsonetal.1955)。随后，小麦条锈菌中也发现它们可通过异核基因重组产生致病的新小种(LittleandManners1969;WrightandLennard1980)。另外，致病性变异的途径中还包括了有性生殖过程。前期实验发现在小麦叶锈和杆锈中，它们经过有性生殖后可以产生新的小种，从而引起后代群体的致病性变异(Craigie1927;GassnerandStraib1933;Yue2011)。近几年来，田间小檗作为小麦条锈菌的转主寄主被科学家们发现，使得锈菌致病性遗传学的研究也得以进行(Zhaoetal.2013)。另外，室内的研究实验发现，在经过小种间的有性繁殖后，条锈菌遗传物质能够发生分离重组。这个发现进一步验证了条锈菌中存在着有性繁殖，并且可能在致病性变异中发挥重要作用，也在一定程度上解析条锈菌毒性及无毒基因之间的关系(Wanetal.2004)。1.2.2小麦品种抗病性丧失一般来说，由于小麦条锈菌致病性的频繁变异，在生产上应用的小麦品种在使用3-5年后就会“丧失”其抗锈性(陈万权等2013；汪可宁等1986)。1950-2010年间，由于小麦条锈菌的不断变异，引起了致病性丧失。先后造成中国多个小麦品种，如农大183、兰天17（Yr26，Yr26=Yr24）、碧蚂1号（Yr1）、Moro（Yr10）、贵农22（Yr10、YrMor）系列；川麦42（Yr24）等抗条锈性“丧失”，导致了小麦条锈病主要流行区7次大规模的小麦品种更替(康振生和李振岐1984；康振生等1994；贾秋珍等2012；邝文静等2013；胡小平等2014)。2009年，我国分离到了一个新菌系V26（avrYr10/24/26/ch42），已被证明其对Moro（Yr10）、贵农22、川麦42、近等基因系NILS16（Yr24）、NILS17（Yr26）与NILS12（Yr10）及四川38个小麦新品种具有致病性，引起了相关部门的高度警惕(康振生等2015)。2002-2009年在高加索和中亚地区，小麦条锈病的大流行引起哈萨克斯坦南部的小麦品种高度感病及乌孜别克斯坦主要抗病品种抗病性丧失(Ziyaevetal.2011)。上个世纪60年代，条锈病在北美的大流行先后造成小麦品种Moro（含Yr10）(BeaverandPowelson1969)和Suwon92(PurdyandAllan1966)抗锈性的“丧失”。2002年，条锈菌新 6小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用小种PST-78克服了在美国加州广泛种植的小麦品种，引起了条锈病的大流行，给小麦生产带了严重损失(Chen2005)。因此，条锈菌不断变异引起的新的小种的产生是导致小麦品种抗性丧失的重要原因，也严重威胁了小麦的生产和粮食安全。因此，利用现有的种质资源加快抗性品种材料的培育就显得尤为重要。1.3植物对病原菌的免疫机理在植物与病原菌互作过程中，病原菌需要通过各种形式从寄主中获得生长所需的营养物质，而植物为了抵抗病原菌的入侵，进化出了各种防卫机制来免受病原菌的威胁。在寄主植物与病原菌长期互作的过程中，彼此间相互识别、传递细胞信号及交换物质，互相斗争又协同进化，逐渐达到一种动态平衡。在对植物免疫系统的研究中，Jones和Dangl于2006年提出的“zigzag”模型被人们广泛认可(JonesandDangl2006)（图1-2）。自然条件下，植物暴露在各种病原微生物中，但是只有很少部分病原菌能够成功定殖侵染并引起植物病害。这种防卫依赖于自身天然存在的屏障，例如细胞壁、蜡状角质层和和植物抗毒素等，它们在物理和化学层面上阻碍潜在病原菌的生长和扩张(Ingleetal.2006)。而一旦这道物理和化学屏障被突破，植物的跨膜受体蛋白便开始发挥作用，用以识别病原菌的保守分子--微生物或病原菌相关分子模型，然后激发基础防卫反应PTI（PAMPstriggeredimmunity），并表现出抗病性(AlbersheimandAndersonprouty1975;Hahn1996)。细菌鞭毛蛋白、脂多糖、延伸因子Tu（EF-Tu）、卵菌转谷酰胺酶及真菌细胞壁组成成分几丁质、葡聚糖等均可以作为PAMP被植物受体蛋白识别而激发PTI(ZipfelandFelix2005)，PTI则主要表现为活性氧及胼胝质等物质的积累和植物细胞壁乳突的形成等(Felixetal.1999;Dowetal.2000;Gitteetal.2008)。这也是后来提出的在植物与病原菌协同进化过程“中心法则”假说的第一阶段(BentandMackey2007)。第二阶段，病原菌为了克服寄主的基础防卫反应,在侵染过程中会产生一类毒性效应分子即效应蛋白，并分泌到植物细胞内抑制或干扰PTI诱导的抗性，从而诱发寄主植物产生感病反应(effectortriggeredsusceptibility,ETS)。例如，在鞭毛蛋白flagellin诱导的PTI中，细菌中的效应蛋白AvrPto和AvrPtoB可以作用于植物MAPK激酶级联信号途径的上游,抑制一些相关防卫基因的转录表达，从而打断PTI基础防御反应途径(Heetal.1993)。而寄主在与病原菌长期斗争过程中，慢慢形成一类抗性R基因，来识别病原菌分泌的效应蛋白。通过二者之间的相互识别触发一系列信号的传导，激发植物的ETI（Effectortriggeredimmunity）(JonesandDangl2006)。与PTI相比，ETI诱导的抗性反应更为强烈，往往引起病原菌侵染位置附近的植物细胞出现过敏性坏死。寄主植物通过坏死去阻遏病原菌蔓延，诱发寄主一系列的变化，并通过长距离传导信号分子激活下游防卫基因的表达，激发植株自身系统性获得抗性的产生(Tyler2002;Hammond-Kosack 第一章文献综述7andJones1997)。这个过程是“中心法则”的第三阶段。第四阶段中，病原菌为了逃脱被植物识别的压力，通过改变效应蛋白种类、数量或者结构来打破植物原有的ETI，使寄主产生感病反应。主要包括：通过改变现有的效应蛋白来躲避寄主R蛋白的识别；另一方面进化出新的效应基因来抑制寄主植物的ETI。然后，对寄主植物来说，寄主进化出与新的效应蛋白相对应的新抗病基因，最终激发寄主新一轮的ETI。综上，植物与病原菌在长期互作过程中呈现出Z字形的“拉锯战”，最终演变为病原菌的效应蛋白与植物的抗性蛋白之间的不断斗争与协同进化。图1-2植物与病原菌互作的“zigzag”模型(JonesandDangl2006)。Fig.1-2Azigzagmodelillustratesthequantitativeoutputoftheplantimmunesystem(JonesandDangl2006).1.4真菌MAPK信号通路进展研究丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）信号通路广泛存在于真核生物体中，是一类进化上十分保守的信号传导途径。在大多数生物细胞内，受到胞外刺激后，MAPK将信号依次级联放大并传递至细胞及核内，调控各种细胞生物学过程，如细胞增殖、分化、转化及凋亡等(Hameletal.2012)。MAPK信号途径通常依次激活三个相互连接的蛋白激酶（PK）(Widmannetal.1999)。活化的MAPKKK（Mitogen-activatedproteinkinasekinasekinase）首先磷酸化位于MAPKK（Mitogen-activatedproteinkinasekinase）的激活环内的两个Ser和/或Thr残基；激活后的MAPKK通过双重磷酸化具有标记基序-TXY-的高度保守的MAPK激活环触发MAPK的激活。接着活化的MAPK可以磷酸化下游底物，从而影响它们的生物化学特性并最终引起特异性的输出反应。在真菌，植物和哺乳动物中，MAPK作为关键信号转导组分可参与调控多种生命 8小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用过程，并在不同的过程中均发挥着至关重要的作用。在哺乳动物中，MAPK信号通路的激活，可以调节细胞的生长、分化，响应环境的刺激、以及调节炎症的发生等各种重要的细胞生理/病理过程(Widmannetal.1999)。MAPK信号通路在植物中调控气孔、侧枝等的形成和生长发育，参与细胞分裂，应对各种生物和非生物胁迫及参与植物激素信号的转导调节等(Maoetal.2011;Gallettietal.2011)。在真菌中，MAPK信号通路主要参与调节真菌的菌丝生长、致病性和交配过程等，模式真菌酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae），玉米瘤黑粉（Ustilagomaydis），稻瘟菌（Magnaporchemoryzae）等MAPK信号通路研究较为深入，为我们更好的理解其它真菌MAPK信号传导途径提供了基础(Hameletal.2012)。1.4.1酵母MAPK信号途径MAPK信号通路是调控酵母生命过程的重要信号传导途径之一，它包括五条MAPK信号途径，分别调节交配，菌丝侵入性生长，细胞壁完整性，应对高渗透压胁迫，和子囊孢子形成(ChenandThorner2007（)图1-3）。酵母交配响应依赖于G蛋白偶联受体（Ste2和Ste3）与同源肽信息素的结合，这种结合刺激抑制性Gα亚基Gpa1从Ste4和Ste18蛋白上分离，分别激活Gβ和Gγ亚基。被激活的Gβγ亚基与支架蛋白Ste5和p21激活激酶（PAK）Ste20结合形成蛋白复合体激活MAPKKK激酶Ste11，然后依次激活下游的MAPKK蛋白激酶（Ste7）和MAPK蛋白激酶（Kss1和Fus3）。最终，信息素反应途径的下游主要靶标细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂Far1和转录因子（TF）Ste12被磷酸化后，分别调控细胞周期阻滞和交配反应基因的表达(Madhanietal.1997;Schamberetal.2010;ChouandLane2006)。信息素途径的许多组分，包括Ste20，Ste50，Ste11，Ste7，Kss1和Ste12，也参与到调节丝状生长过程中。在受到饥饿刺激时，可以引起单倍体细胞的侵入性生长或二倍体细胞中的假菌丝生长。在营养丰富的条件下，无活性的Kss1定位到细胞核，在那里它抑制转录因子的激活，如Ste12和Tec1(Songetal.2004a)。然而，信息素途径中上游的一些组分，例如信息素受体，异源三聚体G蛋白和Ste5支架蛋白，在这条途径中不是必需的存在的，此条途径中Ste11-Ste7-Kss1模块的激活依赖于上游Sho1和Msb2对信号的接收传递(O'RourkeandHerskowitz2002;Tatebayashietal.2006)。第三条酵母MAPK级联途径参与维持细胞完整性，由Bck1（MAPKKK）、两个冗余MAP2K，MKK1和MKK2以及Slt2（MAPK）组成(Zarzovetal.1996)。该级联是维持细胞壁完整性所需要的，并且参与到环境应激的补偿应答，例如高温或重金属存在。表面传感器感知外部刺激将信号传递给鸟嘌呤交换因子（GEF）Rom2，Rom2接收信号后激活Rho1蛋白，被活化的Rho1可以进一步激活PKC1。然后PKC1磷酸化Bck1即通过Slt2级联启动MAPK信号传导。Spa2作为其中的衔接蛋白，可以将MAPK信号 第一章文献综述9传导至细胞生长位点。然后激活的Slt2修饰下游靶标，例如参与调节细胞壁生物发生所需的转录因子R1m1，Sbf1和Swi4/6(Maddenetal.1997;Kimetal.2008)。在高渗条件下生长的酵母细胞中，HOG途径是对渗透保护剂分子的积累和维持穿过应激质膜的渗透梯度所需的(SaitoandTatebayashi2004)。MAPKKK蛋白激酶Ssk2和Ssk22的激活依赖于双组分His激酶磷酸化系统（Sln1，Ypd1和Ssk1），而另外一个MAPKKK蛋白激酶Ste11的激活依赖于与纤维生长途径共享的信号通路包括Sho1，Msb2，Cdc42，Ste20，和Ste50蛋白。两个分支输入的信号都通过激活MAPKK蛋白激酶Pbs2将信号放大传递。信号经过一系列的传递，最终激活位于Hog1下游的转录因子Hot1，Msn2和Sko1，控制参与渗透以及氧化应激反应的基因的表达。Smk1是来自酿酒酵母的第五个MAPK，其仅在减数分裂的晚期阶段，也就是在子囊孢子产生之前表达(Krisaketal.1994)。Smk1通路目前研究较少，上游的MAPKK及MAPKKKK到目前为止都未确定。由于PAKSps1也参与子囊壁组装，Friesen等(1994)推测其可能在Smk1MAPK的上游起作用。图1-3酵母中的MAPK途径(Hameletal.2012)。Fig.1-3MAPKPathwaysinSaccharomycescerevisiae(Hameletal.2012). 10小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用1.4.2植物病原真菌FUS3/KSS1途径1.4.2.1玉米瘤黑粉FUS3/KSS1途径玉米瘤黑粉（Ustilagomaydis）是引起玉米（Zeamays）黑斑病的病原真菌，其作为模式真菌被广泛研究(KahmannandKämper2004;Brefortetal.2009)。作为担子菌的典型代表，玉米瘤黑粉可以在单细胞和多细胞生长形式之间切换，以保证在不同条件下能量的摄取(Nadaletal.2008)。在缺少寄主植物的情况下，玉米瘤黑粉以树突状单细胞生物体形式存在。一旦接触到寄主时，不同交配型的单倍体细胞交配形成双核菌丝体，这种转变标志着寄生生长阶段的开始。在玉米瘤黑粉中，MAPK信号途径一方面参与到调控细胞的交配过程中，另一方面，与信号通路cAMP共同协作参与调节玉米瘤黑粉的寄生生长过程(KahmannandKämper2004;Brefortetal.2009)。玉米瘤黑粉交配系统包括一个七次跨膜受体Pra1或Pra2，分别用来识别同源脂肽信息素Mfa2或Mfa1(KahmannandKämper2004;Brefortetal.2009)。受体接收刺激后将信号依次传递给下游MAPK级联激酶蛋白，包括MAPKKK蛋白激酶Kpp4/Ubc4，MAPKK蛋白激酶Fuz7/Ubc5和MAPK蛋白激酶Kpp2/Ubc3(BanuettandHerskowitz1994;MayorgaandGold1999;Andrewsetal.2000))Fuz7/Ubc5作为级联途径中的第一个被鉴定的组成成分，在调控交配，丝状生长和毒力中发挥着重要作用(BanuettandHerskowitz1994)。Kpp2/Ubc3作为Fuz7下游蛋白激酶也在一定程度上影响细胞的交配，菌丝二倍体的形成和病原真菌的毒力(MayorgaandGold1999;Mülleretal.2003)。另外一种MAPK，Kpp6的缺失突变体导致菌丝不能成功穿透植物胚层，它与Kpp2均由上游的Fuz7激活，而且Kpp2/Kpp6双敲除导致细胞不能交配且致病性丧失，这也表明了这些MAPK在调控交配和毒力方面存在着部分功能冗余(Zhaoetal.2007;Brefortetal.2009;Rispailetal.2009)。另外，上游的MAPKKK蛋白激酶Kpp4的功能研究实验表明，Kpp4通过SAM结构域与上游的衔接蛋白Ubc2相互作用，而且Kpp4突变体在交配和毒力方面都存在有缺陷(Andrewsetal.2000;Mülleretal.2003)。Ubc2作为酿酒酵母Ste50的同源物，其缺失突变体影响信息素应答和毒力(Klostermanetal.2008;MayorgaandGold2001)。玉米瘤黑粉感知信息素信号后，可以诱导几种靶基因的转录，包括位于基因座“a”和“b”内的基因的转录(KahmannandKämper2004;Brefortetal.2009)。“a”基因座包含编码交配信息素和受体的两个基因，而“b”基因座含有两个同源结构域基因，命名为bE和bW。这些基因的调节需要Kpp2/Kpp6信号级联以及cAMP信号途径共同协作。上游信号最终传递给转录因子Prf1，通过诱导Prf1的磷酸化调节下游目标基因的表达。“a”基因的调节仅依赖于PKA诱导的Prf1磷酸化，而“b”基因的表达需要PKA和MAPK两 第一章文献综述11者的共同完成Prf1的磷酸化。Prf1作成一个中枢调节因子，将MAPK和cAMP信号通路的信号连接到一起，最终通过差别磷酸化Prf1区分不同靶基因启动子，并控制表达交配和致病性相关基因的转录(Kaffarniketal.2003)。在玉米瘤黑粉里还有一个存在争议的新的MAP激酶家族，Crk1（Cdk-relatedkinase1）蛋白激酶，它与酿酒酵母中的Ime2同源，但是目前为止，Ime2同源物还没有被正式定义为MAPK。Crk1蛋白包含与MAPK激酶同样的TXY基序，研究也证明了Crk1的激活依赖于此基序的磷酸化。在玉米瘤黑粉里，Crk1通过控制Prf1表达促进形态发生转变(GarridoandPérez-Martín2003;Garridoetal.2004)。因此，缺乏这种激酶蛋白导致相反交配型的菌丝不能融合，使得二核体菌丝的交配和形成受阻(Garridoetal.2004)。由于玉米瘤黑粉单倍体细胞的交配是植物感染的先决条件，因此Crk1对于致病性也是必需的，另外与野生型菌株相比，突变体菌株导致玉米瘤黑粉形成肿瘤数目急剧减少。而且有趣的是，MAP2KFuz7可以靶向磷酸化Crk1的-TXY-基序(Garridoetal.2004)。此外，Crk1也是转录Prf1所必须的。Crk1的活化与信号传导与Kpp2介导的MAPK信号途径紧密相关，且能作为该信号通路的底物被磷酸化发挥功能。1.4.2.2稻瘟菌FUS3/KSS1途径稻瘟菌在侵染寄主过程可以分化出一个特殊的侵染结构——附着胞，通过甘油的积累增加细胞内的膨压，从而帮助其穿透植物表面成功侵染寄主。在稻瘟菌侵染过程中，cAMP信号途径参与到植物表面信号的识别及附着胞的分化，而MAPK信途径则主要介导调控附着胞形成的后期阶段及附着胞侵入阶段。PMK1基因缺失突变体仍然能够识别疏水表面和响应外源cAMP信号，但不能形成附着胞(XuandHamer1996)。PMK1缺失体菌株导致调动糖原和储备脂质的能力丧失，引起甘油积累和膨压的形成受阻(ThinesandTalbot2000)。同时，PMK1突变体菌株也不能定殖于机械损伤的水稻组织，表明这种MAPK不仅参与早期穿透侵染，也是侵入后菌丝生长发育所必须的(XuandHamer1996)。表达和定位实验发现，Pmk1主要在稻瘟菌的附着胞和分生孢子的核中表达累积。另外，还发现了附着胞的形成也依赖于Pmk1的激酶活性(Brunoetal.2004)。目前，PMK1上游基因的生物学功能研究也比较深入。Mst11被上游的蛋白激酶Chm1和Mst20磷酸化并激活，MST20的缺失突变体并不影响附着胞的形成，主要影响产孢量。而CHM1的敲除则使附着胞的形成减少，但在有伤口的植株中仍能侵染生长(Lietal.2004)。MST7，MST50及MST11的基因缺失突变体表型类似，均不能形成附着胞且致病能力丧失。免疫共沉淀和双分子荧光互补实验表明，在附着胞形成期间可以检测到MST7和PMK1二者相互作用，这种相互作用依赖于位于Mst7的N末端的MAPK接合位点与PMK1的结合位点相互结合(ZhaoandXu2007)。酵母衔接蛋白Ste50的同源 12小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用物MST50，作为MST11-MST7-PMK1级联途径的上游蛋白，能够同时与MST7和MST11相互作用(Zhaoetal.2005)。这种三元互作可能导致复合体的形成，使MST7和MST11之间微弱的相互作用保持稳定(Zhaoetal.2005)。Mst50和MST11同样含有SAM结构域，而Mst50中SAM结构域的缺失，不仅导致其与Mst11互作的能力的丧失，同时也丧失附着胞形成和致病能力。另外，Mst50可以与GTPasesRAS1和RAS2相互作用。Ras1缺失突变体对稻瘟菌附着胞形成或植物侵染能力没有影响，而Ras2敲除突变体则导致致死突变。在野生型稻瘟菌株中持续表达RAS2G18V，可以使Pmk1的磷酸化水平提高及cAMP积累，还可在非诱导界面上形成附着胞，但在mst50，mst11，mst7或pmk1突变体中表达RAS2G18V没有出现此表型，表明Ras2有可能处于MAPK信号通路的上游(Parketal.2006)。Mst50还可以与GTPaseCDC42相互作用，但CDC42对于附着胞的形成和植物侵染没有影响，可见其存在不是激活PMK1所必须的(Zhaoetal.2007)。目前研究发现，MoMsb2和MoSho1作为PMK1上游的两个受体基因，在功能上存在冗余。研究显示，MoSho1可能在鉴定水稻叶片蜡质中发挥重要作用，而MoMsb2主要识别疏水性表面和角质单体(Liuetal.2011)。作为Pmk1下游的一个转录因子，Mst12在稻瘟菌侵染过程也发挥着重要的作用。缺失掉MST12并没有影响稻瘟附着胞成形和菌丝的生长及产孢，但是mst12的突变体丧失了侵染能力(Parketal.2004)。Zhou等（2011）鉴定出来一个MoMcm1蛋白，它能够与Mst12互作，另外其突变体产生长且畸形的胚芽管，在粘附穿透过程中存在缺陷，侵然菌丝变细(Zhouetal.2011)。另外，Pic1与Pic5被发现可以在酵母双杂中与PMK1互作。Pic1包含一个典型的MAPK磷酸化位点，突变掉这个基因后产孢率有降低，但致病力未受影响。Pic5蛋白结构中有一个跨膜区和两个CTNS元件，目前这两个元件的功能还未知。PIC5基因的敲除会影响附着胞的形成、穿透，菌丝、芽管的生长以及致病性(Zhangetal.2011)。cDNA差减文库筛选鉴定出了两个稻瘟菌致病相关基因Gas1和Gas2，它们均受到Pmk1的调控，在附着胞形成阶段特异表达，但是在pmk1突变体未检测到表达。gas1和gas2缺失突变体降低稻瘟菌缠头寄主表皮的能力，也造成了病斑大幅度减少(Xueetal.2002)。 第一章文献综述13图1-4稻瘟菌中MAPK相关的信号通路。Fig.1-4MAPKsignalingpathwaysinM.oryzae.1.4.2.3其它病原真菌FUS3/KSS1途径在玉米瘤黑粉和稻瘟菌中，MAPKs调控了一些与致病相关的侵染结构的形成，这些致病相关的MAPKs在进化上与调节酿酒酵母的交配和丝状生长的Kss1和Fus3同源。在其他植物病原真菌中，Kss1/Fus3类的MAPKs也被大量鉴定出来，功能分析也证明这类蛋白激酶在各种真菌的侵染中发挥重要功能。在异旋孢腔菌（Cochliobolusheterostrophus）(Levetal.1999)，炭疽病菌（Colletotrichumlagenarium）(Takanoetal.2000)，和圆核腔菌（Pyrenophorateres）(Ruiz-Roldánetal.2001)，Kss1/Fus3类型的MAPK蛋白激酶参与到附着胞的形成中。研究发现MAP3KMEKK1作用于炭疽病菌中的MAPKCmk1的上游(Sakaguchietal.2010)，而缺失MEKK1和Cmk1的突变体菌株均不能形成附着胞。在MEKK1缺失突变体中，Cmk1绿色荧光蛋白融合体的核定位信号明显减弱。在异旋孢腔菌中，功能验证揭示Ste11（MAPKKK）及CHK1（MAPK）都是在附着胞形成过程中所必需的(Izumitsuetal.2009)。此外，CHK1被证明是诱导编码纤维素分解酶的基因并控制宿主组织穿透所必需的(LevandHorwitz2003)。另外一些植物病原性真菌不形成附着胞，因此依赖于不同的方式来侵染定殖寄主组织。在小麦病原菌禾生球腔菌（Mycosphaerellagraminicola）中，MAPK基因Fus3的敲除突变体不能穿透气孔(Cousinetal.2006)。在谷类病原菌颖枯壳针孢（Stagonosporanodorum）中，MAPK基因Mak2的缺失能从气孔侵入但丧失致病性，因为突变体菌株不能在寄主叶肉中产生侵染结构(Solomonetal. 14小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用2005)。Kss1/Fus3型MAPKs的活性也与几种土壤传播病原菌的毒力有关。在尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）中，MAPK基因Fmk1的缺失导致菌株不能分化侵染菌丝，并且显示果胶酵母裂解酶基因pl1的转录水平降低(Pietroetal.2001)。在黄萎病菌（Verticilliumdahliae）中，MAPK基因VMK1的破坏也导致菌株对多种宿主植物的毒力降低(Rauyareeetal.2005)。在腐生真菌黑斑病菌（Alternariabrassicicola）中，MAPK基因Amk1的破坏导致菌株不能侵染健康完整植物，但仍然可以定殖有伤口损伤的植物组织(Choetal.2007)，这表明Amk1特异性地调控病原真菌穿透寄主的过程，但后续在寄主组织中的增殖不依赖于该MAPK。在缺乏这种Kss1/Fus3型MAPK的黑斑病菌突变体中，穿透寄主组织所需水解酶的形成大量减少(Choetal.2007)。在葡萄灰霉病菌（Botrytiscinerea）中，MAPK基因BMP1的失活导致菌丝不能穿透和侵染植物组织，使其丧失致病性(Zhengetal.2000;Doehlemannetal.2006)。研究还显示，MAPK基因MAP1/Gpmk1的缺失阻碍了禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）的对小麦的致病性(Jenczmionkaetal.2003;Urbanetal.2003)。Gpmk1突变体的致病性丧失可能与植物细胞壁降解有关的酶活性的减弱或延迟诱导相关(JenczmionkaandSchäfer2005)。在专性寄生真菌中，由于缺乏稳定的遗传转化体系，严重阻碍了人们对其探索的脚步，但即便如此，对Kss1/Fus3型MAPKs在专性寄生真菌中的功能研究仍在缓慢推进中。在白粉菌真菌（Blumeriagraminis）中，药理抑制剂实验证明了MAPK信号传导途径在附着胞发育中的具有重要作用(KinaneandOliver2003)。农杆菌介导的植物诱导的短暂基因沉默证明PtMAPK1在菌丝发育和致病性方面发挥着重要作用(Panwaretal.2012)。另外，将小麦叶锈菌的MAPK1异源互补到玉米瘤黑粉，可以恢复玉米瘤黑粉Kpp2和Kpp6单突变体或Kpp2/Kpp6双突变在交配和致病性方面的缺陷(Huetal.2007)。Guo等（2011）研究结果表明，小麦条锈菌MAPK1可以在功能上部分互补稻瘟菌和禾谷镰刀菌相应的突变体。MAPK1在早期感染阶段和在吸器形成期间被诱导表达，表明Kss1/Fus3型MAPKs参与到病原真菌的致病及吸器形成中。总之，根据这些研究，我们可以总结Kss1/Fus3型MAPK是多功能性的致病因子，在各种各样的植物病原真菌中都发挥着重要的作用的。1.5RNAi介导的基因沉默1.5.1小干涉RNA（siRNA）的来源植物细胞中可以产生众多的non-codingRNA，其中有一类大小在21-24nt的短小RNA片段。这一类smallRNA可以分为microRNA，piRNA（piwi-interactingRNA）和siRNA（smallinterferingRNA）。根据来源的不同，siRNA又可以分为内源的siRNA（endogenoussiRNA）和外源的siRNA。内源siRNA由异染色质的反向互补序列转录而 第一章文献综述15来，进到植物体内DNA甲基化和组蛋白甲基化(Kasschauetal.2007;Luetal.2005;Mosheretal.2008;Zhangetal.2007;Xieetal.2004)。外源的siRNA由细胞外核酸序列进入细胞内后，被别细胞内一些力作用酶类识别剪切，形成短序列核酸。在植物免疫反应中具有重要作用(Kamathetal.2000)。当外源核酸进入细胞后，可以被植物细胞识别。研究发现RNaseIII参与到此类smallRNA的形成过程中(Ceruttietal.2000)。2001年，Bernstein及其合作者发现果蝇中属于RNaseIII型酶类的Dicer酶参与到smallRNA的形成过程中(Bernsteinetal.2001)。Dicer酶的结构为含有解旋酶结构域、一个dsRNA结合结构域和一个PAZ结构域。在果蝇、烟草、线虫、哺乳动物和神经细胞中，均发现Dicer酶且结构高度保守性，并且功能相似(Kettingetal.2001)。1.5.2siRNA沉默复合体的形成siRNA进入细胞质后需要结合一系列蛋白组成有功能活性的沉默复合体（RNAinducedsilencingcomplex，RISC）行使功能(Hammondetal.2000)。检测分析发现，siRNA进入沉默复合体或者说沉默复合体能够识别siRNA并装载其中，保护siRNA免受细胞质内降解酶类的降解。组成沉默复合体的多种蛋白中，AGO（Argonaute）蛋白家族处于中心位置。它包含PAZ（RNA结合结构域）和Piwi（H型RNA降解酶结构域）两个功能区域(Songetal.2004b)。许多物种含有多个AGO家族成员，而且已经有证据表明，不同家住成员间具有功能多样性。例如，在动物细胞中含有的4个家族成员中，只有AGO2能够切割RNA序列。AGO蛋白家族在拟南芥中拥有10个成员，AGO7与ta-siRNA的功能密切相关。ago7的突变体与rdr6和sgs3突变体的表型类似，二者是合成ta-siRNA的必须基因(Vazquezetal.2004)。AGO4/6/9能够参与到基因组转座子中并将DNA甲基化处理(Zilbermanetal.2003)。AGO2(类似AGO3)能够结合21nt5’端为A的ta-siRNA但AGO5能够结合多种长度的5’端为C的smallRNA。AGO10可以结合siRNA并将其包裹在复合体内抑制siRNA进一步的剪切活性(Manavellaetal.2011)。AGO1是结合siRNA行使功能的主要蛋白。体外实验证明，AGO4可以结合siRNA并对下游基因有剪切活性。Ago4的突变体可以提高siRNA下游基因的表达水平。而且没有AGO1的植株siRNA积累量急剧下降，可以推测siRNA进入沉默复合体前是不稳定的，同时沉默复合体对siRNA具有保护作用。1.5.3siRNA对下游基因调节siRNA进入RISC可以介导活化沉默复合体并结合同源mRNA，在距离siRNA3’端11-12个碱基的位置切割mRNA并释放出RNAi核酸酶，释放出的siRNA进入下一个循环重复一过程，特异性降解下游对应的mRNA(Kamathetal.2000)。在RdRp(RNAdependentRNApolymerase)作用下，siRNA可作为一种与下游靶基因的mRNA结合，在酶的作用下合成dsRNA。形成的双链DNA序列可被降解形成新的siRNA，引起RNAi 16小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用的大量形成，进入下一个对下游基因的沉默途径。因此只要起始少量的dsRNA，其产生的siRNA快速大量的形成(Nykänenetal.2001;Sijenetal.2001)。无论是植物还是动物细胞中，siRNA诱导的基因沉默都会有RdRp参与其中，实现RNAi信号的增强。应用这一技术，认为导入植物细胞双链DNA核酸序列，可以在细胞内产生对互补基因的下调调节。实现对基因功能的控制。而且，因为植物细胞和微生物细胞之间有smallRNA的交换，可以利用植物体内产生的smallRNA实现对病害真菌的控制(Chengetal.2015)。1.5.4RNAi在农作物改良种的应用许多文献报道表明RNAi对于控制寄生杂草，病毒，细菌，真菌，线虫和昆虫的有着显著的功效。植物寄生杂草广泛分布在作物田间和周围，与农作物争取养分导致农业产量巨大的损失。有许多常规的控制方法，但有一些限制，因此需要开发一种控制寄生杂草的生物技术工具。最近有研究人员报道了RNAi技术在防治杂草中的应用，Aly等人(2009)生产出携带M6PRdsRNA表达盒的转基因番茄，他们发现，在转基因番茄植物上生长的埃及列当属的结核和地下芽中的内源性M6PRmRNA水平降低了60-80％，甘露醇水平显着降低，埃及列当死亡结节的百分比显着增加。Yoder等利用对hpRNA介导的RNAi开发了一种对独脚金具有抗性的野草抗性的玉米(Framondetal.2007;Yoderetal.2009)。害虫以作物损失和杀虫剂的形式花费数十亿美元。仍然农民面临着永远存在的杀虫剂抗性的威胁，促使不断寻找替代害虫控制策略(Ferryetal.2006;GordonandWaterhouse2007)。据报道，无法控制的植物寄生线虫每年损失约1250亿美元。Gheysen和vanholme(2007)证明在宿主植物表达来源于根结线虫的持家基因或寄生基因的dsRNA可以赋予植物对线虫的抗性。利用寄主诱导的RNAi，Sindhu等(2009)对四种拟南芥寄生线虫的甜菜胞囊线虫（Heteroderaschachtii），的寄生基因3B05，4HD06，8H07和10A06进行靶标沉默。结果发现虽然没有观察到完全的抗性，但是导致不同RNAi系中成熟雌性线虫的数量减少了23-64％。Ibrahim等(2011)构建了四个不同目标基因的RNAi载体，这些基因与大豆囊肿线虫和秀丽隐杆线虫中的基因具有很高的相似性，以确定它们能够降低根结线虫引起的根瘤的形成。在四个基因中，针对编码酪氨酸磷酸酶（TP）和线粒体应激70蛋白前体（MSP）的基因的两种构建体能够分别将根瘤的形成减少92%和94.7％。