一种新型抗糖尿病药物对链脲菌素诱导的AD动物模型认知障碍以及病理变化的神经保护作用研究

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分类号：R338学校代码：10114密级：学号：041410085硕士学位论文一种新型抗糖尿病药物对链脲菌素诱导的AD动物模型认知障碍以及病理变化的神经保护作用研究Theneuroprotectiveeffectsofanovelantidiabeticdrugoncognitiveimpairmentsandpathologyinstreptozotocin-inducedAlzheimerratmodel研究生：史丽娟指导教师：李琳教授专业名称：生理学研究方向：神经退行性疾病的防治学位类型：学术学位所在学院：基础医学院中国山西二〇一七年六月二十九日 分类号：R338学校代码：10114密级：学号：041410085一种新型抗糖尿病药物对链脲菌素诱导的AD动物模型认知障碍以及病理变化的神经保护作用研究Theneuroprotectiveeffectsofanovelantidiabeticdrugoncognitiveimpairmentsandpathologyinstreptozotocin-inducedAlzheimerratmodel研究生：史丽娟指导教师：李琳教授专业名称：生理学研究方向：神经退行性疾病的防治学位类型：学术学位所在学院：基础医学院中国山西二〇一七年六月二十九日 学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师李琳指导下，本人独立完成的研究成果。文中任何引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果：1、交回学校授予的学位证书；2、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；3、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉；4、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：日期：年月日指导教师签名：日期：年月日（本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用） 目录摘要....................................................................................................................................IABSTRACT........................................................................................................................III常用缩写词中英文对照表.................................................................................................VI前言....................................................................................................................................1第一部分DA-JC4改善STZ诱导的学习记忆伤害............................................................31材料与方法.........................................................................................................................31.1实验动物与分组..........................................................................................................31.2主要试剂......................................................................................................................31.3主要仪器......................................................................................................................31.4药物管理......................................................................................................................41.5立体定位手术..............................................................................................................41.6实验方法......................................................................................................................41.6.1Y迷宫.......................................................................................................................41.6.2Morris水迷宫............................................................................................................41.7统计分析......................................................................................................................52结果..................................................................................................................................62.1DA-JC4可逆转大鼠的工作记忆损伤........................................................................62.2DA-JC4可逆转大鼠的空间学习记忆损伤................................................................63讨论................................................................................................................................104结论................................................................................................................................12 第二部分DA-JC4降低脑内TAU蛋白磷酸化................................................................131材料与方法.......................................................................................................................131.1主要试剂....................................................................................................................131.2主要仪器....................................................................................................................131.3实验方法....................................................................................................................131.4统计分析....................................................................................................................142结果................................................................................................................................153讨论................................................................................................................................164结论................................................................................................................................20第三部分DA-JC4减轻STZ诱导的慢性炎症反应........................................................211材料与方法.......................................................................................................................211.1主要试剂....................................................................................................................211.2主要仪器....................................................................