《异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用及机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
博士学位论文异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用及机制研究作者姓名唐盛高学科专业医药生物学指导教师谭文所在学院生物科学与工程学院论文提交日期2018年12月12日 ThetherapeticeffectsandrelatedmechanismofisosteviolsodiumondiabeticcardiomyopathyADissertationSubmittedfortheDegreeofDoctorofPhilosophyCandidate：TangShenggaoSupervisor：Prof.TanWenSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou,China 分类号：R972学校代号：10561学号：201410105150华南理工大学博士学位论文异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用及机制研究作者姓名：唐盛高指导教师姓名、职称：谭文、教授申请学位级别：理学博士学科专业名称：医药生物学研究方向：药理学与新药研发论文提交日期：2018年12月12日论文答辩日期：2018年12月10日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：王玉强教授委员：杨博教授，朱明军教授，王丽京教授，谭文教授 华南理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研宄所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任。对本文的研究做出重要贡何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品．献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。ｐ日作者签名日期：年＃学位论文版权使用授权书－本学位论文作者完全了解学校有关保留，即：研、使用学位论文的规定究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南理工大学。学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅（除在保密期内的保密论文外）；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。本学位论文属于：在年解密后适用本授权书。＠呆密，同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览；同意将本人学位论文提交中国学术期刊（光盘版）电子杂志社全文出版和编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》，传播学位论文的命部或部分内容。“”（请在以上相应方框内打Ｖ）作者签名Ａ曰期：＂＂＂＂指导教师签名：日期：联）ｌＷ＾作者联系电话：０＾电子邮箱：丨卞次系地址（含邮编Ｖ：今 摘要糖尿病是由于胰岛素缺乏或胰岛素抵抗引起的一种慢性病，已经成为严重危害人类健康的重大疾病。据世界卫生组织（WHO）预测，到2030年糖尿病将成为全球死亡的第七大主要原因。实际上，比糖尿病本身更为严重的，是各种大血管和微血管方面的并发症。糖尿病除了引发高血压、冠心病、动脉粥样硬化等病症之外，高血糖还对心脏直接造成损伤，使心脏结构和功能发生显著改变，这种糖尿病直接引起心脏病变、独立于其他病症的并发症被称之为糖尿病性心肌病（DiabeticCardiomyopathy，DCM）。DCM引起的心脏结构改变的主要表现为心肌细胞肥大导致左心室重量增加、室壁增厚、腔体容积变大，显著的胶原沉积和间质纤维化导致心脏硬化和重构。而功能上的变化首先是舒张功能的降低，随着疾病发展到中晚期，收缩功能也可能发生下降，心输出量（CO）大大降低，无法满足机体对氧气、养分和能量的需求，最终导致心力衰竭甚至死亡。DCM是糖尿病人死亡的主要原因。目前，DCM的治疗依然缺乏有针对性的药物，现有的治疗手段无法满足临床需求，给糖尿病患者带来巨大风险。针对这一问题，本课题以已上市药物曲美他嗪（TMZ）作为对照，主要研究异甜菊醇钠（STVNa）对DCM的治疗效果及其作用机制。由于一型糖尿病和二型糖尿病引起的心肌病变有许多共同之处，而链脲佐菌素（STZ）诱导的一型糖尿病操作简单，是研究DCM疾病及药物开发研究的主流模型。因此，本课题选择一型糖尿病模型，首先分析DCM发生发展动态过程，接着探讨了STVNa在对抗这一疾病中的作用效果，再结合体内外研究阐述药物潜在的作用机理，比较其与TMZ作用效果和机理的差异。首先，Wistar雄性大鼠造模一型糖尿病成功后，分析4、8、12、16周四个时间节的心脏肥大、纤维化、舒张功能和收缩功能变化的动态过程。研究结果表明，糖尿病造模成功后，第8周可明显见到心肌肥大和纤维化，舒张功发生能异常（8周）先于收缩功能异常（12周），而分子层面则在第4周已可以见到肥大和纤维化标志物（BNP和TGF-β1）表达水平的升高，表明分子水平的改变先于宏观结构和功能的变化。接着，糖尿病一周后大鼠随机分组，分别给予溶剂对照、STVNa或TMZ治疗11周，或者治疗11周后停止给药4周，测定心功能及各项病理学的变化，分析药物作用效果以及可能的作用机制。结果表明，经过11周给药治疗，STVNa和TMZ都可以显著改善DCM各方面的症状，甚至在停止给药4周后，效果依然显著。糖尿病引起心肌I 肥大和纤维化，心肌细胞横截面积、心脏体重比、间质纤维化都显著升高，一型和三型胶原蛋白生成明显增多，肥大和纤维化相关标志物的表达均上升。同时，心肌组织内活性氧自由基（ROS）水平显著升高，总抗氧化能力（T-AOC）和还原型谷胱甘肽（GSH）均明显下降，超氧化物歧化酶（SOD）活性也呈降低趋势，而脂质过氧化产物丙二醛（MDA）则显著升高，ROS的标志物8-OHdG含量也大大上升。炎症反应大大增强，血浆和心脏组织内的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）升高，相关促炎症因子，如白介素1β（IL-1β）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）等的表达增强。STVNa和TMZ都可以不同程度的逆转上述各项指标，且STVNa整体效果更好。此外，糖尿病使血液和心肌组织内糖基化终末产物（AGE）升高，其受体RAGE、以及ERK和NF-κB信号通路被激活，而AMPK信号通路受到抑制。STVNa和TMZ都不能降低血糖浓度，对胰岛素也无显著影响，同时也不抑制AGR-RAGE的水平。STVNa抑制ERK和NF-κB信号，但对AMPK无显著影响。而TMZ则进一步激活ERK信号的同时还活化AMPK分子，但TMZ也抑制NF-κB信号通路。最后，通过体外水平细胞生物学研究，分析STVNa和TMZ对高葡萄糖（HG）培养大鼠H9c2心肌细胞的影响，以及潜在的信号通路转导的变化。HG会对细胞造成损伤，表现为细胞活力下降，以及相应的肥大、纤维化。STVNa和TMZ都可以不同程度降低HG引起的细胞损伤，抑制各种异常反应。同时，HG使细胞内RAGE和氧化应激相关的Nox-2和TRPC3蛋白均表达上升，ERK和NF-κB信号通路被激活，而AMPK和Akt信号通路受到抑制。STVNa可以抑制ERK、NF-κB信号激活以及Nox-2的表达，激活Akt的磷酸化，但对AMPK和TRPC3通道无显著影响。而TMZ则进一步增强ERK的磷酸化，刺激AMPK和Akt信号通路，抑制NF-κB信号通路及Nox-2和TRPC3的表达。与动物实验一致，STVNa和TMZ对AGE-RAGE都无显著影响。此外，体外实验证实，STVNa显著促进糖酵解过程，提高己糖激酶（HK）和磷酸果糖激酶（PFK）活性，但不影响丙酮酸激酶（PK）活性；令人意外的是，TMZ促进己糖激酶活性，但对糖酵解整体过程无显著影响，对磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶也无显著影响。寡霉素（Oligomycin）抑制氧化磷酸化而使H9c2细胞活力下降，STVNa和TMZ都无法恢复细胞活力。本课题的研究，可为糖尿病性心肌病的病理发生机制及未来药物开发参考和方向。