在研究防治病毒过程中，人们发现利用RNAi靶标病毒外壳蛋白（CP）基因在诱导植物对病毒的抗性方面是非常有效的，如具有甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）抗性的烟草(Andikaetal.2005)，抗马铃薯病毒Y（PVY）的马铃薯(Missiouetal.2004)，抗番木瓜环斑病毒型（PRSV-W）的甜瓜(Krubphachayaetal.2007)和抗黄瓜条斑花叶病毒（CGMMV）的本氏烟草(Kamachietal.2007)。Pradeep等(2012)报道，引入烟草条纹 第一章文献综述17病毒（TSV）的CP基因的反向重复序列，可以成为创建具有抗TSV的经济重要作物的有效可靠策略。Zhou等(2012)构建含有来自稻条纹病毒的CP基因和病菌特异性蛋白质基因序列的RNAi载体，将载体转化了两个易感粳稻品种Suyunuo和Guanglingxiangjing，发现在T5和T7代中含有RNAi载体的水稻纯合后代对病毒具有强烈的抗性。细菌性疾病是番茄，大豆和香蕉等作物领域面临的最大挑战之一。细菌疾病传播速度非常快，难以控制，因此预防是目前避免细菌感染的唯一方法。Escobar等人(2001)在实验中发现，两个根癌土壤杆菌基因（iaaM和ipt）的沉默可以将拟南芥中由细菌诱导产生的肿瘤数目降到几乎为零(2006)，这也说明在植物中采用RNAi策略可以增强细菌耐药性。真菌引起的植物病害也给生产上造成巨大的损失，如何安全，经济，有效地控制病害是人们持续关注的问题，而RNAi的出现也带来了防治真菌病害新的策略。白粉病真菌是专性营养性寄生病原体，仅在活体宿主生长并造成数千种植物物种的损害，但是由于缺乏遗传转化方法，目前可直接获得致病性和毒力基因的功能证据很少。Nowara等(2010)在大麦和小麦中通过靶向真菌转录物的双链或反义RNA影响白粉病菌的发育，通过沉默效应基因Avra10证明宿主确实诱导了基因沉默。通过由于沉默点突变而对RNA干扰（RNAi）具有抗性的合成基因的瞬时表达，可以使真菌中的Avra10免受沉默。结果表明，宿主植物的RNA分子可以转运到病原菌，并且可能赋予作物基于RNAi的抗性。Cheng（2015）等发现在植物中表达来源于禾谷镰刀菌毒力基因——甲壳质合成酶（Chs3b），可以增强小麦植物对真菌病原体的抗性。RNA有效地下调了小麦幼苗和穗上定植的镰刀菌病原体中Chs3b的表达。研究结果表明宿主诱导的基因沉默是在田间条件下增强作物植物抗性的有效策略。植物宿主靶向真菌甾醇14α-脱甲基酶（CYP51）基因，可以诱导基因的沉默从而限制镰刀菌的感染。镰刀菌病不仅对全球粮食生产产生重大影响，还因为霉菌毒素颗粒污染对食品安全造成重大影响。结果显示真菌可以受到高效率的抑制，也证明了宿主诱导的CYP51基因的基因靶向沉默是替代化学药剂来控制毁灭性真菌病害的有效方法(Kochetal.2013)。1.6本研究的目的和意义在世界范围内小麦主产区，条锈菌给小麦生产带来很大的破坏作用，给人类粮食生产安全带来严重的威胁。随着近年来研究的不断深入，条锈菌对小麦的侵染已经成为研究病原真菌与植物互作研究的热点。MAPK信号传递途径是生物界保守的代谢途径之一，在细胞生长发育中具有重要的调控作用。在多种植物病源真菌致病性和分化发育中具有重要的控制作用。但是在条锈菌中该信号通路对真菌的致病性和对真菌生长发育的调节机制还不是很清楚。还存在多个问题需要解决：如MAPK对虽然在多种真菌的治 18小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用病性和生长发育上起着重要作用，对条锈菌是否也有类似功能，或者功能有差异性及差异在什么地方；MAPK家族有多个信号通路，具体是哪个信号通路调节条锈菌的致病性，这些都是亟待解决的问题。作为识别寄主和信号传递的主要途径，MAPK作为上游信号代谢具有重要意义，所以对MAPK的研究非常有必要。因此本文分为两个部分，一是研究MAPK中多个基因（或家族基因）成员对条锈菌致病性的影响；另一部分是属于MAPK信号途径的关键治病基因是如何影响条锈菌的致病力。利用寄主诱导的基因沉默技术创建抗病材料。本研究的目的是通过结构分析、抑制剂处理、基因沉默、亚细胞定位、酵母双杂、RNAi等一系列试验来明确MAPK基因家族和关键治病基因FUZ7基因的功能和其调节致病性的机理。MAPK作为生物体内保守的代谢途径，对它深入的研究可以为其它植物病真菌中信号传递途径的研究提供参考，并为小麦的有效防治以及培育优良小麦品种提供理论依据。 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用19第二章小麦条锈菌MAPK信号通路基因鉴定2.1引言生物细胞能够对环境刺激做出反应，这些反应是由一系列细胞内的信号途径来传导的，信号通路接收细胞外刺激信号并进行放大和整合，最终导致生物体一系列生理生化变化。MAPK是在真核生物中普遍存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，可被一系列胞外信号刺激激活。在动物和植物中MAPK相关基因的研究较为深入，而植物病原真菌信号转导相关基因的研究源于前面两者的分析研究，这些基因可以作为抗菌药剂的靶标(Lengeler2000)。许多病原真菌侵染结构、营养结构及生殖结构的产生都会受到气候条件、寄主植物或着生物物理化学等信号的诱导，所以，信号转导途径对病原真菌的定殖、生长发育和繁殖后代都有着至关重要的作用。MAPK信号转导途径在调控植物病原真菌的生长发育、致病性和有性生殖方面有着重要作用，并且可能广泛存在。许多MAPK相关基因的缺失将导致病菌致病性的丧失，因此也被认为是植物病原真菌中重要的致病基因。对病原真菌MAPK信号通路相关基因功能的研究，一方面可以深入地了解病原菌侵染发生的机制，另一方面，也为病害防治提高了潜在的目标。目前，MAPK信号途径在专性寄生真菌（特别是锈菌）功能方面的研究，仍处于起步阶段。在条锈菌与小麦互作过程中，两者之间的分子对话不断发生，真菌MAPK识别小麦的应激信号，帮助条锈菌成功侵染寄主组织，而植物中MAPK则是激活植物免疫所必需的。因此，明确小麦条锈菌MAPK信号转导途径在病菌的生长发育及致病性中发挥的角色成为了我们研究的重点。作为严格的活体营养专性寄生菌，小麦条锈不能离体在培养基上培养，导致稳定的遗传转化体系的缺乏，也使得条锈菌基因功能得研究相对滞后。VIGS（Virus-InducedGeneSilencing，病毒诱导的基因沉默）技术（Yinetal.2011）于小麦条锈菌中的成功运用，为研究小麦条锈菌的基因功能提供了新的方法和途径。本研究拟在实验室前期研究的基础上，从全基因组水平上鉴定并克隆小麦条锈菌MAPK级联途径中的激酶基因，利用实时定量分析基因的表达特征，明确蛋白互作情况，最后利用VIGS技术进一步的解析基因功能。本研究通过初步功能筛选，确定潜在的参与致病过程的小麦条锈菌MAPK级联途径激酶基因，及为持久控制的新策略提供基因资源和奠定理论基础。2.2试验材料2.2.1植物材料小麦品种铭贤169用于小麦条锈菌的扩繁，小麦品种水源11用于VIGS验证实验， 20小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用以上小麦材料均由本实验室提供。小麦均于西北农林科技大学北校区东南窑温室中培养，放置于16℃温度，16h光照/8h黑暗条件下。供试大麦大麦由本校植物保护学院许金荣教授馈赠，培养于25℃温度，16h光照条件下的培养间中。2.2.2菌株本试验所用的小麦条锈菌生理小种条中32（CYR32），是我国目前大田主要的流行小种，由本实验室保存。CYR32在小麦感病品种铭贤169上进行扩繁，收集新鲜的夏孢子以备后续接种实验使用。条锈菌CYR32生理小种与水源11、及铭贤169均组成亲和组合。大肠杆菌（Eschrichiacoli）菌株JM109，酿酒酵母菌株AH109均由本实验室保存。2.2.3质粒载体质粒名称用途抗生素标记来源BSMVVIGSAmp本室保藏pGADT7酵母双杂交Amp本室保藏pGBKT7酵母双杂交Kan本室保藏pGADT7-SV40AD对照质粒AmpClontechpGBKT7-53阳性BD对照质粒KanClontechpGBKT7-Lam阴性BD对照质粒KanClontechpMD18-TTA克隆载体AmpTakara2.2.4分子生物学试剂T7RNApolymerase（Ambion）；高保真酶TransStartFastPfuDNAPolymerase（全式金公司）；胶回收试剂盒（北京百泰克）；pMD19-TSimple（Takara）；CNBr-Sepharose6MB（Pharmacia）；Real-time试剂盒（罗氏）；反转录试剂盒（Thermo）；限制性内切酶（Takara）；质粒小题试剂盒（Omega）；x-α-gal（Sigma）；亚精胺（Sigma）；T4DNA连接酶（Thermo）；PCR扩增mix（康维世纪）；氨苄青霉素100mg/mL（罗氏）；卡那霉素50mg/mL（罗氏）；G418（MP）；硅藻土（sigma）；Lysingenzymes（Sigma）；斑脱土（sigma）；ConA（Pharmacia）；酵母双杂交实验试剂（Clontech）；X-gluc（sigma）；Biozol试剂（BioFluxTM）；引物（上海生工）；测序（北京奥科）；体外转录试剂盒（Promega）；Cap（Promega）；M-10钨粉（Bio-Rad）；WheatGermAgglutinin（Invitrogen）。2.2.5主要仪器分光光度计（Nanodrop2000，Thermo）；台式常温高速离心机（Centrifuge5418， 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用21Eppendorf）；台式低温高速离心机（Centrifuge581OR，Eppendorf）；超纯制水仪（Milli-Q，Millipore）；制冰机（SIM-F140AY65，SANYO）；全自动高压灭菌锅（MLS-3780，SANYO）；PCR仪（Life）；凝胶成像系统（GBoxChemXRQ，GeneCompanyLimited）；荧光显微镜（OlympusBX-53，OlympusCorporation）；超低温冰箱（Thermo907）；荧光定量PCR仪（CFXConnect，Bio-Rad）和超净工作台（1300SERIESA2，Thermo）。2.3方法2.3.1小麦条锈菌的繁殖与收集挑选出饱满的铭贤169小麦种子，播撒20左右粒种子于直径10cm的花盆中。放置于16˚C恒温，16/8h的光/暗周期温室中进行培养，一周左右，待幼苗第一叶完全展开，即可进行小麦条锈菌接种。小麦条锈菌的接种方法按照1984年康振生等的描述：接种前对小麦叶片进行脱蜡处理，然后用毛笔或棉签蘸取沾水的新鲜条锈菌夏孢子，将其均匀地涂抹于小麦叶片的表面，对照处理涂抹无菌水。完成接种后的小麦幼苗在黑暗环境中充分保湿24h，再移至16℃温室中进行培养。2.3.2小麦条锈菌夏孢子萌发与样品采集为了明确候选基因在小麦条锈菌各个侵染阶段的表达，我们采集新鲜夏孢子以及接种条锈菌不同时期的小麦样品，采集方法如下：新鲜夏孢子：收集14d左右的新鲜夏孢子，液氮冷冻并于-80℃保存。小麦接种条锈菌后样品：于小麦品种水源11的第一叶接展开后接种条锈菌CYR32，接种后按照时间点6h、12h、18h、24h、48h、36h、72h、120h、168h和264h取样，剪取小麦的新鲜叶片后应迅速投入液氮中，存放于-80℃。剩余小麦苗子继续在适宜条件下培养，14d后用于观察反应，以保证本次接菌成功。2.3.3小麦条锈菌夏孢子及接种条锈菌叶片总RNA的提取及纯化根据BIZOL说明书提取RNA（略有改动），具体操作如下：（1）研钵加入液氮提前预冷，研磨样品。（2）将研磨充分的样品粉末加入预冷的2mLRNA专用离心管，迅速加入800μLBizol，充分涡旋，冰箱静置10-15min；（3）加入等量的酚：氯仿：异戊醇（pH<4.8；25:24:1），摇晃均匀，冰箱放置10min，低温离心10min（12,000rpm）；（4）小心转移上清至1.5mL离心管中，加入800μL酚：氯仿：异戊醇（pH<4.8），轻摇混匀，-20℃放置10min，离心同上；（5）小心吸取上清转移至1.5mL新离心管中，加入800μL预冷的氯仿，轻摇混 22小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用匀，-20℃放置10min，离心同上；（6）上清转移至新1.5mL离心管中，加入800μL异丙醇，颠倒混匀后，-20˚C沉淀过夜；（7）离心同上，弃上清，加入800μL70%乙醇，将沉淀充分悬浮；（8）离心同上，弃上清，加入800μL无水乙醇，充分悬浮沉淀，离心同上，弃上清，吸去残余液体；（9）超净工作台风干RNA，加DEPC水40μL溶解，-80˚C储存。（10）取1μLRNA，加9μLDEPC稀释至10μL；取1μL测浓度，其余跑胶检测。2.3.4生物信息学分析小麦条锈菌MAPK候选基因利用本实验室已测序的小麦条锈菌CYR32基因组信息资源及玉米黑粉菌中已明确的Fus3/Kss1类MAPK激酶级联途径基因（KPP4-FUZ7-KPP2/KPP6途径），在全基因组水平上BLAST搜索获得小麦条锈菌中的MAPK激酶通路候选基因，并对所获得序列进行生物信息学分析，包括BLAST(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)；PROSITE(http://au.expasy.org/prosite)；ORFFinder(http://ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)；InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/iprscan/)等；分子生物学软件有DNAMAN、ClustalW、MEGA等预测蛋白结构和功能。2.3.5MAPK信号通路候选基因的克隆2.3.5.1引物设计根据生物信息学分析小麦基因组序列获得的小麦条锈菌MAPK信号通路候选基因的cDNA序列，利用PremierPrimer5软件设计候选基因的全长引物，获得ORF序列。2.3.5.2cDNA反转录合成根据试剂盒（Fermentas）说明书，对小麦条锈菌夏孢子或接种小麦锈菌的小麦叶片（时间点参见具体实验要求）总RNA进行反转录，具体步骤如下：RNase-Free的PCR管依次加入以下试剂：试剂用量RNA2.0gOligo（dT）181.0μLRNase-FreeH2O补足至12μL混匀后在65℃PCR仪中孵育5min，冰上冷却2-3min后，分别加入： 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用23试剂用量5×反应缓冲液4.0μL反转录酶(200U/μL)1.0μLRNase抑制剂(20U/μL)1.0μLdNTP(10mmol/L)2.0μL混匀，于42℃PCR仪中孵育1h，70℃灭活5min，产物置于-20℃中备用。2.3.5.3MAPK候选基因ORF扩增取小麦条锈菌夏孢子，萌发的孢子芽管及接种条锈菌5d后的小麦叶片纯化后的总RNA按照上述方法（2.3.3）进行反转录，以此反转录产物模板，分别用ORF全长引物（附表1）扩增出MAPK候选基因，具体PCR体系如下：试剂用量5×缓冲液10μL正向引物1μL反向引物1μLdNTP（2.5mM）5μL酶Fastpfu（10U/μL）1μLcDNA2-4μLddH2O补足至50μL所用PCR反应程序为：95℃，3min1cycles95℃，10s57℃，20s38cycles72℃，1-4min（根据ORF长度设定）72℃，10min1cycles向PCR扩增产物中加入0.5μLTaq酶，于72℃进行末端加A反应30min。2.3.5.4候选基因克隆载体构建PCR产物或质粒片段的回收纯化、连接、DNA限制性内切酶酶切、大肠杆菌质粒的提取等操作按照酶或试剂盒产品说明书进行。感受态细胞制备及转化等分子生物学的基本实验操作按照《分子克隆实验指南》中所描述方法进行。 24小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用2.3.5.5序列比对利用DNAMAN软件，将扩增序列经过公司测序后得到的结果与从基因组序列中获得的原序列进行序列比对分析。2.3.6Real-timePCR分析利用软件PrimerPremier5.0设计MAPK信号通路基因特异的定量引物（附表1），选择小麦条锈菌延伸因子（elongationfactor-1，PsEF-1）作为相对定量的内参基因(Chengetal.2014)。所有定量引物提前验证引物的特异性，保证良好的扩增效率，可用于荧光定量PCR。本实验实时定量的PCR体系如下：试剂用量2×Mix10μLcDNA2.0μL正/反向引物各0.4μLddH2O补足至20μL所用反应程序为：95˚C条件下运行10min；95˚C运行10s，55˚C运行20s，72˚C运行30s，循环40次；72˚C延伸10min，随后进行溶解曲线分析。每个样品反应包括3次重复，Ct值取平均值，运用2–ΔΔCt相对定量算法分析实验结果。实验结果需进行3次独立的生物学重复(Livaketal.2001)。2.3.7酵母转化（1）挑取YPD平板上新鲜的AH109单克隆，转接于新培养液中，250rpm，30°C条件下过夜培养；（2）转接母液于100mL新鲜的YPD液体培养基中，30°C恒温，250rpm振荡扩繁至OD600达到0.6；（3）将培养菌液富集于50mL离心管中，室温条件下2500rpm离心5min；（4）除上清；加5-10mL1×TE洗酵母细胞，重复2次。（5）倒出上清液体，加入1.5mL提前配制好的1×TE/LiAc液体，重悬后的液体就是酵母感受态细胞；（6）提前配置以下试剂：2×转化反应10×TE10×LiAc50%PEGddH2OA.1×TE/LiAc1.5mL150μL150μL/1.2mLB.PEG/LiAc1.2mL120μL120μL960μL/C.1×TE1.0mL100μL//900μL（7）分装质粒DNA： 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用25阳性对照实验组阴性对照用量pGBKT7-53pGBKT7-baitpGBKT7-lam0.2μgpGADT7-TpGADT7-preypGADT7-T0.1μg分装完后，每管加入10μL浓度为10mg/mL的鲑鱼精DNA。（8）每管加入100μL感受态细胞与上述试剂充分混匀；随后加入600μLPEG/LiAc（加之前需要剧烈混匀），涡旋，在30°C条件下200rpm培养30-60min；（9）培养适当时间后，加入DMSO（70μL/管），颠倒几次，42°C条件下，水浴15min，冷却1-2min；（10）10000rpm室温离心5s，弃上清，加入1×TE（100μL）重悬，吸取重悬液涂布二缺和四缺固体培养基（加入x-α-gal），30°C倒置培养。附实验所需培养基及缓冲液：A、YPD培养基（1L）：YeastExtract10g；Peptone20g；葡萄糖20g；Agar（液体则不加）20g。用蒸馏水定容至1L，121℃灭菌15min。B、SD-Trp培养基（1L）：YNB6.7g；Dropent0.74g；葡萄糖20g；Agar（液体则不加）20g。用蒸馏水定容至1L，固体需调pH至7.0，121℃灭菌15min。C、SD-Leu培养基（1L）：YNB6.7g；Dropent0.69g；葡萄糖20g；Agar（液体则不加）20g。用蒸馏水定容至1L，固体培养基需调pH至7.0，121℃灭菌15min。D、SD-Trp-Leu培养基（1L）：YNB6.7g；Dropent0.64g；葡萄糖20g；Agar（液体则不加）20g。用蒸馏水定容至1L，固体培养基需调pH至7.0，121℃灭菌15min灭菌。E、SD-Trp-Leu-His-Ade培养基（1L）：YNB6.7g；Dropent0.6g；葡萄糖20g；Agar（液体则不加）20g。用蒸馏水定容至1L，固体培养基需调pH至7.0，121℃灭菌15min。F、10×LiAc：LiAc·2H2O10.202g；蒸馏水100mL。用乙酸调pH至7.5，灭菌。G、10×TE：由0.1MTris·HCl（pH7.5）及10mMEDTA等体积混合而成：0.1MTris·HCl：Tris碱1.211g；蒸馏水80mL；浓盐酸6.5mL。冷却，pH调至7.5（NaOH），定容为100mL，灭菌。10mMEDTA：EDTA0.37224g；蒸馏水100mL。高压灭菌。H、50%PEG4000：加入PEG400010g，用蒸馏水定容至20mL，微孔过滤器过滤除菌。I、10mg/mL鲑鱼精：称取鲑鱼精DNA50mg，加入1×TE缓冲液5mL配置而成。G、20mg/mLX-α-GAL：称取X-α-GAL20mg，加入1mLDMF配置而成。2.3.8病毒介导的基因沉默实验 26小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用2.3.8.1病毒介导的基因沉默载体构建每条小麦条锈候选基因的5’端和3’端各选取一段特异的序列片段，设计引物，分别标注为-1as/-2as。每对引物中，正向引物的5’端前面添加PacI酶切位点（TTAATTAA），反向引物的5’端则添加NotI酶切位点（GCGGCCGC）（附表1）。PCR扩增目的基因，胶回收DNA条带，连T过夜后，转化（JM109感受态），检测单克隆，摇菌，提质粒并测序验证。将克隆得到的含有目的基因的T质粒和BSMV:γ-PDS-as载体分别用PacI和NotI在37°C条件下进行双酶切4-6h，体系如下（左）；用1.2%琼脂糖对酶切产物进行凝胶电泳，然后胶回收目的基因片段和BSMV:γ载体片段。胶回收产物在T4DNA连接酶作用下4°C过夜，以连接基因目的片段和载体，体系如下（右）：试剂用量试剂用量10×Buffer4.0μL10×RapidLigationBuffer1.0μLPacI（10U/μL）2μLT4DNALigase（3U/μL）1.0μLNotI（10U/μL）1μL目的基因片段胶回收产物200ng质粒DNA8μg载体胶回收产物50ngddH2O补至40μLddH2O补至10μL连接产物经过转化，PCR检测，提质粒，测序验证，完成目的基因与γ载体的连接构建。2.3.8.2病毒载体的线性化及体外转录将γ-PDS-as、α、β、γ及γ-目的基因质粒分别用限制性内切酶进行线性化，体系如下：（1）酶切体系（α、γ质粒）：（2）酶切体系（β质粒）：试剂用量试剂用量10×RBuffer2.0μL10×TangoBuffer2.0μLMluI（10U/μL）1μLSpeI（10U/μL）1.0μLα/γ质粒2μgβ质粒2μgddH2O补足至20μLddH2O补足至20μL（3）γ-PDS-as、γ-gene质粒酶切体系：试剂用量10×RBuffer2.0μLBssHII（10U/μL）1.0μL 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用27γ-PDS-as/γ-gene质粒2μgddH2O补足至20μL37℃酶切4-6h，吸取1μL酶切产物，加入9μLddH2O稀释，电泳检测，保证线性化进行完全；70℃，5min使酶失活。2.3.8.3病毒载体的体外转录按照RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionSystems-T7试剂盒的操作说明，将已线性化的质粒进行体外转录。反应体系为：试剂用量线性化质粒4.0μLNTP:rATP0.5μLrUTP0.5μLrCTP0.5μLrGTP0.5μL5×T7TranscriptionBuffer2.0μLRNaseinhibitor0.5μLRibom7GcapAnalog（40mM）0.5μLEnzyme（200U/μL）1.0μLTotal10μL上述反应物依次加入RNase-free离心管中，37℃孵育2小时。吸出1.0μL体外转录产物加DEPC水稀释至10倍，电泳检测。将其余转录产物用DEPC水稀释3倍，-80℃保存备用。2.3.8.4病毒接种将体外转录的BSMV病毒载体α、β、γ三联体等比例混合，即可形成有病毒活性的RNA混合物，因此实验操作中需注意，防止RNA降解，具体步骤如下：（1）实验所用小麦苗子预先准备好，选取在16˚C生长至三叶期也就是“两叶一心”时期的水源11小麦苗，每盆种植6-8株，每个处理种植3盆；（2）为防止操作不慎导致RNA降解，最终影响到病毒侵染和沉默效果，实验过程中要小心谨慎，提前准备好所需要的RNase-free的枪头，一次性PE手套，口罩等；（3）将α和β的体外转录产物各吸取7.5μL，与等体积的γ-目的基因或者γ-PDS的体外转录产物混合（1:1:1），混合物中加入135μLFes缓冲液，准备接毒； 28小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用（4）根据Liu(2005)等描述的方法，对三叶期小麦幼苗进行接病接种。用RNase-free的手套蘸取上述Fes及病毒混合物，每株幼苗选取完全舒展开的第二叶进行人工摩擦接种。每次实验接种Fes缓冲液及BSMV:γ作为阴性对照，接种BSMV:γ-PDS作为阳性对照。每个目的基因的沉默实验需要3次生物学意义上重复；（5）接种BSMV后小麦幼苗，放置在高温（25±2℃）、高湿及黑暗条件下处理24h，然后在正常16/8h光暗周期条件下继续培养。随时观察小麦叶片的病毒表型症状。2.3.8.5小麦条锈菌接种及取样（1）在适宜条件下接种BSMV10d后，即可观察到小麦叶片上产生的花叶病毒症状，随后即可进行条锈菌的接种；（2）用毛笔或棉签将条锈菌小种CYR32的新鲜夏孢子分别均匀接种至小麦叶片，接菌后的小麦苗子应及时喷水以充分保湿；（3）接完菌后的小麦苗于16˚C人工保湿箱黑暗保湿24-36h；（4）保湿结束后，将小麦幼苗转移至16˚C恒温温室中，以正常的16/8h光暗周期进行培养；（5）于接种后不同时间点取样，剪取接种过小麦条锈菌的第四叶，分为两份：一份投入液氮，并于-80℃保存，用于检测目标基因的表达；另外一份用于组织学观察。小麦叶片RNA提取及基因相对表达量的检测方法参照本章2.3.3，每个处理均以接种过BSMV:γ的病毒植株叶片作为对照。接种小麦条锈菌14天后观察记录发病情况并照相。Fes缓冲液配方：焦磷酸钠1.5g；斑脱土1.5g；硅藻土1.5g；GP30mL。定容至150mL，灭菌20min后，4℃保存。10×GP（母液）：13.07g磷酸氢二钾，9.39g甘氨酸，定容为250mL，高压灭菌20min，4℃保存备用。2.4结果2.4.1小麦条锈菌基因组中MAPK候选基因的鉴定及克隆MAPK信号通路是一类进化上高度保守的蛋白激酶，在植物病原真菌中，MAPK同源序列有着高度保守的特性。因此，我们借助功能明确的玉米黑粉菌的MAPK激酶信号通路基因（KPP4-FUZ7-KPP2/KPP6和KPP4-FUZ7-CRK1）以及本实验已经测序完成的小麦条锈菌CYR32的基因组信息资源，在全基因组水平上进行本地BLAST搜索。小麦条锈菌基因组大小107Mb，包含27964个基因，其中激酶类基因282个。我们从小麦条锈菌基因组数据库中查找获得七个FUS3/Kss1类MAPK级联途径候选基因。其中包括：PsUBC2（adaptorprotein）、PsKPP4（MAPKKK同源基因）、PsFUZ7 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用29（MAPKK同源基因）、PsKPP2、PsKPP6和PsCRK1（三个均为MAPK同源基因）、PsPRF1（转录因子）。根据搜索得到的基因序列设计引物（附表1），成功从CYR32cDNA中克隆到七个基因。表2-1.候选的小麦条锈菌的Fus3/Kss1类MAPK级联途径基因Table2-1.MAPKorthologsidentifiedinPst.ProteinNameorthologinNo.ofBLASTE-valueUstilagomaydisaminoacidsIdentityPsUBC2UBC280141%5e-67PsKPP4KPP4155132%e-134PsFUZ7FUZ743054%5.00E-156PsKPP6KPP640978%2.00E-164PsKPP2KPP234581%e-164PsCRK1CRK1117665%e-135PsPRF1PRF156946%5e-242.4.2小麦条锈菌MAPK候选激酶基因的转录表达水平特征分析利用荧光定量检测对小麦条锈菌候选MAPK基因在夏孢子以及接种后不同时间点进行RT-PCR分析，以明确候选基因在小麦条锈菌生长发育的不同阶段的转录表达特征。以夏孢子时期表达作为对照，从图2-1中可以看出，PsUBC2、PsKPP4、PsFUZ7、PsKPP6、PsCRK1和PsPRF1均持续上调表达至72h，在这个时期小麦条锈菌已经成功定殖并且开始在植物组织中蔓延。而且PsUBC2、PsKPP4、PsFUZ7、PsKPP6和PsPRF1在6h-18h表达水平达到高，可能基因在小麦条锈菌芽管（12h）和气孔下囊及初生吸器（18h）形成时期发挥重要作用。PsCRK1则在吸器大量形成时期（24h）表现出明显的上调表达；，而PsKPP2在条锈菌侵染小麦的各个时期的表达量都很低，转录水平明显下调。这些结果表明，这七个激酶基因在小麦条锈菌侵染阶段具有不同的转录表达特征，且除PsKPP2外其余基因均在侵染前期诱导表达，推测这些基因在条锈菌与小麦的互作过程中发挥一定的作用。在玉米瘤黑粉中，KPP2和KPP6在功能上存在部分重叠(Zhaoetal.2007;Brefortetal.2009;Rispailetal.2009)，结合本实验结果可以推测，PsKPP2与PsKPP6在小麦条锈菌中可能也存在功能冗余，PsKPP2可能在特定条件下诱导表达，所以后续未进行PsKPP2的功能验证实验。 30小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用图2-1MAPK级联途径候选基因在小麦条锈菌不同发育阶段表达特征分析。Fig.2-1RelativeexpressionofMAPKorthologsinPst.DatawerenormalisedtothePsEF-1expressionlevel.Errorbarsrepresentvariationsamongthreeindependentreplicates.2.4.3酵母双杂验证MAPK候选基因之间互作为了证实MAPK级联途径基因相互作用在小麦条锈菌中的保守性，我们将小麦条锈菌中MAPKK的同源基因PsFUZ7、PsUBC2构建到pGADT7载体，MAPKKK的同源基因PsKPP4和MAPK同源基因PsKPP6克隆到载体pGBKT7上，结果证实PsFUZ7能与上游的PsKPP4相互作用，同时也能与下游的PsKPP6和PsCRK1相互作用(图2-2)。但在PsFUZ7-PsKPP2、PsKPP6/PsKPP2/PsCRK1-PsPRF1之间没有检测到直接相互作用，可能PsFUZ7-PsKPP2或PsKPP6/PsKPP2/PsCRK1-PsPRF1之间相互作用太弱或太短暂，不能通过酵母双杂交测定法检测到，或者仅磷酸化的PsFUZ7将与其下游靶标PsKPP2相互作用。这个实验表明MAPK级联途径基因的相互作用在小麦条锈菌中可能是保守的，并且推测他们通过之间的相互作用发挥着调控下游基因的重要作用。图2-2MAPK级联途径候选基因酵母双杂交。Fig.2-2Yeasttwo-hybridbetweenMAPKcascadegenes. 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用312.4.4VIGS沉默实验为了初步筛选在条锈菌侵染致病过程中起到关键作用的MAPK激酶基因，我们利用BSMV介导的基因沉默技术分别对六个基因进行沉默。将小麦幼苗培养到二叶一心后，利用人工摩擦接种的方法将BSMV接种到完全舒展开的第二叶，随时观察对照和处理的症状。接种BSMV:TaPDS病毒的叶片在10d左右，可以观察到叶片漂白的现象出现（图2-3），而接种空载体和携带目的基因的病毒叶片出现条纹状褪绿的病毒症状，证明本次接毒实验是成功的。图2-3接种BSMV病毒10天后小麦叶片表型。Fig.2-3PhenotypeoftheleavesinoculatedwithBSMVat10daypostinoculation(dpi).Plantswerepre-inoculatedwithmock(FESbuffer).在观察到病毒表型后，即可在第四片叶子上接种条锈菌毒性菌株CYR32，14d后观察条锈菌在小麦上的发病情况，记录致病表型并照相。结果如图2-4所示，小麦条锈菌在接种过空病毒与FES缓冲液的叶片上发病情况相似，夏孢子堆多且密，也证明小麦接种BSMV病毒后与条锈菌之间的互作没有受到明显的影响。与对照相比，在接种过携带目的基因的病毒BSMV:PsUBC2的叶片上夏孢子堆的数目变化不明显（图2-4；图2-5A）。另外，接种BSMV:PsKPP4，BSMV:PsFUZ7，BSMV:PsKPP6，BSMV:CRK1和PsPRF1后的小麦叶片上，夏孢子堆的数目均有一定程度减少。从沉默六个基因后的整体表型分析来看，接种PsFUZ7后的叶片沉默效果最为显著明显，接种过BSMV:FUZ7的叶片产孢量减少最为显著。这些结果表明小麦条锈菌中的关键激酶基因可能参与到条锈菌对小麦的致病性的过程中来，尤其PsFUZ7的调控作用更为显著，可能作为小麦条锈菌中关键的致病因子在小麦条锈菌侵染过程中发挥着重要的作用。 32小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用图2-4对照和沉默目的基因的植株中接种毒性菌株CYR3214d后的致病表型。