................................................211.3实验方法....................................................................................................................211.4统计分析....................................................................................................................222结果................................................................................................................................232.1DA-JC4有助于减少GFAP阳性星形胶质细胞数量..............................................232.1DA-JC4有助于减少IBA1阳性小胶质细胞数量...................................................253讨论................................................................................................................................294结论................................................................................................................................30第四部分DA-JC4部分逆转STZ诱导的凋亡信号的增强............................................31 1材料与方法.......................................................................................................................311.1主要试剂....................................................................................................................311.2所需配制溶液............................................................................................................311.3主要仪器....................................................................................................................321.4实验方法....................................................................................................................321.5统计分析....................................................................................................................342结果................................................................................................................................353讨论................................................................................................................................374结论................................................................................................................................38第五部分DA-JC4促使脑内胰岛素信号通路再度活化..................................................391材料与方法.......................................................................................................................391.1主要试剂....................................................................................................................391.2所需配制溶液............................................................................................................391.3主要仪器....................................................................................................................391.4实验方法....................................................................................................................391.5统计分析....................................................................................................................402结果................................................................................................................................413讨论................................................................................................................................444结论................................................................................................................................45参考文献..............................................................................................................................46综述......................................................................................................................................52 致谢....................................................................................................................................64个人简历..............................................................................................................................65 山西医科大学硕士学位论文一种新型抗糖尿病药物对链脲菌素诱导的AD动物模型认知障碍以及病理变化的神经保护作用研究摘要目的：探究新型GLP-1/GIP双受体激动剂DA-JC4是否能够改善STZ诱导的阿尔兹海默大鼠模型的工作以及空间学习记忆能力的伤害，是否能缓解tau蛋白的高度磷酸化，是否具有抗凋亡和抗炎症作用，并进一步探讨了DA-JC4的神经保护机制是否与脑内胰岛素信号通路相关。方法：1.大鼠被随机分为四组，1)对照组：侧脑室注射人工脑脊液+腹腔注射生理盐水；2)DA-JC4组：侧脑室注射人工脑脊液+腹腔注射DA-JC4；3)STZ组：侧脑室注射STZ+腹腔注射生理盐水；4)STZ+DA-JC4组：侧脑室注射STZ+腹腔注射DA-JC4。脑部手术第二天起，每天腹腔注射10nmol/kgDA-JC4，连续2周，随后通过Y迷宫和Morris水迷宫分别检测各组大鼠的工作工作以及空间学习记忆能力。2.采用免疫组织化学技术，观察了各组大鼠脑内的tau蛋白磷酸化水平以及GFAP阳性星型胶质细胞和IBA1阳性小胶质细胞数量变化。3.采用免疫印记法，检测了各组大鼠脑内皮层海马部位的凋亡相关分子，如BAX和Bcl-2的蛋白表达水平，以及胰岛素信号转导通路的相关分子，如IRS1和Akt的蛋白表达水平。结果：1.Y迷宫以及Morris水迷宫实验结果显示：与对照组相比，侧脑室注射STZ大鼠的自发交替行为、空间探索行为等记忆行为评分显著降低，治疗组给予DA-JC4后大鼠的记忆行为评分明显得到改善。I 山西医科大学硕士学位论文2.STZ组大鼠脑内皮层海马部位的tau蛋白磷酸化水平明显高于对照组。经DA-JC4治疗后，STZ+DA-JC4组大鼠脑内的tau蛋白磷酸化水平明显低于STZ组。3.STZ组大鼠脑内皮层海马部位的GFAP阳性星型胶质细胞和IBA1阳性小胶质细胞数量明显高于对照组。经DA-JC4治疗后，STZ+DA-JC4组大鼠脑内的GFAP阳性星型胶质细胞和IBA1阳性小胶质细胞数量明显低于STZ组。4.STZ组大鼠脑内皮层海马部位的促凋亡因子BAX与抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达水平比例明显高于对照组。经DA-JC4治疗后，STZ+DA-JC4组大鼠脑内的促凋亡因子BAX与抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达水平比例明显低于STZ组。5.STZ组大鼠脑内皮层海马部位的p-IRS1(Ser1101)蛋白表达水平明显高于对照组，p-Akt(Ser473)蛋白表达水平明显低于对照组。经DA-JC4治疗后，STZ+DA-JC4组大鼠脑内的p-IRS1(Ser1101)和p-Akt(Ser473)蛋白表达水平被部分逆转。