目前不同的DCM研究之间采用不同的时间周期，无论是心功能、心肌肥大还是纤维化，II 各研究之间的结果都存在较大差异，本研究通过设置不同时间节点来分析DCM发生发展的动态过程，揭示心脏结构和功能改变的具体时间，为后续同类研究提供参考。本课题所研究STVNa是天然植物提取物的典型代表，而对照药物TMZ是最常用的代谢调控类抗心衰药物，两者都有望在对抗DCM这类多因素诱发的复杂慢性疾病中发挥重要作用。本研究证实了STVNa对DCM的治疗作用，并初步阐述了其作用机制。未来，我们将采用基因敲除、过表达等手段深入分析药物作用的精确调控靶点，深入阐明STVNa的作用机制，为DCM的治疗提供切实有效的应对措施。关键词：异甜菊醇钠；糖尿病性心肌病；糖基化终末产物；信号转导分子机制；氧化应激III AbstractDiabetesmellitus(DM),aseriousdiseasethreateninghumanhealth,isachronicdiseasecausedbyinsulindeficiencyorinsulinresistance.AccordingtotheWorldHealthOrganization(WHO),DMwillbetheseventhleadingcauseofdeathin2030.MoreseriousthanDMitselfisitsvarietyofmacrovascularandmicrovascularcomplicationsincludingheartdisease,whichhasbecometheleadingcauseofdeathindiabeticpatients.Inadditiontocausinghypertension,coronaryheartdisease,atherosclerosisandotherdiseases,hyperglycemiaalsodirectlyinducesdamagestotheheart,causessignificantchangesinthecardiacstructuresandfunctions,whichisdefinedasdiabeticcardiomyopathy(DCM).ThemaincharacterizationofcardiacstructuralchangescausedbyDCMisthatmyocardialhypertrophyasincreasinginleftventricularmass,thickeningoftheventricularwall,enlargementofthevolumeofthecavity,aswellassignificantcollagendepositionandinterstitialfibrosis,leadingtoarterialstiffnessandfibroticremodeling.Thefunctionalchangesarefirstlycharacterizedbydiastolicdysfunction,asthediseaseprogressestotheadvancedstages,systolicfunctionmayalsodeclines.Meanwhile,cardiacoutput(CO)isgreatlyreducedandunabletomeetthewholebody'sdemandsofoxygen,nutrientsandenergy,ultimatelyleadingtoheartfailureandevendeath.Atpresent,thereisstillnospecificdrugsforDCMtherapies,andtheexistingtreatmentscannotsatisfytheclinicalneeds,whichbringsgreatriskstodiabeticpatients.Thisstudywasdedicatedtodemonstratethetherapeuticefficacyandpotentialmechanismofisosteviolsodium(STVNa)onDCM,usingmarketedtrimetazidine(TMZ)asacontroldrug.Forthecommonalityoftype1diabetesandtype2diabetes-inducedheartdisease,moststudiesusingstreptozotocin(STZ)-inducedtype1diabetesforstudyingthepathophysiologyofDCMandfordrugdevelpmentbecauseofitseaseofoperation.Therefore,thisstudyselectedtype1diabetestostudythedynamicdevelopmentprocessofDCM,anddemonstratetheeffectsofSTVNaonthedisease,aswellastheunderlyingmechanismsofactionandthedifferencesbetweenSTVNaandTMZ.Firstly,streptozotocin(STZ)wasusedtoinducetype1diabetesinmaleWistarrats.Differenttimepointsof4,8,12,and16weekswereusedtoanalyzethedynamicchangesofhypertrophy,fibrosis,diastolicfunctionandsystolicfunctioninDCMprogresses.Theresultsshowedthataftersuccessfulinductionofdiabetes,myocardialhypertrophyandfibrosiswerethevidentfromthe8week,dysfunctionofthediastolicfunction(8weeks)precededsystolicdysfunction(12weeks).However,increasedexpressionlevelsofhypertrophyandfibrosisIV thbiomarkers(BNPandTGF-β1)wereobservedearlier(fromthe4week),indicatingthatchangesinmolecularlevelsprecedechangesinstructuresandfunctions.Subsequently,theratssuccessfullyinduceddiabeteswererandomlygroupedafter1weekofSTZinjection,andthentreatedwithsolventcontrol,STVNaorTMZfor11weeks,or11weekstreatmentfollowingnotreatmentof4weeks.Thecardiacfunctionandpathologicalchangesandpotentialmechanismswereinvestigated.Diabetescausescardiachypertrophyandfibrosis,characterizedbyincreasedcardiomyocytecross-sectionalarea,heartweighttobodyweightratio(HW/BW),interstitialfibrosis,typeⅠandtypeⅢcollagenproduction,aswellassignificantlyelevatedhypertrophyandfibrosisrelatedmarkers.Atthesametime,thelevelsofreactiveoxygenspecies(ROS)inmyocardialtissueweresignificantlyincreased,andthetotalantioxidantcapacity(T-AOC)andtotalreducedglutathione(GSH)weresignificantlydecreased,togetherwithsuperoxidedismutase(SOD)activityshowedatrendofdecline.Malondialdehyde(MDA),thelipidperoxidationproduct,andtheROSmarker8-OHdGcontentweresignificantlyincreased.Moreover,thepro-inflammatorycytokinesweregreatlyenhanced,includingtumornecrosisfactor-α(TNF-α)andinterleukin-6(IL-6)inplasmaandhearttissueswereelevated,aswellastheexpressionofrelatedinflammatorygenes,suchasIL-1β,MCP-1,ICAM-1andVCAM-1weresignificantlyincreased.BothSTVNaandTMZsignificantlyimprovedsymptomsinalmostallaspectsofDCM,evenafter4weeksofdiscontinuationoftreatment.Overall,STVNaworksbetterthanTMZ.Moreover,diabetesinducedtheformationofglycationendproducts(AGE)inbloodandmyocardialtissue,promotedRAGEexpressionintheheart,activatedERKandNF-κBsignalingpathways.However,AMPKsignalingpathwaywasinhibited.BothSTVNaandTMZhadnosignificanteffectsonbloodglucose,insulinorAGE-RAGEaxis.STVNainhibitedERKandNF-κBsignaling,buthadnosignificanteffectonAMPK.However,TMZfurtherenhancedphosphorylationofERK,stimulatedAMPKsignalingpathway,whereasinhibitedNF-κBsignalingpathway.Finally,invitrostudieswerecarriedouttoanalyzetheeffectsofSTVNaorTMZonH9c2cardiomyocytesinjuriesinducedbyhighglucose(HG).Thepotentialsignaltransductionpathwayswereinvestigated.HGinducedsignificantdamagestocells,whichwasmanifestedbydecreasedcellviabilityandelevatedhypertrophyandfibrosissymptoms.BothSTVNaandTMZcouldreduceHG-inducedcelldamageandinhibitvariousabnormalprocesses.Meanwhile,HGincreasedtheexpressionofbothRAGEandoxidativestress-associatedNox-2andTRPC3,andtheERKandNF-κBsignalingpathwayswereactivated,whiletheAMPKandAktsignalingpathwayswereinhibited.STVNainhibitedERK,NF-κBandNox-2V signalingandactivatedphosphorylationofAkt,buthadnosignificanteffectonAMPKorTRPC3.However,TMZfurtherenhancedphosphorylationofERK,stimulatedAMPKandAktsignalingpathways,whereasinhibitedNF-κBsignalingpathwayaswellasexpressionosNox-2andTRPC3.Consistentwithanimalexperiments,STVNaandTMZhadnosignificanteffectsonAGE-RAGEaxis.Inaddition,invitrocellexperimentsconfirmedthatHGinhibittheglycolysisofH9c2cells.STVNasignificantlypromotedglucoseglycolysis,restoredhexokinase(HK)andphosphofructokinase(PFK)activity,anddidnotaffectpyruvatekinase(PK)activity.Interestingly,TMZpromotedHKactivitybutnotglycolysisprocessandhadnosignificanteffectsonPFKandPK.OligomycininhibitsoxidativephosphorylationanddecreasestheviabilityofH9c2cells,whichcouldnotbepromotedbySTVNaorTMZ.Thisstudycanprovidesomeinformationforthepathologicalmechanismofdiabeticcardiomyopathyanddrugdevelopments.Atpresent,differentstudiesofDCMwithdifferenttimeperiodsleadtodifferentresultsaboutcardiacfunction,cardiachypertrophyorfibrosis.ThisstudyanalyzedthedynamicprocessofDCMdevelopmentbysettingdifferenttimepoints.Thespecifictimeofchangesincardiacstructureandfunctionwillbecriticalforanalysingresultsofsimilarresearches.STVNaisatypicalrepresentativeofnaturalplantextracts,andTMZisthemostcommonlyusedmetabolically-regulatedanti-heartfailuredrug,bothofwhichareexpectedtobeeffectiveapproachesagainstcomplexchronicdiseasesinducedbymultiplefactorssuchasDCM.ThisstudyconfirmedthetherapeuticeffectsofSTVNaonDCMandpreliminarilyexplaineditsmechanismsofaction,whichisdifferentformTMZ.Inthefuture,wewillusegeneknockout,overexpressionandothermeanstodeeplyanalyzethepreciseregulatorytargetsofdrugaction,clarifythemechanismofSTVNatoprovideeffectivemethodforthetreatmentofDCM.KeyWords:IsosteviolSodium;DiabeticCardiomyopathy;AdvancedGlycationEndProducts;Signaltransductionmolecularmechanism;OxidativestressVI 