Fig.2-4PhenotypeofthefourthleavesinoculatedwithCYR32at14dpi.Plantswerepre-inoculatedwithmock(FESbuffer),BSMV:TaPDS,BSMV:γ,BSMV:PsUBC2,BSMV:PsKPP4,BSMV:PsFUZ7,BSMV:PsKPP6,BSMV:PsCRK1,orBSMV:PsPRF1,respectively.为了确定致病力的降低是否由目的基因的沉默引起，我们分别检测了不同目的基因在条锈菌侵染病毒预先处理过小麦叶片48h和168h后的表达水平（图2-5B）。与对照相比，接种相应重组病毒的小麦叶片中，目的基因在48h和168h的表达量明显下降。接种条锈菌48h和168h后，PsUBC2基因分别导致约56.1%和48.2%下调；PsKPP4基因分别导致约50.9%和51.3%下调；PsFUZ7基因分别导致约59.8%和54.4%下调；PsKPP6基因分别导致约57.4%和56.7%下调；PsCRK1基因分别导致约45.8%和41.0%下调；PsPRF1基因分别导致约50.7%和44.8%下调。这些检测的结果说明，目的基因的表达确实可以通过VIGS被沉默，也证明了观察到的病原菌致病力的降低的确是由目的基因的沉默引起的。图2-5利用VIGS技术对MAPK激酶基因在小麦与条锈菌互作过程中的功能进行分析。A，接种 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用33CYR3214d后对沉默植株和对照中产生的夏孢子堆密度进行定量统计。B，目的基因在沉默植株中的相对表达量。Fig.2-5FunctionalassessmentofMAPKrelatedgenesinthewheat-Pstinteractionbyvirus-inducedgenesilencing.A,Quantificationofurediadensityinsilencedplants14dpiwithCYR32.B,RelativetranscriptlevelsoftargetgenesinknockdownplantsinoculatedwithCYR32at2and7dpi.WheatleavesinoculatedwithBSMV:γandsampledafterinoculationwithCYR32wereusedasthecontrols.ThedatawerenormalizedtotheexpressionlevelofPsEF-1.2.5讨论MAPK级联途径在真核生物中广泛存在，且高度保守性。在玉米瘤黑粉中，MAPK级联途径可以将细胞外的信号传递到细胞内，调节其参与到病原菌的一系列生理生化反应中，包括菌丝交配和致病力等复杂代谢活动。但是，MAPK级联途径在小麦条锈中的是否起着同样重要调节作用，目前尚未见深入报道。在本研究中，我们利用现有的小麦条锈的基因组资源并参考玉米瘤黑粉里MAPK的序列信息，在小麦条锈菌中搜索并克隆到MPAK级联途径激酶基因，其中包括PsUBC2（adaptorprotein）、PsKPP4（MAPKKK同源基因）、PsFUZ7（MAPKK同源基因）、PsKPP2、PsKPP6和PsCRK1（MAPK同源基因）、PsPRF1（转录因子）等一系列同源基因。首先，我们对克隆到的七个MAPK信号途径相关基因在条锈菌与小麦互作的中转录表达水平特征进行了分析。结果显示，除PsKPP2外，其余MAPK信号通路相关基因在前期互作过程中的表达量均有所上升，主要从芽管萌发（6h）的时期持续上调表达到条锈菌成功定殖（18-24h），随后在菌丝扩展（大约72h）阶段也有明显的上调。这些结果说明了这六个MAPK相关基因可能在前期的侵染定殖和菌丝蔓延过程中发挥着重要的作用。然而，PsKPP2的表达则在整个病原真菌与寄主互作过程中呈现下调趋势。在玉米瘤黑粉中，Kpp2和Kpp6存在着一定的功能重叠，例如，kpp2的缺失突变只能部分地影响了交配过程，因为Kpp6的存在可以恢复部分的交配缺失表型（MayorgaandGold1999;Mülleretal.2003;Brachmannetal.2003）。而kpp2/kpp6双重敲除突变体不能交配而且是非致病性的，这些结果表明MAPK信号途径在真菌交配和侵染毒性方面有部分重叠的功能（Zhaoetal.2007;Brefortetal.2009;Rispailetal.2009）。由此，我们推测，在小麦条锈菌中，PsKPP6与PsKPP2也可能存在着功能冗余，且PsKPP2可能在某种条件下诱导表达。在酵母双杂交实验中，我们发现PsUBC2-PsKPP4、PsKPP4-PsFUZ7、PsFU7-PsKPP6/PsCRK1可以互相作用，说明这几个MAPK级联途径基因的相互作用在小麦条锈菌中也是保守的；并且推测他们通过相互作用传递信号，发挥着调控下游基因的重要作用。但是，在PsFUZ7-PsKPP2、PsKPP2/PsCRK1/PsKPP6-PsPRF1之间没有检测到直接相互作用。根据稻瘟菌中报道，Pmk1和Mst7以及Pmk1和Mst11或Mst50之间也未能通过酵母双杂交检测它们之间的物理相互作用（Zhaoetal.2005）。因此，我 34小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用们推测一方可能是由于他们之间相互作用太弱或太短暂，不能通过酵母双杂交检测到，另外一方面可能是仅在上游蛋白磷酸化的情况才可以与其下游靶标相互作用。小麦条锈菌因为其专性寄生的特性，未能建立起稳定的遗传转化体系。但是近几年VIGS技术的发展，为研究小麦条锈菌的功能提供了一个可行的方法。在本实验中，我们利用VIGS技术分别沉默了条锈菌MAPK通路中六个相关基因，它们的表达水平在48h和168h分别有不同程度下调，证明VIGS技术在研究条锈菌基因功能方面的有效性。PsFUZ7沉默植株接种条锈菌CYR32小种后，可以从表型上看出小麦条锈菌夏孢子的数目显著减少；在PsKPP4，PsKPP6，PsCRK1和PsPRF1的沉默植株上，夏孢子堆数也有减少。结果说明了MAPK信号通路基因在小麦条锈菌的生长发育中发挥着不同程度的调控作用。另外，沉默PsFUZ7后的表型最为显著，推测可能PsFUZ7处于信号级联途径的核心位置，且在条锈菌中与其功能冗余的相关基因较少。总之，以上结果说明，条锈菌中MAPK级联激酶基因的沉默，可以使小麦条锈菌信号传导受到影响，从而影响了小麦条锈菌的生长发育和在小麦上的致病性。综上，本章研究中，我们克隆得到了七个条锈菌MAPK级联途径激酶候选基因，证明了其中PsKPP4、PsFUZ7、PsKPP6、PsCRK1和PsPRF1五个基因不同程度参与到调节小麦条锈菌生长发育和的过程中，并且影响对小麦的致病性。结果也表明小麦条锈菌中的MAPK信号途径与其它真菌存在着功能的保守性，为小麦条锈菌信号传导途径的解析提供了依据，也为抗条锈材料的创建提供了潜在的基因资源。 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用35第三章小麦条锈菌关键MAPKKK激酶基因PsKPP4功能分析3.1引言在担子菌门真菌中，玉米黑粉菌的Fus3/Kss1类MAPK途径KPP4(MEKK)-FUZ7(MEK)-KPP2/KPP6(MAPK)被解析的较为清晰。其中，KPP4-FUZ7-KPP2途径主要是参与黑粉菌的有性交配过程。而KPP4-FUZ7-KPP6/KPP2途径参与了病菌的致病过程（Brefortetal.2009）。在子囊菌门真菌中，稻瘟菌的MST11(MEKK)-MST7(MEK)-PMK1(MAPK)途径是被研究的最为清楚的Fus3/Kss1类MAPK途径。mst11和mst7突变体与pmk1突变体一样，致病性丧失并且不能形成附着胞，并且SAM（SterileAlphaMotif）基序对MST11基因功能的执行是必需的（Zhaoetal.2005）。MST11类似于其他STE11同源物，在N末端具有SAM结构域（Mülleretal.2003;Grimshawetal.2004）。最初发表的粗糙脉孢菌NRC-1序列（KotheandFree1998）比实际的基因组序列（NCU06182）短，缺少SAM结构域。在稻瘟菌中，与MST11相互作用的STE50同源物（MST50）也含有SAM结构域。MgRas1和MgRas2在酵母双杂交测定中与MST11相互作用。因为已知Ras蛋白在MAPK级联的上游起作用（Liebmann2001;Cherkasovaetal.2003），MST11可能由稻瘟菌中的Ras蛋白激活。酿酒酵母PAK激酶STE20对于Ste11的活化和交配和丝状生长途径至关重要（Bardwell2004）。本研究发现，小麦条锈菌PsKPP4是一个典型的MAPKKK蛋白激酶，含有SAM（SterileAlphaMotif）结构域，RA（Ras-association）结构域和一个蛋白激酶结构域。抑制剂处理PsKPP4后诱导菌丝的严重畸形，且利用病毒诱导的基因沉默技术对PsKPP4进行特异沉默后，导致小麦条锈菌的菌丝生长畸形，致病力显著降低。本研究将为揭示小麦条锈菌MAPK级联途径激酶的功能奠定了基础及条锈病持久控制的新策略提供基因资源。3.2试验材料3.2.1植物材料实验所用小麦材料及小麦条锈菌培养条件参考2.2.1。供试大麦大麦由本校植物保护学院许金荣教授馈赠，培养于25℃温度，16h光照条件下的培养间中。3.2.2菌株野生型稻瘟菌Guy11、70-15，稻瘟菌突变体mst7、mst11，酵母菌株XK1-25，均由本校植物保护学院许金荣教授馈赠。 36小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharaomycespombe）菌株SP-Q01，大肠杆菌（Eschrichiacoli）菌株JM109、Top10、DH10B，酿酒酵母菌株AH109均由本实验室保存。3.2.3质粒载体质粒名称用途抗生素标记来源BSMVVIGSAmp本室保藏pREP-3X酵母过表达Amp本室保藏pFL2稻瘟突变体互补Amp和G418许金荣实验室馈赠16318原生质体定位Amp本室保藏pMD18-TTA克隆载体AmpTakara3.2.4分子生物学试剂无内毒素质粒大提试剂盒（康维世纪）；潮霉素（罗氏）；G418（MP）；Lysingenzymes（Sigma）；MAPKKK抑制剂（Ste11MAPKKKActivationInhibitor，Calbiochem）；WheatGermAgglutinin（Invitrogen）；其余实验中所用试剂参考2.2.4。3.3方法3.3.1小麦条锈菌的培养小麦条锈菌培养方法条件参见2.3.1。3.3.2小麦条锈菌夏孢子萌发与样品采集实验所用具体操作方法参见2.3.2。3.3.3小麦条锈菌夏孢子及接种条锈菌叶片总RNA的提取及纯化具体操作方法参考2.3.33.3.4生物信息学分析小麦条锈菌关键激酶基因利用ClustalW2对其他物种中同源的蛋白序列进行比对，之后利用在线的Boxshade软件（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.htmL）添加阴影并呈现图片。利用在线软件Pfam和NCBIConservedDomainSerach预测候选蛋白的保守结构域。利用本实验室已测序的小麦条锈菌CYR32基因组信息资源，在全基因组水平上BLAST搜索获得小麦条锈菌中的MAPKKK基因（KPP4同源基因）。3.3.5酵母转化具体实验方法参考2.3.7。3.3.6酵母过表达（1）挑取转化成功的pREP-3X-gene及pREP-3X质粒的裂殖酵母单克隆，在10mL含2μMVB1的SD-Leu液体培养基中培养，30℃，200rpm至OD=0.6-1.0。裂殖酵母 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用37SP-Q01转化方法参照上述2.3.7酵母双杂实验。（2）上述培养液均分两份，倒入50mL离心管，室温条件下3000rpm离心5min。（3）分别用含有2μMVB1和不含VB1的SD-Leu液体培养基洗涤沉淀细胞，重复两次。（4）然后分别转入20mL含有2μMVB1和不含VB1的SD-Leu液体培养基，将OD调整至0.2。（5）30℃恒温，200rpm培养20h。（6）显微镜下观察记录细胞形态；稀释细胞浓度至105，104，103和102，并分别置于含有高渗胁迫（0.35MNaCl）和氧化胁迫（0.5mMH2O2）固体培养基上重新培养。3.3.7抑制剂处理MAPKKK抑制剂用DMSO溶解并配置为10mM浓度的母液，于-20℃保存。工作液浓度通过实验确定为10μmol/L，以DMSO做对照。在4°C黑暗条件下，新鲜的小麦条锈菌夏孢子CYR32在MAPPKKK抑制剂工作液和对照中萌发3-6h，在显微镜下观察。另外，将抑制剂处理过1-2h的孢子分别接种到一叶期水源11小麦上，于14d观察表型并照相统计。3.3.8稻瘟突变体互补3.3.8.1稻瘟互补突变体载体构建利用酵母的同源重组能力将小麦条锈菌同源序列互补片段插入到pFL2载体中。引物设计时：在互补片段的正向引物5’端加上RP27启动子的上游序列5’-CAGATCTTGGCTTTCGTAGGAACCCAATCTTCA-3’与pFL2载体序列同源的一段碱基序列；反向引物去掉终止密码子，且5’端也需加上RP27启动下游序列5’-CACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCAC-3’（附表1），回收纯化互补所需的DNA片段；用XhoI酶切即线性化pFL2载体并回收纯化。将纯化得到的目的DNA片段和载体线性化片段共转化进入XK1-25酵母菌株中，具体方法参见酵母共转化方法2.3.8，PCR检测单克隆。3.3.8.2酵母质粒的提取（1）挑选上述转化成功的单克隆，30℃，200rpm摇菌过夜培养；（2）收集菌体，12000rpm离心30s，弃上清；（3）加入100μLYE裂解液重悬菌体，然后加入酚：氯仿（100μL；1:1），强烈震荡10min； 38小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用（3）65℃水浴锅中水浴5min，期间保持静止；（4）12000rpm离心5min，吸取上清至新的1.5mL离心管中；（5）加入2倍体积的95%乙醇，室温放置5min，12000rpm离心5min，去除上清；（6）用70%的乙醇重悬并洗涤沉淀两次，超净工作台风干；（7）加入100μL蒸馏水溶解沉淀，-20℃保存。附YE酵母裂解液：试剂浓度TritonX-1002%(V/V)SDS1%(W/V)NaCl100mMTris-HCl(8.0)10mMEDTA1mM3.3.8.3大肠杆菌电转化（1）用ddH2O将电极杯冲洗干净后，浸泡于100％乙醇中30min，取出后在超净工作台中风干，冰上预冷；（2）感受态细胞融化后，加入5μL提取的酵母质粒，混匀；（3）感受态细胞加入电极杯（预冷），使菌液自然流到底部，不要有气泡。电极杯外壁擦拭干净，放入仪器，2500mv电击5ms；（4）电击成功后，将1mLLB培养基加入电极杯，反复冲洗几次，将菌液洗至2mL离心管；（5）150rpm，37℃，培养40-60min；（6）将复苏过的菌液用涂布器均匀地涂到含有50μg/mL氨苄青霉素（Amp）的固体LB平板上，晾干倒置平板；37℃培养过夜；（7）对单克隆进行PCR检测、提取质粒并测序。3.3.8.4稻瘟菌原生质体转化（1）将稻瘟菌突变体及野生型菌株在燕麦培养基上进行活化，在平板上培养6-10天后，用无菌牙签抠取2.5×2.5cm的菌饼放入提前灭过菌的破碎仪，加入50mL5×YEG（含50μg/mLAmp）液体培养基，断续破碎几次，每次10s，随后转移至250mL锥形瓶中，175rpm，25-28℃条件下继续培养24h； 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用39（2）培养24h后，将菌液倒入灭过菌的组织破碎仪中重新打碎，断续破碎30s，倒回锥形瓶，加入50mL含50μg/mLAmp的新鲜CM培养基，25-28℃，170rpm培养12h；（3）将培养物用microcloth滤布（提前灭菌）过滤(漏斗提前灭菌)，然后用1M无菌山梨醇冲洗干净。（4）用勺子将菌丝挤压去除水分，分装于50mL离心管中，加入5mg/mL酶解液。30℃，90rpm酶解1.5-2h；在显微镜下观察菌丝是否释放出大量并完整的原生质体。（5）将两层擦镜纸叠加在一起，再加上一层滤布（高温灭菌过）来过滤酶解后的原生质体，到新的50mL离心管中，室温条件下离心5min（水平转头3,500rpm）；（6）倒走上清，用20mL1×STC重新悬浮原生质体，3,500rpm离心5min；（7）加入2mL左右1×STC重新悬浮原生质体，将原生质体浓度调节至5×107，若要于-80℃保存，可以加入DMSO调整终浓度为7%后保存。（8）将200μL原生质体分装至50mL无菌离心管，加入20μg含目的DNA片段的质粒，轻柔混匀，略微倾斜放置，室温静止放置20min；（9）用去尖枪头加入1-1.2mL提前过滤除菌的40%PTC，轻轻混合均匀，室温静止放置20min；（10）加入10mLTB3（含50mg/mLAmp）液体培养基，28℃，100rpm条件下过夜使原生质体重新生成细胞壁；（11）培养过夜后，用水平转头3,500rpm离心5min，弃上清，加入200μLSTC悬浮沉淀；（12）融化BottomAgar，至55℃左右，加Amp（50mg/mL）和G418（200g/mL）。将10mLBottomAgar加入到原生质体，混匀后倒平板，室温条件下（25-28℃），过夜培养；（13）在平板上覆盖一层TopAgar（含50mg/mLAmp和600μg/mLG418），28℃继续培养；（14）4-6天后，转移转化子至提前加入Amp抗生素（150μg/mL）和G418抗生素（300μg/mL）的燕麦培养基上，继续培养并进行检测筛选；附缓冲液及培养基配方：A、酶解液：lysingenzyme200mg1M山梨醇40mL用过滤器过滤除菌。B、PTC溶液（100mL）：PEG800040g 40小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用1×STC溶液补足至100mL可在65℃烘箱中放置加速溶解，用细菌过滤器除菌于4℃保存C、1×STC溶液（500mL）蔗糖100g0.5MTris-HCl（pH=8.0）50mLCaCl2•2H2O3.6755gddH2O补足至500mLD、燕麦培养基（2L）：燕麦片100g蒸馏水1500mL70℃水浴2h后，用纱布过滤掉燕麦碎渣，收集汁液定容至2000mL，然后分装至250mL锥形瓶，每200mL加入2.7g琼脂混匀，121℃高压灭菌40分钟。E、5×YEG培养基（2L）：YeastExtract10g葡萄糖20g加入蒸馏水定容至2L，灭菌。F、CM培养基（1L）：YeastExtract1gPeptone2g葡萄糖10g酸水解酪蛋白1gNaNO36gMgSO4·7H2O1.023gKH2PO41.5gKCl0.5gAgar（液体则不加）15g加入蒸馏水定容至1L，调节pH至6.5，灭菌。G、TB3培养基（2L）：YeastExtract6g酸水解酪蛋白6g蔗糖400g加入蒸馏水定容2L，灭菌。H、Bottomagar（2L）：YeastExtract6g 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用41酸水解酪蛋白6g蔗糖400gAgar20g加入蒸馏水定容至1L，灭菌。I、Topagar（2L）：YeastExtract6g酸水解酪蛋白6g蔗糖400gAgar30g加入蒸馏水定容至1L，灭菌。3.3.8.5稻瘟菌互补转化子DNA提取及鉴定（1）将筛选出来的稻瘟转化子接种于铺有无菌玻璃纸的燕麦培养基上，25℃黑暗培养5-7天。（2）用牙签刮取玻璃纸上的菌丝，放入加入钢珠的2mL离心管中，液氮速冻后震荡破碎菌丝；（3）加入600μL预热的CTAB缓冲液(55-65℃)，悬浮沉淀。（4）65℃静置30分钟，每隔15分钟轻柔颠倒混匀一次。（5）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，4000rpm离心10min。（6）转移上清，加入氯仿：异戊醇（24：1），混匀，离心同上。（7）转移上清，加入2倍体积的无水乙醇及1/10体积的NaAc后，-20℃放置两个小时。（8）4℃，10,000rpm离心10-15min。（9）用600μL75%乙醇悬浮洗涤沉淀。（10）用600μL100%乙醇重新洗涤一次，风干。（11）加入40μL无菌ddH2O,待溶解完全，置于-20℃保存。（12）加入2-4μLDNAPCR鉴定是否有目的基因存在。附缓冲液配方：A、CTAB抽提液CTAB20g0.5MTris-Cl（pH8.0）200mL0.5MEDTA（pH8.0）40mLNaCl81.8g 42小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用ddH2O补足到1L121℃高压灭菌20分钟，室温保存B、pH5.2醋酸钠（3M）：称量40.8gNaAc·3H2O，加水溶解，以冰醋酸调pH值至5.2，随后以纯水定容至100mL。121℃灭菌20分钟。3.3.8.6稻瘟菌附着孢（1）分别将稻瘟菌Guy11野生菌、突变体以及鉴定成功的转化菌株接种到燕麦培养基上，适宜条件下培养5-7天；（2）用1mL无菌水冲洗菌丝直至分生孢子洗脱下来；（3）将3层擦镜纸叠加在一起，用于过滤收集到的孢子悬浮液；（4）3,000rpm离心10min；重复洗涤两次；（5）重新加入无菌水，配制成最终的孢子悬浮液（1×105个/mL）；（6）在疏水玻片上滴上20μL的上述配置好的悬浮液，黑暗（25℃）下培养24h（保湿充分）；（7）观察并记录附着胞的形成。3.3.8.7大麦接种试验（1）活化稻瘟菌野生菌株、突变体菌株及互补转化子于燕麦培养基上，培养5-8d（25℃条件下），制备孢子悬浮液，方法同上；（2）将加入0.25%Gelation的悬浮液滴施于生长一周左右健壮的大麦叶片，0.25%的Gelatin作为对照)；（3）25℃保湿培养，观察发病情况，4~5d后拍照；重复3次。3.3.9Westernblotting（1）将电泳后的胶板取出，裁取和胶一致的硝酸纤维素膜，将分离胶放入转膜缓冲液中15min，另外将硝酸纤维素膜、滤纸也浸入转膜缓冲液中。按照海绵——滤纸（2层）——胶——纤维素膜——滤纸（2层）——海绵的方式依次放置于电转槽。（2）加入转膜缓冲液，需要提前预冷，放置于冰水浴中以60v电压，150mA转膜2小时。（3）用TBS冲洗一下膜，加入TBS（含10%脱脂奶粉），封闭1h，然后弃除封闭液。用TTBS洗膜10min，TTBS需要提前加入吐温-20至0.1%终浓度。（4）取出1μL一抗，稀释于TTBS（含2%脱脂奶粉和0.05%吐温-20），之后将其 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用43均匀点在一次性手套上，形状要同膜大小一致。小心地将膜贴在其上（有蛋白的一侧的接触一抗），排完气泡并保湿。25℃孵育2h（或者4℃条件下过夜放置）。（5）膜用TBS洗2次，用TTBS（提前加入吐温至0.05%）再洗一次，10min/次。（6）取1μL二抗，稀释在含2%奶粉的TTBS中，方法同一抗，25℃孵育1h。（7）膜用TTBS（提前加入吐温至0.05%）再洗4～5次，5min/次。（8）加染料照相。实验所需试剂：A．1×TBS:Tris碱6.05gNaCl9g加ddH2O定容至1L，用盐酸调pH至7.5。B．转膜缓冲液：Tris碱4.45g甘氨酸21.6g甲醇300mL加ddH2O定容至1.5L。C．10%脱脂奶粉：脱脂奶粉2gTBS18mLD．TTBS（0.1%吐温-20）：吐温-2010μL1×TBS10mL3.3.10小麦条锈菌组织学处理参照成玉林(2015)等报道的方法，对小麦叶片组织中条锈菌组织利用偶联fluorophorealexa488（Invitrogen）荧光素的小麦凝集素（wheatgermagglutinin）处理，可以获得到高质量的的侵染结构图像。（1）根据实验需要选取不同接种时间小麦叶片进行取样。（2）将接种过的小麦叶片剪成1.5cm左右的叶段，放入固定液中直至叶片绿色完全褪去，期间需根据情况更换加入新的固定液。（3）褪色完全后，移除固定液，加入饱和水合氯醛溶液过夜，至小麦叶片完全透明。（4）水合氯醛中透明完全后，用Tirs-HCl（0.05M，pH7.5）缓冲液冲洗2-3次；（3）除去Tirs-HCl，用50%乙醇洗2次，每次15min； 44小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用（4）Tirs-HCl冲洗2-3次；（4）加入适量1MKOH溶液，确定能够浸没叶片，放入高温灭菌锅中121℃处理3-8min（高温处理后叶片极易碎，此步骤之后需非常谨慎）；（5）Tris-HCl小心冲洗3次，每次5min；（6）然后加入1mg/mL的适量WGA-alexa488溶液，浸没过叶片8-10min（将荧光染料回收以便下次重复利用）；（7）然后Tris-HCl缓冲液小心冲洗3次，5min/次，用第三次Tris-HCl缓冲液保存叶片。（8）处理后的样品即可用以制片观察，用OlympusBX-53荧光显微镜（OlympusCorporation）对条锈病原菌的结构进行观察，同时对观察到的侵染点菌丝结构进行记录统计。包括统计初生菌丝的分支数，吸器母细胞及吸器的个数，菌丝的长度及菌丝蔓延面积，每个样品统计30-50个侵染点。附所需试剂配方：固定液配方：无水乙醇：氯仿（4:1）+三氯乙酸（0.15%）即：无水乙醇800mL，氯仿200mL，0.15g三氯乙酸或者无水乙醇：冰醋酸（1:1）即：无水乙醇100mL，冰醋酸100mL饱和水合氯醛：水合氯醛+100mL蒸馏水Tirs-HCl缓冲液：取900mL蒸馏水加入110gTris,以浓盐酸调pH至7.5，将溶液总体积定容至1000mL即可。3.3.11原生质体定位（1）配制30mL酶解液：纤维素酶（CellulaseR-10）0.4g果胶酶（Macerozyme）0.09g甘露醇（Mannitol）2.18g0.3MKCl母液2mL200mMMES母液(KOH调pH=5.7)3mL加入水至20mL，55度水浴10min，冷却后继续加入下列试剂：0.15MCaCl2母液2mL1.5%BSA母液2mLβ-巯基乙醇5μL（2）过滤酶解液至一个无菌培养皿里，待用；（3）取正常培养2周的苗期小麦新鲜叶片，用锋利的手术刀切成细丝，投入酶解液中，保证完全浸没； 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用45（4）真空泵抽真空30min；（5）25℃-28℃黑暗条件下，脱色摇床最低转速酶解3小时；（6）用200目的过滤网（预先W5润洗）过滤酶解液至新50mL离心管；（7）常温圆底水平离心300rpm，5min；（8）弃上清，加W5溶液10mL，冰上静置30min；（9）常温圆底水平离心300rpm，5min；（10）弃上清，用MMG溶液悬浮即为原生质体，待用；（11）加10-20µg的重组载体质粒于2mL离心管，每个反应加入100µL原生质体，轻转混匀；（12）加110µL的PEG溶液，再轻转混匀。23度下反应25-35min；（13）加440µL的W5溶液，混匀。圆底水平离心300rpm，5min；（14）去上清，尽量去除PEG液体；（15）加200-300µLW5溶液悬浮原生质体。22-23度过夜诱导培养；（16）显微镜观察。附试剂配方：PEG4000溶液（现用现配，每个样品需要100μLPEG4000）：PEG40001gH2O20.75mL0.8MMannitol0.625mL1MCaCl20.25mLW5溶液（1000mL）：NaCl9gCaCl2.H2O18.4gKCl0.37gGlucose0.9gMES0.3g用KOH调节pH至5.8，高温高压灭菌20min,室温保存。MMG溶液：MgCl20.71gMES0.5gMannitol36.5g用KOH调pH至5.6，高温高压灭菌20min，室温保存。3.3.12农杆菌介导的PVX诱导表达 46小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用3.3.12.1PVX载体构建pGR106载体（PVX）共包含三个酶切位点--ClaI、SalI和SmaI，在目的基因引物两端加入合适的酶切位点，将目的片段转化连接到PVX载体，通用引物(PVX-F/R)进行检测，挑选阳性克隆，测序。3.3.12.2农杆菌感受态细胞的制备（1）枪头蘸取新鲜GV3101农杆菌单克隆于3-4mL液体LB培养基中，在适宜温度条件下（28℃，200rpm）培养至OD=2.0左右；（2）按1：100比例将农杆菌母液转接于新液体培养基中，28℃180rpm振荡培养，待OD600达到0.6，冰浴几分钟；（3）在4℃条件下，富集菌体至50mL离心管，离心10min（5500rpm）；（4）去上清，超纯水（高温灭菌）轻轻重悬，保证悬浮充分。（5）4℃条件下，5500rpm，离心5-10min；（6）菌体全部富集完后，去上清，加入15%甘油2mL，重悬细胞；（7）冰上分装，于预冷并提前灭菌的EP管（1.5或2mL）中；速冻于液氮然后放置-80℃冰箱。3.3.12.3农杆菌电转（1）用ddH2O将电极杯冲洗干净后，浸泡于100％乙醇中30min，取出后在超净工作台中风干，冰上预冷；（2）感受态细胞融化后，加入2-3μLPVX-目的基因的载体质粒，混匀；（3）将含有质粒的感受态细胞转移到预冷的电极杯，注意不要吹打出气泡，轻弹电击杯使菌体到达底部，电极杯外壁擦拭干净，放入仪器，2500mv电击5ms；（4）电击成功后，将1mLLB培养基加入电极杯，反复冲洗几次，将菌液洗至2mL离心管；（5）150rpm，37℃，培养40-60min；（6）菌液涂布于加入卡那霉素（50μg/mL）、利福平（50μg/mL）和庆大霉素（50μg/mL）的固体LB培养基，28℃，避光培养2-3d。3.3.12.4农杆菌侵染烟草（1）挑取PCR检测后的阳性单克隆于含有卡那霉素（50μg/mL）、利福平（50μg/mL） 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用47和庆大霉素（50μg/mL）的液体LB培养基中，28℃，200rpm避光培养1-2d；（2）4000rpm，5min离心收集菌体；（3）用MgCl2（10mM）洗涤菌体2-3次，然后稀释液体使OD600至0.2；（4）培养烟草4-6周后，选择健康叶片进行悬浮液注射，做好标记；（5）将处理过的烟草放置于25℃培养箱，适宜光照条件下培养。3.4结果3.4.1PsKPP4的蛋白结构分析我们克隆到PsKPP4基因，全长由4650个核苷酸组成，蛋白包含有1550个氨基酸残基。PsKPP4类似于kpp4和其他STE11同源物，在N末端具有SAM结构域，RA结构域和C末端蛋白激酶结构域(图3-1A)（Mülleretal.2003;Grimshawetal.2004）。我们对PsKPP4蛋白结构进行分析发现，PsKPP4属于MAPKKK家族，是一个典型的MAPKKK蛋白激酶。多序列同源比对结果显示，与其它真菌物种中的的同源蛋白MAPKKK类似，PsKPP4的蛋白激酶除了具有一个“-D[L/I/V]K-”保守活性位点外（图3-1B，红色框），还包含一个“-G[S/T][V/P][F/M][W/Y]M[A/S]PEV-”保守序列基序（图3-1B，蓝色框）。PsKPP4这个位点与植物的结构保守，具有MAPKKK的家族特异性(巩校东等2014)。图3-1PsKPP4结构分析。A.PsKPP4与其它真菌同源蛋白质激酶序列的结构分析。B.PsKPP4与其它真菌同源蛋白质激酶序列的比对。蓝色标框为MAPKKK特异性保守位点-G[T/S]Px[W/F]MAPEV；红色为“-D[L/I/V]K-”活性位点。Fig.3-1CharacteristicsofthePsKPP4genefromPst.A,SchematicorganizationsofPstanditshomologsfromotherfungi.Thesterileamotif(SAM)domain,Ras-association(RA)domainandcatalyticproteinkinasedomainsarerepresentedbywhite,black,andgreyboxes,respectively.B,AlignmentofkinasedomainofMAPKKK.Aminoacidswithconservative≥90%werecoloring,andtheredandbuleboxesmeantaactivesite-D[L/I/V]K-andspecificconservativesite-G[S/T][V/P][F/M][W/Y]M[A/S]PEV-, 48小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用respectively.Ste11,Byr2,Mst11,Kpp4,CnSte11,Pt-Ste11andPgt-Ste11werederivedfromSaccharomycescerevisiae,Schizosaccharomycespombe,Magnaportheoryzae,Ustilagomaydis,Cryptococcusneoforman,.PucciniatriticinaandPucciniagraminisf.sp.tritici,respectively.另外，系统进化树表明PsKPP4与叶锈杆锈中MAPKKK的亲缘关系最近，与担子菌中的MAPKKK被归为进化树上的一枝；其余的子囊菌归为另外一枝(图3-2)。图3-2小麦条锈菌PsKPP4与其同源物种中MAPKKK的进化树分析。Fig.3-2PhylogenetictreeofPsKPP4andorthologsfromotherfungi.3.4.2亚细胞定位为了明确小麦条锈菌中PsKPP4的亚细胞定位情况，我们进行了小麦原生质体转化实验，实验结果如图3-3所示。在转入16318-GFP对照质粒的原生质体中，可以在整个细胞中都观察到绿色荧光，包括细胞质，细胞核和细胞膜中。而PsKPP4-GFP融合蛋白在小麦原生质体中表达后，绿色荧光主要集中在细胞质中。图3-3PsKPP4的亚细胞定位。标尺=10µm。Fig.3-3SubcellularlocalizationofPsKPP4protein.Bar=10µm.3.4.3裂殖酵母中过表达激酶基因为了明确PsKPP4基因在菌丝生长发育和应对抗逆中起的作用，我们将PsKPP4基因与pREP3X载体重组(Forsburg1993)，然后在粟酒裂殖酵母（SP-Q01）中进行了异 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用49源的过表达。pREP3X载体上携带有表达Leu的基因，但SP-Q01是一种具有Leu缺陷的菌株，pREP3X载体在酵母中的表达可以弥补菌株的缺陷。nmtl是pREP3X质粒上存在的启动子，可以启动目的基因，对其进行蛋白表达。该启动子受维生素B1（thiamine）的调节。nmtl启动子在培养基中的thiamine浓度高于0.5μM时表达受到抑制，而当缺少VB抑制剂时，nmtl启动子则能被激活并正常的表达。将转化成功的酵母细胞分别添加VB（抑制表达）培养基和未添加VB（不抑制表达）培养基中，在相同条件下，对细胞培养20h后进行形态的观察。如图所示携带目的基因载体与携带空载体的酵母细胞在抑制培养基中培养20h后都表现出正常的形态。但是在诱导培养基中培养20h后，携带空载体的酵母细胞依然呈现出正常的长杆状形态且均匀分散开，而携带PsKPP4重组载体的酵母细胞则表现出细胞形态上的变化，大多数细胞呈现纺锤状，而且有细胞聚集的现象出现，与酵母中常见的絮凝现象类似（图3-4A；图3-4B）；细胞核用DAPI染色后表现出弥散的荧光（图3-4A）。而且，过表达PsKPP4后，裂殖酵母酵母细胞对氧化胁迫刺激（0.5mMH2O2）的抗性与对照相比均略有所提高（图3-4C）。因此，我们推测小麦条锈菌MAPK信号通路相关基因可能在抵抗外界各种生物和非生物胁迫中均发挥着重要的作用。图3-4裂殖酵母中过表达PsKPP4后表型。A，在酵母中过表达PsKPP4诱发了絮凝现象及影响了细胞形态。标尺=10µm。B，过表达PsKPP4后酵母细胞长度宽度统计。C，过表达PsKPP4增强了酵母细胞对氧胁迫（0.5mMH2O2）刺激。Fig.3-4OverexpressionassayofPsKPP4inthefissionyeastSP-Q01.A,OverexpressionofPsKPP4causesflocculationinyeast.Bar=10μm.B,Averagelengthofcellswerecalculated.DifferenceswereassessedusingStudent’st-testswithresultsfromthreereplicates.DoubleasterisksindicateP<0.01.C,OverexpressionofPsKPP4enhancesyeastresistancetooxidativestress(0.5mMH2O2). 50小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用3.4.4抑制剂处理实验在无菌水中分别加入DMSO，免疫抑制剂Ste11MAPKKKActivationInhibitor处理小麦条锈菌夏孢子，观察其萌发情况。实验结果表明，夏孢子在加入1μL/mLDMSO的水溶液（对照）中处理后，大部分都能萌发以及产生正常的芽管（图3-5）。而在经过10μM抑制剂处理后的小麦条锈菌夏孢子，萌发效率与对照相比没有显著的变化，但是萌发后形成的芽管则普遍呈现畸形状态。从图3-6A中可以明显看出，在抑制剂处理3h和6h后的萌发芽管中，芽管呈现出螺旋扭曲，畸形率分别达到27.2%和69.3%。在4℃条件下，分别用DMSO和免疫抑制剂Ste11MAPKKKActivationInhibitor处理夏孢子1-2h，然后接种到水源11小麦叶片上，14d后观察表型。结果显示，接种对照小麦条锈菌夏孢子的叶片可以正常产孢，并破裂散开；但是在接种抑制剂处理后的夏孢子的小麦叶片上产孢量严重减少，而且夏孢子堆表面光滑，未能破裂散开。图3-5免疫抑制剂Ste11MAPKKKActivationInhibitor处理观察小麦条锈菌夏孢子。A，免疫抑制剂处理观察小麦条锈菌夏孢子萌发，标尺=50μm。B，不同抑制剂处理后小麦条锈菌的萌发率统计；GT，芽管。C，抑制剂处理后的孢子接种小麦叶片后的表型观察。表型观察于接种后14d。Fig.3-5Effectoftheimmuno-suppressiveinhibitorSte11MAPKKKActivationInhibitorongerminationofPstgermtube.A,PstisolateCYR32germinatedinwatercontainingDMSOorinhibitor(10μM)at3hand6h.TreatmenturediosporeswiththeinhibitorlimitsgerminationofPstgermtubeandblocksfurtherdifferentiation.Analyseswereperformedbylightmicroscopy.Bars=50μm.B,GerminationofPstgermtube.Percentageofmalformedgermtubesisindicatedbyblackbars,thepercentageofnormalgermtubesisindicatedbywhitebars.GT,germtube.C,Phenotypeofwheatleavesinoculatedwithurediosporestreatedwithinhibitor.Datatakenat14dpi.3.4.5稻瘟突变体互补实验前期Guo等（2011年）对小麦条锈菌PsMAPK1(PsKPP6)基因进行了稻瘟和小麦赤霉菌突变体异源互补，证明了不同物种间的同源基因具有功能保守性。同样，我们构 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用51建了RP27强启动子启动的pFL2-PsKPP4载体转入稻瘟菌突变体mst11中，并用PCR检测获得阳性植株（图3-6）。图3-6PsKPP4互补稻瘟突变体mst11后转化子PCR检测筛选。Fig.3-6Detectedthetransformantsofmst11/PsKPP4byPCR.在疏水载玻片上Guy11和mst11/PsKPP4的附着胞形成率分别为94.8%和12.5%，而mst11突变体则不能形成附着胞（图3-7A）。在亲水玻片上，野生型、突变体和互补转化子菌株均未能形成附着胞。分别收集培养7d的稻瘟菌野生菌株Guy11、突变体菌株mst11以及互补后的转化子菌株的分生孢子，制成浓度1×105/mL的分生孢子悬浮液，加入Gelation，均匀的滴施于健康大麦叶片表面，25℃条件下保湿培养5-7天后观察统计发病情况，结果如3-7B所示。侵染大麦7天后，野生型的菌株可以在大麦叶片上产生面积大且可以逐渐蔓延的坏死病斑。互补PsKPP4的表型发病较弱，能观察到微弱的坏死。突变体菌株mst11以及对照Gelation完全不致病，接种后的植株上面并未观察到任何病斑。因此，推测小麦条锈菌PsKPP4基因分别能够部分互补稻瘟菌突变体附着胞的形成及致病性，但小麦条锈菌和稻瘟菌存在进化上的差异，PsKPP4物种间差异相对较大，功能保守性差，导致了互补后的表型较差。图3-7稻瘟菌野生型Guy11、突变体mst11和mst11/PsKPP4互补体的附着胞形成及大麦侵染实验。A，稻瘟菌野生型、突变体及互补体附着胞孢子附着胞形成实验，标尺=10μm。B，大麦侵染实验。Fig.3-7Complementationofthemst11mutantofMagnaportheoryzaewithPsKPP4.A,Appressoriumformationassaysonhydrophobicandhydrophilicsurfaces.Appressoriaareformedbythewildtype70-15andmst11/PsKPP4transformantonhydrophobicsurfaces.Themst11mutantfailstoformappressoriaby 52小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用24honhydrophobicsurfaces.Allstrainsfailtoformappressoriaonhydrophilicsurfaces.Bars=10mm.B,Leavesofone-week-oldbarleyseedlingswereinoculatedwithconidiaofthewildtype70-15,themst11mutant,orthecomplementedstrainmst11/PsKPP4.Inoculationwith0.25%gelatinwasusedasthecontrol.3.4.6酵母双杂交验证SAM结构域功能在玉米瘤黑粉中，KPP4的SAM结构域是与上游UBC2蛋白互作不可或缺的区域（Klostermanetal.2008）。前面酵母双杂实验验证了PsKPP4与PsUBC2之间存在着直接的互作关系，PsKPP4与PsUBC2可能通过蛋白之间互相作用传递信号，发挥着对条锈菌生长发育的调控作用。为了验证PsKPP4中SAM结构域在互作过程起到的作用，我们构建了结构域缺失的突变体进行互作验证。从图3-8可以看出，PsKPP4ΔSAM（氨基酸残基从137-198部分缺失）不能与PsUBC2互作，同样，敲除PsUBC2的SAM区域（3-67氨基酸）后也不能与PsKPP4互作，证明SAM在PsKPP4与PsUBC2互作中起着不可或缺的作用。图3-8SAM结构域在PsKPP4与PsUBC2互作过程中起着重要的作用。Fig.3-8TheSAMdomainisessentialfortheinteractionbetweenPsKPP4andPsUBC2.3.4.7农杆菌介导的诱导表达将目的基因PsKPP4与PsUBC2重组连接到PVX表达载体，转入农杆菌中并转染烟草，在烟草中瞬时表达目的基因；而注射eGFP与PVX重组载体的烟草作为为阴性对照。如图3-9所示，在注射eGFP和目的基因24h后，一侧的同一位置再次注射含有PVX-BAX的农杆菌；另一侧作为对照不进行注射，于3-5天后观察表型。结果表明，BAX可以诱导PCD的症状，其类似于病原菌与寄主互作过程中的诱导产生的HR（Baeketal.2004;LacommeandCruz1999）；而PVX诱导表达的目的基因PsKPP4蛋白能够抑制BAX诱导产生的PCD，与之对比，PsUBC2蛋白的诱导表达未能抑制BAX产生的PCD。结果表明PsKPP4可能抑制病原菌与植物互作中的HR反应，也就是它具有潜在的抑制植物防卫反应的功能。 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用53图3-9瞬时表达PsKPP4可抑制BAX诱导的PCD。Fig.3-9TransientexpressionofPsKPP4genescaninhibitthePCDtriggeredbyBAX.3.4.8VIGS沉默实验为了进一步明确PsKPP4和PsUBC2基因在条锈菌侵染致病过程中起到的作用，我们对它们进行了沉默。PsKPP4和PsUBC2均选择了两个不同的区段来用作沉默靶标，分别位于5’端的ORF区及3’端ORF区（图3-10A）。接种方法同前。结果如图3-10所示，接种BSMV:TaPDS病毒的叶片在10d左右，可以观察到叶片漂白的现象出现（图3-10B），而接种空载体和携带目的基因的病毒叶片出现条纹状褪绿的病毒症状，证明本次接毒实验是成功的。接种小麦条锈菌CYR3216天后，对照中小麦条锈菌的夏孢子堆多且密；但在接种过BSMV:PsKPP4和BSMV:PsUBC2的叶片上，夏孢子堆的数目出现不同程度的减少（图3-10C）。另外，生物量实验也进一步证明了，菌丝含量在沉默后植株里有不同程度降低，菌丝的生长发育受到了抑制（图3-10D）。图3-10利用VIGS技术对PsKPP4和PsUBC2基因在小麦与条锈菌互作过程中的功能进行分析。A，BSMV:PsKPP4和BSMV:PsUBC2载体的构建。α，β，γ：病毒三线体。B，接种BSMV病毒10天后小麦叶片表型。C，分别在对照和沉默目的基因的植株中接种毒性菌株CYR3214d后的致病表型。从左至右分别接种mock(FESbuffer)，BSMV:γ，BSMV:PsKPP4-1as，BSMV:PsKPP4-2as，BSMV:PsUBC2-1as，orBSMV:PsUBC2-2as。D，小麦条锈菌生物量分析。TaEF-1和PsEF-1作为对照。双星号代表P<0.01，星号代表P<0.05。 54小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用Fig.3-10FunctionalanalysisofPsKPP4andPsUBC2byvirus-inducedgenesilencing.A,StructureofBSMV:PsKPP4andBSMV:PsUBC2vector.B,PhenotypeoftheleavesinoculatedwithBSMVat10daypostinoculation(dpi).Plantswerepre-inoculatedwithmock(FESbuffer).C,PhenotypeofthefourthleavesinoculatedwithCYR32at14dpi.Plantswerepre-inoculatedwithmock(FESbuffer),BSMV:γ,BSMV:PsKPP4-1as,BSMV:PsKPP4-2as,BSMV:PsUBC2-1as,orBSMV:PsUBC2-2as,respectively.D,Fungalbiomassmeasurementsusingreal-timePCRanalysisoftotalDNAextractedfromwheatleavesinfectedwithCYR32at7dpi.RatiooftotalfungalDNAtototalwheatDNAwasassessedusingthewheatgeneTaEF-1andthePstgenePsEF-1.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests.DoubleasterisksindicateP<0.01.AsterisksindicateP<0.05.为了确定致病力的降低是否由目的基因的沉默引起，我们分别检测了不同目的基因在48h和168h后的表达水平。与对照相比，接种相应重组病毒的小麦叶片中，PsKPP4和PsUBC2基因在48h和168h的表达量明显下降。接种条锈菌48h后，PsKPP4基因的两个沉默片段分别导致约50.4%和62.2%下调；PsUBC2基因分别导致约58.0%和53.9%下调；168h，目的基因PsKPP4和PsUBC2表达量仍然降低，依次为43.2%和57.1%，47.6%和51.7%（图3-11）。检测结果说明，PsKPP4和PsUBC2基因确实可以通过VIGS技术被沉默，也证明了观察到的条锈菌致病能力的减弱的确是由PsKPP4和PsUBC2的表达被下调造成的。图3-11沉默植株中PsKPP4和PsUBC2基因的表达量和产孢量统计。A，PsKPP4和PsKPP6基因在沉默植株中的相对表达量。B，接种CYR3214d后对沉默植株和对照中产生的夏孢子堆密度进行定量统计。Fig.3-11FunctionalanalysisofPsKPP4andPsUBC2byvirus-inducedgenesilencing.A,RelativetranscriptlevelsofPsKPP4andPsUBC2inknockdownplantsinoculatedwithCYR32at2and7dpi.B,Quantificationofurediadensityinsilencedplants14dpiwithCYR32.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests.Valuesrepresentthemeans±standarderrorsofthreeindependentsamples.确定表型变化确实是由基因沉默引起后，我们对沉默目的基因后的条锈菌进行组织学观察。在接种条锈菌48h后，我们统计了吸器母细胞，菌丝分支和吸器的数量和菌丝长度。在接种重组病毒苗子上，小麦条锈菌形成的吸器数目和初生菌丝长度与对照相比显著减少，但是初生菌丝分支数和吸器母细胞的数目与对照性比并无明显变化（图3-12；3-13）。接种条锈菌120h后，对照植株上可以形成大面积的菌落，而在沉默PsKPP4后的植株中，小麦条锈菌的菌丝略干瘪，菌丝的生长受到显著的抑制；在沉默PsKPP6 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用55的植株中，小麦条锈菌菌丝的形态变化不大，但侵染扩增受到抑制。因此我们推测MAPK级联基因很可能是通过调控吸器的形成和发育来影响条锈菌的定殖与蔓延。图3-12沉默PsKPP4和PsUBC2基因后对条锈菌生长发育的组织学观察。A，接种条锈菌48hpi后，条锈菌组织学观察，标尺=10μm。从左至右依次BSMV:γ；BSMV:PsKPP4-1as；BSMV:PsKPP4-2as；BSMV:PsUBC2-1as；BSMV:PsUBC2-2as。B，接种条锈菌120hpi，观察菌丝的扩展面积，标尺=50μm。从左至右，从上到下依次BSMV:γ；BSMV:PsKPP4-1as；BSMV:PsKPP4-2as；BSMV:PsUBC2-1as；BSMV:PsUBC2-2as。SV:气孔下囊；HMC:吸器母细胞；IH:侵染菌丝；H:吸器。Fig.3-12HistologicalobservationoffungalgrowthinwheatinfectedwithBSMV:γandrecombinantBSMVafterinoculationwithCYR32.A,Fungalgrowthat48hpiinBSMV-infectedplants.Fromrighttoleft,wheatlevespreviouslyinoculatedwithBSMV:γBSMV:PsKPP4-1as,BSMV:PsKPP4-2as,BSMV:PsUBC2-1as,BSMV:PsUBC2-2as.Bar,20μm.B,Fungalgrowthat120hpiinBSMV-infectedplants.SilencingofPsKPP4wassuppressedonhyphaeextensionwithdefectinhyphaeandhaustorium,whileknowdownofPsUBC2onlywassuppressedonhyphaeextension.Incontrast,developmentofPstinplantsinoculatedwithBSMV:γwasnormalcomparedwiththatinMock.Bar,50μm.SV,substomatalvesicle;HB,branchesofinfectionhyphae;IH,infectionhypha;HMC,haustorialmothercell;H,haustorium. 56小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用图3-13PsKPP4和PsUBC2基因沉默后条锈菌生长发育的组织学观察统计。A，接种CYR32后48h，对PsKPP4沉默植株中菌丝分支，条锈菌吸器，吸器母细胞数目进行统计。B，接种CYR32后48h，对PsUBC2沉默植株中菌丝分支，条锈菌吸器，吸器母细胞数目进行统计。C，接种CYR32后48h，沉默PsKPP4和PsUBC2后条锈菌侵染菌丝长度统计。D，接种CYR32后120h，沉默PsKPP4和PsUBC2植株中条锈菌侵染蔓延面积与对照相比显著减少。双星号代表P<0.01，星号代表P<0.05。Fig.3-13EffectsofPsKPP4andPsUBC2onthePstdevelopmentinknockdownplants.A,Thenumbersofprimaryhyphaebranches(HB),haustorialmothercells(HMC)andhaustorium(H)inPsKPP4-silencedplantswererecordedat48hpi.B,Thenumbersofprimaryhyphaebranches(HB),haustorialmothercells(HMC)andhaustorium(H)inPsUBC2-silencedplantswererecordedat48hpi.C,Thelengthofinfectionhyphae(IH)inPsKPP4andPsUBC2-silencedplantsat48hpiwithCYR32isolate.D,TheinfectionareaofperinfectionunitinPsKPP4andPsUBC2-silencedplantsat120hpi.Valuesrepresentthemeans±standarderrorsofthreeindependentsamples.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests.AsterisksindicateP<0.05.DoubleasterisksindicateP<0.01.3.5讨论在本研究中，我们通过生物信息学分析及多序列比对，发现PsKPP4含有典型的磷酸化位点，与其他真菌中的同源物相似度较高。PsKPP4与酵母MST11和玉米瘤黑粉Kpp4相似，含有一个SAM（sterilealphamotif）结构域。本研究中发现敲除SAM结构域后，PsKPP4不能与PsUBC2相互作用，推测小麦条锈菌中PsKPP4中的SAM结构域在其与PsUBC2互作的过程中发挥着重要作用。在玉米瘤黑粉中，KPP4与UBC2在酵母双杂中的互作中需要通过各自的SAM结构域来完成(Klostermanetal.2008)；在稻瘟菌中，SAM结构域对于MST11在附着胞形成和植物感染中的调节功能至关重要（Zhao 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用57etal.2005）。因此，SAM结构域作为蛋白互作的关键位点，可能在小麦条锈菌PsKPP4基因调控生长发育过程中也发挥着重要的作用。MAPK信号通路中各类激酶的定位情况决定着它们功能能否正常的发挥，这也是其发挥调节功能的决定条件。前期的研究发现，在未刺激的细胞中，MAPK一般存在于细胞质中，并与不同的蛋白相互锚定（潘教文和李德全2010）。而MAPK受到信号刺激后可以转移进入核内，这个转移的过程需要MAPK的磷酸化。MAPK磷酸化后有三个去向：第一，留在细胞质中，继续激活其它蛋白激酶；第二，在细胞质中，使细胞骨架成分磷酸化；第三，转移入核，磷酸化下游的转录因子，从而调控基因表达（张维等2003）。而上游的MAPKKK和MAPKK一般情况下只存在于细胞质中。我们分析了PsKPP4基因的亚细胞定位情况，结果显示PsKPP4定位于细胞质中，可能经过一系列信号传导，最终磷酸化下游MAPK，调控不同生理生化过程。在稻瘟菌中，PsKPP4、PsFUZ7和PsKPP6基因均参与附着胞的形成，且其突变体丧失了病原菌对大麦和水稻的致病性。本实验室团队Guo等在2011年利用异源互补原理，将PsMAPK1（PsKPP6）成功互补到pmk1突变体中，而且部分恢复了附着胞的形成能力和致病力。因此，我们将PsKPP4异源互补到突变体mst11中去，在一定程度上恢复附着胞形成能力及致病性。这也说明了，PsKPP4在小麦条锈菌和稻瘟菌之间存在着一定的功能保守性。但是，PsKPP4互补突变体mst11后表型较弱，原因可能是它们除了结构域部分高度保守外，其余的区域差异较大，这些物种间的差异造成PsKPP4互补稻瘟突变体后表型不能完全恢复。在抑制剂处理的体外实验中，虽然MAPKKK抑制剂处理后芽管的萌发并未受到明显影响，但是萌发后芽管呈现麻花状的扭曲，严重抑制了芽管的发育，这个结果暗示了MAPKKK可能在菌丝的生长发育过程中发挥着重要的作用。另外，我们将PsKPP4基因在酿酒裂殖酵母中进行了过表达，结果发现，过表达后的酵母出现絮凝现象，主要表现为细胞的形态由原来的长杆状变为纺锤状居多，对胁迫环境的抗性有所提高。根据结果推测，PsKPP4可能参与调控酵母信号通路过程中，过表达后使细胞形态发生变化并导致细胞壁略微增厚，最终提高了酵母菌株对逆境的抗性。在农杆菌介导的诱导表达实验中发现，在烟草中诱导表达PsKPP4后能够抑制BAX诱导产生的PCD，也就是PsKPP4可能抑制病原菌与植物互作中的HR反应，表明它具有潜在的抑制植物防卫反应的功能。酵母双杂交实验验证了PsKPP4可以与上游的PsUBC2进行互作，两者可能在调控条锈生长发育过程中共同发挥作用。利用病毒介导的基因沉默对PsKPP4和PsUBC进行基因沉默后结果显示，PsKPP4和PsUBC2积累水平均降低，均为有效的沉默。接种48h后，在PsKPP4和PsUBC2沉默的植株中，小麦条锈菌的生长发育受到影响，条锈菌的初生菌丝长度和吸器母形成受到抑制；接种120h后，PsKPP4沉默株系菌丝略有干瘪，蔓延受到一程度的抑制。PsUBC2沉默株系菌丝形态没有明显改变，但是侵染力 58小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用下降。推测由于MAPK级联激酶基因的部分沉默，导致小麦条锈菌信号受到一定程度的影响，从而影响了小麦条锈菌的生长发育相关基因的表达。因此综上所述，MAPK级联通路中MAPKKK蛋白激酶PsKPP4和MAPKK蛋白激酶PsUBC2在小麦条锈菌的生长发育过程中可能发挥着重要的作用，为以后病害防治提供了潜在的靶标。 第四章小麦条锈菌基因PsPRF1功能分析59第四章小麦条锈菌基因PsPRF1功能分析4.1引言真核基因表达的调控的特征在于在特定时间激活特定基因，从而实现预定的，不可逆的分化和发育进程，导致不同组织和器官的行使特定的功能。真核基因的表达是一个复杂的过程，其中包括蛋白与蛋白，蛋白与DNA之间的相互作用，涉及蛋白质复合物与复合大分子之间复杂相互的调节作用。作为基因表达的重要环节，DNA水平以及转录起始水平的调控显得非常重要。在细胞核中，高迁移率族蛋白家族（highmobilitygroupprotein，HMG）发挥着许多重要的生物学功能，例如DNA的转录复制，重组以及修饰等，其中转录基因表达调控是非常重要的（Goodwinetal.1973;Baxevanisetal.1995）。HMG蛋白可以与DNA或者染色质结合，然后发生弯曲折叠，也可以通过影响他们与表达有关的结构，或者促进他们与其他调节蛋白的结合及大分子复合物的形成，继而调节下游的转录起始过程(Bustinetal.2001;Zhangetal.2003;)。Rox1是抑制酵母酿酒酵母中缺氧基因表达的DNA结合蛋白。Roxl的第一个三分之一包含与HMG基序同源的位点特异性DNA结合结构域，该结构域指导与缺氧基因的调节区域的结合（Deckertetal.1999）。在玉米瘤黑粉中，cAMP信号传导途径与MAPK信号通路一起，也参与到调控真菌生长和毒力。MAPK和cAMP信号转导共同传导到转录因子Prf1中，其控制信息素和毒力诱导基因的表达。Prf1是识别目标基因调控区中信息素反应元件的因子，含有HMG结构域（KahmannandKämper,2004;Brefortetal.,2009）。HMG蛋白的多种生物学特点与其核内功能密切相关，其高迁移率的特性与其功能有着密切的关系。本研究发现，小麦条锈菌中存在一个HMG转录因子，其与玉米瘤黑粉中的PRF1同源。在烟草中表达小麦条锈菌PsPRF1有诱导细胞坏死的功能，为了探索诱导坏死的原因，我们做了各种探究实验，发现PsPRF1蛋白有降解核酸的功能。HMG蛋白的此类功能前面未有报道，所以，PsPRF1蛋白在小麦条锈菌和小麦互作中发挥的作用，还需我们深入的研究，可能为未来小麦抗条锈菌的研究提供新的研究思路。4.2试验材料4.2.1植物材料实验所用小麦材料及小麦条锈菌培养条件参见2.2.1。4.2.2菌株实验所用菌株参见3.2.2。 60小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用4.2.3质粒载体实验所用载体参见3.2.3。4.2.4分子生物学试剂所用试剂参见3.2.4。4.3方法4.3.1小麦条锈菌的培养实验所用小麦条锈菌培养方法条件参见2.3.1。4.3.2原生质体定位实验具体操作方法参见3.3.11。4.3.3酵母过表达实验具体操作方法参见3.3.6。4.3.4病毒介导的基因沉默实验实验具体操作方法参见2.3.8。4.3.5农杆菌介导的PVX病毒诱导表达实验具体操作方法参见3.3.12。4.3.6同位素检测小片段4.3.6.1探针的标记1.标记探针，反应体系如下：试剂用量待标记探针（10μmol/L）4μLT4PolynucleotideKinaseBuffer（10×）2μLNuclease-FreeWater11μL[γ-32P]ATP（3000Ci/mmolat10mCi/ml）2μLT4PolynucleotideKinase（5-10U/μL）1μL至20μL依次加入上述试剂，冰上操作。加入同位素，震荡混匀后加入T4PNK，混匀。2.将反应体系放入37℃的金属浴，孵育30分钟。3.纯化标记探针，利用Bio-RadP-6纯化柱，对标记好的探针进行纯化。除去反应体系中为标记的核酸、ATP和相关酶类。 第四章小麦条锈菌基因PsPRF1功能分析614.3.6.2聚丙烯酰胺凝胶的配制1.按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(本实验使用了29:1的Acr/Bis预混液)。TBEbuffer（10×）1mL双蒸水16.21mL29:1acrylamide/bisacrylamide（40%，w/v）21mL80%甘油625μL10%过硫酸铵150μLTEMED10μL2.混匀除APS和TEMED的液体后，立刻加入APS和TEMED立马倒入模具槽子中。避免产生气泡，插入梳子。4.3.6.3设置蛋白DNA结合反应样品反应：（1）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)：2μL（2）纯化的蛋白：2μL（3）标记好的探针：1μL（4）Nuclease-FreeWater：5μL（5）总体积：10μL2.加入各种试剂混匀，然后加入标记好的探针，然后室温放置30分钟。3.孵育后立即上样。注意：尽量避免使用loadingBuffer，因为溴酚蓝可能会影响蛋白和DNA的结合。4.3.6.4电泳分析1.用0.5×TBE作为电泳液。将制作的胶先预跑30min。2.加入样品到上样孔。在多出来的上样孔中加入10μL的缓冲液(蓝色)，随时观察电泳情况。3.确保胶的温度不升高条件下选择高的电压。待蓝色染料溴酚蓝移动至离胶块下段距离1/4处时候，停止电泳。4.取出凝胶，并用保鲜膜包裹，赶走气泡。5.干燥凝胶并用X光片压片。6.显影，将X光片在显影液和定影液中显色，确定结合情况。 62小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用4.3.7蛋白表达及纯化4.3.7.1蛋白表达（1）活化转有目的基因的BL21菌株；（2）按照1:100的比例将活化的菌株转接到100mLLB培养基中，220rpm，37℃培养2~3h；（3）菌液的OD值OD600为0.4~0.6时，加入诱导剂IPTG（终浓度4mol/L）；（4）16℃，诱导过夜；（5）收集菌体，8000rpm，10min，弃上清；（6）用10mLPBS缓冲液漂洗两次；（7）加10mLPBS缓冲液重悬菌体，超声破碎仪破碎菌体10~20min；（8）12000rpm，20min离心，将上清转移至另一新管子中；（9）吸出100μL上清加入等体积的蛋白Loadingbuffer，沸水煮10min；（10）跑蛋白胶进行检测蛋白是否表达。4.3.7.2蛋白纯化1．10mL灭菌水洗一遍；2.10倍体积15mM咪唑（pH8.0）的PBS平衡；3.上样；4.20倍体积的15mM（pH8.0）咪唑洗涤，收集流出液；5.500mM的咪唑洗脱，每次1mL收集蛋白；6.10倍体积15mM咪唑洗涤，可用于纯化同种蛋白；7.20%乙醇清洗。所用试剂：PBS溶液：8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO7，0.24gKH2PO4定容至1L；A液：PBS溶液+15mM咪唑(500mL)；B液：PBS溶液+500mM咪唑(250mL)。4.4结果4.4.1PsPRF1序列分析我们在小麦条锈菌中克隆到一个玉米瘤黑粉Prf1的同源基因PsPRF1，全长由1704个核苷酸组成，蛋白包含568个氨基酸残基。