结论：1.DA-JC4能显著改善STZ诱导的工作以及空间学习记忆能力的伤害，部分逆转认知下降。2.DA-JC4可明显降低脑内tau蛋白磷酸化水平，避免其进一步高度磷酸化，进而延缓AD病理特征-神经缠结的形成。3.DA-JC4能减少脑内GFAP阳性星型胶质细胞和IBA1阳性小胶质细胞数量，以此减轻STZ诱导的慢性炎症反应。4.DA-JC4通过调节促凋亡因子BAX与抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达，抑制STZ诱发的神经元凋亡。5.DA-JC4能下调p-IRS1蛋白表达水平，上调p-Akt蛋白表达水平，促使脑内胰岛素信号通路再次活化。关键词：阿尔兹海默病；二型糖尿病；肠促胰岛素；Tau磷酸化；炎症；凋亡；胰岛素信号通路II 山西医科大学硕士学位论文Theneuroprotectiveeffectsofanovelantidiabeticdrugoncognitiveimpairmentsandpathologyinstreptozotocin-inducedAlzheimerratmodelAbstractObjective:ToexplorewhetherDA-JC4,anewGLP-1/GIPdoubleagonists,couldeffectivelyamelioratetheimpairmentofworkingmemoryandspatiallearningandmemoryabilityinstreptozotocin-inducedAlzheimerratmodel,reducetauphosphorylation,decreaseinflammationandapoptosis.Inaddition,wefurtherinvestigatedtherelationbetweenneuroprotectivemechanismofDA-JC4andbraininsulinsignalingpathway.Methods:1.Ratswererandomlydividedintofourgroups:1)Controlgroup:artificialcerebralspinalfluid(aCSF)intra-cerebralventricular(ICV)injectionplussalineintraperitoneal(IP)injection;2)DA-JC4:aCSFICVinjectionplusdualagonistsIPinjection;3)STZgroup:STZICVinjectionplussalineIPinjection;4)STZ+DA-JC4group:STZICVinjectionplusdualagonistIPinjection.EachratwastreatmentwithDA-JC4(10nmol/kgip.)orsalineonce-dailyfor2weeksafterSTZintracerebroventricular(ICV)administration.AndbehavioreffectsofDA-JC4weretestedbyY-mazeandMorriswatermaze.2.ImmunohistochemistrywasusedtoobservethelevelsoftauphosphorylationandthenumbersofGFAP-positiveastrocytesandIBA1-positivemicrogliainthebrain3.Proteinexpressionlevelsofapoptosis-relatedmolecules,suchasBAXandBcl-2,andinsulinsignalingpathway-relatedmolecules,suchasIRS1andAkt,werequantifiedbyWesternblot.III 山西医科大学硕士学位论文Results:1.Y-mazeandMorriswatermazeshowedthatratsreceivingSTZICVinjectionalonehavesignificantlowermemorybehaviorscoresinspontaneousalternationandspaceexplorationthancontrolgroup.ComparedwithSTZgroup,DA-JC4couldstatisticallyimprovememorydeficit.2.Comparedwithcontrolgroup,STZincreasedthelevelsoftauphosphorylationinthecortexandhippocampus.ThischangewasreversedbytreatmentwithDA-JC4.3.Comparedwithcontrolgroup,STZincreasedthenumberofGFAP-positiveastrocytesandIBA1-positivemicrogliainthecortexandhippocampus.ThenumberofthesepositiveneurogliacellsintreatmentgroupweresignificantlylowerthanSTZgroup.4.Comparedwithcontrolgroup,STZcouldincreasedtheratioofpro-apoptoticBAXtoanti-apoptoticBcl-2proteinexpressionlevels.ThisratiointhecortexandhippocampuswaspartlyreversedafterDA-JC4treatment.5.Comparedwithcontrolgroup,STZtreatmentelevatedIRS1(pSer1101)butsuppressedAkt(pSer473).However,DA-JC4effectivelyattenuatedtheSTZ-inducedthesechange.Conclusion：1.DA-JC4treatmentcouldeffectivelyalleviatetheimpairmentofmultiplelearningandmemoryabilityinducedbySTZandpartlyreversedthedeclineofcognitive.2.DA-JC4couldreducetauphosphorylationinthebrainoftheAlzheimericv.STZratmodeltoavoiditshighlyphosphorylationanddelaytheformationofnervetangles.3.DA-JC4couldsignificantlyreducethenumberofGFAP-positiveastrocytesandIBA1-positivemicrogliainthebrainandfurtherrelievethechronicinflammationinducedbySTZ.4.DA-JC4wouldperformanti-apoptoticeffectsinthecortexandhippocampusbywhichregulatewiththeproteinexpressionofpro-apoptoticBAXandanti-apoptoticBcl-IV 山西医科大学硕士学位论文2toinhibitSTZ-inducedneuronalapoptosis.5.DA-JC4woulddown-regulatep-IRS1andup-regulatep-Akt,whichsupportstheneuroprotectiveeffectofDA-JC4againstSTZ-inducedbraininsulinresistance.Keywords:Alzheimer’sdisease;Type2diabetesmellitus;Incretin;tauphosphorylation;Inflammation;Apoptosis;InsulinsignalingV 山西医科大学硕士学位论文常用缩写词中英文对照表英文缩写英文名称中文名称ADAlzheimer’Disease阿尔兹海默病T2DMTypeIIDiabetesMellitus二型糖尿病PDParkinson'sDisease帕金森病GLP-1Glucagon-likepeptide1胰高血糖素样肽1glucoseGIP葡萄糖依赖性胰岛素分泌多肽dependentinsulinotropicpolypeptideSTZstreptozocin链脲菌素GFAPglialfibrillaryacidicportein胶质纤维酸性蛋白ionizedcalcium-bindingadapterIBA1离子钙接头蛋白molecule1DABdiaminobenzidine二氨基联苯胺PHFsPairedHelicalFilaments双螺旋丝phosphorylated-insulinReceptorp-IRS1磷酸化的胰岛素受体底物1Substrate1P-Aktphosphorylated-proteinkinaseB磷酸化的丝苏氨酸蛋白激酶VI 山西医科大学硕士学位论文前言阿尔兹海默病(Alzheimer’Disease,AD)是一种最普遍的神经退行性疾病。随着工业化国家的公民寿命逐渐变长，据估计，2050年全世界的痴呆患者人数可能达到1亿3150万。阿尔兹海默病的典型病理特征包括tau蛋白高度磷酸化形成的神经缠结以及淀粉样蛋白的不断积累，并且由脑内很多区域的神经元损失造成不断的记忆丧失以及认知下降[1-3]。目前为止，阿尔兹海默病的药物治疗备受限制，主要有3种胆碱酯酶抑制剂以及受体抑制剂美金刚胺，但这些药物都不能从根本上阻止或延迟疾病的恶化[4-7]。越来越多的证据表明，二型糖尿病（TypeIIDiabetesMellitus,T2DM）是阿尔兹海默病的诱因之一[8-10]。二型糖尿病患者有学习记忆障碍[11]，比正常人增加了几乎2倍的概率形成阿尔兹海默病[8,12]。同样的，阿尔兹海默病与二型糖尿病有很多共同的病理特征，其中包括：胰岛素抵抗、炎症反应、淀粉样蛋白积累[13]。根据这些共同的病理特征，胰岛素抵抗是一种关键的潜在机制[12,14,15]。肠促胰岛素是一类用于治疗二型糖尿病的药物，包括胰高血糖素样肽1（Glucagon-likepeptide1,GLP-1）和葡萄糖依赖性胰岛素分泌多肽（glucosedependentinsulinotropicpolypeptide,GIP）。鉴于二型糖尿病与阿尔兹海默病之间的密切关系，科研工作者尝试将肠促胰岛素药物用于治疗阿尔兹海默病。大量的临床前研究表明，肠促胰岛素类药物能改善阿尔兹海默病带来的记忆力减退，神经元减少以及老年斑的形成[16-19]，减少τ蛋白的高度磷酸化[20-23]，激发抗炎反应[24-26]，减少神经元的凋亡[22,27,28]。一项针对检测GLP-1类似物利拉鲁肽对阿尔兹海默病患者疗效的先导性研究中显示，这些患者的FDG-PEF脑部扫描图呈现出了改善的状态[29]。GLP-1/GIP双受体激动剂已经在糖尿病患者中首次显示出了阳性结果[30]。我们已经在MPTP小鼠模型中检测了一种命名为DA-JC1的双受体激动剂并取得了可喜的成果[31][32]。本课题中，我们检测了更新的双受体激动剂DA-JC4。这种新药经过优化之后能更好的进入血脑屏障。