目录摘要...........................................................................................................................................IAbstract................................................................................................................................IV目录.......................................................................................................................................VII缩略词表.................................................................................................................................XII第一章绪论............................................................................................................................1糖尿病性心肌病发病机制与药物研发现状............................................................................11.1概述..............................................................................................................................11.2糖尿病性心肌病的特征与诊断..................................................................................21.2.1结构变化............................................................................................................21.2.2功能变化............................................................................................................31.2.3诊断方法............................................................................................................41.3糖尿病性心肌病的发病机制......................................................................................51.3.1病理因素............................................................................................................51.3.2分子信号通路....................................................................................................81.3.3.代谢紊乱及调控信号通路.............................................................................121.4针对糖尿病性心肌病的药物开发............................................................................151.4.1流行病学与治疗难题......................................................................................151.4.2现有治疗药物..................................................................................................151.4.3新型药物研发..................................................................................................171.5本课题的研究方案....................................................................................................191.6总结与展望................................................................................................................22第二章大鼠一型糖尿病性心肌病模型的建立与验证......................................................232.1前言............................................................................................................................232.2材料与方法................................................................................................................262.2.1动物.................................................................................................................262.2.2试剂..................................................................................................................262.2.3仪器设备...........................................................................................................272.2.4耗材...................................................................................................................28VII 2.2.5一型糖尿病模型构建......................................................................................282.2.6血糖浓度测定..................................................................................................282.2.7动物分组..........................................................................................................292.2.8活体动物血液动力学和心功能检测..............................................................292.2.9内脏分离与血浆制备......................................................................................292.2.10组织学分析....................................................................................................302.2.11信使RNA（mRNA）表达水平检测...........................................................312.2.12数据统计........................................................................................................332.3结果............................