通过NCBIBLAST结果发现，PsPRF1包含有一个HMG(highmobilitygroup)结构域（图4-1），这是HMG类转录因子的显著特征。在模式真菌酿酒酵母和担子菌玉米瘤黑粉的基因组中，Blastp比对发现PsPRF1与酿酒酵母的Rox1p（Evalue=3e-14）和玉米瘤黑粉的PRF1(Evalue=7e-35）最为同源 第四章小麦条锈菌基因PsPRF1功能分析63（图4-2）。PsSRPKL与Rox1p和PRF1蛋白相似性分别为41%和46%，但相似处仅集中于HMG结构域区域处，序列覆盖率仅25%和33%。另外分析结果显示，PsPRF1与杆锈中的PGTG_06975同源性最高，达到68%。图4-1通过NCBI对PsPRF1进行序列分析。Fig.4-1SequenceanalysisonthePsPRF1viaNCBI.图4-2PsPRF1与其它真菌同源蛋白比对。Fig.4-2MultiplesequencealignmentofPsFUZ7orthologs.4.4.2亚细胞定位从结构上分析，PsPRF1是含有HMG-box的转录因子。前期研究中，转录因子大多定位于细胞核中。为了明确小麦条锈菌中PsPRF1的亚细胞定位情况，我们进行了小麦原生质体转化实验，实验结果如图4-3所示。在荧光显微镜488nm波长的激发光下叶绿体呈现出红色的荧光，eGFP融合蛋白则可以被激发出绿色荧光。在转入16318-GFP对照质粒的原生质体中，可以在整个细胞质，细胞核和细胞膜中都观察到绿色荧光。而PsPRF1-GFP融合蛋白在小麦原生质体中表达时候，绿色荧光主要集中在细胞核中。 64小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用图4-3PsPRF1蛋白的亚细胞定位。标尺=10µm。Fig.4-3SubcellularlocalizationofPRF1protein.Bar=10µm.4.4.3PsPRF1在酵母中过表达诱导坏死在栗酒裂殖酵SP-Q01中过表达PsPRF1后，发现其可以诱导酵母细胞坏死。本实验中以转入pREP-3X空载体的酵母菌株作为阴性对照，在不添加VB的Leu缺陷型液体培养基中，PsPRF1在启动子的作用下转录表达；但在添加VB的SD-Leu培养基中，nmt启动子受到VB的抑制，PsPRF1蛋白不能表达。我们对转入目的基因的酵母菌生长情况进行统计，并对进行苯胺蓝来对坏死细胞进行染色。结果如图4-4所示。对照（pREP3X空载体）酵母在含有抑制剂（+VB）和不含抑制剂培养基（-VB）中的生长形态没有明显的差异；而含有pREP3X-PsPRF1的酵母在加入抑制剂的培养基中生长正常，但在未加抑制剂的培养基中生长缓慢，且苯胺蓝染色发现坏死较多，表明PsPRF1诱导表达引致酵母细胞死亡。图4-4酵母中过表达PsPRF1后表型。A，过表PsPRF1后诱导酵母细胞坏死，标尺=50μm；pREP3X 第四章小麦条锈菌基因PsPRF1功能分析65用作阴性对照。B，在接种后不同时间计算每毫升酵母细胞的数量（初始OD600为0.01）。使用血细胞计数器对裂殖酵母细胞进行计数，并且每次处理获得3次重复的值，并进行三次生物重复。C，计算总细胞中死酵母细胞的比例。在每个处理的十个视野中计数染色细胞。Fig.4-4Over-expressionofPsPRF1inducedcelldeathinfissionyeastcells.A,Thecelldeathphenotypeofyeastcellswerecheckedbymethylenebluestaining.Thedeadyeastcellswerestainedintoblue.Bars=50μm.B,Thenumberofyeastcellspermilliliterwascalculatedatdifferenttimes（initialOD600at0.01）.Thefissionyeastcellswerecountedusingahemocytometerandthevalueswereobtainedfrom3replicatespertreatmentandthreebiologicalreplicateswereperformed.C,Theratioofdeadyeastcellsintotalcellswascalculated.Stainedcellswerecountedintenviewfieldsforeachtreatment.FissionyeastcellsexpressingPsPRF1resultedinmorecelldeaththanthecontrols.4.4.4植物中瞬时表达PsPRF1能引起植物坏死在酵母中明确了PsPRF1具有诱导细胞坏死的功能后，我们进一步利用PVX诱导的表达系统，在烟草中进行功能验证。将携带目的基因的农杆菌转染烟草，3-5d后观察表型。结果如图4-5所示，在烟草中过表达PsPRF1后可以诱导植物细胞的坏死，与动物的促凋亡蛋白BAX在烟草上诱导的坏死表型类似，但注射阴性对照eGFP、空载体和缓冲液处未发现有坏死产生。随后，我们将表达纯化后的PsPRF1蛋白注射到烟草里发现也能诱导植物坏死，但是效果没有直接以PVX载体在烟草里诱导表达后引起的坏死明显，可能直接注射纯化后的蛋白容易降解，在一定程度上降低了坏死程度。总之，PsPRF1确实可以引起植物的坏死，但如何引起坏死成为我们进一步探索的目的。图4-5PsPRF1在在烟草中诱导坏死的产生。A，PVX表达系统中瞬时表达PsPRF1能诱导烟草坏死。Bax作为阳性对照。空载体，缓冲液，和eGFP作为阴性对照。B，纯化后的蛋白直接注射烟草引起坏死。表型观察在5dpi进行。Fig.4-5PsPRF1inducedcelldeathintobacco.A,TransientexpressionofPsPRF1triggeredcelldeathintobacco.BAXproteinswasusedaspositiveandvector,Bufferande-GFPproteinwereusedasnegativecontrols.TheseproteinsaretransientlyexpressedbyAgrobacteriumtumefacienscarryingthePVXvector.B,PsPRF1proteininducedcelldeathintobacco.Phenotypewasobservedin5dpi.4.4.5PsPRF1蛋白中保守结构域负责诱导坏死我们构建了PsPRF1不同区域的缺失体，将它们在烟草中瞬时表达，以确定引起坏死功能的区域。突变体分段缺失结果如图4-6所示，HMG结构域在前三个突变体上被缺失掉，后三个突变体上保留有此结构域。烟草转染结果显示，突变掉HMG的缺失体均不能诱导植物细胞的坏死，而包含有结构域的突变体则显著诱导了植物的坏死。因此， 66小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用我们推测PsPRF1蛋白中的HMG保守结构域负责其诱导植物坏死，但具体引起坏死的原因有待进一步的验证。图4-6PsPRF1诱导植物坏死的突变体分析。通过将PsPRF1的序列进行分段缺失，从而获得一系列突变体。P4，P5和P6含有HMG结构域。Fig.4-6MutationanalysisofPsPRF1intriggeringtobaccocelldeath.ThesemutantsweretransientlyexpressedbyA.tumefacienscarryingthePVXvector.4.4.6PsPRF1具有核酸酶功能前面研究发现PsPRF1可以诱导植物和酵母菌的坏死，为了探究坏死产生的原因，我们做了一系列的探究实验。有趣的是，在研究过程中发现PsPRF1蛋白可以对核酸进行切割。同位素检测结果显示，PsPRF1蛋白与人工合成的引物DNA结合后展现出降解DNA的能力（图4-7A，条带3）。实验中将纯化的蛋白和同位素标记的DNA探针混合孵育，标记原子为32P。利用非变性的聚丙烯凝胶电泳，发现加入PsPRF1的蛋白将DNA切成小片段后可以用同位素检测出来，也验证了蛋白的核酸酶功能。琼脂糖凝胶电泳结果也进一步证实了观察到的现象，PsPRF1蛋白可以降解小麦DNA（图4-7B），这说明PsPRF1蛋白降解DNA并没有特异性，能够广泛的降解不同来源的DNA。 第四章小麦条锈菌基因PsPRF1功能分析67图4-7PsPRF1核酸酶活性的检测。A，同位素标记检测PsPRF1核酸酶活性。条带1，PsPRF1蛋白；条带2，同位素标记引物；条带3，PsPRF1降解引物。B，琼脂糖凝胶电泳检测PsPRF1核酸酶的活性。条带1和3，PsPRF1降解小麦DNA；条带2和4，小麦DNA。Fig.4-7ThenucleaseactivityofthePsPRF1.a,DetectionofthenucleaseactivityinPsPRF1byisotope.Line1,PsPRF1protein;Line2,isotopelabledpromer;Line3,PsPRF1+isotopelabledpromer.b,ThenucleaseactivityinPsPRF1detectedbyagarosegelelectrophoresis.Line1and3,wheatDNA+PsPRF1protein;Line2and4,wheatDAN.4.4.7PsPRF1功能结构域验证我们前面研究发现PsPRF1可以诱导植物和酵母菌的坏死，接着又在研究中发现PsPRF1蛋白可以降解DNA。为了确定发挥酶切作用的功能区域，我们构建了PsPRF1不同区域的缺失体，突变体缺失区域如上面图4-6所示。随后，分别对他们进行原核表达并得到纯化蛋白，并对获得蛋白进行不同浓度稀释。如图4-8所示，每5条泳道为一组，共包括了6组，分别代表不同缺失突变体。结果显示，突变掉HMG结构域的缺失体不能降解DNA，而包含有结构域的突变体则可以降解DNA。因此，我们推测PsPRF1蛋白中的HMG保守结构域在PsPRF1发挥功能过程中起着着重要的作用，缺失掉结构域使蛋白功能受到影响。图4-8琼脂糖凝胶电泳检测PsPRF1酶切功能区域。泳道1-5蛋白浓度分别为，0.1μg/μL、2μg/μL、3μg/μL、0.5μg/μL、0μg/μL。 68小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用Fig.4-8MutationanalysisofPsPRF1innucleaseactivity.ConcentrationofproteinusedinLine1-5,0.1μg/μL、2μg/μL、3μg/μL、0.5μg/μL、0μg/μL.4.4.8VIGS沉默实验我们利用VIGS技术对PsPRF1基因进行沉默，以研究其在小麦条锈菌与小麦互作中是否发挥着作用。接种方法同前。结果如图4-9所示，对照中小麦条锈菌的夏孢子堆多且密，在接种过携带目的基因的病毒BSMV:PsPRF1的叶片上，夏孢子堆的数目减少并不明显。我们分别检测了沉默基因48h和168h后的表达水平。与对照相比，接种相应重组病毒的小麦叶片中，PsPRF1基因在48h和168h的表达量明显下降（图4-9B）。接种条锈菌48h后，PsPRF1基因在沉默片段BSMV:PsPRF1-1as和BSMV:PsPRF1-2as的沉默植株中，分别导致约46.1%和56.3%下调；在168h时候，目的基因PsPRF1表达水平仍然下调58.3%和54.4%。对沉默叶片中小麦条锈菌侵染5d后的组织学观察说明沉默PsPRF1后在前期侵染过程中菌丝的蔓延受到了抑制（图4-9C）。图4-9利用VIGS技术对PsPRF1基因在小麦与条锈菌互作过程中的功能进行分析。A，分别在对照和沉默目的基因的植株中接种毒性菌株CYR3214d后的致病表型。B，PsPRF1基因在沉默植株中的相对表达量。C，接种条锈菌120hpi后菌丝的扩展面积，标尺=50μm。Fig.4-9FunctionalassessmentofPsPRF1inthewheat-Pstinteractionbyvirus-inducedgenesilencing.A,PhenotypeofthefourthleavesinoculatedwithCYR32at14dpi.Plantswerepre-inoculatedwithBSMV:γ,BSMV:PsPRF1-1as,orBSMV:PsPRF1-2as,respectively.B,RelativetranscriptlevelsofPsPRF1in 第四章小麦条锈菌基因PsPRF1功能分析69knockdownplantsinoculatedwithCYR32at2and7dpi.C,WheatleavesinoculatedwithCYR32at120hpi(Bars=50μm).Fromlefttoright,fromabovetobelowBSMV:γ;BSMV:PsPRF1-1as;BSMV:PsPRF1-2as.4.5讨论植物与病原菌互作过程是一个复杂而多变的过程，许多研究者试图找到寄主中关键抗病基因和病原菌中关键的致病基因来解析他们之间的互作机制。本实验中，通过筛选在小麦条锈中发现了一个具有HMG-box的蛋白PsPRF1在植物和酵母中过表达可引起植物细胞坏死并且具有降解DNA的功能。先前报道中，虽然关于HMG家族基因的研究很多，但具有核酸酶功能的分析未见报道，可能PsPRF1在小麦条锈菌与植物互作过程中发挥着特异的功能。近年来发现，在动物中可以通过释放胞外诱捕网（extracellulartraps,ETs）来实现先天免疫系统，并对病原菌的感染进行应答。除了人类和小鼠等动物细胞也可以释放ETs外，ETs也在昆虫中有报道，其中细胞外核酸可以由类绛色细胞释放，这个过程是针对昆虫病原微生物进行防御的重要策略(Altinciceketal.2008)。另外，ETs也在植物种有所报道，ETs可以在植物防御根尖感染的真菌过程中发挥重要作用(Wenetal.2009;Hawesetal.2011)。不同细胞释放ETs的共同特点是可以捕获和杀死大多数微生物，它们是具有抗菌分子修饰的DNA骨架(Brinkmannetal.2004;Goldmannetal.2013)。随后，人们研究发现病原体通过一系列的机制来抵御这些结构对微生物的抗性。其中一个方面就是通过产生肽酶和DNase酶类来切割ETs的DNA骨架，但目前尚未见相关机制在植物中更深入的研究。考虑到PsPRF1能够诱导植物细胞的坏死且能降解核酸。我们推测：一方面，PsPRF1可能参与到自身的细胞凋亡过程中去，另外一方面可能通过降解植物外源DNA物质的侵入，从而限制了植物对病原菌的抑制作用。但具体的机制还需要进一步的探索。在小麦条锈菌侵染小麦过程中，PsPRF1在夏孢子萌发初期具有较高的转录水平，最高达到300多倍（图2-1），考虑到前面PsPRF1的功能，我们推测PsPRF1可能在前期小麦条锈菌的侵染、定殖过程中发挥着重要的作用。根据原生质体定位实验结果显示，PsPRF1定位于细胞核中，可能其能够在细胞核里发挥功能。虽然，PsPRF1诱导坏死的目的和具体机制并不明确。但是从基因沉默实验中可以看出来，PsPRF1确实参与到小麦条锈菌的致病过程中。沉默PsPRF1后，可以降低小麦的产孢，尤其是前期菌丝的侵染蔓延受到抑制。因此，PsPRF1可能在小麦条锈菌侵染定殖的过程中发挥着重要的作用，推测可能通过降解抑制小麦的一些DNA分子，来保证自身的侵染定殖成功；但是还有许多未知需要我们继续探索，通过本实验的研究也期望能够为小麦条锈菌的防治提供新的思路与方法。 70小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用第五章小麦条锈菌重要激酶基因PsFUZ7的功能分析5.1引言在真核细胞中，丝裂原活化蛋白（MAP）激酶（MAPK）的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族参与多种细胞外信号的转导和不同发育过程的调控。通过MAPK激酶（MEK或MAPKK）的TXY基序的双磷酸化激活MAPK，其依次被MEK激酶（MEKK或MAPKKK）激活。MAPK级联的顺序激活最终导致转录因子的激活和对环境刺激响应的特定基因组的表达。在过去数十年中，已经对各种植物和人类致病真菌中的MAPKs进行了功能研究，MAPKK作为MAPK信号通路中重要的组成部份，在调控生命过程中也发挥了关键的作用。在植物病原模式真菌稻瘟菌中，MST11-MST7-PMK1MAPK激酶级联对于形成和植物感染是必不可少的。在附着胞形成时期，PMK1由MAPK激酶（MEK）基因MST7和MEK激酶（MEKK）基因MST11（Zhaoetal.2005）激活，它们分别与酵母的STE7和STE11同源。在酵母双杂交中没有观察到Mst7和Pmk1之间的直接相互作用，而在共免疫沉淀和双分子荧光互补（BiFC）检测中，只有在附着胞形成时候时才检测到Mst7和Pmk1之间的直接相互作用。另外，Mst7中与MAPK结合位点的缺失影响了Mst7-Pmk1的相互作用。这些结果表明，Mst7中MAPK的结合位点的存在对其下游Pmk1的结合和活化是必需的，并且Mst7-Pmk1相互作用在附着胞形成时期得到增强。mst7的缺失突变体，与pmk1和mst11的缺失突变体一样均都不能形成附着胞，也不具有致病性（Zhaoetal.2005）。在玉米瘤黑粉中，FUZ7是第一个被鉴定的MAPK组分，它在信息素响应过程，丝状生长，交配和致病性等过程中均发挥着重要的作用（BanuettandHerskowitz1994;Andrewsetal.2000;Mülleretal.2003）。在酿酒酵母Ste7和几种哺乳动物MEK中，在N末端非催化区域是与MAPK结合的位点（Bardwelletal.1996）。它由短的保守序列[K/R]2-3-X1-6-[L/I]-X-[L/I]（Bardwelletal.2001）组成。具有缺陷MAPK结合位点的ste7突变体在信号传导方面效率降低，但在传输相应的信息素信号时未被完全阻断。在前面章节的VIGS实验中，我们发现在同样的沉默条件下，沉默PsFUZ7后小麦条锈菌的生长发育与其他基因沉默后受到的抑制更为明显。因此，为了深入解析小麦条锈菌中MAPKK在病菌的生长发育及致病性中发挥的角色，我们对其功能进行了更深入的探究。通过生物信息学对PsFUZ7的蛋白结构进行分析并构建不同物种间的进化树，明确PsFUZ7作为蛋白激酶在进化上的结构保守性；利用异源互补系统，对稻瘟mst7突变体进行互补，明确PsFUZ7的功能保守性；通过抑制剂处理及过表达实验研究基因 第五章小麦条锈菌重要激酶基因PsFUZ7的功能分析71功能，最后利用VIGS技术进一步确认PsFUZ7在侵染过程中发挥的作用。本研究将为揭示小麦条锈菌MAPK级联途径激酶的功能，及条锈病持久控制的新策略提供基因资源和奠定理论基础。5.2试验材料5.2.1植物材料实验所用小麦材料及小麦条锈菌培养条件参见2.2.1。供试大麦大麦材料及培养条件参见3.2.15.2.2菌株实验所用稻瘟菌株，酵母菌株，大肠杆菌菌株参见3.2.2。5.2.3质粒载体实验所用质粒载体参见3.2.3。5.2.4分子生物学试剂MAPKK抑制剂（MEKInhibitorU0126，Promega）；其他所用试剂参见3.2.4。5.3方法5.3.1小麦条锈菌的繁殖与收集实验所用小麦条锈菌培养方法条件参见2.3.1。5.3.2小麦条锈菌夏孢子萌发与样品采集实验所用具体操作方法参见2.3.2。5.3.3小麦条锈菌夏孢子及接种条锈菌叶片总RNA的提取及纯化具体操作方法参考2.3.3。5.3.4生物信息学分析小麦条锈菌关键激酶基因具体操作方法参考3.3.4。5.3.5原生质体定位实验具体操作方法参见3.3.11。5.3.6酵母转化实验具体操作方法参见3.3.5。5.3.7酵母过表达实验具体操作方法参见3.3.6。5.3.8抑制剂处理 72小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用实验具体操作方法参见3.3.7。5.3.9稻瘟突变体互补实验具体操作方法参见3.3.8。5.3.10病毒介导的基因沉默实验实验具体操作方法参见2.3.8。5.3.11小麦条锈菌组织学处理实验具体操作方法参见3.3.10。5.3.12农杆菌介导的PVX诱导表达实验具体操作方法参见5.3.12。5.4结果5.4.1PsFUZ7蛋白结构分析我们在小麦条锈菌中克隆到一个玉米瘤黑粉中FUZ7同源的基因PsFUZ7，全长的由1290个核苷酸组成，蛋白包含有430个氨基酸残基，分子量约为43.6kD。它属于一个MAPKK家族，在进化上表现出显著的保守性，也表明了MAPKK广泛的存在各种真菌中。另外，系统进化树表明PsFUZ7与担子菌中的MAPKK被归为进化树上的一枝，它与叶锈杆锈中MAPKK的亲缘关系最近，同源性最高达到93%；其余的子囊菌归为另外一枝，说明它们的亲缘关系较远(图5-1)。图5-1小麦条锈菌PsFUZ7与其同源物种中MAPKK的进化树分析。Fig.5-1PhylogenetictreeofPsFUZ7andorthologsfromotherfungi.PsFUZ7是一个典型的MAPKK蛋白激酶（图5-2），它的蛋白激酶区域包括两个磷 第五章小麦条锈菌重要激酶基因PsFUZ7的功能分析73酸化位点(Kiegerletal.2000;Cardinaleetal.2002)和12个催化亚区(HanksandHunter1995)。PsFUZ7含有一个保守的磷酸化位点S/TXXXS/T激活环（图5-2，蓝色框），这个位点可以被MAPKKK磷酸化而激活。另外，PsFUZ7蛋白N端的非催化区含有一个-K/R-K/R-K/R-X(l-3)-L/I-X-L/I区域（图5-2，绿色下划线），这个DEJL结构域是MAPKK和MAPK相互作用的区域（图5-2）(BardwellandThorner1996;Jacobsetal.1999)。图5-2PsFUZ7与其它真菌同源蛋白质激酶序列的比对（命名方式参考Hamel）。蓝色框为保守的磷酸化位点S/TXXXS/T激活环；绿色下划线为MAPKK与MAPK结合位点。Fig.5-2MultiplesequencealignmentofPsFUZ7orthologs.MultiplesequencealignmentofPsFUZ7orthologs.Thehighlyconservedthreonine(T)andserine(S)ofputativephosphorylationsitesinMAPKKsaremarkedwithanasterisksandtheputativeinteractionsites(DEJL)withadownstreamMAPKareunderlined.I-XIindicatetheconservedcatalyticsubdomainsofproteinkinases.5.4.2稻瘟突变体互补实验为了验证PsFUZ7的功能是否也存在物种间保守性，我们进行了稻瘟突变体异源互补实验。本实验构建了RP27强启动子启动的pFL2-PsFUZ7载体，转入稻瘟菌突变体mst7中，并用PCR检测筛选得到阳性转化子（图5-3）。图5-3PsFUZ7互补稻瘟突变体后转化子PCR检测筛选。Fig.5-3Detectedthetransformantsofmst7/PsFUZ7byPCR.随后对分生孢子进行收集处理，在疏水载玻片上mst7突变体不能形成附着胞，而Guy11、mst7/PsFUZ7的附着胞形成率分别为94.8%和38.3%（图5-4A，B）。在亲水玻 74小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用片上，野生型、突变体和互补转化子菌株均不能形成附着胞。分别收集培养7d的稻瘟菌野生菌株Guy11、突变体菌株mst7以及互补后的转化子菌株的分生孢子，制成浓度1×105/mL的分生孢子悬浮液，加入Gelation，均匀的滴施于健康大麦叶片表面，25℃条件下保湿培养5-7天后观察统计发病情况，结果如5-4C所示。侵染大麦7天后，野生型的菌株可以在大麦叶片上产生面积大且可以逐渐蔓延的坏死病斑。mst7突变体互补PsFUZ7后的转化子菌株在大面叶片上产生的表型与野生型菌株类似，它可以在大麦叶片上形成典型的病斑，但是坏死面积比野生型的略小且扩展慢。突变体菌株mst7以及对照Gelation基本完全不致病，接种后的植株上面并未观察到任何病斑。因此，推测小麦条锈菌PsFUZ7及PsKPP4基因分别能够部分恢复相应的稻瘟菌突变体附着胞的形成及致病性，且PsFUZ7在物种间的功能保守性较高。图5-4稻瘟菌野生型Guy11、突变体mst7及mst7/PsFUZ7互补体的附着胞形成及大麦侵染实验。A，稻瘟菌野生型、突变体及互补体附着胞孢子附着胞形成实验，标尺=10μm。B，大麦侵染实验。Fig.5-4Complementationofthemst7mutantofMagnaportheoryzaewithPsFUZ7.A,Appressoriumformationassaysonhydrophobicandhydrophilicsurfaces.Appressoriaareformedbythewildtype70-15andthemst7/PsFUZ7transformantonhydrophobicsurfaces.Themst7mutantfailstoformappressoriaby24honhydrophobicsurfaces.Allstrainsfailtoformappressoriaonhydrophilicsurfaces.Bars=10mm.B,Leavesofone-week-oldbarleyseedlingswereinoculatedwithconidiaofthewildtype70-15,themst7mutant,orthecomplementedstrainmst7/PsFUZ.Inoculationwith0.25%gelatinwasusedasthecontrol.5.4.3裂殖酵母中过表达PsFUZ7基因将构建成功的携带目的基因的过表达载体pREP-3X-PsFUZ7转化进入裂殖酵母中，选择转化成功的单克隆挑入不加VB（不抑制表达）液体培养基中进行培养，同时，以添加VB（抑制表达）的作为对照。在同等条件下进行培养，20h后对酵母的细胞形态进行观察统计并用DAPI染色观察细胞核。结果表明携带目的基因载体与携带空载体的酵母细胞在抑制培养基中培养20h后都表现出正常的形态。但是在诱导培养基中培养20h后，携带空载体的酵母细胞依然呈现出正常的长杆状形态且均匀分散开，但是携带 第五章小麦条锈菌重要激酶基因PsFUZ7的功能分析75PsFUZ7重组载体的酵母细胞则表现细胞形态的变化，大多数细胞呈现纺锤状（图5-5A，B），而且有细胞聚集的现象出现，与酵母中常见的絮凝现象类似（图5-5A）；细胞核的形态发生了变化并用DAPI染色后散发出的荧光呈现弥散状（图5-5A，C）。而且，过表达PsFUZ7后，裂殖酵母酵母细胞对NaCl和氧化胁迫刺激（0.5mMH2O2）等逆境的抗性与对照相比均略有所提高（图5-5D）。因此，我们推测，过表达PsFUZ7可能参与到酵母细胞的形态调控及絮凝信号通路中去，从而引起细胞形态的变化和絮凝的出现，进而增强了对外界环境胁迫的抗性增强。图5-5过表达PsFUZ7后酵母形态的变化。A，过表达PsFUZ7诱发了絮凝现象及酵母形态发生改变。标尺=10µm。B，过表达后酵母细胞长度变化。C，过表达后酵母细胞的平均正常细胞核统计。双星号代表P<0.01。D，酵母细胞中过表达PsFUZ7后增强了其对逆境的抗性。E，验证HA标签表达。Fig.5-5OverexpressionassayofPsFUZ7inthefissionyeastSP-Q01.A,OverexpressionofPsFUZ7causesflocculationinyeast.Afterexponentiallygrowingwiththiamine,cellsbearingeitherpREP-3x,orpREP-3x-HA-PsFUZ7wereincubatedintheabsenceofthiamineat30°Cfor16h.Bars=10μm.B,AveragewidthandlengthincellsoverexpressingPsFUZ7andcontrolcellsafterincubationintheabsenceofthiaminefor16h.C,RatioofabnormalnucleiandabnormalcellsincellsoverexpressingPsFUZ7andcontrolcells.D,OverexpressionofPsFUZ7enhancesyeastresistancetooxidativestress(0.5mMH2O2)andhyperosmoticstress(0.35MNaCl).E,VerificationofexpressionoftheHA-PsFUZ7fusionprotein.Cellsweresampledafterincubationintheabsenceofthiaminefor16h.CellscarryingpREP-3xservedasthecontrol.DifferencesindandcwereassessedusingStudent’st-tests.Valuesrepresentthemeans±standarderrorsofthreeindependentsamples.DoubleasterisksindicateP<0.01.5.4.4抑制剂处理实验在无菌水中中分别加入DMSO，免疫抑制剂MEKInhibitorU016来处理小麦条锈菌夏孢子，观察其不同的萌发情况。实验结果表明，夏孢子在经过加入1μL/mLDMSO的水溶液（对照）处理后，大部分都能进行正常的萌发以及产生正常的芽管（图5-6A， 76小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用B）。而在经过10μMMEKInhibitorU016处理过的小麦条锈菌夏孢子，萌发受到严格的限制，而且分化发育也受到影响，而能够萌发的芽管一半形成畸形的芽管，芽管变短变粗，且从一个正常的芽管分化成多个。在4℃条件下，分别用DMSO，免疫抑制剂MEKInhibitorU016处理孢子1-2h，然后将孢子接种到水源11小麦叶片上，14d后观察表型。结果显示，对照DMSO处理后的小麦条锈菌夏孢子可以正常的侵染小麦叶片，在14d后也能正常的产孢并且夏孢子堆可以正常的破裂产生粉状物（图5-6C，D）。但是接种抑制剂处理过的夏孢子后，小麦叶片上的产孢严重减少，且夏孢子堆表面比较光滑，并未能破裂散开。图5-6免疫抑制剂MEKInhibitorU0126处理观察小麦条锈菌夏孢子。A，免疫抑制剂处理观察小麦条锈菌夏孢子萌发，标尺=50μm。B，不同抑制剂处理后小麦条锈菌的萌发率统计；GT，芽管。C，小抑制剂处理后的孢子接种小麦叶片后的夏孢子统计。表型观察于接种后14d。D，小抑制剂处理后的孢子接种小麦叶片后的表型观察。表型观察于接种后14d。Fig.5-6Effectoftheimmuno-suppressiveinhibitorU0126ongerminationofPstgermtube.A,PstisolateCYR32germinatedinwatercontainingDMSOorU0126(10μM)at3hand6h.TreatmenturediosporeswiththeinhibitorlimitsgerminationofPstgermtubeandblocksfurtherdifferentiation.Analyseswereperformedbylightmicroscopy.Bars=50μm.B,GerminationofPstgermtube.Percentageofmalformedgermtubesisindicatedbyblackbars,thepercentageofnormalgermtubesisindicatedbywhitebars.GT,germtube.C,QuantificationofurediadensityonplantsinoculatedwithurediosporesofPsttreatedwithU0126.Datatakenat14dpi.D,PhenotypeofwheatleavesinoculatedwithurediosporestreatedwithU0126.Datatakenat14dpi.DifferencesinbandcwereassessedusingStudent’st-tests.Valuesrepresentthemeans±standarderrorsofthreeindependentsamples.DoubleasterisksindicateP<0.01.5.4.5VIGS沉默实验我们利用VIGS技术对三个激酶基因的功能进行分析。为了保证沉默的特异性，每个基因均选择两个片段作为靶标进行沉默，两个片段分别位于5’端的ORF区及3’端ORF区。将小麦幼苗培养到二叶一心后，利用人工摩擦接种的方法将BSMV接种到完全舒展开的第二叶，随时观察对照和处理的症状。接种BSMV:TaPDS病毒的叶片在 第五章小麦条锈菌重要激酶基因PsFUZ7的功能分析7710d左右，可以观察到叶片漂白的现象出现（图5-7A），而接种空载体和携带目的基因的病毒叶片出现条纹状褪绿的病毒症状，这也证明本次接毒实验是成功的。在10d观察到病毒显症后，即可在小麦新长出的叶子（4-5叶）上接种条锈菌毒性菌株CYR32，14d后观察条锈菌在小麦上的发病情况，记录致病表型并照相。结果如图5-7所示，小麦条锈菌在接种过空病毒与FES缓冲液的叶片上发病情况相似，夏孢子堆多且密，也证明小麦接种BSMV病毒后与条锈菌之间的互作没有受到明显的影响。与对照相比，在接种过携带目的基因的病毒BSMV:PsFUZ7的叶片上，夏孢子堆的数目明显减少。