本次试验选用的模型是侧脑室注射链脲菌素(Streptozocin,STZ)诱导的阿尔兹海默大鼠模型。STZ可使脑内的胰岛素信号通路受到抑制[33,34]并产生出一系列与阿尔兹海默病相一致的病理特征[13,35,36]，如认知功能障碍[21,37-39]，脑内的慢性炎症激活[40]，tau蛋白的磷酸化水平增加[22,41]。我们采用这1 山西医科大学硕士学位论文种散发型AD动物模型模型检测了该新药DA-JC4的疗效，从认知功能，tau蛋白的磷酸化，慢性炎症，胰岛素信号通路，生长因子以及凋亡细胞信号方面对其进行了评价。2 山西医科大学硕士学位论文第一部分DA-JC4改善STZ诱导的学习记忆伤害阿尔兹海默病，又名老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病。其主要表现为渐进性记忆障碍以及认知功能障碍等。逐渐发生记忆障碍或遗忘是AD的首发症状。随着病情的加重，认知障碍愈发明显。大量研究表明，GLP-1以及GIP类似物可分别显著改善很多老鼠AD模型的认知功能障碍[16-19,23,25,42,43]，鉴于此，本部分检测了新型双手体激动剂DA-JC4对AD动物模型认知功能障碍的作用。本试验采用侧脑室注射STZ诱导的散发型阿尔兹海默大鼠模型，通过Y迷宫以及Morris水迷宫行为学方法，探究DA-JC4对模型鼠认知障碍的影响。1材料与方法1.1实验动物与分组实验动物：雄性SD大鼠（210-230g）从山西医科大学动物中心获得。大鼠被安置在塑料笼中，每5只一笼。保持室内温度在25±2◦C，湿度为50±10%和12h的光暗周期。大鼠可随意接近水和食物。动物分组：大鼠被随机分为四组，1)对照组：侧脑室注射人工脑脊液+腹腔注射生理盐水；2)DA-JC4组：侧脑室注射人工脑脊液+腹腔注射DA-JC4；3)STZ组：侧脑室注射STZ+腹腔注射生理盐水；4)STZ+DA-JC4组：侧脑室注射STZ+腹腔注射DA-JC4。1.2主要试剂1)STZsigma2）DA-JC4上海强耀1.3主要仪器1)微量注射器汉密尔顿2）立体定位仪瑞沃德3）微量注射泵瑞沃德3 山西医科大学硕士学位论文1.4药物管理STZ组大鼠侧脑室注射STZ的剂量是3mg/kg体重，将所需STZ溶到人工脑脊液中。假手术组的大鼠直接受同等体积的人工脑脊液。大鼠经过立体定位手术之后，连续两周腹腔注射DA-JC4（10nmol/kg体重）或生理盐水。人工脑脊液的配方：NaCl140mM;KCl3.0mM;CaCl22.5mM;MgCl21.2mM;NaH2PO41.2mM,PH7.4。1.5立体定位手术[44]我们依据先前的实验过程。术前，通过腹腔注射水合氯醛（0.3ml/100g体重）将大鼠麻醉。将大鼠固定在立体定位仪之后，找准左侧脑室的位置（前囟后0.8mm;矢状缝侧1.5mm;深3.6mm）进行侧脑室注射药物。通过10微升的汉密尔顿微量注射器将STZ注射到大鼠侧脑室，历时15分钟。注射完毕后，为避免注射药物溢出，将针头留在原位置保持10分钟。假手术组的大鼠依据上述同样的操作侧脑室注射同等体积的人工脑脊液。术后，将大鼠单笼饲养。1.6实验方法1.6.1Y迷宫药物处理之后，空间工作记忆通过Y迷宫中大鼠的自发交替行为进行了评价[45]。Y迷宫包含3个臂（50×10×20cm3，各臂夹角120°）。大鼠随机放在一个臂的末端并容许其自由活动8分钟。当大鼠的尾巴完全进入某个臂当中，我们则认为其属于真正意义的进入。每次测试之后，装置用10%乙醇溶液喷洒并用纸巾擦净。我们记录了总共进臂次数（N）和先后进臂顺序。交替行为是指，大鼠连续进入三个不同臂，即完成了一次交替行为。交替率（%）=总共的交替次数/(N-2)*100。1.6.2Morris水迷宫次日，大鼠进行了Morris水迷宫测试，用以评价其空间学习记忆能力[46]。Morris水迷宫装置中有一个直径150厘米高60厘米的黑色圆状水箱。水池周围用蓝色帘包围并加入30cm深的自来水，水温控制在28±1◦C。直径14厘米的透明平台放置在目标象限的中央并潜入水下1.5cm.大鼠在水池中的运动情况由水池上方的摄像头捕捉。大鼠面对池壁随机放入一个象限当中，并容许其自由发现隐匿平台。第4 山西医科大学硕士学位论文一天若大鼠未在120s内发现平台，我们将其引导找到平台并独自待15s。连续5天的潜伏期由动物行为软件系统（Ethovision11.5,信息技术公司，瓦赫宁根，荷兰）进行了记录，潜伏期即抵达平台的时间。为了排除大鼠运动能力的影响，我们也分析了其运动速度。第六天，移出平台并进行空间探索试验。在该试验中，我们记录了大鼠在目标象限中待的时间（n=8-10只）。1.7统计分析实验数据表示为平均数±标准误。应用GraphPadPrism5(Graph-PadsoftwareInc.,SanDiego,CA,USA)进行统计分析。当P<0.05时，我们认为具有统计学意义。水迷宫的认知试验结果采用双因素方差分析进行统计分析。Y迷宫的交替行为、水迷宫的探索试验和大鼠的游泳速度结果采用单因素方差分析和Student-Newman-Keulspost-hoc试验进行分析。5 山西医科大学硕士学位论文2结果2.1DA-JC4可逆转大鼠的工作记忆损伤在Y迷宫实验中各组大鼠均存在总体差异（单因素方差分析，F=3.931,P<0.05）。如图1-1所示，模型组大鼠（0.4708±0.04312）的自发交替行为明显比正常组(0.6811±0.03200)下降(P<0.05)。DA-JC4组的正确进臂率为67.22%±4.17%，与control组的正确进臂率之间没有统计学意义(P>0.05),表明DA-JC4对大鼠的工作记忆能力没有影响。但经过DA-JC4的治疗(0.6283±0.06798)之后，部分逆转了STZ诱导的工作记忆损伤(P<0.05)。图1-1：DA-JC4可逆转大鼠的工作记忆损伤Fig1-1:SpontaneousalternationbehaviorwassignificantlydecreasedintheSTZgroupcomparedwiththecontrolgroup(comparedwithcontrols,*P<0.05),andDA-JC4treatmentpreventedtheSTZ-inducedlearningdeficit(comparedwithSTZgroup,#P<0.05).2.2DA-JC4可逆转大鼠的空间学习记忆损伤在Morris水迷宫实验中，大鼠给予了为期5天的学习训练，期间的潜伏期逐渐缩短。但直到第四天，各组之间没有显著差异(图1-2.B)。依据双因素方差分析，6 山西医科大学硕士学位论文DA-JC4的治疗效果就逃避期而言有意义(F=15.20,P<0.0001)，组别和时间之间无明显的交互作用(F=0.5319,P=0.8918)。从第二天开始，STZ组大鼠(48.61±2.056)的潜伏期比对照组(36.67±1.548)明显增加，两组开始出现差异(F=6.459,P<0.01)。对照组和STZ组大鼠在第四天(F=9.438,P<0.001,22.81±1.498vs39.65±2.793)和第五天(F=3.618,P<0.05,20.02±1.387vs26.43±2.086)存在明显的差异。同时，STZ组和治疗组大鼠(30.65±3.372,21.91±1.243)的潜伏期明显变短。DA-JC4组的在第四天和第五天的潜伏期分别是：23.68±1.838，20.06±1.480。DA-JC4组与control组两组之间大鼠的潜伏期无统计学意义(P>0.05)。学习训练结束后第6天，大鼠进行了探索实验以检测其的空间记忆能力。图1-2.C显示出了探索试验中大鼠在目标象限所探索的时间比例。经单因素方差分析得出，各组大鼠之间存在显著差异(F=7.818,P<0.001)。与逃避期相反，STZ组大鼠(0.2800±0.01630)的空间记忆能力明显比对照组(0.4217±0.01696)差(P<0.001)。治疗组(0.3920±0.02713)的表现要优于模型组(P<0.01)。DA-JC4组(0.4098±0.02511)的表现与control组无明显差别(P>0.05)。另外，为排除大鼠的运动速度对水迷宫实验的影响，我们同时记录了大鼠的运动速度，经统计分析得出，各组大鼠间无显著差异(F=1.151,P=0.3422)。7 山西医科大学硕士学位论文8 山西医科大学硕士学位论文图1-2:DA-JC4改善STZ诱导的空间学习记忆损伤Fig1-2:B.EscapelatencywassignificantlyincreasedintheSTZgroupcomparedtothecontrolgrouponday2,4,5(comparedwithcontrol,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001),andDA-JC4treatmentpartiallyattenuatedtheimpairmentinducedbySTZ.C.STZtreatmentsignificantlydecreasedthepercentoftimeeachratspentinthetargetquadrant(P<0.001),andDA-JC4treatmentavailablypreventedtheSTZ-inducedmemorydeficit(P<0.01).D.Swimspeeddidnotdifferbetweengroups.E.Sampletracksintheprobetest.9 山西医科大学硕士学位论文3讨论AD作为一种常见的慢性进展性神经系统退行性疾病，以进行性认知障碍和记忆能力损伤为主要临床表现。至今，其发病机制仍尚不明确。由于患者起病隐袭，精神改变隐匿，早期不易被家人觉察，往往因此错过了最佳治疗时期。轻度认知障碍（MCI）期，是患者形成AD之前的过渡期，患者出现了轻度的认知功能障碍并影响其日常生活。理想状态下，患者能在MCI期得到有效治疗，防止病情的进一步恶化。用胰岛素治疗AD，能显著改善认知和注意力，降低AD的生物标记水平，使脑能量利用率正常化[47-50]。鼻腔注射胰岛素可改善非糖尿病患者注意力以及记忆的形成[49,51]。AD患者的二期临床试验阶段同样表明，鼻腔注射糖尿病能改善轻度认知障碍。通过18F-脱氧葡萄糖正电子发射层析扫描（18F-FDG-PET）技术测量脑内活动以及能量利用率，表明此法还能维持正常脑脊液中淀粉样蛋白1-40/1-42的比例，增加脑活动，改善意识的形成[52,53]。但是，此法仍存在相应的弊端，研究者推测：胰岛素给药可能使脑内的胰岛素脱敏状况更为严重，认知状况进一步恶化[53]。GLP-1是一种高血糖素家族的一种生长因子，与胰岛素很相似[30]。这类药物不会直接影响血糖水平，对于非糖尿病患者也很安全[43]。鉴于此类药物在临床实验阶段的良好药效记录[44]，科研界已经广泛认可这类药物。在一些表达淀粉样前体蛋白以及早老素1的双转AD老鼠模型中，GLP-1类似物利拉鲁肽以及利西拉来具有显著的神经保护作用。连续8周每天1次注射能减少记忆的丧失，突触的减少，脑内突触的传递,慢性炎症以及淀粉样斑块减少[18,25]。在加速衰老的SAMP8老鼠模型中，利拉鲁肽也有效具有神经保护作用，显著改善记忆的形成以及神经元的缺失[23,42]。GLP-1类似物艾塞纳肽4（exenatide,ByettaandBydureon）改善三转AD老鼠症状，其中包括认知下降[19]。GLP-1的姐妹激素GIP对APP/PS-1转基因AD小鼠模型疗效显著[16,17,43]。鉴于上述GLP-1以及GIP对AD动物模型的认知功能的改善，我们对本实验采用的双手体激动剂DA-JC4予以更高的期望。