................................................................................................332.3.1糖尿病心肌病的肥大和纤维化改变..............................................................332.3.2糖尿病心肌病变的心功能下降......................................................................342.3.3糖尿病心肌病变的肥大和纤维化标志物的变化..........................................352.4讨论............................................................................................................................372.4.1糖尿病性心肌病的动物模型..........................................................................372.4.2大鼠一型糖尿病引起的心肌病模型..............................................................382.5本章总结....................................................................................................................39第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用..........................................................403.1前言............................................................................................................................403.2材料与方法................................................................................................................403.2.1试剂、药液与耗材..........................................................................................403.2.2本研究用到的试剂盒清单..............................................................................413.2.3PCR引物..........................................................................................................423.2.4SDS-PAGE/Westernblot检测试剂..................................................................433.2.5仪器..................................................................................................................443.2.6动物造模与检测等..........................................................................................443.2.7分组与给药.......................................................................................................443.2.8体重与生理常数测定......................................................................................443.2.9酶联免疫吸附试验（ELISA）检测...............................................................453.2.10组织总抗氧化（T-AOC）能力....................................................................473.2.11组织超氧化物歧化酶（SOD）活性............................................................47VIII 3.2.12组织还原型谷胱甘肽（GSH）水平检测....................................................473.2.13组织丙二醛（MDA）浓度测定...................................................................483.2.14组织三磷酸腺苷（ATP）含量检测.............................................................493.2.15血浆甘油三酯（TG）分析...........................................................................493.2.16血浆总胆固醇（T-CHO）检测....................................................................493.2.17血浆谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）测定.............................503.2.18血清肌酐（Cr）测定....................................................................................503.2.19血尿氮（BUN）检测...................................................................................503.2.20实时荧光定量PCR检测基因表达..............................................................503.2.21蛋白裂解与浓度测定....................................................................................513.2.22蛋白电泳与杂交（SDS-PAGE/Westernblotting）......................................513.2.23免疫组化染色（IHC）.................................................................................533.2.24数据分析与统计............................................................................................543.3结果............................................................................................................................543.3.1糖尿病引起大鼠体重下降及STVNa对体重的影响....................................543.3.2血糖浓度..........................