另外，沉默基因之间相比，接种过BSMV:PsFUZ7-2as的叶片产孢量减少尤为明显（图5-7B，D）。这些结果表明PsFUZ7基因参与到条锈菌对小麦的致病性的过程中来，尤其PsFUZ7的调控作用更为显著，可能为小麦条锈菌中关键的致病因子。图5-7利用VIGS技术对PsFUZ7基因在小麦与条锈菌互作过程中的功能进行分析。A，分别在对照和沉默目的基因的植株中接种毒性10d后的表型。B，分别在对照和沉默目的基因的植株中接种毒性菌株CYR3214d后的致病表型。C，在沉默植株中PsFUZ7基因的相对表达量。D，14d后，对夏孢子堆进行统计分析。Fig.5-7FunctionalanalysiofPsFUZ7byvirus-inducedgenesilencing.A,PhenotypeoftheleavesinoculatedwithBSMVat10dpi.Plantswerepre-inoculatedwithmock(FESbuffer).B,PhenotypeofthefourthleavesinoculatedwithCYR32at14dpi.Plantswerepre-inoculatedwithmock(FESbuffer),BSMV:TaPDS,BSMV:γ,BSMV:PsFUZ7-1as,orBSMV:PsFUZ7-2as,respectively.C,RelativetranscriptlevelsofPsFUZ7inknockdownplantsinoculatedwithCYR32at2dpi,7dpi,14dpi.D,Quantificationofurediadensityinsilencedplants14dpiwithCYR32.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests.Valuesrepresentthemeans±standarderrorsofthreeindependentsamples. 78小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用本实验中我们检测了目的基因PsFUZ7在接种小麦条锈菌2d、7d和14d后的表达水平，以便来确定小麦条锈菌对寄主致病力的减弱是否是由于目的基因的沉默引起。与对照相比，接种相应重组病毒的小麦叶片中，PsFUZ7基因在不同时期的表达量均有明显下降。接种条锈菌2d后，PsFUZ7基因的表达水平在接种BSMV:PsFUZ7-1as和BSMV:PsFUZ7-2as植株中，分别有约50.1%和66.3%的下调；接种7d后，目的基因PsFUZ7表达量仍然下调，依次为51.6%和55.5%；接种14d后，目的基因表达水平仍然下调，依次为26.6%和24.3%（图5-7C）。表达量检测的这些结果说明，PsFUZ7基因的表达确实可以通过VIGS技术被沉默，也证明了观察到的条锈菌致病能力的减弱的确是由PsFUZ7的表达被下调造成的。另外为了进一步研究VIGS沉默对靶标基因的同源基因造成的影响，我们对靶标序列的同源基因进行了分析。从小麦条锈菌全基因组中分别找到3条PsFUZ7同源基因，包括PSTCY32_02131、PSTCY32_20537、PSTCY32_01161如下表所示。表5-1.小麦条锈菌中PsFUZ7旁系同源基因Table5-1.HomologsofPsFUZ7inPst.ProteinNameHomologsinPstBLASTQueryNo.ofaminoE-valueIdentitycoveracidsPsFUZ7PSTCY32_0213144.7%77%5422.90E-60PSTCY32_2053737.1%73%4238.29E-34PSTCY32_0116139.1%63%9359.99E-32对上述同源基因进行了表达水平分析，结果如图5-8所示，靶标序列的同源基因表达均未明显下调，也就是说VIGS沉默具有特异性，并未对同源基因造成非特异沉默。PsFUZ7同源基因PSTCY32_02131、PSTCY32_20537、PSTCY32_01161表达量略有上调，可能同源基因间存在功能冗余，在靶标序列被沉默后，它们的同源基因通过上调表达来对功能进行互补及恢复。图5-8PsFUZ7同源基因在沉默植株接种CYR322d后中的相对表达量。Fig.5-8RelativetranscriptlevelsofPsFUZ7homologgenesinknockdownplantsinoculatedwithCYR32 第五章小麦条锈菌重要激酶基因PsFUZ7的功能分析79at2dpi.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests.Valuesrepresentthemeans±standarderrorsofthreeindependentsamples.确定表型变化确实是由基因沉默引起后，我们对沉默目的基因后的条锈菌进行组织学细胞观察。条锈菌的菌丝可以被荧光增白染色剂染色。在荧光显微镜下可以激发绿色荧光。正常情况下，条锈菌在48h大量形成吸器，我们对这个时期的吸器母细胞和吸器数量进行了统计，作为条锈菌侵染能力的指征。另外，菌丝体的分枝数和长度也进行了统计，作为条锈菌扩展能力的指征。在接种重组病毒苗子上，小麦条锈菌形成的吸器数目和初生菌丝长度与对照相比显著减少，但是初生菌丝分支数和吸器母细胞的数目与对照性比并无明显变化（图5-9）。接种条锈菌120h后，对照植株上可以形成大面积的菌落，而在沉默PsFUZ7后的植株中，菌丝的生长受到显著的抑制，沉默PsFUZ7-2as后表型最为明显（图5-9）。因此我们推测MAPK级联基因很可能是通过调控吸器的形成和发育来影响条锈菌的定殖与蔓延。图5-9沉默PsFUZ7基因后对条锈菌生长发育的组织学观察。A-C，接种条锈菌48h后，条锈菌组织学观察，标尺=10μm。A，BSMV:γ；B，BSMV:PsFUZ7-1as；C，BSMV:PsFUZ7-2as。D-F，接种条锈菌120h后，对菌丝的扩展面积进行统计。标尺=50μm。D，BSMV:γ；E，BSMV:PsFUZ7-1as；F，BSMV:PsFUZ7-2as。IH代表侵染菌丝；SV代表气孔下囊；HMC代表吸器母细胞；H代表吸器。G，接种CYR32后48h，PsFUZ7沉默植株的条锈菌吸器母细胞和吸器的数目及菌丝分支统计。H，接种CYR32后48h，PsFUZ7沉默植株的条锈菌侵染菌丝（IH）的长度与对照植物相比显著减少。I，接种CYR32后120h，沉默PsFUZ7植株中条锈菌侵染蔓延面积与对照植物相比显著减少。Fig.5-9EpifluorescenceobservationofPst.LeavesinoculatedwithCYR32weresampledat48and120hpiandexaminedunderanepifluorescencemicroscopeafterstainingwithwheatgermagglutinin 80小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用conjugatedtoAlexa-488(Invitrogen,USA).TreatmentsincludeA,BSMV:γ;B,BSMV:PsFUZ7-1asandC,BSMV:PsFUZ7-2asinoculatedwithCYR32at48hpi(Bars=10μm);D,BSMV:γ;E,BSMV:PsFUZ7-1asandF,BSMV:PsFUZ7-2asinoculatedwithCYR32at120hpi(Bars=50μm).IHrepresentinitialinfectionhypha;SVrepresentsubstomatalvesicle;Hrepresenthaustorium;HMCrepresenthaustorialmothercell.G,Averagenumberofhaustoria(H),hyphalbranches(HB)andhaustorialmothercells(HMC)inwheatinoculatedwithBSMVconstructsandinfectedwithCYR32at48hpi.H,Averagelengthifinfectionhyphae(IH)measuredfromtheiroriginatthesubstomatalvesicletothetipofthehyphainwheatinoculatedwithBSMVconstructsandinfectedwithCYR32at48hpi.I,InfectionunitareaperinfectionsiteinwheatinoculatedwithBSMVandinfectedwithCYR32at120hpi.DifferencesinG-IwereassessedusingStudent’st-tests.Valuesrepresentthemeans±standarderrorsofthreeindependentsamples.5.5讨论小麦条锈菌能够专性寄生在小麦上，小麦条锈菌的发育及侵染的过程都是与植物互相识别，相互作用的结果。对于多种植物病原真菌，MAPKK在它们的生长发育过程中均发挥着不可或缺的作用。在玉米瘤黑粉中，FUZ7是细胞信号传递过程中关键的组分，并且参与到细胞内的一系列生理生化反应，包括菌丝交配和致病力。在稻瘟菌中，与FUZ7同源的Mst7参与到附着胞的形成及毒性作用中来。但是，在小麦条锈中，MAPKK的作用尚未见报导。在本研究中，生物信息学分析及多序列比对结果显示，条锈菌PsFUZ7含有典型的磷酸化位点，且蛋白结构与其他真菌存在较高的相似性。由此，我们确定条锈菌MAPKK相关基因在真菌进化上存在一定程度的保守性。前期实验，我们发现PsFUZ7基因在条锈菌与小麦互作的过程中前期表达水平比较高，从芽管萌发（6h）的时期持续上调表达到条锈菌成功定殖（18h-24h）及扩展（大约72h），推测它可能在小麦条锈菌整个侵染过程中发挥着重要的作用。依赖前期成熟的异源互补转化体系，我们将PsFUZ7互补回稻瘟同源突变体mst7中去，结果发现小麦条锈菌的PsFUZ7在一定程度上恢复稻瘟附着胞的形成及致病性。这一结果说明，PsFUZ7在小麦条锈菌和稻瘟菌中有一定的功能保守性。但是，PsFUZ7互补稻瘟突变体mst7后菌丝表型未完全恢复，也说明PsFUZ7在条锈菌有其特异的功能。另外，为了进一步明确PsFUZ7的功能，我们将其在酿酒裂殖酵母中进行了过表达。结果发现，过表达目的基因后可以引起酵母絮凝的产生，且细胞的形态多由原来的长杆状变为纺锤状。过表达后的酵母对胁迫环境的抗性有所提高，推测是过表达后细胞形态略有变化，细胞壁略增厚，从而产生絮凝表型并提高了酵母菌细胞对逆境的抗性。与体内（invivo）实验结果一致，在用抑制剂处理的体外（invitro）实验中，用MAPKK对应的抑制剂U0126处理条锈菌夏孢子后，夏孢子的萌发受到严格的抑制，且萌发后的芽管分化出现畸形。从以上结果可以看出，MAPK级联通路激酶PsFUZ7在小麦条锈菌的生长发育过程中起着重要的作用。前期通过VIGS初步筛选功能基因过后，我们初步确定PsFUZ7可能在小麦条锈菌侵染过程中发挥着重要的作用。为了进一步明确其如何发挥作用的，我们对沉默PsFUZ7 第五章小麦条锈菌重要激酶基因PsFUZ7的功能分析81后的小麦条锈菌进行了细胞组织学观察。另外，为了保证沉默的特异性，我们选择PsFUZ7的两个不同片段构建沉默载体。利用qRT-PCR对目的基因的表达水平进行检测，结果表明，病毒载体（Virus）实现的寄主诱导沉默PsFUZ7基因表达后，它的转录积累水平降低。同时，对小麦条锈菌中可能存在的同源基因的表达水平进行检测，并发现未受到抑制现象。这也证明了，VIGS沉默的特异性和有效性。接种48h后，PsFUZ7沉默后的植株中，小麦条锈菌的生长发育受到抑制，主要表现为条锈菌的初生菌丝长度和吸器的形成受到影响；接种后120h，条锈菌的菌丝侵染蔓延与对照相比也受到严格的抑制。另外，PsFUZ7-2as沉默后的表型较好，作为候选靶标序列为后续转基因材料构建提供了依据。总之，根据上述体内和体外实验来看，MAPKK基因在小麦条锈菌的分化和发育过程中发挥着重要的作用。其中，PsFUZ7的沉默可能导致小麦条锈菌信号传导受到很大程度的影响，从而影响了小麦条锈菌的生长发育。综上，本章研究中我们克隆并鉴定了一个条锈菌MAPKK基因PsFUZ7，并证明抑制它的表达可以影响真菌的生长发育。说明它在条锈菌的生长发育和致病过程中发挥着重要作用，为后期构建小麦持续稳定抗锈病材料提供了候选基因资源。 82小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程6.1引言小麦条锈菌发病范围广泛，可寄生多种禾谷类作物。在全球范围内，每年都会造成一定的损失，大爆发时更是会造成严重的减产。目前，防治小麦条锈病最为有效的办法是农药的喷施和抗病品种的选育。但是，一方面，农药对环境的危害，对人类健康的影响都是人们所关注的问题，如何减少农药的使用，也是科学家们需要思考的问题；另外一方面，传统的遗传育种是一件非常耗时耗力的工程，而且抗锈性会随着条锈菌的快速变异而丧失。所以，如何利用现有的种质资源加速对抗病品种的培育就成了我们必须要面临的问题。另外，小麦条锈菌因为专性寄生的特性，导致未能构建出稳定的遗传转化体系，从而严重阻碍了对小麦条锈菌的深入研究。目前，利用病毒诱导的基因沉默技术在研究专性寄生真菌方面得到了广泛的应用（Chengetal.2015;Liuetal.2016）。Panwar等（2012）利用农杆菌介导的短暂基因沉默可以用作反向遗传工具来研究锈菌中的基因功能。这些研究同时也证明了被靶标的真菌转录物在发病机制中可能发挥着重要的功能，并且可以被用作开发抗真菌的潜在靶标。虽然病毒或农杆菌介导的的基因沉默，在研究小麦条锈菌功能上是行之有效的，但是由于其短暂沉默的特性，接种后小麦对小麦条锈菌的限制很快就会消失。因此，如何利用RNAi技术构建稳定的抗性材料是我们需要努力达成的目标。近年来，众多报道证实携带有目的基因同源序列的具有发卡结构的RNAi载体转入植物中，可以在植物体内表达dsRNA，被切割成小干涉RNA后，可以转运到目的生物体内，特异有效的降解目的mRNA，引起转录后水平的基因沉默。因此将可表达的双链DNA或者可产生单链RNA结构的遗传物质导入植物体内，都可以在植物体内检测到smallRNA诱导的基因转录本的沉默。本研究结合上述MAPK级联途径激酶基因的功能分析，选取了PsFUZ7-2as的片段设计了运用于RNAi的发卡结构（759bp），构建了可以在小麦中产生smallRNA的沉默载体，并利用基因枪轰击方法将载体转入小麦体内，沉默载体的功能单元（RNAicassattee）可以在小麦细胞内转录产生部分PsFUZ7片段的dsRNA结构，双链RNA结构会在植物体内经Dicer酶的切割作用形成小RNA（siRNA）。当小麦条锈菌侵染小麦时，已经在小麦细胞内产生的siRNA就会进入小麦条锈菌体内，使小麦具有对条锈菌抗性的目的。希望能通过筛选，得到具有抗小麦条锈菌的小麦转基因植株，使小麦具有对此类真菌的免疫或高抗活性。同时探索利用分子生物学和遗传学技术获得抗并植物的新方法和策略，最终利用功能基因和RNAi技术融合实现获得抗小麦条锈菌小麦新品种的目标。 第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程836.2试验材料6.2.1植物材料、菌株及质粒载体小麦品种西农1376用于构建转基因材料，小麦材料由本实验室提供。转基因小麦于西北农林科技大学北校区东南窑苗圃及北校地下温室中培养。CYR32为本实验供试菌种，与西农1376组成亲和组合。pAHC25载体用于RNAi小麦转基因材料的构建，由本实验室保存。6.2.2常用试剂尼龙膜或硝酸纤维素膜，滤纸，NH4NO3，KNO3，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，Na2EDTA，CuSO4·5H2O，Na2MoO4·2H2O，天冬酰胺，麦芽糖，酸水解酪蛋白，甘露醇，甘氨酸，MS培养基等试剂。6.2.3主要仪器基因枪：BiolisticPDS21000/He(Bio-Rad);莱卡超薄切片机，透射电子显微镜（HT-7700，Hitachi），恒温金属浴或水浴锅（JingHong），电泳仪（Bio-Rad），水平电泳槽（Bio-Rad），杂交炉（Bio-Rad），杂交管，紫外交联仪和80℃烤箱，X线胶片，FUJIFILMFLA-7000磷屏成像系统。其余同2.2.5。6.3方法6.3.1PsFUZ7干涉载体的构建pAHC25载体作为禾本类植物转基因的适用载体，被本实验用于构建HIGS载体。本实验于金唯智公司合成了插入干涉载体的发卡结构，它包含一个来源于PsFUZ7的300bp大小正义链，中间插入一个来自玉米的内含子alcoholdehydrogenase1(adh1)gene，后面跟着一个300bp来源于PsFUZ7的反义链。反义链与正义链是互为反向互补的序列，可以在体内形成RNA双链。这段发卡结构的上下游分别含有XmaI和SacI酶切位点，将载体用同样的限制性内切酶处理后用T4连接酶将合成片段与载体连接起来。最终得到干涉载体pAHC25-PsFUZ7。所获得的载体经酶切及测序等确定载体的正确性。6.3.2基因枪介导法转化小麦实验参考徐惠君在2001年改进的方法，并在此基础上略加改进而成。6.3.2.1按照以下配方配置所需试剂及培养基：大量元素（10×）： 84小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用大量元素组分用量NH4NO316.5gKNO319.0gCaCl2·2H2O4.4gMgSO4·7H2O3.7gKH2PO41.7g用双蒸水溶解并定容至1L，*特别注意CaCl2·2H2O需用一定量的双蒸水提前单独溶解混匀，之后再与其他元素混合溶解。微量元素（100×）：微量元素组分质量KI83mgH3BO3620mgMnSO4·4H2O2230mgZnSO4·7H2O860mgNa2MoO4·2H2O25mgCuSO4·5H2O2.5mgCoCl2·H2O2.5mg用双蒸水溶解并定容至1L，*特别注意MnSO4·4H2O要先用1MHCl的溶液提前溶解混匀，然后再与其它元素溶液混合溶解。铁盐母液（200×）：组分用量Na2EDTA3.37gFeSO4·7H2O2.78gddH2O500mL萘乙酸（NAA；10-3M）溶液配方：用95%乙醇溶解萘乙酸（18.6mg），补足蒸馏水到1,000mL。另外需要配置其他各种母液，包括肌醇（20mg/mL）母液；烟酸（0.5mg/mL）母液；甘氨酸（1.0mg/mL）母液；吲哚乙酸（2,4-D）（0.5mg/mL）溶液；盐酸硫胺素（0.1mg/mL）溶液；吲哚乙酸（IAA）（0.2mg/mL）溶液；激动素（KT）（1.0mg/mL，需先用少量1MHCl溶解）溶液；草丁瞵(PPT)（3.0mg/mL除菌后-20℃放置）。 第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程85MS培养基（母液）：组分用量大量元素母液100mL微量元素母液10mL铁盐母液5mL肌醇母液5mL甘氨酸母液2mL烟酸母液1mL盐酸吡哚素母液1mL琼脂7g盐酸硫胺素母液1mL蔗糖30g将上述元素液体进行混合，定容至1L（NaOH调节pH到5.8后，灭菌20分钟）。愈伤组织诱导培养基：MS+2mg/L2,4-D，并添加天冬酰胺（Glutamine）500mg/L，水解酪蛋白100mg/L，麦芽糖40g/L，琼脂7g/L，pH5.8，灭菌20min。胚性愈伤组织诱导培养基：MS+2mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA，添加天冬酰胺和酸水解酪蛋白分别使终浓度达到500mg/L和100mg/L，麦芽糖40g/L，pH5.8，琼脂7g/L，灭菌20min。分化培养基I：1/2MS+1mg/LNAA+1mg/LKT+2mg/LPPT，加入酸水解酪蛋白和天冬酰胺使终浓度分别达到100mg/L和500mg/L，麦芽糖添加至40g/L，最后加入琼脂至7g/L，pH调至5.8，灭菌20min。分化培养基II：1/2MS+1mg/LNAA+1mg/LKT+3mg/LPPT，添加天冬酰胺酸和水解酪蛋白分别至浓度500mg/L和100mg/L，麦芽糖40g/L，琼脂7g/L，pH5.8，灭菌20min。高渗培养基：1/2MS+1.0mg/L2,4-D，附加0.5%甘露醇，麦芽糖40g/L，琼脂7g/L，pH5.8，121℃灭菌20min。筛选培养基：MS+2mg/L2,4-D+3mg/LPPT，麦芽糖40g/L，琼脂7g/L，pH5.8。恢复培养基：MS+2mg/L2,4-D，麦芽糖40g/L，琼脂7g/L，pH5.8。生根培养基：1/2MS+0.2mg/LNAA，麦芽糖40g/L，琼脂7g/L，pH6.5，121℃灭菌20min。6.3.2.2基因枪转化取小麦幼胚作为诱导材料： 86小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用（1）取授粉14天左右的麦粒，在三角瓶或烧杯中将麦粒在70%乙醇溶液浸泡，充分摇动容器，消毒约10min；（2）随后，将乙醇倒掉，用无菌水充分漂洗麦粒；（3）然后倒入10%（V/V）NaClO（次氯酸纳）溶液浸泡10-15min，并将容器放入无菌操台中，确保环境无菌；（4）随后，用水（无菌）反复冲3～4次，充分洗净NaClO。（5）剥取未成熟胚直径（0.8-1.2mm），操作要在工作台中进行保证无菌环境，放置于诱导培养基上，盾片向上；（6）将材料放入25℃培养箱中，培养6-7d后，挑选高品质的幼胚愈伤组织；（7）将愈伤组织集中放于含0.4M渗透压培养基中。在直径为2.5cm的范围内,大约聚集35-40个幼胚，预处理4-6小时后，作为基因枪轰击所用的受体材料。。6.3.2.3微弹制备微粒子弹的制备方法制微粒弹：（1）称取BioRad公司购买的的金粉（直径1.0μm）60mg，将其放入无菌离心管（1.5mL）中。随后用1mL无水乙醇充分涡旋，用10000rpm离心10秒收集金粉；（2）去上清，再加入无菌水1mL涡旋后，10000rpm，10s，3次重复；最后的金粉沉淀可以用1mL浓度为50%的无菌甘油重悬，-20°C存放；（3）取50μL上述制备好的金粉悬浮液，依次加入DNA溶液（10μL），2.5mol/LCaCl2（50μL，提前灭菌），0.1mol/L亚精胺（20μL；现用现配，提前灭菌）混合均匀，冰浴1分钟，如此重复10次；（4）冰上静置30min，离心，倒除清液；再用无水乙醇冲金粉2次，250μL/次；10000rpm转速下离心30s，弃清液。金粉颗粒包裹制备完成。（5）使用时，用100μL无水乙醇重悬金粉，基因枪用于轰击，每次轰击用量为1.0μgDNA/100μg金粉颗粒。6.3.2.4基因枪轰击幼胚形成的愈伤组织（1）于超净工作台中使用基因枪，将试验台，可裂膜、载体膜、阻挡网及Macrocarrierholders用75%乙醇消毒15分钟；（2）然后将载体膜，可裂膜等放置于提前灭过菌的无菌滤纸上，在超净工作台中凉干；将Macrocarrierholders在酒精灯上高温灭菌，于无菌滤纸上冷却；（3）待其至常温后，将载体膜放于中间并保证平整展开；（4）用枪吸取10μL溶解在无水乙醇中的包裹着DNA的金粉颗粒于载体膜正中间， 第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程87吹干；（5）打开基因枪电源、连接真空泵开关及氦气瓶阀门，把Macrocarrierholders倒扣在Macrocarrierlaunchassembly中的凹槽上，旋紧盖子；将可裂膜放在固定盖中旋紧；将提前准备好的装有小麦愈伤组织的培养皿置于轰击架中间位置，选取6cm为实验所用轰击距离；关闭真空室外面的小门，进行轰击处理；（6）轰击后将组织置于高渗培养基上16-18h，然后转移到诱导培养基，恢复培养；（7）2周后，转入含有NAA（1mg/L）和KT（1mg/L）的分化筛选培养基中，其中筛选剂PPT浓度为2-3ppm，25℃左右光照培养，每2周可将组织转移一个新的分化培养基中继代；6.3.2.5转基因植物的筛选和再生（1）筛选培养中去掉筛选过程中品质差的愈伤组织（如褐化和出现水浸状），挑取后愈伤组织转接到分化培养基I中继续培养，用来诱导分化成苗。需要条件25℃/22℃，和光照/黑暗16h/8h。（2）长出芽点的愈伤被挑选转入分化培养基II中，继续分化，待苗长大。（3）挑选健壮的苗转移至生根培养基上生根。（4）诱导出根系，并且苗长高到7-8cm时候，便可将幼苗放入冷库中春化，大概需要30d，培养条件为4℃温度下，黑暗16h/光照8h。（5）春化结束常温炼苗3d，冲洗干净根部的残余的培养基，移栽于土中，适宜条件下培养。6.3.3对转基因小麦后代阳性植株的分子检测取转基植株（实验组和对照组）小麦的叶组织，CTAB法提取基因组DNA，引物PsFUZ7-rPCR-F/R检测目的基因（附表1）。CTAB提取DNA：（1）取小麦植株叶片长度0.5cm左右于1.5mL离心管中，加入钢珠，液氮冷冻后破碎小麦叶片；（2）每个离心管中加入600μL的CTAB预热溶液，剧烈震荡混匀。放入65℃烘箱或65℃水浴30min，每隔10min颠倒混匀一次；（4）每个离心管中加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀，然后10000-13000rpm离心10-15min，小心取出，不要混合上下层液体；（5）小心吸取上清500μL转于一新离心管中，加入等体积异丙醇，室温静止沉淀30min以上，离心同上；（6）弃去上清，加入500μL70%无水乙醇，洗涤后离心同上，5min； 88小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用（7）弃上清，吹干至无乙醇残留；（8）加入30-50μL无菌水溶解。6.3.4Northernblot6.3.4.1提取植物总RNA具体操作方法参考2.3.3。6.3.4.2聚丙烯酰胺（尿素）变性凝胶电泳（1）提前配制5×TBE溶液，放于室温备用。（2）在配置电泳胶前将可能用到的电泳板、梳子和电泳槽清洗干净。并用H2O2(3%)浸泡1h，备用。（3）配置聚丙烯酰胺凝胶配置19%凝胶40mL15mL（bio-rad大胶板）（2个bio-rad小胶板）29%Acrylamide/1%Bis-acrylamide18.9mL6.3mLUrea15.9g5.3gTBE5x7.5mL2.5mL充分溶解后添加如下试剂，TEMED50L15LAPS10%(w/w)140L10L混匀后倒入制胶板，插上梳子，凝聚1小时后备用。（4）交联1h后，将聚丙烯酰胺凝胶装入支架，放入电泳槽。将用5×TBE用单蒸水稀释成1×TBEbuffer倒入电泳槽，在180V电压下预跑1h。（5）期间准备使用上面提取的RNA样品；每个样品槽中加入40-45μg的totalRNA（或者5-10μgsmallRNA）。根据浓度换算成需要体积，为了条带在移动时整齐且条带锐利单一，尽量要使样品体积最小。TotalRNA与RNAloading（+EB）等体积混合，65℃孵育10min，快速放入冰上变性。（6）凝胶预跑完后，用长枪头吹打、清理样品槽，将沉淀在其中的杂志和盐吹打出来。将混合RNAloading的totalRNA加入样品槽。在100V电压下跑电泳，等到RNAloadingbuffer后面的色带跑到胶块的中间，并且最前端的色带跑到凝胶底部时，便可停止电泳，约3h。（7）转膜处理，用0.5×TBE冲洗胶2-5min，在紫外灯下观察结果，拍设条带迁移 第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程89记录。（8）将聚丙烯凝胶和尼龙膜贴合。白板在最下（阳极）往上依次放2张whatman纸，交联膜，凝胶，2张whatman纸，（阴极）黑板板。用玻璃棒或试管壁沿纸面轻推小心把气泡赶走。（详细操作：首先铺滤纸后，TBE浸湿后用试管壁在一侧轻推把气泡赶走，再铺尼龙膜，接着放凝胶，同样用试管壁推走气泡，最后再铺一层滤纸，同样推走气泡。正确区分正负极，使核酸由负极的胶内迁移到正极的尼龙膜上。）（9）在400mA电流，1×TBEbuffer中转膜1h。然后用20000mJ的紫外（UV）交联在尼龙膜上，然后65℃烘烤2h（可放在滤纸上进行）。保鲜膜包好，-20℃备用。（10）杂交时取出尼龙膜放入杂交管中，确保固定RNA的一面对着管内，加20mL的1×SSC浸润整个膜，赶走气泡，倒掉SSC。加入预杂交液，大概10-15mL，37℃恒温预杂交1-2h。（预杂交期间特别注意不要让杂交液流出杂交管，或者杂交膜之间是否重叠象）。（11）DNA模板合成：使用引物PsFUZ7-RNAi-F/R将转基因的片段PCR扩增出，跑胶确认片段大小正确，回收目的片段备用。（12）探针合成：取1.5mL离心管加入上步中的变性模板。95℃孵育5min，置于冰浴中冷却5min，离心几秒钟，备用。另取一离心管，依次加入如下体系各个成分，混匀，加入KlenowFragment酶1μL。最后在杂交室加同位素2μL。混匀后，37℃下放置60-120min，合成探针。labeling5×Buffer5μLdNTP（A/T/G）mix1μLdenaturedDNAtemplate15μLNuclease-FreeBSA(10mg/mL)1μLKlenowFragment（5u/μL）1μL[α-32P]dCTP2μL（13）纯化标记探针，用Bio-RadP-6纯化柱。在上述体系中加入50μL水，加入到纯化柱中，离心纯化探针，除去未标记核酸和反应体系中的酶类。然后95℃孵育10min，冰上放置5min后稍微离心，用于杂交备用。（14）将纯化的探针加入到预杂交管中，37℃过夜杂交。（15）清洗杂交膜，步骤：5×SSC+0.1%SDS20min37℃；2×SSC+0.1%SDS20min37℃；1×SSC+0.1%SDS5-10min56℃；冷却后用清水冲洗一次，将盐洗净。（16）将尼龙膜取出，放在滤纸上晾干15-30min，用保鲜膜把尼龙膜包好，放入压片夹。在暗室中放入底片自显影。可以将压片夹放入-80℃，根据信号强度确定自显 90小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用影时间，约4-5d。（17）显影：把压片夹在超低温冰箱拿出，降至室温后暗室显影底片。（18）尼龙膜用0.1×SSC+0.1%SDS，65℃清洗2h，可以将探针除去。为进行下一个探针的杂交做准备。附Nothernblot试剂及其配制：TE（10mL）：2MTris-Cl(pH8.0)50µL0.5MEDTA20µLDEPC灭菌水9.3mL10×TBE：Tris109g硼酸55g0.5MEDTA(pH8.0)40mL定容至1000mL，过滤备用，用时稀释20倍10%APS：0.1g溶于1mL的DEPC水中，震荡溶解备用Loadingbuffer：50%甘油0.03%溴酚蓝50mMTris-Cl(pH7.7)5mMEDTA0.03%二甲苯青FF取30mg的溴酚蓝加1mL的RNase-free水充分溶解，取其100μL加入3mLRNase-free水，充分混匀，加入250μL的2MTris-Cl(pH8.0)和100μL的0.5MEDTA(pH8.0)定容至5mL，再加入与总体积等量的甘油，-20℃保存。20%SDS（100mL）：SDS20gRNase-free水80mL用HCl调pH值至7.2，定容至100mL。不可以直接灭菌，用RNase-free水配制。20×SSC：NaCl175.3g柠檬酸钠88.2g水800mL溶解后用10M或浓HCl调pH值至7.0，纯水定容至1L。 第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程91杂交液（可自制）：甲酰胺18mL50×Denhardt母液0.8mL20%SDS母液14mL3MNaCl母液4mLPB混合液2mL加100μg/mL经变性并断裂成片段的鲑精DNA；加水补足体积40mL，杂交液中另外加入合成的探针。6.3.5SouthernblotDNA提取方法参考6.3.3，过程中有所改进：首先叶片在研钵中加液氮研磨成粉末后，加入10mL离心管中。另外最后要检验其质量浓度OD260/OD280>1.8，保证DNA完整性好，纯度高，以满足要求，-20℃保存。然后对DNA进行琼脂糖凝胶电泳：（1）取基因组DNA，用限制性内切酶HindIII和EcoRI进行消化处理，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段。（2）酶解完全的样品点样于0.7-1.0%大板琼脂糖凝胶进行电泳。电压不要过高25-30V，使条带缓慢移动。（3）电泳结束后，将凝胶在TBEbuffer（+EB）中浸泡，在凝胶成像仪中照相。（4）利用毛细管转移法，在转印迹槽中，加入20×SSC溶液，约槽的一半体积。槽上面放一个支架作为支持物，在支架上从下向上依次放一下材料：两张与凝胶等宽的whatman纸，将纸纵向自支架两侧垂如转印迹槽中搭一个“盐桥”，两侧的纸边缘浸入SSC溶液中。然后放上倒置的的凝胶（底面在上），与凝胶相同大小的纤维素膜，再放两层与凝胶等大whatman纸，其上放一打吸水纸（约5-8cm高），在上面压500-700g重物。凝胶四周可用Parafilm膜包围，减少蒸发以防止短路。纤维素膜和whatman滤纸事先用2×SSC浸湿至少5min。转膜18-20小时，确保转膜充分。（转膜装置中whatman纸和纤维素膜之间要将气泡赶净；转膜系统建立后，防止滤膜和凝胶出现相对移动；保持台面平整和静止；并注意吸水纸，避免出现倒塌和完全湿透，可以通过及时更换吸水纸来解决。）（5）转膜结束后，拆解转膜体系，取出纤维素膜并在右上剪一小角做标记，以区分正反和方向。