在本实验中，我们采用了一种AD早期动物模型，即侧脑室注射STZ诱发的动物模型。这种AD早期模型与AD患者很相似[36]，脑内出现胰岛素抵抗状态[33]，能比较稳定的模拟出AD的早期症状，其中包括认知障碍[39]，神经炎症[40]，tau蛋白易10 山西医科大学硕士学位论文高度磷酸化[41]等。本课题进行了Y迷宫实验，用于检测大鼠的空间识别记忆能力，该迷宫利用了啮齿动物对新异环境的自然习性，不需要动物学习任何规则来趋利避害，能有效的反应出动物对新异环境的识别记忆能力。图1-1结果显示，STZ组大鼠的自发交替行为明显受到影响，再次验证了侧脑室注射STZ可对大鼠的记忆能力产生影响。经过DA-JC4处理，部分逆转了STZ诱导的记忆能力的伤害。同时，我们还对大鼠进行了Morris水迷宫检测。Morris水迷宫是一种强迫大鼠游泳，学习寻找在水中平台的一种实验，主要用于测试大鼠对空间定位的学习记忆能力，结果与Y迷宫相一致。再次说明了DA-JC4能改善由糖尿病因素诱导的AD大鼠认知功能障碍。总之，我们的研究从行为学的角度探究出了DA-JC4能改善大鼠的工作以及空间学习记忆。侧脑室注射STZ诱导的AD大鼠模型已经发展成了一种相对稳定的，已被科研界公认的发散性AD动物模型。本部分的实验证据有力地证明了DA-JC4可能成为改善认知损伤的一种新型治疗策略。11 山西医科大学硕士学位论文4结论侧脑室注射STZ明显对大鼠的工作记忆能力和空间学习记忆能力构成威胁，导致大鼠认知功能障碍。而腹腔注射DA-JC4治疗有助于改善STZ诱导的空间记忆损伤并对正常大鼠的自发交替行为以及空间学习记忆能力没有副作用。12 山西医科大学硕士学位论文第二部分DA-JC4降低脑内tau蛋白磷酸化AD的典型病理特征包括tau蛋白高度磷酸化形成的神经缠结以及淀粉样蛋白的不断积累。其中tau蛋白是神经元细胞内一种含量最高的微管相关蛋白，影响着细胞骨架的稳定性，胞内线粒体功能以及神经递质的释放。实验数据显示：GLP-1类似物可明显减少AD老鼠模型脑内的tau磷酸化以及神经缠结[54]。在一种额颞叶痴呆以及肌萎缩侧索硬化症模型中，即P301Ltau表达突变的老鼠模型，GLP-1类似物能减少大量的神经缠结以及高度磷酸化的tau[23]。同时GIP类似物能显著降低APP/PS1转基因AD老鼠模型的β淀粉样蛋白的负荷，改善了突触可塑性[16,17]。我们实验室已经发现侧脑室注射STZ诱导的AD大鼠模型脑内未出现β淀粉样蛋白的积累[22]，基于GLP-1以及GIP的显著神经保护作用，本部分中我们在STZ诱导的AD大鼠模型中检测了DA-JC4对大鼠脑内tau蛋白磷酸化程度的影响。1材料与方法1.1主要试剂1）水合氯醛sigma2）聚甲醛sigma3）ABC试剂盒武汉博士德4）DAB显色液北京中杉金桥5）p-Tau(Ser396)Abcam6）PBS缓冲液武汉博士德1.2主要仪器1）石蜡包埋机德国Leica2）石蜡切片机德国Leica3）光学显微镜MoticBA2101.3实验方法13 山西医科大学硕士学位论文动物行为行为测试完毕后，每组随机挑取4-5只大鼠进行水合氯醛麻醉，之后先后用冰生理盐水以及4%的多聚甲醛溶液进行心脏灌注。灌注结束后，将大鼠大脑移出并与固定于4%的多聚甲醛溶液24h。组织再经过梯度酒精脱水包埋于蜡块当中。切片机切取5μm的组织切片储存于20◦C用于免疫组化。组织切片依次放入二甲苯和梯度酒精中，用3%H2O2处理10min以封闭内源性过氧化物酶活性。之后对切片进行柠檬酸盐缓冲液的热抗原修复处理。经过5%BSA封闭之后，开始孵育一抗p-Tau(Ser396)(兔抗p-Tau(Ser396);1:1000,Abcam,Cambridge,MA,USA)，37◦C孵育2h。之后37◦C孵育生物素化羊抗兔IgG30min,紧接着孵育抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(BosterBiotechnologyCo.,Ltd.Wuhan,China)30min。通过3,3-diaminobenzidine(DAB)(ZhongshanGoldenBridgeBiotechnologyCo.,Ltd.Beijing,China)使过氧化物酶可视化。染色后的切片经摄像头(MoticBA210)捕捉显微照片，然后ImageJ软件(Version6.0,developedbyNationalInstitutesofHealth)进行定量化分析。1.4统计分析实验数据表示为平均数±标准误。应用GraphPadPrism5(Graph-PadsoftwareInc.,SanDiego,CA,USA)进行统计分析。当P<0.05时，我们认为具有统计学意义。Tau蛋白磷酸化水平采用单因素方差分析和Student-Newman-Keulspost-hoc试验进行分析。14 山西医科大学硕士学位论文2结果AD患者显著的病理特征之一是tau蛋白的高度磷酸化。我们采用免疫组织化学技术观察大鼠皮层海马部位tau蛋白的磷酸化程度并检测出DA-JC4对tau蛋白高度磷酸化的影响。经单向方差分析后，各组皮层海马的tau蛋白磷酸化水平具有统计学差异(F=8.497,p<0.01;F=10.38,P<0.001)。图2的I,II显示出STZ组(0.2774±0.02585,0.2794±0.02579)的p-tau水平比正常组(0.1610±0.01080,0.167±0.01308)的要高(P<0.01,P<0.01)。较模型组而言，STZ+DA-JC4组的p-tau水平降低(P<0.01,P<0.01)。同时，DA-JC4对正常大鼠皮层海马部位tau蛋白磷酸化程度无影响（0.1600±0.01665，0.1757±0.01258）（P>0.05）。15 山西医科大学硕士学位论文16 山西医科大学硕士学位论文17 山西医科大学硕士学位论文图2：DA-JC4降低大鼠皮层(Ⅰ)海马(Ⅱ)的tau蛋白磷酸化水平Fig.2.DA-JC4reducedthelevelsofphospho-tauproteinintheratcerebralcortex(I)andhippocampus(II)(A–D,scalebar=100μm;E-H,scalebar=50μm).Theexpressionofphospho-tauwasincreasedfollowingtreatmentwithSTZ(**P<0.01;comparedwithcontrol),andreducedbyDA-JC4(##P<0.01,comparedwithSTZgroup).18 山西医科大学硕士学位论文3讨论Tau蛋白高度磷酸化作为主要的AD病理特征，易引发产生双螺旋丝（PairedHelicalFilaments,PHFs），进而在神经元胞内形成神经缠结。实验数据显示：GLP-1类似物可明显减少AD老鼠模型脑内的tau磷酸化以及神经缠结[55]。在一种额颞叶痴呆以及肌萎缩侧索硬化症模型中，即P301Ltau表达突变的老鼠模型，GLP-1类似物能减少大量的神经缠结以及高度磷酸化的tau[23]。同时GIP类似物能显著降低APP/PS1转基因AD老鼠模型的β淀粉样蛋白的负荷，改善了突触可塑性[16,17]。我们已经分别检测到了GLP-1和GIP类似物对tau蛋白磷酸化水平的积极作用，本部分我们检测了新型双受体激动剂DA-JC4对大鼠脑内tau蛋白磷酸化水平的影响并取得了可喜的成果。通过免疫组织化学技术，我们发现：与之前的研究一致，侧脑室注射STZ诱发的AD大鼠模型脑内tau蛋白的磷酸化显著增加。最重要的是，DA-JC4能在不产生任何副作用的基础上有效地阻止STZ诱导形成高度磷酸化的tau蛋白。根据之前的研究，我们采用免疫组织化学以及免疫印迹法两方面得出侧脑室注射STZ诱发的AD大鼠模型脑内,β淀粉样蛋白以及其前体蛋白APP的表达与正常大鼠没有任何差异。与tau蛋白的磷酸化相比，我们能得出这样一个假设：在AD患者脑内tau蛋白的磷酸化可能早于β淀粉样蛋白的沉积。19 山西医科大学硕士学位论文4结论上述实验结果表明：侧脑室注射STZ可使大鼠脑内皮层海马部位的tau蛋白磷酸化水平显著增加，对大鼠进行DA-JC4处理不但没有副作用反而能有效地阻止形成高度磷酸化的tau蛋白。20 山西医科大学硕士学位论文第三部分DA-JC4减轻STZ诱导的慢性炎症反应AD患者的病理特征除了tau蛋白高度磷酸化形成的神经缠结以及淀粉样蛋白的不断积累，神经炎症反应也是其始终存在的病理特征。脑内的神经炎症反应包括星形胶质细胞以及小胶质细胞的活化，一旦启动了炎症反应，将独立迫使神经元功能紊乱以及神经元非程序性死亡，并形成自我连续的恶性循环，进一步使病情恶化。脑内的慢性炎症反应在神经退行性疾病的发展过程中起着举足轻重的地位[55]，在此进程中如果能最大限度的减少慢性炎症可使疾病得到显著改善。因此，本课题通过免疫组化技术观察了各组大鼠脑内的炎症情况并探究出DA-JC4是否对慢性炎症起作用。1材料与方法1.1主要试剂1）水合氯醛sigma2）多聚甲醛sigma3）ABC试剂盒武汉博士德4）DAB显色液北京中杉金桥5）兔抗GFAP武汉博士德6）兔抗IBA1武汉博士德7）PBS缓冲液武汉博士德1.2主要仪器同第一部分1.3实验方法组织切片依次放入二甲苯和梯度酒精中，用3%H2O2处理10min以封闭内源性过氧化物酶活性。之后对切片进行柠檬酸盐缓冲液的热抗原修复处理。经过5%BSA封闭之后，开始孵育一抗GFAP(rabbitanti-GFAP;1:100;BosterBiotechnologyCo.,Ltd.Wuhan,China)和IBA1(rabbitanti-IBA1;1:100;BosterBiotechnologyCo.,21 山西医科大学硕士学位论文Ltd.Wuhan,China)，37◦C孵育2h。之后37◦C孵育生物素化羊抗兔IgG30min,紧接着孵育抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(BosterBiotechnologyCo.,Ltd.Wuhan,China)30min。通过3,3-diaminobenzidine(DAB)(ZhongshanGoldenBridgeBiotechnologyCo.,Ltd.Beijing,China)使过氧化物酶可视化。染色后的切片经摄像头(MoticBA210)捕捉显微照片，然后ImageJ软件(Version6.0,developedbyNationalInstitutesofHealth)进行定量化分析。1.4统计分析实验数据表示为平均数±标准误。应用GraphPadPrism5(Graph-PadsoftwareInc.,SanDiego,CA,USA)进行统计分析。当P<0.05时，我们认为具有统计学意义。各组大鼠皮层海马部位的GFAP阳性星形胶质细胞和IBA1阳性小胶质细胞的平均光密度值分别采用单因素方差分析和Student-Newman-Keulspost-hoc试验进行分析。22 山西医科大学硕士学位论文2结果2.1DA-JC4有助于减少GFAP阳性星形胶质细胞数量如图3-1所示，各组大鼠皮层和海马的星形胶质细胞活性具有统计学差异(F=30.83,P<0.0001;F=9.867,P<0.01)。模型组(8.340±0.4890,15.3±2.348)的GFAP阳性星形胶质细胞数量比正常组(2.808±0.3406,6.761±0.2818)的多(P<0.001,P<0.01)，DA-JC4组(2.881±0.4943,7.174±0.7706)和正常组两者之间无明显统计学差异。