................................................................................553.3.3血浆胰岛素浓度及胰岛素抵抗指数..............................................................553.3.4STVNa提高心肌组织内ATP水平.................................................................563.3.5糖尿病对心功能的影响及药物的保护作用..................................................573.3.6STVNa可有效抑制糖尿病引起的心肌肥大..................................................593.2.7STVNa可有效缓解糖尿病引起的心肌纤维化..............................................613.3.8STVNa可降低糖尿病引起的氧化应激..........................................................633.3.9STVNa可显著抑制糖尿病引起的炎症反应..................................................673.3.10STVNa对血脂代谢无显著影响....................................................................713.3.11STVNa可在一定程度上改善糖尿病引起的肾功能与肝功能下降............723.3.12STVNa不影响糖尿病导致的晚期糖基化终末产物（AGE）...................733.3.13药物作用的分子信号通路检测....................................................................743.3.14异甜菊醇钠对正常大鼠的影响....................................................................763.4讨论............................................................................................................................793.4.1糖尿病心肌病变引起氧化应激和炎症反应..................................................79IX 3.4.2STVNa对糖尿病大鼠机体代谢及内脏损伤的保护作用..............................813.4.3STVNa分子作用机制的初步分析..................................................................823.4.4异甜菊醇与血糖、胰岛素及糖尿病..............................................................833.4.5异甜菊醇钠的安全性......................................................................................843.4.6糖尿病性心肌病药物开发..............................................................................853.5本章总结....................................................................................................................86第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用.........................884.1前言............................................................................................................................884.2材料与方法................................................................................................................894.2.1试剂..................................................................................................................894.2.2耗材..................................................................................................................904.2.3仪器设备..........................................................................................................914.2.4细胞培养、传代与计数..................................................................................914.2.5高糖培养细胞的分组与药物处理..................................................................914.2.6细胞活力测定..................................................................................................924.2.7细胞内ROS水平检测....................................................................................934.2.8细胞裂解液的总抗氧化能力测定..................................................................934.2.9细胞培养上清液乳酸脱氢酶（LDH）活性测定..........................................934.2.10总RNA提取、逆转录与实时定量荧光PCR检测....................................944.2.11蛋白提取纯化与浓度测定............................................................................944.2.12蛋白电泳与Western杂交分析.....................................................................954.2.13细胞能量代谢仪测定心肌细胞糖酵解........................................................954.2.14糖酵解及氧化磷酸化抑制与药物作用研究................................................964.2.15核酸干扰（RNAi）检测..............................................................................974.2.16数据统计........................................................................................................984.3.