（6）用2000值的紫外交联照射纤维素膜的正面，置于80℃烤箱烘烤0.5-2小时。（膜可立即进行预杂交和杂交，或保存于4℃待以后应用）（7）探针合成：取2mL离心管加入上步中的变性模板。95℃孵育5min，置于冰浴中冷却5min， 92小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用离心几秒钟，备用。另取一离心管，依次加入如下体系各个成分，混匀，加入KlenowFragment酶1μL。最后在杂交室加同位素2μL。混匀后，37℃下放置60-120min，合成探针。labeling5×Buffer5μLdNTP（A/T/G）mix1μLdenaturedDNAtemplate15μLNuclease-FreeBSA（10mg/mL）1μLKlenowFragment（5U/μL）1μL[α-32P]dCTP2μL（8）纯化标记探针，用Bio-RadP-6纯化柱。在上述体系中加入50μL水，加入到纯化柱中，离心纯化探针，除去未标记核酸和反应体系中的酶类。然后95℃孵育10min，冰上放置5min后稍微离心，用于杂交备用。（9）将杂交膜放于杂交管中，并加入20mL的2×SSC浸泡整个膜2min，避免膜和管壁之间有气泡产生。（10）将杂交管中液体倒出，加入10mL的杂交液，将杂交管放入杂交炉中至预杂交，温度42℃，时间3-4h。（11）在杂交管中加入纯化的探针，温度42℃，时间13-14h。（12）完成后清洗杂交膜，步骤：5×SSC+0.1%SDS20min37℃；2×SSC+0.1%SDS20min37℃；1×SSC+0.1%SDS5-10min56℃；冷却后用清水冲洗一次，将盐洗净。可用同位素检测仪检测膜上信号强度，如果太强可以继续用1×SSC+0.1%SDS清洗数次。（13）将尼龙膜取出，放在滤纸上晾干15-30min，用保鲜膜把尼龙膜包好，放入压片夹。在暗室中放入底片自显影。可以将压片夹放入-80℃，根据信号强度确定自显影时间，约4-5d。（14）显影：把压片夹在超低温冰箱拿出，降至室温后暗室显影底片。（15）尼龙膜用0.1×SSC+0.1%SDS，65℃清洗2h，可以将探针除去。为进行下一个探针的杂交做准备。6.3.6生物量检测6.3.6.1TaEF-1和PsEF-1载体的构建分别选取小麦和条锈菌持家基因延伸因子TaEF-1和PsEF-1，设计特异引物（附表1），进行扩增，胶回收，将扩增片段连接到pMD18-TSimple载体上。 第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程936.3.6.2标准曲线模板的计算和稀释copy(10x)WEF（200bp）REF（250bp）CopyVolumCopyVolum10100.75μL10μL10101.16μL10μL109100μL109100μL108100μL108100μL依次稀释十倍至拷贝数为100，以这两组DNA为模板，进行qRT-PCR分析。6.3.6.3标准曲线模板的绘制根据qRT-PCR结果绘制标准曲线如下图。图6-1标准曲线的绘制。Fig6-1StandardDNAconcentrationcurvesconstructed.6.3.6.4小麦条锈菌生物量计算携带干涉载体和空载体的转基因小麦分别接种条锈菌CYR32，20天后采集DNA样品，CTAB法提取DNA同6.3.3。qRT-PCR检测处理和对照中TaEF-1和PsEF-1的含量，根据标准曲线计算小麦条锈菌的生物量。6.3.7透射样品的制备透射电镜样品制备方法参照Kang等（2002）。将第10天采集的接种过条锈菌的小麦叶片剪成1mm×2mm的叶状，放进加入4%戊二醛的2mL离心管中（加入量以没过叶段为宜）抽真空，于戊二醛中固定4-15h。用pH=6.8的PBS缓冲液漂洗4-6次，每次漂洗15-30min；漂洗后，样品中加入1%的锇酸（OsO4,10g/L）并放置于4℃条件下固定2-3h；用PBS缓冲液（pH=6.8）漂洗4-6次，每次时间为15-30min；用30%，50%， 94小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用70%，80%，90%，100%系列乙醇溶液依次对样品进行脱水，每次30min，100%乙醇脱水3次；完全脱水后，依次加入3种不同比例的包埋渗透剂（LRWhite树脂包埋剂：无水乙醇，1:3、1:1、3:1）来进行渗透，处理时间依次为2-3h、4-5h和10-12h；最后用纯LRWhite树脂对样品进行两次包埋渗透（24h/次）。渗透时，将样品置于旋转台上旋转，注意做好标记。渗透后的样品用纯LRWhite树脂进行包埋，放入50℃烘箱孵育聚合48h。包埋样块进行修整，用钻石刀切成超薄组织切片，经柠檬酸铅和乙酸双氧铀染色，用透射电子显微镜(80kV)下进行观察，挑选对比明显视野，拍照。6.3.8WGA-Alexa488荧光染色具体操作方法见3.3.10。6.3.9条锈菌的沉默效率检测RNA样品的采集及提取方法同2.3.3及Real-timePCR同2.3.6。6.4结果6.4.1pAHC25-PsFUZ7干涉载体的构建构建的干涉载体结构如图所示（图6-2A），首先对其用XmaI和SacI酶切进行了验证。结果如图，大小符合756bp（图6-2B），然后进行测序确定插入的是目的序列。图6-2pAHC25-PsFUZ7干涉载体的构建。A,RNAi干涉载体的发卡结构。Ubi-p，启动子；Adh1，内含子；NOS-T，终止子；Bar，抗除草剂基因。B，载体酶切结果。泳道1，未酶切载体；泳道2，SmaIandSacI酶切载体后条带；泳道3，1kbladder。Fig6-2StructureofthepAHC25-PsFUZ7RNAiconstruct.A,StructureoftheRNAicassettecontainingPsFUZ7senseandantisensefragmentsforstablewheattransformation.Ubi-P,maizeubiquitin1promoter; 第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程95Adh1,Zeamaysalcoholdehydrogenase1;Nos-T,Nosterminator;Bar,Biolaphosresistancegene.Bb,Restrictiondigesttestresults.Lane1:undigested；Lane2:digestedwithSmaIandSacI；Lane3:ladder.6.4.2T0代转基因植株的PCR检测利用基因枪对小麦进行遗传转化，最终获得了99株成活的T0代植株，大部分植株生长发育良好（图6-3）。转化率约为1.34%，计算公式为：转化率=存活阳性植株/轰击的幼胚数，具体检测情况见表6-1。以转基因的DAN为模板进行PCR检测，以PsFUZ7-rPCR-F/R为引物，可以扩增出749bp的片段（图6-4）。然后通过PCR对这些存活小麦转基因植株进行筛选，最终筛选出了43株阳性植株，为进一步的抗病性鉴定奠定基础。PCR检测重复2~3次。图6-3在培养基上壮苗。Fig.6-3Resistantplantletsobtainedontheselectedmedium。图6-4T0代部分转基因植株的PCR检测。从左到右：转基因株系(L1-L7)，DS2000，转基因株系(L8-L10)，西农1376野生型植株，干涉载体质粒。Fig.6-4PCRdetectionofPsFUZ7segmentsinT0generation.Lefttoright:transgenicplants(L1-L7),DS2000,transgenicplants(L8-L10),Non-transgenicplant,positivevectorcontrol. 96小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用表6-1小麦基因枪转化试验总结表。Table6-1Theratiooftransformationofwheatbygenegunintheexperiment.基因名称轰击幼胚数T0代存活植株阳性植株阳性率（个）（株）（株）（%）PsFUZ7321899431.34%pAHCG25112742141.24%（空载体）6.4.3筛选出的L65和L91株系T3代分子鉴定收获了L65和L91株系T2代种子后，为了进一步确定这两个株系是否携带有目的基因，我们对T3代重新进行了分子鉴定，结果如下图所示。图6-5A显示，两个株系中均能用发卡结构两端的特异引物PsFUZ7-rPCR-F/R扩增出目的序列，而含有空载体的对照转基因植株并没有检测到目的条带。但是，Bar基因可以从三个株系中同时检测到，证明了目的基因和空载体确实分别转入了小麦植株中。为了进一步确定目的片段的存在，我们用特异探针对这两个单株进行SourthernBlot检测。从图6-5B可以看出，L65株系中插入了三个目的片段拷贝，L91株系中插入一个拷贝，而携带转基因空载体的CK植株则未能杂交出目的片段，也证明了目的片段成功转入了L65和L91株系中。图6-5L65和L91株系中目的片段的分子鉴定。A，L65，L91和CK植株的PCR检测。B，L65，L91和CK植株的Southernblot检测。Fig.6-5Molecularidentificationintransgenicplants.A,PCRproductsamplifiedfromT3transgenicwheatlinesL65,L91,andCK.B,Southernblotanalysisoftransgenicwheatlines.DNAextractedfromT3transgenicwheatlinesL65,L91,andCKweredigestedwithEcoRIandHindIII,resolvedonanagarosegel,transferredtoHybond-N+andhybridizedwithanα-[32P]-dCTP-labeledDNAfragmentthatwas 第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程97amplifiedfromthePsFUZ7sensefragment.6.4.4T2代转基因小麦室内生物学抗病性鉴定T0代筛选出来的植株在T1代进行了扩繁，并未进行抗病性鉴定实验。T1代收获的种子较多，因此，对T2代转基因植株接种了小麦条锈菌进行抗病性的鉴定实验。待小麦长到3叶时，采用抖粉法均匀接种小麦条锈菌，于黑暗条件下充分保湿24h，接种16天后观察记录小麦叶片发病情况。按照McNeal（1971）提出的九级分类标准调查病情，从中筛选出两个抗病性较好的株系L65和L91，寄主反应型在1-3级之间，而转入空载的对照植株反应型则处于6-7级（图6-6）。另外，这两个株系的生长发育情况与野生型相同，表现正常。6.4.5L65和L91株系T3代的室内抗病性鉴定及分子生物学分析为了确定转基因小麦的抗条锈性可以稳定遗传，我们分别对40株L65和L91株系的T3代进行了抗病性鉴定（图6-6A，D），图中显示，这两个株系在T3代依然保持了较高的抗病性，寄主反应型仍然保持在1-3级。统计数据显示，对照植株中，有26株寄主反应型为7级，其余14株反应型为6级，且比较稳定，从16d观察到25d未有变化。在L65接种小麦条锈菌CYR3216d后，寄主反应型3级，2级，1级的植株数分别为5株，15株，18株；25d后，分别为16株，10株，14株，也就是有些在16d未产孢的也有零星产孢，或者产孢略有增多，表现出慢锈性的特性。L91抗性比L65稍弱，在L91株系中接种条锈菌16d后，出现3级，2级，1级反应型的植株个数分别为28株，10株，2株；25d后，分别为30株，8株，2株。接着，我们进行了NorthernBlot实验检测体内小RNA的产生情况，以确定寄主抗性的升高是否是由于产生的小干扰RNA引起。如图6-6B所示，利用特异的探针可以在L65和L91中检测到21-24nt的小RNA，但在携带空载体的植株中未检测出来。U6作为对照，可以在各个株系里面检测到，且差异不大，说明样品质量可以满足实验要求（图6-6B）。随后，为了验证产生的小RNA是否能够靶标目的PsFUZ7基因，我们对小麦条锈菌分别侵染两个株系过程中的转录水平进行了分析。结果发现在不同时间点3d，10d和16d两个株系的表达量均有下降，PsFUZ7在L65转基因株系中分别下调57.8%，51.7%，50.7%；在L91株系中分别下调58.3%，30.1%，25.2%。这些结果也说明了小RNA靶向到了条锈菌中的目的基因PsFUZ7，并引起了PsFUZ7转录水平的降低（图6-6C）。另外，生物量实验也进一步证明了，菌丝在转基因L65和L91里的含量降低，也就是菌丝的生长发育受到了抑制（图6-6E）。 98小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用图6-6T3代L65和L91中小RNA的产生靶向PsFUZ7序列引起基因沉默。A，接种小麦条锈菌CYR3216d后，CK，L65和L91的抗病性鉴定。CK，携带空载的转基因植株。B，NorthernBlot检测转基因植株中的小RNA产生。U6，smallnuclearRNA作为对照。C，PsFUZ7在接种CYR323d，10d和16d的转基因植株上的表达水平检测。CK-10d表达量设置为1。D，CK，L65和L91在接种小麦条锈菌后的反应型。n=40。E，小麦条锈菌生物量分析。TaEF-1和PsEF-1作为对照。Fig.6-6TransgenicwheatlinesL65andL91producingfungalgene-derivedsiRNAsinducesilencingofthetargetmRNAandconferresistancetoPstinfection.A,PhenotypeoftransgeniclinesL65,L91,andcontrol(CK)inT2andT3generations.CK,transgeniclinescarryingemptyvector;L65andL91,transgeniclinescarryingRNAiconstructs.B,NorthernblotanalysisofsiRNAisolatedfromT3transgenicwheatlinesdetectedwithspecificprobederivedfromthePsFUZ7fragment.U6smallnuclearRNAasaloadingcontrol.C,RelativeexpressionofPsFUZ7at3,10and16dpiwithCYR32ofT3transgenicwheatlinesL65,L91,andthecontrol(CK).D,HostresponseandinfectiontypedescriptioninT3transgenicwheatlinesL65,L91,andthecontrol(CK)assessedat16and25dpiwithCYR32.E,Fungalbiomassmeasurementsusingreal-timePCRanalysisoftotalDNAextractedfromwheatleavesinfectedwithCYR32at16dpi.RatiooftotalfungalDNAtototalwheatDNAwasassessedusingthewheatgeneTaEF-1andthePstgenePsEF-1.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests.DoubleasterisksindicateP<0.01.另外，我们对RNAi干扰实验中可能存在的“脱靶”靶标进行了生物信息学预测， 第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程99并未预测到完全匹配连续21nt-24nt小RNA的潜在靶标（表6-2）。表6-2.脱靶效应检测。Table6-2.PredictionofPsFUZ7off-targettranscriptsa.OrganismbAllhitsEfficienthits小麦条锈菌（Pucciniastriiformis）00小麦（Triticumaestivum）00大麦（Hordeumvulgare）00人类（Homosapiens）00a，Si-Fi软件(http://labtools.ipk-gatersleben.de)预测是否有脱靶效应发生。b，用于预测脱靶效应的小麦条锈菌，小麦，大麦以及人类基因组序列来源于NCBI(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)a,SimulationswererunusingSi-Fisoftware(v21)foroff-targetprediction(http://labtools.ipk-gatersleben.de).b,P.striiformis,T.aestivum,H.vulgareandH.sapiensgenesequencefileswereobtainedfromNCBIGenomeAssembly/AnnotationProjects(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)foroff-targetprediction.为了进一步验证表型的变化并非“脱靶效应”引起，我们从小麦条锈菌和小麦转录组中各挑选出12条存在1-3nt错配的最有可能潜在的脱靶靶标序列，并对其表达量进行检测，结果如图所示，它们的表达量并未发现有显著的下调（图6-7；图6-8）。这些也进一步说明了本实验中RNAi沉默的特异性，并未对最有可能潜在的脱靶对象产生影响。图6-7小麦条锈菌中潜在脱靶序列表达量分析。Fig.6-7TranscriptabundanceoftheputativeRNAioff-targetPstgenesintransgenicplantsinoculatedwithCYR32at10dpi.ThedatawerenormalizedtotheexpressionlevelofPsEF-1,andtheCKcontrolwassetat1.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests. 100小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用图6-8小麦中潜在脱靶序列表达量分析。Fig.6-8TranscriptabundanceoftheputativeRNAioff-targetwheatgenesintransgenicplantsinoculatedwithCYR32at10dpi.ThedatawerenormalizedtotheexpressionlevelofTaEF-1,andtheCKcontrolwassetat1.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests.6.4.6小麦条锈菌接种于L65和L91株系后的细胞组织学观察在我们确定小麦对条锈菌抗性的提高确实是由小RNA的产生靶标到目的基因PsFUZ7引起转录水平的沉默后，我们对沉默PsFUZ7后的小麦条锈菌进行细胞组织学观察。取接种10d的样品，用荧光增白剂染料特异染色小麦条锈菌后，在荧光显微镜下进行观察。从图6-9A中可以明显的看出，对照中的菌丝蔓延面积较大，且没有坏死出现；但是携带干涉载体的转基因植株L65和L91的菌丝扩展受到了严格的限制，而且在混合通道和白场中能明显的观察到大面积的坏死。随后，我们对菌丝扩展面积，坏死面积以及吸器数目进行了统计，结果与观察到的表型一致性。另外，还发现L65和L91中吸器数目较对照中显著减少（图6-9，B-D）。为了更清晰的观察小麦和小麦条锈菌细胞内部的结构，我们制作了接种条锈菌10d后小麦叶片的电镜样品。如图6-9E可以看到，在对照中小麦和小麦条锈菌的形态发育都呈现正常状态，小麦的细胞都保持着完整性，而且小麦条锈菌的细胞核和细胞器清晰可见。但是在L65和L91中，菌丝附近的小麦细胞完全坏死坍塌，同时小麦条锈菌的细胞质呈现浓缩化，细胞核和细胞器也出现塌陷模糊的状况。这些结果显示了小麦条锈菌在携带干涉载体植株上的生长发育确实受到明显的影响，另外，小麦坏死的出现值得 第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程101我们进一步的探讨。图6-9小麦条锈菌接种L65和L91株系后细胞组织学观察。A，荧光增白剂染色菌丝后组织观察。SV，气孔下囊；IH，侵染菌丝；HMC，吸器母细胞；H，吸器；NHC，寄主坏死细胞。标尺=50μm。B，菌丝侵染面积统计。C，吸器数目统计。D，寄主坏死面积统计。双星号表示P<0.01。E，透射显微镜下观察小麦和小麦条锈菌的细胞组织学结构。左标尺=2μm，右标尺=500nm。HMC，吸器母细胞；H，吸器；RN，条锈菌细胞核；Ch，叶绿体；Cy，细胞质；IH，侵染菌丝；HC，寄主细胞；NHC，寄主坏死细胞；Org，细胞器。Fig.6-9Microscopicvisualizationoftheinhost-inducedgenesilencingeffecttargetingPsFUZ7oncolonizationofwheatleaftissuebyPst.A,Cytologicalobservationofrustinteractionwithwheatbyepifluorescencemicroscopy.LeavesinoculatedwithCYR32weresampledat10dpi.SVrepresentsubstomatalvesicle;IHrepresentinfectionhypha;HMCrepresenthaustorialmothercell;Hrepresenthaustorium;NHC,representnecrotichostcell.Bars=50μm.B,InfectionareaperinfectionsiteisreducedinthetransgeniclinesL65andL91infectedwithCYR32comparedwithCKat10dpi.C,TheformationofhaustoriainlinesL65andL91isinhibitedafterinoculationwithCYR32comparedwithCKat10dpi.D,ThenecroticareaofplantsfromlinesL65andL91isincreasedcomparedwithCKat10dpiwithCYR32.E,CytologicalobservationsofPstCYR32andwheatbytransmissionelectronmicroscopyat10dpi.HMC,haustorialmothercell;H,haustorium;RN,rustnucleus;Ch,chloroplast;Cy,cytoplasm;IH,infectionhypha;HC,hostcell;NHC,necrotichostcell;Org,organelle.Leftbars=2μm,Rightbars=500nm.Differencesind-ewereassessedusingStudent’st-tests.DoubleasterisksindicateP<0.01.6.4.7小麦条锈菌MAPK通路基因及小麦抗病蛋白的转录水平表达 102小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用我们对小麦条锈菌中MAPK信号通路相关的基因在转基因植株中的表达进行分析发现，除了PsKPP2外，信号通路上游和下游的相关基因的转录表达均能受到抑制（图6-10）。另外对小麦条锈菌中一些抗病相关的基因进行转录水平的分析发现，一些活性氧清除基因TaCAT1，TaCAT2，TaAPX和PR1、PR2基因有一定的上调。这些结果说明，沉默PsFUZ7后可能引起小麦条锈菌和小麦中一系列基因的转录水平的变化，由此也说明沉默后发生的分子调控过程非常复杂。图6-10小麦条锈菌和小麦中部分抗性相关基因的转录表达。A，MAPK信号通路上下游基因的转录水平分析。PsKPP4，MAPKKK基因；PsFUZ7，MAPKK基因；PsKPP2，PsKPP6andPsCRK1，MAPK基因。B，小麦中部分抗性基因的转录水平分析。TaPR1，pathogenesis-relatedprotein1；TaPR2，β-1,3-glucanase；TaPAL，phenylalanineammonialyase；TaAPX，ascorbateperoxidase；TaNOX，NADPHoxidase；TaSOD，superoxidedismutase；TaPOD，peroxidase；TaCAT2，catalase2；TaCAT1，catalase1。Fig.6-10TranscriptprofilesofgenesinvolvedintheMAPKpathwayinPstanddefense-relatedgenesintransgenicwheatplantsL65andL91.A,TranscriptabundanceofMAPK-pathwayrelatedgenesinPstdecreasesexceptforPsKPP2.Wheatleavesweresampledat3and10dpiwithPst.DatawerenormalizedtothePsEF-1expressionlevel.B,Transcriptabundanceofpathogenesis-relatedproteinsordefense-relatedgenesincreaseintransgenicwheatplantsL65andL91at3and10dpi.TaPR1,pathogenesis-relatedprotein1;TaPR2,β-1,3-glucanase;TaPAL,phenylalanineammonialyase;TaAPX,ascorbateperoxidase;TaNOX,NADPHoxidase;TaSOD,superoxidedismutase;TaPOD,peroxidase;TaCAT2,catalase2;TaCAT1,catalase1.ThedatawerenormalizedtotheTaEF-1expressionlevel.6.4.8小麦条锈菌与小麦之间“分子对话”根据我们的实验结果和现有报道的参考文献，我们构建了如图6-11的模型，展示 第六章RNAi介导的抗小麦条锈菌基因工程103了沉默小麦条锈菌PsFUZ7的机理和可能引起的一系列细胞生理生化的变化。在转基因小麦细胞内，产生的真菌dsRNA被切割成小干扰RNA（siRNA）。这些siRNA被蛋白质复合体捕获，并被传送到小麦与条锈菌接触的空间中。小分子通过细胞壁后，进入小麦条锈菌细胞内，触发其靶mRNA的转录后水平沉默，进而影响一系列基因的转录水平，导致小麦条锈菌体内信号传导受到抑制。另一方面，在小麦体内可能通过调控ETI和PTI等机制诱导转基因小麦体内免疫系统激活。图6-11携带RNAi干涉载体的转基因植株和定殖的小麦条锈菌之间可能存在的“分子对话”示意图。Fig.6-11SchematicpresentationofpossiblemoleculardialoguesbetweentransgeniclinescarryingRNAiconstructsandcolonizingPst.FungaldsRNA,producedinsidetransgenicwheatcells,iscleavedbytheplantsilencingmachineryusingendonuclease-typeDICERenzymesintosmallsilencingmolecules(siRNAs).ThesesiRNAsaretrappedbyacomplexofproteins,andtransportedtotheparamuralspace.Afterpassingthehaustorialcellwall,thesilencingmoleculestriggerRNAioftheirmRNAtargets,andmayactasprimersleadingtotheactivationofsystemicsilencingsignals,thusinducingtheimmunitysystemoftransgenicwheatbymechanismsincludingETIandPTI.6.5讨论由于抗真菌病害的种质资源非常有限以及寄主的抗病性丧失较快，如何增强谷类作物的抗真菌病害是关系到粮食生产的一个主要的挑战。本研究的目的是，确定靶向条锈菌基因的RNAi干涉载体转入小麦后，是否可以赋予小麦对条锈菌稳定遗传的抗性材料。根据前面的瞬时沉默实验，我们筛选出的一个用于构建RNAi干扰载体的靶基因 104小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用PsFUZ7。在酵母、稻瘟和玉米瘤黑粉中，FUZ7同源基因在调控发育过程种都发挥了重要的作用。功能实验分析证明了PsFUZ7在小麦条锈菌的生长发育和致病过程中同样也起着重要的作用，前期MAPK相关基因的功能筛选对随后RNAi沉默机制的稳定遗传研究至关重要。我们对选取的PsFUZ7的片段进行了生物信息学分析发现其在小麦条锈菌，小麦，大麦和人类中均没有同源相似序列，避免了可能出现的脱靶效应。证明了选取的这段序列是控制小麦条锈菌的理想靶标，避免了出现靶标到非目标序列的副作用。通过基因枪轰击转化RNAi干涉载体pAHC25-PsFUZ7进入小麦中，最终获得稳定遗传的阳性植株。我们对获得的阳性植株进行了抗病性鉴定和各种分子生物学检测，证明RNAi技术确实可以应用于提高小麦对小麦条锈菌的抗性中去，即携带RNAi载体的转基因植物可以产生siRNA干扰PsFUZ7靶基因，从而限制真菌生长并降低其致病力。细胞组织学观察发现，与携带空载体的对照小麦相比，在携带RNAi载体小麦中条锈菌菌丝生长上出现了显著差异，菌丝的生长受到严格的限制，而且寄主植物中诱导产生坏死现象。另外，为了进一步说明表型变化并非由于脱靶效应引起的，我们对潜在的脱靶位点进行分析。因为前期未能从小麦和小麦条锈菌转录组中预测到连续21-24nt匹配的靶标位点，所以，我们选择存在1-3nt错配的潜在靶标进行定量分析。我们从小麦和小麦条锈菌转录组中分别找到12条基因进行检测，结果发现，这些基因在转基因植株中的表达量与对照性比并未有明显的下调，因此，可以推测表型的变化并非由于脱靶引起。通过以上数据分析，我们提出了转基因小麦RNAi沉默PsFUZ7引发一系列抗病反应的示意图。在植物免疫系统中，抗病反应包括两个主要阶段，病原体相关分子模式（PAMP）激发的免疫反应（PTI）和效应物激发的免疫反应（ETI）。在转基因小麦中产生的细胞死亡与ETI免疫反应中的过敏反应（HR）表型一致。在玉米瘤黑粉中，MAPK级联途径下游的激酶CRK1负调节某些效应蛋白的转录和分泌(Bielskaetal.2014)。在我们的研究中，沉默PsFUZ7发现PsCRK1积累水平降低明显。综合这些结果，我们推测siRNA靶标PsFUZ7的表达可能影响小麦条锈菌中的效应子分泌，并在转基因XN1376小麦中触发ETI免疫反应。此外，与真菌发病相关的许多依赖于MAPK信号传导的致病相关因子也收到影响，包含生物因子的合成、转运和分泌相关途径。PsFUZ7的沉默可能影响PAMP途径中生物合成或分泌，进而影响PTI免疫反应。本文首次证实了通过寄主诱导的靶基因沉默（HIGS）可以赋予小麦对条锈菌稳定持久的抗病性。因此，利用来源于病原真菌的关键基因或特异毒性基因构建RNAi序列，通过HIGS技术成为控制小麦条锈菌的有效方法。应用这一策略来防治病害，可以减少杀真菌剂的应用来保证环境的健康和农业的可持续发展。同时，RNAi技术的成功，也为抗小麦条锈病提供了一个潜在的、巨大的抗性基因资源库，以用于生产对真菌性病原菌持续耐受的转基因作物。 小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用105第七章全文的总结和展望全文结论：1.从小麦条锈菌中鉴定出七个MAPK信号通路相关的候选基因，这些基因与其它真核生物中的同源基因存在结构上的保守性。随后，经过一系列的体内和体外实验证明，小麦条锈菌中的MAPK级联基因在调控小麦条锈菌的生长发育和对小麦的致病性中发挥着重要的角色。2.实验发现了一个具有HMG结构域的蛋白PsPRF1，其具有核酸酶的活性，进一步实验发现它能够诱导植物和酵母细胞的坏死。我们推测PsPRF1可能参与到调控小麦条锈菌自身凋亡的过程中来；或者可能参与降解植物DNA，为成功寄生提供基础。但仍需要进一步的实验探索，期望将来能够为抗条锈病的研究提供新的视角和突破口。3.PsFUZ7作为MAPK信号通路核心部位的激酶，在信号传导过程中起着不可或缺的作用。转基因植株中沉默目的基因PsFUZ7后，小麦和条锈菌体内可能发生深入的分子交流：一方面可能造成小麦条锈菌内部一系列生理生化过程受到影响，导致小麦条锈菌自身生长发育受到限制；另外一方面，可能诱导寄主小麦自身免疫系统或信号通路产生一系列的变化，从而影响小麦的抗病能力。4.初步揭示了RNAi技术可以应用于小麦与小麦条锈菌互作的体系中来，为小麦条锈菌的持续防治提供了新的思路。既避免了对环境和人类的危害，又节约了传统育种中所耗费时力。更重要的可以提供巨大的抗性基因资源库，在小麦抗性丧失后，能够快速补充更新抗病资源。