STZ+DA-JC4组(5.010±0.5244,8.820±0.7110)的星形胶质细胞显著减少(P<0.001,P<0.01)。23 山西医科大学硕士学位论文24 山西医科大学硕士学位论文图3-1：DA-JC4减弱大鼠皮层(Ⅰ)海马(Ⅲ)中STZ诱导的星型胶质细胞的活性Fig3-1:DA-JC4attenuatedtheSTZ−inducedtheactivationofastrocytesintheratcerebralcortex(I)andhippocampus(III)(A-D,scalebar=100μm).QuantificationoftheareaofGFAPpositivestainintheratcerebralcortex(II)andhippocampus(IV)demonstratedthatSTZinjectioninducedastrogliosis(***P<0.001;**P<0.01comparedtocontrols).DA-JC4partiallyreversedthis(###P<0.001;##P<0.01comparedwithSTZgroup).2.2DA-JC4有助于减少IBA1阳性小胶质细胞数量图3-2的I和Ⅱ显示出了大鼠皮层海马中IBA1阳性小胶质细胞的免疫活性。对照组(0.8879±0.04772,1.244±0.1184)和DA-JC4组(0.9417±0.04789,1.217±0.1018)间无统计学差异。STZ组大鼠(4.895±0.2610,4.103±0.4160)的小胶质活性明显比对照组高(P<0.001,P<0.001)，经DA-JC4治疗，该组(1.839±0.2617,2.586±0.2038)的IBA1阳性小胶质细胞数量比模型组显著减少(P<0.001,P<0.01)。25 山西医科大学硕士学位论文26 山西医科大学硕士学位论文27 山西医科大学硕士学位论文图3-2：DA-JC4降低大鼠皮层(Ⅰ)海马(Ⅲ)中STZ诱导的小胶质细胞的活性Fig3-2:DA-JC4attenuatedtheSTZ-inducedactivationofmicrogliaintheratcortex(I)andhippocampus(III)(A-D,scalebar=100μm).QuantificationoftheareaofIBA-1positivestaininthecerebralcortex(II)andhippocampus(IV)revealedthatSTZinjectioninducedmicrogliosis(***P<0.001comparedtocontrols).DA-JC4partiallyreversedthis(###P<0.001;##P<0.01comparedwiththeSTZgroup).28 山西医科大学硕士学位论文3讨论脑内的慢性炎症反应在神经退行性疾病的发展过程中起着举足轻重的地位[55]，在此进程中如果能最大限度的减少慢性炎症可使疾病得到显著改善。星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化，可促进神经缠结的形成以及老年斑的沉积，进而推进了AD患者病情恶化[56]。GLP-1具有抗炎的作用[57]，我们之前已经成功检测出GLP-1以及GIP受体激动剂能减少脑内慢性炎症反应[16,17,26]。新型GLP-1/GIP受体激动剂能同时激活两条通路，并且优于单个的GLP-1受体激动剂[30,58]。鉴于此，本课题同时检测了侧脑室注射STZ诱导的AD大鼠模型是否存在慢性炎症反应，DA-JC4是否对慢性炎症反应产生影响。与先前的研究一致，如图3和4所示，侧脑室注射STZ可引发脑内产生慢性炎症反应。STZ组大鼠脑内皮层海马部位的GFAP阳性星形胶质细胞数量以及IBA1阳性小胶质细胞明显比正常组的要多。这一结果表明STZ诱发了脑内的炎症反应很可能与STZ组大鼠的认知下降有关，也同时与tau蛋白的磷酸化有关。STZ+DA-JC4组大鼠由于有DA-JC4的治疗，皮层海马部位的GFAP阳性星形胶质细胞以及IBA1阳性小胶质细胞数量明显比STZ组的要少。这一结果表明DA-JC4有效逆转了STZ诱导的慢性炎症状况，并可能通过调节大鼠脑内的炎症情况使大鼠的认知得到改善，tau蛋白磷酸化程度减弱。29 山西医科大学硕士学位论文4结论上述实验结果表明：侧脑室注射STZ可使大鼠脑内皮层海马部位的GFAP阳性星形胶质细胞数量以及IBA1阳性小胶质细胞数量增多，对大鼠进行DA-JC4处理不但没有副作用反而能有效地阻止大鼠脑内的慢性炎症的蔓延，延缓病情的进一步恶化。30 山西医科大学硕士学位论文第四部分DA-JC4部分逆转STZ诱导的凋亡信号的增强当机体的正常细胞受到病理性刺激的时候都会自发引起程序性死亡，即细胞凋亡，其受多种基因的共同调控，是引起AD患者脑内神经元丢失的因素之一。细胞凋亡在神经退行性疾病中有着举足轻重的地位。同时已有很多研究表明，GLP-1类似物能减少神经元的丢失[22,27,28]。本课题通过免疫印记法分析了各组大鼠皮层海马部位的促凋亡因子BAX以及抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达水平并进一步探索出DA-JC4对脑内凋亡信号的影响。1材料与方法1.1主要试剂1)RIPA裂解液碧云天2）PMSF碧云天3）BCA蛋白定量试剂盒博士德4）凝胶制备试剂盒博士德5）10%SDS溶液索莱宝6）甘氨酸索莱宝7）Tris索莱宝8）牛血清白蛋白索莱宝9）甲醇索莱宝10）Tween-20博士德11）兔抗BAXBioworld12）兔抗Bcl-2Bioworld13）羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶（HRP）Abcam14）兔抗β-actinAbcam1.2所需配制溶液1)5MNaCl：称取116.88gNaCl，定容至400ml,4◦C保存备用。2）1MTris.Hcl：称取60.55gTris，定容至500ml且浓盐酸调PH至7.5,4◦C保31 山西医科大学硕士学位论文存备用。3）TBST：5MNaCl60ml1MTris.Hcl20mlTween-201ml蒸馏水定容至2L，且调PH为7.5，4◦C保存备用。4）TBS5MNaCl60ml1MTris.Hcl20ml蒸馏水定容至2L，4◦C保存备用。5）5×电泳液Tris7.55g甘氨酸47g10%SDS溶液25ml蒸馏水定容至500ml，且调PH为8.3，4◦C保存备用。6）转移液Tris1.5g甲醇100ml甘氨酸7.2g蒸馏水定容至500ml，且调PH为8.3，4◦C保存备用。1.3主要仪器1)超声波裂解破碎仪美国Sonics2）低温高速离心机德国Eppendorf3）酶标仪美国MD4）电泳与转印仪伯乐5）凝胶成像系统北京赛智1.4实验方法4-5只大鼠的皮层海马分离并冻存于-80◦C用于免疫印记分析。将组织中加入一32 山西医科大学硕士学位论文定比例的裂解液（碧云天生物研究所，上海，中国）并剪碎。30min之后，再加入苯甲基磺酰氟（PMSF）和磷酸转移酶抑制剂并匀质化。将混悬液14000×g4◦C高速离心20min得到溶液上清。上清液的蛋白浓度通过BCA蛋白定量试剂盒（博士德生物技术有限公司，武汉，中国）测出。样品与上样缓冲液混合使样品浓度一致并煮沸5min。用12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶将等量的蛋白样品进行电泳分离并将蛋白转至PVDF膜上。5%的牛血清蛋白封闭1h，PVDF膜孵一抗Bcl-2(1:500;BioworldTechnologyCo.,Ltd.Nanjing,China),Bax(1:500;BioworldTechnologyCo.,Ltd.Nanjing,China),andβ-Actin(1:5000;Abcam,Cambridge,UK)4◦C过夜。次日，4◦C再孵二抗（羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶，HRP）2h。相应的蛋白条带使用化学发光成像系统（赛智创业科技有限公司，北京，中国）捕捉，通过使用ECL增强型化学发光液（博士德生物技术有限公司，武汉，中国）使条带可视化，使用QuantityOne4.31(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)分析图像结果。表1分离胶配方试剂分离胶浓度8%12%H2O(ml)4.63.230%Acr-Bis(29:1)(ml)2.641.5MTris.Hcl(PH8.8)(ml)2.62.610%SDS(ml)0.10.110%AP(ml)0.10.1TEMED(μl)77总体积(ml)10表2浓缩胶配方试剂浓缩胶(5%)H2O(ml)2.830%Acr-Bis(29:1)(ml)0.661.5MTris.Hcl(PH6.8)(ml)0.510%SDS(ml)0.0410%AP(ml)0.04TEMED(μl)7总体积(ml)333 山西医科大学硕士学位论文1.5统计分析实验数据表示为平均数±标准误。应用GraphPadPrism5(Graph-PadsoftwareInc.,SanDiego,CA,USA)进行统计分析。当P<0.05时，我们认为具有统计学意义。促凋亡因子BAX和抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达水平由单因素方差以及Student-Newman-Keulspost-hoc试验进行分析。34 山西医科大学硕士学位论文2结果如图4所示，四组大鼠皮层海马部位的促凋亡因子BAX/抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达量比值明显不同（F=26.78,P<0.0001;F=120.1,P<0.0001）。与对照组(0.9915±0.01694,0.8145±0.03596)相比，STZ模型组(2.387±0.2384,2.276±0.1191)的凋亡比值明显增加(P<0.001,P<0.001)。与此相比，STZ+DA-JC4组(1.192±0.06932,0.8966±0.02022)逆转了STZ诱导的BAX/Bcl-2比值的增加(P<0.001,P<0.001)。同时，DA-JC4组(1.034±0.1056,0.7970±0.03804)大鼠脑内凋亡信号与对照组无明显差异。35 山西医科大学硕士学位论文图4：DA-JC4降低皮层海马中STZ诱导的凋亡信号Fig4:DA-JC4reducedtheSTZ-inducedapoptoticsignalinginthecortexandhippocampus.A.WesternblotassayofBAXandBcl-2inresponsetoSTZandDA-JC4.B.WesternblotquantificationofproteinlevelsofBAXandBcl-2.Aone-wayANOVAfoundoveralldifferencesbetweengroups.Post-hocanalysesshoweddifferencescomparedtocontrols(***P<0.001comparedtocontrols;###P<0.001comparedtoSTZgroup).Dataarerepresentedasmean±SEM,andshowdataof4blottingrepetitions.36 山西医科大学硕士学位论文3讨论细胞凋亡是一种由多基因调控的细胞程序性死亡过程，与神经退行性疾病密切相关[22,27,28]。