结果...........................................................................................................................984.3.1不同浓度葡萄糖对H9c2细胞活力的影响...................................................984.3.2STVNa对高糖抑制的H9c2细胞活力的作用...............................................994.3.3STVNa显著抑制高糖引起的细胞膜损伤......................................................994.3.4STVNa对过氧化氢抑制的H9c2细胞活力的作用.....................................100X 4.3.5STVNa及TMZ对正常H9c2细胞活力的影响...........................................1014.3.6STVNa有效抑制高葡萄糖引起的H9c2细胞肥大和纤维化.....................1024.3.7STVNa抑制高糖引起的H9c2细胞氧化应激.............................................1044.3.8STVNa有效抑制高葡萄糖诱导的H9c2细胞炎症基因的表达.................1074.3.9STVNa对RAGE基因的表达无显著影响...................................................1074.3.10STVNa抑制、TMZ激活糖尿病性心肌病激活的ERK信号通路..........1084.3.11STVNa及TMZ抑制糖尿病性心肌病激活的NF-κB信号通路..............1094.3.12TMZ显著激活AMPK信号通路................................................................1094.3.13STVNa和TMZ都通过激活PI3K/Akt信号通路保护心肌细胞..............1104.3.14STVNa和TMZ对ROS相关的TRPC3/Nox-2的影响............................1114.3.15STVNa及TMZ对糖酵解的影响...............................................................1124.3.16STVNa及TMZ对氧化磷酸化的影响.......................................................1144.4.讨论.........................................................................................................................1154.4.1高糖培养心肌细胞引起的信号通路改变....................................................1154.4.2STVNa及TMZ对高糖诱导的心肌细胞信号转导紊乱的作用.................1164.4.3不同条件诱导的心肌细胞损伤及药物的保护作用....................................1184.4.4STVNa对葡萄糖吸收与代谢作用的分析....................................................1194.4.5体外细胞模型作为DCM研究的局限性.....................................................1214.5.本章总结.................................................................................................................121结论与展望............................................................................................................................123结论.................................................................................................................................123创新之处.........................................................................................................................124展望.................................................................................................................................125参考文献................................................................................................................................128攻读博士学位期间取得的研究成果....................................................................................127致谢........................................................................................................................................144XI 缩略词表英文缩写英文全称中文全称ACEiAngiotensin-converting-enzymeinhibitor血管紧张素转化酶抑制剂ADPAdenosinediphosphate二磷酸腺苷AGEAdvancedglycationendproduct晚期糖基化终产物AMPAdenosinemonophosphate单磷酸腺苷AMPKAdenosinemonophosphatekinaseAMP激活的蛋白激酶ANPAtrialnatriureticpeptide心钠肽ARBAngiotensinreceptorblocker血管紧张素受体阻断剂α-SMAα-Smoothmuscleactinα-平滑肌激动蛋白ATPAdenosinetriphosphate三磷酸腺苷β-ARβ-AdrenergicreceptorΒ-肾上腺素受体BNPBrainnatriureticpeptide脑钠肽BUNBloodureanitrogen血尿氮cAMPcyclicadenosinemonophosphate环化腺苷酸cGMPcyclicguanosinemonophosphate环化鸟苷酸CATCatalase过氧化氢酶CHOCholesterol胆固醇CKCreatinekinase肌酐激酶CTGFConnectivetissuegrowthfactor结缔组织生长因子CVDCardiovasculardisease心血管疾病CYLDCylindromatosis圆柱瘤基因DAGDiacylglycerol甘油二酯DCMDiabeticcardiomyopathy糖尿病性心肌病DMDiabetesmiletus糖尿病dp/dtmaxThemaximumrateofleftventricular(LV)pressurerise左心室压力上升最大速率dp/dtminThemaximumrateofleftventricular(LV)pressurefall左心室压力下降最大速率XII 