展望：1、在前期的研究基础上，开展更全面和深入的研究，系统揭示小麦条锈菌的致病机理。2、深入探索HIGS的沉默机制及其在条锈菌与小麦互作中发挥的功能，从而明确小麦条锈与小麦互作过程中可能存在的分子对话。3、进一步明确小麦条锈菌的PsPRF1基因在小麦条锈菌发育和致病过程中可能发挥的作用，并探索其具体的调控机制。4、鉴定更多禾谷类锈菌特有的或条锈菌特有的激酶基因，并明确它们在锈菌致病性中的作用。 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116小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用IdentificationofeighteenBerberisspeciesasalternatehostsofPucciniastriiformisf.sp.triticiandvirulencevariationinthepathogenisolatesfromnaturalinfectionofbarberryplantsinChina.Phytopathology,103(9):927-934ZhaoJ,WangM,ChenX,KangZ.2016.Roleofalternatehostsinepidemiologyandpathogenvariationofcerealrusts.AnnualReviewofPhytopathology,54(1):207-228ZhaoX,KimY,ParkG,XuJ-R.2005.Amitogen-activatedproteinkinasecascaderegulatinginfection-relatedmorphogenesisinMagnaporthegrisea.ThePlantCell,17(4):1317-1329ZhaoX,MehrabiR,XuJR.2007.Mitogen-activatedproteinkinasepathwaysandfungalpathogenesis.EukaryoticCell,6(10):1701-1714ZhaoX,XuJR.2007.AhighlyconservedMAPK-dockingsiteinMst7isessentialforPmk1activationinMagnaporthegrisea.MolecularMicrobiology,63(3):881-894ZhengL,CampbellM,MurphyJ,LamS,XuJR.2000.TheBMP1geneisessentialforpathogenicityinthegraymoldfungusBotrytiscinerea.Molecularplant-microbeinteractions,13(7):724-732ZhengW,HuangL,HuangJ,WangX,ChenX,ZhaoJ,GuoJ,ZhuangH,QiuC,LiuJ.2013.Highgenomeheterozygosityandendemicgeneticrecombinationinthewheatstriperustfungus.Naturecommunications,4:2673ZhouX,LiuW,WangC,XuQ,WangY,DingS,XuJR.2011.AMADS-boxtranscriptionfactorMoMcm1isrequiredformalefertility,microconidiumproductionandvirulenceinMagnaportheoryzae.MolecularMicrobiology,80(1):33-53ZhouY,YuanY,YuanF,WangM,ZhongH,GuM,LiangG.2012.RNAi-directeddown-regulationofRSVresultsinincreasedresistanceinrice(OryzasativaL.).BiotechnologyLetters,34(5):965-972ZilbermanD,CaoX,JacobsenSE.2003.ARGONAUTE4controloflocus-specificsiRNAaccumulationandDNAandhistonemethylation.Science,299(5607):716-719.ZipfelC,FelixG.2005.Plantsandanimals:adifferenttasteformicrobes?CurrentOpinioninPlantBiology,8(4):353ZiyaevZM,SharmaRC,NazariK,MorgounovAI,AmanovAA,ZiyadullaevZF,KhalikulovZI,AlikulovSM.2011.ImprovingwheatstriperustresistanceinCentralAsiaandtheCaucasus.Euphytica,179(1):197-207 附录117附录附录1引物序列SupplementaryTable1.Primersusedinthisstudy.NameUsedforPrimersequence(5’→3’)TaEF-1-FqRT-PCRTGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGTTaEF-1-RqRT-PCRACTCATGGTGCATCTCAACGGACTPsEF-1-FqRT-PCRTTCGCCGTCCGTGATATGAGACAAPsEF-1-RqRT-PCRATGCGTATCATGGTGGTGGAGTGAPsUBC2-FCloningATGTCAGTACTCGACTGGAACGPsUBC2-RCloningCTAAGATGCAGGGGAATTAGCCAGAPsKPP4-FCloningATGGCCAAGGGACAGATCAGAPsKPP4-RCloningTTAGATGACCGGGTTGAGTTCAGPsFUZ7-FCloningATGCTATCTCAAAGTAAGAAGAACAPsFUZ7-RCloningTTATAAAGTGAGAGTACTAGCCCATPsKPP6-FCloningATGGCAGCCGTTGTAGCTCPsKPP6-RCloningTTAAGCAGTGGAGTGGAAGCPsKPP2-FCloningATGGATCGCAACTTCCGAGTCPsKPP2-RCloningCTAAGCCATGATTTCATTGAAGATTPsCRK1-FCloningATGTCAAACAATAATCATAATAGCAGCPsCRK1-RCloningTCAGCTATTCATATGTTGATCATTATPsPRF1-FCloningATGGATTTTCACGAAGAGACTGPsPRF1-RCloningTTAGGAATGGGAATATGTACTATAATC163-PsKPP4-FLocalizationCTGCAGATGGCCAAGGGACAGATCAGA163-PsKPP4-RLocalizationCTGCAGGATGACCGGGTTGAGTTCAG163-PsPRF1-FLocalizationCTGCAGATGGATTTTCACGAAGAGACTG163-PsPRF1-RLocalizationCCATGGAGGAATGGGAATATGTACTATAATCPsKPP4-1as-FVIGSATATTAATTAAGAACGGTCGGAGTAGTAGCAPsKPP4-1as-RVIGSTATGCGGCCGCGCATTAAGAGGCATAGAAGAPsKPP4-2as-FVIGSATATTAATTAATCCTGGTGGTTCAGTTTCTACPsKPP4-2as-RVIGSTATGCGGCCGCTTGCTTTACTACTTCGGGTGPsFUZ7-1as-FVIGSATATTAATTAAGCCATCAGTAAGGAAGCAGPsFUZ7-1as-RVIGSTATGCGGCCGCGACCAGAAACGACAGCCACPsFUZ7-2as-FVIGSCAAGAGGATGGTGAACTGPsFUZ7-2as-RVIGSTTATAAAGTGAGAGTACTAGCCCPsPRF1-1as-FVIGSATATTAATTAACACGCCTACGTGGGCTATTPsPRF1-1as-RVIGSTATGCGGCCGCCTGGGAGACGAGTGGAACAAPsPRF1-2as-FVIGSATATTAATTAAGAGATTGTTGCCAAGGTTCT 118小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用PsPRF1-2as-RVIGSTATGCGGCCGCAGGGCTCGTTCTGAGTTGTPsUBC2-1as-FVIGSATATTAATTAACTGGAACGAAGCGAAAGTAPsUBC2-1as-RVIGSTATGCGGCCGCTGCGTCGGAGTGAGTATCTPsUBC2-2as-FVIGSATATTAATTAACGGGTTCTGTATCGCCATCTAPsUBC2-2as-RVIGSTATGCGGCCGCCTCTTCGGCTCCTTCTGTTCGPsKPP6-1as-FVIGSATATTAATTAACTCCAAAAGCTCCCAGTTCGPsKPP6-1as-RVIGSTATGCGGCCGCTTCTCGCAAGGTTCTCAGACPsKPP2-1as-FVIGSATATTAATTAATTGCTTACGGACGTTGAGAPsKPP2-1as-RVIGSTATGCGGCCGCGAAGTACGGCGGCTGAGTGPsCRK1-1as-FVIGSATATTAATTAAGAACTCAAGTCACTCCGAACAATPsCRK1-1as-RVIGSTATGCGGCCGCTATCCCGATGAAAGAATCCACAGPsFUZ7-pREP-FExpr.inyeastGTCGACTCATGCTATCTCAAAGTAAGAAGAAPsFUZ7-pREP-RExpr.inyeastCCCGGGTTATAAAGTGAGAGTACTAGCCCATPsKPP4-pREP-FExpr.inyeastCCCGGGATGGCCAAGGGACAGATCAGAPsKPP4-pREP-RExpr.inyeastCCCGGGTTAGATGACCGGGTTGAGTTCAGPsPRF1-pREP-FExpr.inyeastCTCGAGATGGATTTTCACGAAGAGACTGPsPRF1-pREP-RExpr.inyeastCCCGGGTTAGGAATGGGAATATGTACTATAATCPsFUZ7-RNAi-FRNAiCAAGAGGATGGTGAACTGPsFUZ7-RNAi-RRNAiTTATAAAGTGAGAGTACTAGCCCPsFUZ7-si-FHIGS/VIGS-qRTGGCTGTCGTTTCTGGTCTGAPsFUZ7-si-RHIGS/VIGS-qRTAAAGTATCGGCAATGGAGTTPsFUZ7-blot-FNBandSBCAAGAGGATGGTGAACTGPsFUZ7-blot-RNBandSBTTATAAAGTGAGAGTACTAGCCCPsFUZ7-rPCR-FRNAihairpinGGCAAGAGGATGGTGAACPsFUZ7-rPCR-RRNAihairpinCTCCAAGAGGATGGTGAABar-FRNAibarATCTCGGTGACGGGCAGGACBar-RRNAibarGCACCATCGTCAACCACTACATCPsKPP4-qRT-FReal-timePCRGGTGCCAGTTCCAGTCCAAPsKPP4-qRT-RReal-timePCRTTCCCTCCTGTCCCGTCTTPsFUZ7-qRT-FReal-timePCRGTGAAATCGGATGTTTGGTCPsFUZ7-qRT-RReal-timePCRTTCCCTCTTCTGAAATGCTGPsKPP6-qRT-FReal-timePCRTGACATTATTCGTCCACCTACCPsKPP6-qRT-RReal-timePCRCACATCTGCCGAGTGAAGCPsKPP2-qRT-FReal-timePCRATTTGTGATTTCGGATTGGPsKPP2-qRT-RReal-timePCRTAGCCTTCGTGTATTCTTTGAPsPRF1-qRT-FReal-timePCRGCCTTGCCAACAATGAAACPsPRF1-qRT-RReal-timePCRCGTGAGACCGAAACAAGATAAAPsUBC2-qRT-FReal-timePCRCGATGACTGCGAAGAGCAAPsUBC2-qRT-RReal-timePCRTTGAGTGCGGCTGGTAAAAPsCRK1-qRT-FReal-timePCRAGCGGTTGATAAGGGTAAAG 附录119PsCRK1-qRT-RReal-timePCRTATTCTGGTCGTGTCTGTCGTaAPX-qRT-FReal-timePCRGGTTTGAGTGACCAGGACATTGTaAPX-qRT-RReal-timePCRGCATCCTCATCCGCAGCATTaPAL-qRT-FReal-timePCRCGTCAAGAGCTGTGTGAAGATGGTaPAL-qRT-RReal-timePCRGGTAGTTGGAGCTGCAAGGGTCTaNOX-qRT-FReal-timePCRATGTTCGGCAACTTGGTGACTTaNOX-qRT-RReal-timePCRCGTCTGCTCTAAGAAGACCACTTTTTaSOD-qRT-FReal-timePCRCCGAGGTCTGGAACCATCACTaSOD-qRT-RReal-timePCRAGCCGAAATCCTTCTCGATCTTaPR2-qRT-FReal-timePCRAGGATGTTGCTTCCATGTTTGCCGTaPR2-qRT-RReal-timePCRAAGTAGATGCGCATGCCGTTGATGTaPR1-qRT-FReal-timePCRGAGAATGCAGACGCCCAAGCTaPR1-qRT-RReal-timePCRCTGGAGCTTGCAGTCGTTGATCTaPOD-qRT-FReal-timePCRTCCGTTGTCGCCTCTGGTTaPOD-qRT-RReal-timePCRGTGCCTTGCCGATGGTGTTaCAT2-qRT-FReal-timePCRCGTGTTCTATCTGGCTGCTaCAT2-qRT-RReal-timePCRTCTGGATTTCATGGGTGATaCAT1-qRT-FReal-timePCRGCCCAAGTGCTCCCACCACAACATaCAT1-qRT-RReal-timePCRTGAGGGTGCGGGAGGGGATGCAGATCTTGGCTTTCGTAGGAACCCAATCTTCAATGCTATCTCAAAPsFUZ7-PFL2-FComp.mutantGTAAGAAGAACACACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACTAAAGTGAGPsFUZ7-PFL2-RComp.mutantAGTACTAGCCCATCAGATCTTGGCTTTCGTAGGAACCCAATCTTCAATGGCCAAGGGAPsKPP4-PFL2-FComp.mutantCAGATCAGACACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACGATGACCGGPsKPP4-PFL2-RComp.mutantGTTGAGTTCAGPsKPP4-BD-FY2HCCCGGGATGGCCAAGGGACAGATCAGAPsKPP4-BD-RY2HCTGCAGTTAGATGACCGGGTTGAGTTCAPsFUZ7-AD-FY2HCCCGGGATGCTATCTCAAAGTAAGAAGAACAPsFUZ7-AD-RY2HTCTAGATTATAAAGTGAGAGTACTAGCCCATPsKPP6-BD-FY2HCCATGGAGATGGCAGCCGTTGTAGCTCPsKPP6-BD-RY2HCTGCAGTTAAGCAGTGGAGTGGAAGCPsUBC2-AD-FY2HCCCGGGATGTCAGTACTCGACTGGAACGPsUBC2-AD-RY2HTCTAGACTAAGATGCAGGGGAATTAGCCAGAPsCRK1-BD-FY2HCCATGGAGATGTCAAACAATAATCATAATAGPsCRK1-BD-RY2HCTGCAGTCAGCTATTCATATGTTGATCATTATPsKPP4-PVX-FExpr.intobaccoCCCGGGATGGCCAAGGGACAGATCAGAPsKPP4-PVX-RExpr.intobaccoCCCGGGTTAGATGACCGGGTTGAGTTCAGPsKPP6-PVX-FExpr.intobaccoCCCGGGATGGCAGCCGTTGTAGCTC 120小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用PsKPP6-PVX-RExpr.intobaccoATCGATTTAAGCAGTGGAGTGGAAGCPsPRF1-1-PVX-FExpr.intobaccoCCCGGGATGGATTTTCACGAAGAGPsPRF1-1-PVX-RExpr.intobaccoGCGGCCGCGCCCTGAGCGGTAGGAGGPsPRF1-2-PVX-FExpr.intobaccoCCCGGGGATACTTTCCCCTTTCTCPsPRF1-2-PVX-RExpr.intobaccoGCGGCCGCAGGCATGCCTTCTGAGTGCGPsPRF1-3-PVX-FExpr.intobaccoCCCGGGGGTGGTCGCAGAGGCTCTPsPRF1-3-PVX-RExpr.intobaccoGCGGCCGCATGGCCAGGTGGCGTCTTTPsPRF1-4-PVX-FExpr.intobaccoCCCGGGGTCAAACGGCCCCGGAACGPsPRF1-4-PVX-RExpr.intobaccoGCGGCCGCTTTCGCGGCGGAAGACGAPsPRF1-5-PVX-FExpr.intobaccoCCCGGGAAGAAAGCTGTCACCCGGAAAAPsPRF1-5-PVX-RExpr.intobaccoGCGGCCGCCGGTTGAAGTTGATCACCCPsPRF1-6-PVX-FExpr.intobaccoCCCGGGACCTTGAGTTACGACTCAGAGPsPRF1-6-PVX-RExpr.intobaccoGCGGCCGCTTAGGAATGGGAATATGTAPsPRF1-1-pCold-FExpr.inE.coliGAATTCATGGATTTTCACGAAGAGPsPRF1-1-pCold-RExpr.inE.coliTCTAGAGCCCTGAGCGGTAGGAGGPsPRF1-2-pCold-FExpr.inE.coliGAATTCGATACTTTCCCCTTTCTCPsPRF1-2-pCold-RExpr.inE.coliTCTAGAAGGCATGCCTTCTGAGTGCGPsPRF1-3-pCold-FExpr.inE.coliGAATTCGGTGGTCGCAGAGGCTCTPsPRF1-3-pCold-RExpr.inE.coliTCTAGAATGGCCAGGTGGCGTCTTTPsPRF1-4-pCold-FExpr.inE.coliGAATTCGTCAAACGGCCCCGGAACGPsPRF1-4-pCold-RExpr.inE.coliTCTAGATTTCGCGGCGGAAGACGAPsPRF1-5-pCold-FExpr.inE.coliGAATTCAAGAAAGCTGTCACCCGGAAAAPsPRF1-5-pCold-RExpr.inE.coliTCTAGACGGTTGAAGTTGATCACCCPsPRF1-6-pCold-FExpr.inE.coliGAATTCACCTTGAGTTACGACTCAGAGPsPRF1-6-pCold-RExpr.inE.coliTCTAGATTAGGAATGGGAATATGTATraesCS3D01G022900-ROff-targetdetectedCCCTTGCTCTAGCCTCCATraesCS4B01G406600LC-FOff-targetdetectedTGCCTTTGACTTGCCTATTraesCS4B01G406600LC-ROff-targetdetectedAGTAACCCAGACTTCAATAATraesCS5B01G306000-FOff-targetdetectedGTCGAGGTGAACGAGGAAGGTraesCS5B01G306000-ROff-targetdetectedAAGAAGGCAAACGGATGGTCTraesCS2D01G566100LC-FOff-targetdetectedTTACCGTCGCTTTGCTGAATraesCS2D01G566100LC-ROff-targetdetectedGCCGCTGTCCACGTTATTTTraesCS4D01G115200LC-FOff-targetdetectedTACATTGACTTCCTTGGCTTTCTraesCS4D01G115200LC-ROff-targetdetectedCGGTGGGTATGGTCTTTGATraesCS6B01G516800LC-FOff-targetdetectedTTCCAGAAGGCTATGCTCTraesCS6B01G516800LC-ROff-targetdetectedACCTCCAGGAATGTCAAGTraesCS1B01G224400LC-FOff-targetdetectedGCTGAGAAATCTACCCAACTTraesCS1B01G224400LC-ROff-targetdetectedAAGAAATCCGCACCATAATraesCS7D01G616100LC-FOff-targetdetectedGGTGCTGTTTCCCTATCATraesCS7D01G616100LC-ROff-targetdetectedTTCCGACTTCTGGTTTCA 附录121TraesCS7B01G475500-FOff-targetdetectedTATCTTGCTTGAAATAGGGAGGTraesCS7B01G475500-ROff-targetdetectedTCGTGGTGGTCCGAGTTTTraesCS2B01G398100-FOff-targetdetectedCTGCTTCAGGGATATTCTGGTraesCS2B01G398100-ROff-targetdetectedGATGGTGCCTCTAAGTGGTAGTraesCS2D01G134000-FOff-targetdetectedGGAGCGACAATGTTGACTGTraesCS2D01G134000-ROff-targetdetectedCATGGAAAGCCCAAACTTATTraesCS6A01G342600LC-FOff-targetdetectedTCGCATCTTACTTGCCTATTraesCS6A01G342600LC-ROff-targetdetectedTTCCTCCTCTATTTCACCATPs10640-FOff-targetdetectedTCGTCATCTGATCCAGTACTCATCPs10640-ROff-targetdetectedGCGGATCATCTGACGGATCPs06503-FOff-targetdetectedACCTCACAAAGAGAATGATTTTGACPs06503-ROff-targetdetectedATGCCTAGGTTCTGTCGTAGATCTPs14412-FOff-targetdetectedACTCCCCTGGCTCAGCGAPs14412-ROff-targetdetectedTTGAAGACGTCTCTCAAGGTCAAGTPs25876-FOff-targetdetectedTGATAAGGTTTTAGGTTCGGATTATPs25876-ROff-targetdetectedTGGTCCCGTATTCACTTCAGGPs14448-FOff-targetdetectedTGGATGTAGCTGGTGCAGATACTPs14448-ROff-targetdetectedTCTTTGTGTATTAAGTCATCCCCATPs26795-FOff-targetdetectedTACGAGAGATAGTCGATCGAATCCPs26795-ROff-targetdetectedTTCACAAGTCCACAATCTAAGTGACPs06316-FOff-targetdetectedTTGGCAGTTCTGTCTCGCPs06316-ROff-targetdetectedTGTCCTCCGTTCCATCCCPs03807-FOff-targetdetectedATGGAACCCAAATACTATTACCPs03807-ROff-targetdetectedGGCTGGCTTACGAACTCTPs19738-FOff-targetdetectedCCCTCACCTGTTCCGGCTAPs19738-ROff-targetdetectedATTGCACCGTTGCCAATGPs15856-FOff-targetdetectedACGATTCATCCTCCCAAACPs15856-ROff-targetdetectedCATCAGGCTGCCACATTAPs23282-FOff-targetdetectedCTTCTAAGCCGAGGACTGPs23282-ROff-targetdetectedAGGAATGGAGGGAGGATAPs25400-FOff-targetdetectedCTACATCGCCAAGCGATACACAPs25400-ROff-targetdetectedATAGGGGCCTGGCGTCGPs15351-FHomologdetectedTCAGTCAATCCCTTCTTCPs15351-RHomologdetectedGCTCAGTATCAAAGCCACPs15103-FHomologdetectedTGTGGGAAGAATGTAAGGGPs15103-RHomologdetectedGCAAGCGTCTGAGATGACTPs17637-FHomologdetectedCTGCACGATCACCAGTCCPs17637-RHomologdetectedTTAGCCAGTCGGTTTCCTPs15581-FHomologdetectedATGAGTGAGACGGTGATCPs15581-RHomologdetectedAAGTAAGCCGATAGAAGG 122小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用Ps02131-FHomologdetectedTAGCCATCGTCCTCATCCPs02131-RHomologdetectedATCCTTCCGCTTAGTCATPs20537-FHomologdetectedTCCTAATCCTTCCCTACAPs20537-RHomologdetectedAACTGATTCGGCTACTTTPs01161-FHomologdetectedGCGAAGCCCGATGAGACAPs01161-RHomologdetectedCGAGGGTGATTGCGATGCPs06134-FHomologdetectedGGACGCAAGTGCTATCGGPs06134-RHomologdetectedAGGTTGGAAGGCTTCAGGPs06471-FHomologdetectedCGTCAAGCCGAAACCAACPs06471-RHomologdetectedAAGCACCCTCGCCAATAAPs15431-FHomologdetectedCTTCACTCAGCCGCCGTACPs15431-RHomologdetectedGACCGAGCCAATCCGAAAPs11488-FHomologdetectedCTTTAGCACAAGCCAATAPs11488-RHomologdetectedCTCAGCAAGAATACACCCPs00512-FHomologdetectedAGCGAAGCTCTAGCTCACPs00512-RHomologdetectedCCAAGTATCAACGGGTAA 致谢123致谢在毕业论文即将完成之际，我首先要感谢我的导师——西北农林科技大学康振生教授和郭军教授在这7年中给予的悉心指导和关怀。感谢康老师为我们提供的良好的学习工作的平台。康老师严谨的学风、高瞻远瞩的预见性、无私奉献的精神、伟大的人格魅力都一直激励着我在求学的路上奋勇前进。感谢郭老师对论文和课题的指导，本课题的每一处细节都经过了郭老师的指导、核查、确认。郭老师的学识和严谨的治学态度给我留下了深刻的印象，对我以后的工作和生活将起到极大地推动作用。再次对康老师和郭老师表示由衷的谢意！衷心感谢詹刚明老师、魏国荣老师和陈银潮老师在温室育苗、条锈菌繁殖及接种过程中给予的无私帮助；感谢韩青梅老师、韩德俊老师、赵晶老师、赵杰老师、黄雪玲老师、张新梅老师、刘杰老师、周新力老师、王晓静老师、裴国亮老师、王建锋老师、王晨芳老师、许金荣老师、刘慧泉老师以及庄华老师在试验开展过程中给予的诸多帮助和便利；感谢实验室师兄师姐：段迎辉、杨宇衡、汤春蕾、段小圆、傅艳萍、王琪琳、曾庆东、郝影宾、成玉林、王冰、冯浩、刘敏捷、王志艳、王龙、罗坤等；师弟师妹杨倩、怀宝玉、王宁、何付新、张阳、宋平、郭嘉、谭成龙、兰定云、马薇、褚秀玲等及同级同学黄传明、秦娟、刘芃、戚拓、吴建辉、常青、赵梦鑫、吴宽等；也特别感谢兄弟实验室各位同学：张世杰、王光辉、郑大伟、陈旺、李朝辉、曹淑琳、张慧丽、张艺美、胡帅等对我的慷慨帮助。同时，感谢中科院周金秋教授和朱建康教授在实验技术上对我无私的指导和帮助。还要感谢我的家人，感谢你们的默默陪伴、鼓励与支持。父母在生活中给予我细心周到的照顾，是我专心学业的坚强后盾；爱人在试验与论文撰写中伸出的援助之手，是我试验顺利、论文发表的有力保障。最后，感谢西北农林科技大学，感谢小麦锈病课题组为我提供优越的学习和生活环境，这不仅让我度过了人生中最美好的大学时光，更让我学到了许多非常有用的宝贵知识。最后我要特别特别感谢一直以来默默支持、鼓励和关心我的家人，在我遇到困难和挫折的时候是家人给予了我最强大的支持、鼓励和理解。我最亲爱的家人的支持和鼓励是我一直以来努力奋斗的无限源泉和动力。朱晓果2017年9月于杨凌 124小麦条锈菌MAPK信号通路介导的致病机理及其在抗锈育种中的应用个人简介朱晓果，女，汉族，1990年2月出生于河南平顶山市，中共党员。2007年09月－2011年07月：西北农林科技大学植物保护专业学习，获得农学学士学位。2011年09月－2017年12月：攻读西北农林科技大学植物保护学院植物病理学专业硕博连读研究生，研究方向为植物免疫学。在读期间发表论文：1.XiaoguoZhu,WeiLiu,XiulingChu,QixiongSun,ChenglongTan,QianYang,MinJiao,JunGuoandZhenshengKang.(2017)ThetranscriptionfactorPstSTE12isrequiredforvirulenceofPucciniastriiformisf.sp.tritici.MolecularPlantPathology.doi:10.1111/mpp.12582（IF=4.697）2.Xiao-guoZhu,TuoQi,QianYang,Fu-xinHe,Cheng-longTan,WeiMa,Zhen-shengKang*,andJunGuo*.(2017)Host-inducedgenesilencingoftheMAPKKgenePsFUZ7confersstableresistancetowheatstriperust.PlantPhysiology.pp.01223.(IF=6.456)3.XiaoguoZhu,MinJiao,JiaGuo,PengLiu,QianYang,YangZhang,ZhenshengKangandJunGuo.(2017)Roleofarustfungi-specificMADS-boxtranscriptionfactorMCM1inPucciniastriiformisf.sp.tritici.EnvironmentalMicrobiology.(Unpublished,IF=5.395)4.XiaoguoZhu,FuxinHe,YangZhang,ChenglongTan,QianYang,ChuanmingHuang,JunGuo*andZhenshengKang*(2017)Host-inducedgenesilencingofstriperustfungimitogen-activatedproteinkinasekinasekinasePsKPP4generesultinginreducedhyphaedevelopmentandvirulence.EnvironmentalMicrobiology.(Unpublished,IF=5.395)5.TuoQi,XiaoguoZhu,ChenlongTan,PengLiu,JiaGuo,ZhenshengKang,JunGuo.(2017)Host-inducedgenesilencingofanimportantpathogenicityfactorPsCPK1inPucciniastriiformisf.sp.triticienhancesresistanceofwheattostriperust.PlantBiotechnologyJournal.(IF=7.443)