Bcl2蛋白家族是细胞内线粒体凋亡的主要调控者[59]。本身是与促凋亡因子，如BAX相结合的，以此阻止孔隙的形成以及细胞色素C的释放[59,60]。BAX是一种特别关键的促凋亡蛋白，隶属于Bcl2家族。BAX和Bcl2可结合形成聚合物，彼此相互抑制。因此，常用BAX和Bcl2的蛋白比例来表明凋亡信号的强弱。本部分通过免疫印迹法分别分析了各组大鼠皮层海马部位促凋亡因子BAX以及抗凋亡因子Bcl2的蛋白表达水平。经过单因素方差分析得出：与我们的预期一致，STZ组促凋亡信号明显强于对照组，DA-JC4组与对照组的凋亡信号没有显著差异，DA-JC4可部分逆转STZ诱导的促凋亡信号增强。新型GLP-1/GIP受体激动剂能同时激活两条通路，并且优于单个的GLP-1受体激动剂[30,58]。先前我们我们报道了另一种双受体激动剂DA-JC1在MPTP诱导的PD小鼠模型中发挥了良好的神经保护作用[31,61]。这种双受体激动剂的疗效没有单个GLP-1受体激动剂显著[62]，我们最终不得不采用了更高的给药浓度(50nmol/kg)，在本次课题中，我们只使用了更低的剂量（10nmol/kg）来评估DA-JC4在STZ诱导的AD大鼠模型中的神经保护作用，实验结果优于利拉鲁肽(25nmol/kg)[26]。本课题可能给出我们这样一个提示：该双受体激动剂可能优于单受体激动剂。但是更多的剂量仍需继续检测。上述结果有力地证明：在AD早期采用DA-JCC4进行治疗，可能有效阻止或延缓疾病的恶化，避免了永久性的神经元死亡和突触损伤，进而防止了不可逆转的认知损伤。37 山西医科大学硕士学位论文4结论上述实验结果表明：侧脑室注射STZ可使大鼠脑内皮层海马部位的促凋亡信号显著增强，对大鼠进行DA-JC4处理不但没有副作用反而能有效地阻止大鼠脑内的神经元凋亡，延缓病情的进一步恶化。38 山西医科大学硕士学位论文第五部分DA-JC4促使脑内胰岛素信号通路再度活化越来越多的证据表明，阿尔兹海默病与二型糖尿病有很多共同的病理特征，其中包括：胰岛素抵抗、炎症反应、淀粉样蛋白积累[13]。根据这些共同的病理特征，胰岛素抵抗是一种关键的潜在的发病机制，与认知下降密切相关[15,63]。GLP-1类似物利拉鲁肽能显著缓解AD脑内的胰岛素抵抗状态[64]。这些证据给我们这样一个提示，GLP-1类似物发挥神经保护作用与胰岛素信号转导通路的复敏相关。1材料与方法1.1主要试剂1）兔抗AktAbcam2）兔抗p-Akt(Ser473)Abcam3）兔抗IRS1Abcam4）鼠抗p-IRS-1(Ser1101)CellSignaling1.2所需配制溶液同第四部分1.3主要仪器同第四部分1.4实验方法4-5只大鼠的皮层海马分离并冻存于-80◦C用于免疫印记分析。将组织中加入一定比例的裂解液（碧云天生物研究所，上海，中国）并剪碎。30min之后，再加入苯甲基磺酰氟（PMSF）和磷酸转移酶抑制剂并匀质化。将混悬液14000×g4◦C高速离心20min得到溶液上清。上清液的蛋白浓度通过BCA蛋白定量试剂盒（博士德生物技术有限公司，武汉，中国）测出。样品与上样缓冲液混合使样品浓度一致并煮沸5min。用8%、12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶将等量的蛋白样品进行电泳分离并将蛋白转至PVDF膜上。5%的牛血清蛋白封闭1h，PVDF膜孵一抗IRS-1(1:500;39 山西医科大学硕士学位论文Abcam,Cambridge,UK),p-IRS-1(Ser1101)(1:750;CellSignalingTechnology,Danvers,MA),Akt(1:1000;CellSignalingTechnology,Danvers,MA),p-Akt(Ser473,1:2000;CellSignalingTechnology,Danvers,MA)4◦C过夜。次日，4◦C再孵二抗（羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶，HRP）2h。相应的蛋白条带使用化学发光成像系统（赛智创业科技有限公司，北京，中国）捕捉，通过使用ECL增强型化学发光液（博士德生物技术有限公司，武汉，中国）使条带可视化，使用QuantityOne4.31(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)分析图像结果。1.5统计分析实验数据表示为平均数±标准误。应用GraphPadPrism5(Graph-PadsoftwareInc.,SanDiego,CA,USA)进行统计分析。当P<0.05时，我们认为具有统计学意义。大鼠脑内胰岛素信号通路分子AKT与IRS1蛋白表达水平采用单因素方差分析和Student-Newman-Keulspost-hoc试验进行分析。40 山西医科大学硕士学位论文2结果Akt和IRS1的总蛋白表达水平在各组间没有显著差异。见图5中的免疫印迹条带，STZ组(0.04414±0.001197,0.03244±0.001044)中皮层海马的p-IRS1(Ser1101)蛋白表达水平明显比对照组(0.03712±0.001724,0.02815±0.0008825)增加(P<0.01,P<0.05)。但经过DA-JC4的治疗，DA-JC4+STZ组(0.04034±0.0006476,0.02869±0.0009052)与模型组大鼠相比较，大鼠脑内的p-IRS1Ser1101蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.05)。另外，DA-JC4组(0.03701±0.001020,0.02543±0.001475)与对照组无明显差异(P>0.05)。与p-IRS1Ser1101蛋白表达水平相反，STZ组(0.1872±0.02649,0.1540±0.02694)较对照组(0.3356±0.02061,0.2929±0.01382)，明显抑制了大鼠皮层海马中p-AktSer473的蛋白表达水平(P<0.01,P<0.01)。经分析得出，DA-JC4适度地逆转了STZ诱导的p-Akt(Ser473)失活(P<0.05,P<0.05)。另外，DA-JC4组(0.3088±0.03095,0.2811±0.01242)也与对照组无明显差异(P>0.05)。41 山西医科大学硕士学位论文42 山西医科大学硕士学位论文图5：DA-JC4使大鼠脑内胰岛素信号通路再次活化Fig5:DA-JC4re-sensitizedinsulinsignalinginthebrain.TheeffectsofDA-JC4onproteinexpressionlevelsofp-Aktandp-IRS-1inthecortexandthehippocampusasmeasuredbywesternblotassay(A,C).Quantificationofp-Aktandp-IRS-1inthecortexandthehippocampus(B,D).Aone-wayANOVAfoundoveralldifferencesforB(F=8.020,P<0.01;F=13.69,P<0.01)andD(F=7.724,P<0.01;F=6.841,P<0.01).Post-hocanalysesshoweddifferencescomparedtocontrols(*P<0.05;**P<0.01).Dataarerepresentedasmean±SEM,andshowdataof4blottingrepetitions43 山西医科大学硕士学位论文3讨论胰岛素作为一种重要的关键生长因子，参与神经元的生长以及修复。出人意料的是，神经元中葡萄糖的摄入不依赖胰岛素，除了表达GLUT4亚型的大型神经元[65,66]。因此，大脑普遍被作为“胰岛素非敏感”器官[67]。但是，胰岛素和胰岛素样生长因子1都是重要的生长因子，都能激活细胞生长，细胞修复，基因表达，能量利用以及蛋白合成。这可能用来解释脑内胰岛素脱敏增加AD形成的风险。二型糖尿病与神经退行性疾病有一个共同的关键机制就是脑内胰岛素信号减弱。对AD患者的脑组织进行化学分析，结果表明：即使不是糖尿病患者，脑内明确存在胰岛素脱敏现象[68,69]。大量试验已经在AD患者脑内检测到了胰岛素脱敏[69-71]。我们先前已经报道了，GLP-1类似物利拉鲁肽能改善小鼠脑内的胰岛素脱敏状态[64]。令我们最为关注的是，脑内的胰岛素脱敏状态与认知下降密切相关[15,63]，与tau蛋白磷酸化相关[72]。有试验通过鼻腔给药方式，将AD患者给予胰岛素治疗，最终证明疗效显著[73,74]。本部分胰岛素信号是由IRS1磷酸化和Akt磷酸化来呈现的。由图6可知，STZ可使大鼠脑内皮层海马部位的胰岛素信号分子处于失活状态，而DA-JC4能部分逆转STZ诱导的胰岛素抵抗，将IRS1信号分子以及Akt激酶由失活形式转变为活化形式。44 山西医科大学硕士学位论文4结论上述实验结果表明：侧脑室注射STZ可使大鼠脑内皮层海马部位的胰岛素信号减弱，IRS1/Akt通路处于抑制状态。对大鼠进行DA-JC4处理不但没有副作用反而能有效地增强大鼠脑内的胰岛素信号，重新恢复IRS1/Akt通路的活性。.45 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山西医科大学硕士学位论文综述GLP-1及GIP类似物治疗AD和PD的研究进展摘要：二型糖尿病（TypeIIDiabetesMellitus,T2DM）是形成慢性神经退行性疾病的危险因子，如：阿尔兹海默病（Alzheimer’Disease,AD）和帕金森氏病（Parkinson'sdisease,PD）。这种关联的潜在机制很可能与脑内胰岛素脱敏有关。现有研究表明一系列用来治疗T2MD的胰高血糖素样肽1（Glucagon-likepeptide1,GLP-1）模拟剂以及葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽（glucosedependentinsulinotropicpolypeptide,GIP）类似物能够显著改善AD以及PD症状。新型GLP-1/GIP双受体激动剂药物也具有潜在的神经保护作用。基于上述发现，首次临床试验已开展开来。采用18F-FDG-PET脑显像技术，针对AD患者进行了初步研究，结果显示：GLP-1类似物利拉鲁肽具有明显的保护功效，并完全阻止了AD相关的脑活动衰退。同时，GLP-1模拟剂艾塞纳肽能显著减轻PD患者的运动和认知障碍。这些结果为AD和PD提供了最新的治疗方案。糖尿病是神经退行性疾病的危险因素诱发AD和PD形成的因素之一是T2MD。相关流行病学表明，PD患者中T2MD患者所占比例极大，这一现象暗示：外周胰岛素脱敏可能引发或加速神经退行性病变[1,2]。通过AD患者的数据库分析，发现T2MD和AD也具有一定的关联性[3-8]。T2MD患者比正常人更易形成AD，且风险增加了[9]。在一项队列研究中，研究人员长期随访了一些人的健康状况，通过口服葡萄糖耐量试验发现，葡萄糖耐受性不良的高血糖人群容易诱发AD[10]。除此之外，还有研究得出了类似的结论[11]。同样地，T2MD也是PD的危险因素[12-15]。T2MD患者的基地神经节出现多巴胺能神经传递减弱，胰岛素脱敏以及能量消耗等症状[16]。脑内胰岛素信号失活T2MD与神经退行性疾病有一个共同的关键机制就是脑内胰岛素信号消失。对AD患者的脑组织进行化学分析，结果表明：即使不是糖尿病患者，脑内明确存在52 山西医科大学硕士学位论文胰岛素脱敏现象[17-20].。对糖尿病患者的外周组织进行化学分析发现，胰岛素受体亚基以及IRS1过度磷酸化[19,20]。PD患者中的关键脑区域如基底核和黑质，也存在胰岛素脱敏[1,21]。能量利用，线粒体功能，胰岛素信号转导以及多巴胺运输都发生变化[21-23]。胰岛素作为一种关键的生长因子胰岛素作为一种重要的关键生长因子，参与神经元的生长以及修复。出人意料的是，神经元中葡萄糖的摄入不依赖胰岛素，除了表达GLUT4亚型的大型神经元[24,25]。因此，大脑普遍被作为“胰岛素非敏感”器官[26]。但是，胰岛素和胰岛素样生长因子1都是重要的生长因子，都能激活细胞生长，细胞修复，基因表达，能量利用以及蛋白合成[27-30]。这可能用来解释脑内胰岛素脱敏增加神经退行性疾病形成的风险，如AD和PD。用胰岛素治疗阿尔兹海默病就像胰岛素改善T2DM，用胰岛素治疗AD，能显著改善认知和注意力，降低AD的生物标记水平，使脑能量利用率正常化[31-34]。胰岛素不能用来治疗非AD患者。注射胰岛素依靠鼻腔注射，通过鼻腔胰岛素更易直接进入脑内，并且绕过了诱发低血糖的问题。鼻腔注射胰岛素可改善非糖尿病患者注意力以及记忆的形成[33,35,36]。AD患者的临床试验阶段二期表明，鼻腔注射糖尿病能改善轻度认知障碍。通过18F-脱氧葡萄糖正电子发射层析扫描（18F-FDG-PET）技术测量脑内活动以及能量利用率，表明此法还能维持正常脑脊液中淀粉样蛋白1-40/1-42的比例，增加脑活动，改善意识形成[37,38]。但是，与T2DM患者类似，胰岛素给药被预测可能使脑内的胰岛素脱敏状况更为严重，认知状况进一步恶化[38]。审查，见[39,40]。治疗T2DM药物具有神经保护作用治疗糖尿病以及使胰岛素信号转导通路正常化的药物现在已市场化，其中包括GLP-1类似物[41,42]。GLP-1是一种高血糖素家族的一种生长因子，与胰岛素很相似[30]。这些药物不会直接影响血糖水平，对于非糖尿病患者很安全[43]。这些药物已经被很好的接受，并有很好的药效记录[44]。53 山西医科大学硕士学位论文部分这些药物能通过血脑屏障，这表明类似于其他生长因子如胰岛素或瘦素，存在GLP-1转运体[24,45-49]。脑内是否存在胰高血糖素样肽1受体（GLP-1Rs）一直备受争议。通过检测GLP-1R的PNA表达情况，有研究表明，脑内广泛分布着GLP-1Rs，AD和PD形成的关键脑区域如，皮层，海马以及黑质[50]。至此，针对脑内GLP-1R的表达，还有很多研究对此采用相应的抗体进行了免疫组化验证[51-57]。但是又有研究表明这些抗体不一定只对GLP-1R有选择性[58]，近期对转基因GFP受体表达老鼠进行了脑内GLP-1受体分析，结果表明GLP-1R在皮层，海马CA3区，齿状回等区域表达显著[59]，最终停止了所有的争议。胰高血糖素样肽1类似物对AD动物模型起作用在一些表达淀粉样前体蛋白以及早老素1的双转AD老鼠模型中，GLP-1类似物具有神经保护作用。利拉鲁肽(Victoza)已经投入市场作为治疗T2DM药物[60]。连续8周每天1次注射能减少记忆的丧失，突触的减少，脑内突触的传递,慢性炎症以及淀粉样斑块减少[61]。在很小的时候给予转基因老鼠上述给药方式，能显著减缓疾病的恶化，起到疾病防治的作用[62]。GLP-1类似物利西拉来(Lyxumia)与利拉鲁肽类似，具有相似的神经保护作用[63]。利拉鲁肽明显减少AD老鼠模型脑内的tau磷酸化以及神经缠结。在一种额颞叶痴呆以及肌萎缩侧索硬化症模型中，即P301Ltau表达突变的老鼠模型，利拉鲁肽能减少大量的神经缠结以及高度磷酸化的tau[64]..在加速衰老的SAMP8老鼠模型中，利拉鲁肽也有效具有神经保护作用，显著改善记忆的形成以及神经元的缺失[65]。GLP-1类似物艾塞纳肽4（exenatide,ByettaandBydureon）改善三转AD老鼠症状[66]。艾塞纳肽对其他的神经退行性动物模型同样也具有神经保护作用[67-70]。此外，GLP-1类似物还能促进小鼠脑内神经细胞前体的增值以及再生。在糖尿病的AD模型中，GLP-1类似物可恢复或增加中枢神经系统中神经细胞前体的增值[48,55,61,66,71-73]。GLP-1的姐妹激素GIP对APP/PS-1转基因AD小鼠模型疗效显著[74-76]。胰高血糖素样肽1类似物对PD起作用艾塞纳肽对几种PD老鼠模型有很好的神经保护作用。在由6-羟基多巴胺诱导的PD老鼠模型中，老鼠的多巴胺能神经元被损伤，连续3周给药，老鼠机能恢复。54 山西医科大学硕士学位论文黑质部位的部分胺能神经元免受6-OHDA的毒害[77]。上述结果在第二项研究中得到证实，该研究用到的模型是6-OHDA病变模型以及脂多糖诱导的黑质病变模型。艾塞纳肽能逆转这些模型损伤。基底神经节内的多巴胺水平也显著增加。用药组的黑质神经元数量比模型组高[78]。第三项研究表明：艾塞纳肽能保护多巴胺能神经元，逆转由1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD老鼠模型的运动机能[57]。有研究比较GLP-1类似物，利拉鲁肽，利西拉来以及艾塞纳肽，结果表明：利拉鲁肽和利西拉来具有很好的神经保护作用，而艾塞纳肽只能改善由PTP诱导的PD老鼠模型的运动能力。运动功能得到改善，黑质的多巴胺能神经元得到保护。经拉鲁肽以及利西拉来治疗的老鼠，多巴胺表达的生物标记物---酪氨酸羟化酶活性增加。用药组的凋亡细胞信号转导减弱，生长因子信号转导通路信号增强[79]。应运MPTP老鼠模型检测GIP药效，长期给予D-Ala2-GIP-glu-PAL处理，取得了可喜的结果。运动能力部分恢复，黑质部位的多巴胺能神经元数量增加。突触数量增加，cAMP/PKA/CREB生长因子第二信使通路也被激活[80]。现已发展出了新型GLP-1/GIP双受体激动剂用于治疗二型糖尿病。其中的一些已投入临床试验当中，比GLP-1类似物利拉鲁肽有更好的疗效[81]。当我们在MPTP小鼠模型中检测这些双受体激动剂时，惊奇的发现：新型GLP-1/GIP双受体激动剂能显著改善小鼠的运动能力，增加突触数量以及黑质部位的多巴胺能神经元数量。而且，脑源性神经营养因子的蛋白表达量增加，这或多或少可以解释这些双受体激动剂具有神经保护作用[82,83]。已有研究报道：脑源性神经营养因子具有保护突触活性的作用[84,85]。临床试验临床前研究表明，GLP-1以及GIP模拟剂具有很广泛的神经保护作用。因为有几个GLP-1类似物已经投入市场用于治疗二型糖尿病，所以针对艾塞那肽以及利拉鲁肽对AD或PD患者的疗效已经在临床试验中顺利展开。帕金森氏症针对艾塞那肽对PD患者的临床前研究已经完成（临床试验编号：55 山西医科大学硕士学位论文NCT01174810）。这种“概念验证”研究是在一个随机的、开放的45位PD患者群中进行的。艾塞那肽治疗坚持了12个月，之后暂停了2个月。与正常组相比，药物处理组的运动能力以及认知方面有了一个单盲级别的改善。根据帕金森病评定量表，给予艾塞那肽治疗的PD患者经过12个月的治疗平均改善了2.7分，比正常人群低2.2分(P=0.037)。最重要的是，根据Mattis痴呆评定量表2评判，治疗组有显著改善。此证据表明，艾塞那肽能改善患者的认知记忆下降[86]。治疗组患者在临床试验结束12个月后又重新进行了检测，发现与临床试验的研究结果一致[87]。这表明：组间的不同不是由于安慰剂引起的，艾塞那肽对PD患者的疗效可持续12个月以上。每周针对艾塞那肽(Bydureon)的二期临床试验已经完成(NCT01971242)。这个结果已公布，并初步认为获得了一个可喜的结果。针对检测利拉鲁肽的二期临床试验已经进行，开始于2016年7月，利用双盲、安慰剂对照原则随机在100位PD患者身上试验。阿尔兹海默病在美国针对检测艾塞那肽对AD早期患者的安全性以及有效性检测，已经展开了一个随机的、双盲临床试验。本次试验依据临床痴呆评定表的参数，检测了艾塞那肽对AD早期患者的疗效。其中包括：认知次量，行为和认知表现的测定，患者脑片的结构和功能的改变，脑脊液和血液中激素与代谢的变化，和AD标志物的变化（临床试验官方编号：NCT01255163）。在丹麦奥胡斯大学开展了一个34位患者的小面积研究。该随机双盲的临床试验调查了利拉鲁肽以及安慰剂对轻度认知障碍的AD患者的影响，通过18F-FDG-PET显像评估了大脑皮层的活动，通过PIB-PET显像评价了脑内的老年斑量。让人兴奋的是，18F-FDG-PET显像得出了阳性结果。18F-FDG是一个经修饰的葡萄糖分子，其吸收直接与脑部活动、突触活动以及病情进展相关[88]。安慰剂组患者的18F-FDG-PET脑片显像大脑皮层活动降低了，而治疗组患者的大脑皮层活动根本没有降低甚至在某个脑部区域改善了某些信号转导(NCT01469351)[89]。在英国，针对利拉鲁肽的2期临床试验已经在206名AD早期患者中进行了。本次试验是随机的，有安慰剂对照组，双盲设计。将进一步依据分析18F-FDG-PET脑片中大脑皮层活动，PET炎症标志物（小胶质细胞的活性），核磁共振成像脑部扫56 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山西医科大学硕士学位论文致谢三年研究生生涯终将拉上帷帐，心中不免感慨之至。猛然回想起自己刚来学校的情景，周围一切都是陌生的，生活学习模式与大学截然不同，诸多的不适应随之而来。初次来到实验室时，师兄师姐探讨实验疑点，说的甚是复杂，那时候的我觉得一切都是天马行空。现在想想自己马上就能顺利毕业了，期间不乏贵人相助。首先，我很感激我的导师，李琳教授，感激他给我提供了一个如此全面的学习天地科研平台。在这个平台中，我明白了科研所谓何物，作为一名科研工作者，应该拥有怎样的科研态度。面对一个全新的领域、一个崭新的课题，我的基础非常薄弱，或许有些些许的茫然，经过查阅各种资料、重新温习基础知识，对自己的课题有了一定的认识。诚然先天资质是一方面因素，但导师教会了我勤能补拙。同时，他耐心的教会了我们课题组的每一个人，写英文文章其实也很简单。其次，我也很感激我的第二导师，英国的Holscher教授。很感激他对我实验设计的帮助，以及对自己英语表达能力的帮助。他是我的老师，但他更像是我的朋友。跟他交流，我可以了解国外更多这一领域的研究进展，同时通过和他的日常交流，英语口语突飞猛进。在实验过程中，难免会遇到很多的坎坷。会有很多的疑难，也有很多的艰辛。感激一路上陪伴我的诸位师兄师姐师妹以及生理专业的同学们，感激她们对自己无私的帮助与支持。他们是我研究生生涯中的盏盏明灯，我不会忘记你们。再次允许我对你们表示由衷的感激。本课题承蒙山西省“百人计划”的资助，特此致谢。64 山西医科大学硕士学位论文个人简历一、基本情况史丽娟，女，1990年5月7日出生，汉族，山西省孝义市(县)人，主要研究方向：神经退行性疾病的防治。二、学习工作经历2010年9月-2014年7月，渭南师范学院，生命科学学院，生物科学专业，学士2014年9月-2017年7月，山西医科大学，基础医学院，生理学专业，硕士三、科研成果（一）科研项目[1]2015年山西省高校“131”领军人才,第二层次人才ChristianHolscher教授，金额50万，在研，参与。（二）发表文章[1]LijuanShi,ZhihuaZhang,LinLi,ChristianHolscher.AnoveldualGLP-1/GIPreceptoragonistalleviatescognitivedeclinebyre-sensitizinginsulinsignalingintheAlzheimericv.STZratmosel[J].BehaviouralBrainResearch,2017,327:65-74.(SCI,影响因子：3.002).65