缩略词表（续）英文缩写英文全称中文全称DPP-4Dipeptidylpeptidase-4二肽基肽酶-4ECMExtracellularmatrix细胞外基质eNOSEndothelialnitricoxidesynthase内皮一氧化氮合成酶ERKExtracellular-signal-regulatedkinase细胞外信号调节激酶ESCEuropeanSocietyofCardiology欧洲心脏病学会FABPFatty-acid-bindingprotein脂肪酸结合蛋白FAT/CD36Fattyacid(FA)translocase脂肪酸转运酶FATP1Fattyacidtransportprotein-1脂肪酸转运蛋白1FFAFreefattyacid自由脂肪酸FOXOForkheadboxO叉头蛋白FSFractionalshortening缩短分数GAPDHGlyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase甘油醛三磷酸脱氢酶GLP-1Glucagon-likepeptide-1胰高血糖素样肽-1GLUT-4Glucosetransportertype4葡萄糖转运蛋白-4GPCRGprotein-coupledreceptorG蛋白偶联受体GPXGlutathioneperoxidase谷胱甘肽过氧化物酶HDLHigh-densitylipoprotein高密度脂蛋白HGHighGlucose高葡萄糖HIF-1Hypoxia-induciblefactor-1缺氧诱导因子-1HKHexokinase己糖激酶HMGBHigh-mobilitygroupbox高迁移率蛋白HOMA-IRInsulinresistanceindex胰岛素抵抗指数HRHeartrate心率ICAM-1Intercellularddhesionmolecule1细胞内粘附分子-1IFNInterferon干扰素ILInterleukin白介素XIII 缩略词表（续）英文缩写英文全称中文全称INSRInsulinreceptor胰岛素受体IP3Inositoltriphosphate三磷酸肌醇IPCIschemicpreconditioning缺血预适应IRS-1Insulinreceptorsubstrate1胰岛素受体底物-1ISOIsoprenaline异丙肾上腺素IVGTTIntravenousglucosetolerancetest静脉注射葡萄糖耐量IVSInterventricularseptalwall室间隔厚度JAK-STATJanuskinase/signaltransducersandactivatorsofJanus激酶-信号转导和转录transcription激活因子JNKc-JunN-terminalkinasec-Jun氨基末端激酶LDHLactatedehydrogenase乳酸脱氢酶LDLLow-densitylipoprotein低密度脂蛋白LPLLipoproteinlipase脂蛋白脂肪酶LTCCL-typecalciumchannel电压依赖L型钙离子通道LVLeftventricle左心室LVEFLeftventricularejectionfraction左心室射血分数LVEDPLeftventricularend-diastolicpressure左心室舒张末期压力LVESPLeftventricularend-diastolicpressure左心室收缩末期压力LVFSLeftventricularfractionalshortening左心室缩短分数LVHLeftventricularhypertrophy左心室肥大LVPWLeftventricularposteriorwallthickness左心室后壁厚度LVSPLeftVentricularSystolicPressure左心室收缩压MEKMAPK/ERKkinaseMAPK/ERK激酶MRIMagneticresonanceimaging核磁共振成像MAPMeanarterialpressure平均动脉压XIV 缩略词表（续）英文缩写英文全称中文全称MAPKMitogen-activatedproteinkinase有丝分裂原激活的蛋白激酶MCP-1Monocytechemoattractantprotein-1单核细胞趋化因子-1MMPMatrixmetalloproteinases基质金属蛋白酶mTORMammaliantargetofrapamycin哺乳动物雷帕霉素靶标NAPDHNicotinamideadeninedinucleotide烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NFATNuclearfactorofactivatedT-cell活化T细胞核因子NF-κBnuclearfactorkappa-light-chain-enhancerofactivated核因子活化B细胞κ轻链增Bcell强子NONitricoxide一氧化氮NoxNAPDHOxidaseNADPH氧化酶NYHANewYorkHeartAssociation纽约心脏病学会PCIPercutaneousCoronaryIntervention冠状动脉介入疗法PDEPhosphodiesterase磷酸二酯酶PDHPyruvatedehydrogenase丙酮酸脱氢酶PDKPyruvatedehydrogenasekinase丙酮酸脱氢酶激酶PFKPhosphofructokinase磷酸果糖激酶PGC-1αPeroxisomeproliferator-activatedreceptor-γ过氧化物酶体增殖活化受体coactivator-1αγ共激活因子-1αPIP2Phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphate磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸PIP3Phosphatidylinositol(3,4,5)-trisphosphate磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸PI3K/AktPhosphoinositide-3-kinase/proteinkinaseB磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶BPKPyruvatekinase丙酮酸激酶PKCProteinKinaseC蛋白激酶CPKGProteinkinaseG蛋白激酶GPPARPeroxisomeproliferators-activatedreceptor过氧化物酶体增殖激活受体XV 缩略词表（续）英文缩写英文全称中文全称PrxPeroxiredoxin过氧化氢还原酶RAASRenin-angiotensin-aldosteronesystem肾素血管紧张素醛固酮系统RAGEReceptorforadvancedglycosylationendproduct晚期糖基化终末产物受体ROSReactiveoxygenspecies活性氧自由基RTKTyrosinekinasereceptor酪氨酸激酶受体SERCA2aSarcoplasmicreticulumCa2+ATPase肌浆网钙泵-ATP酶SGLT2Sodium/glucosecotransporter2钠-葡萄糖协同转运蛋白2siRNASmallinterferingribonucleicacid小干扰核糖核酸SIRT1Sirtuin1沉默信息调节子2蛋白SOCEStore-operatecalciumentry钙库操纵性钙离子内流SODSuperoxidedismutase超氧化物歧化酶STZStreptozotocin链脲佐菌素STVNaIsosteviolsodium异甜菊醇钠TDITissueDopplerechocardiography组织多普勒成像TGTriglyceride甘油三酯TGF-βransforminggrowthfactor-β转化生长因子-βTIMPTissueinhibitorofmetalloproteinase基质金属蛋白酶抑制因子TMZTrimetazidine曲美他嗪TNF-αTumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子-αTRPCCanonicaltransientreceptorpotential经典瞬时受体电位通道TrxThioredoxin硫氧还蛋白VCAM-1Vascularcelladhesionprotein1血管细胞粘附分子-1VEGFVascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子XVI 第一章绪论第一章绪论糖尿病性心肌病发病机制与药物研发现状1.1概述糖尿病是一种发病率极高的慢性疾病，2000年患病人群为1.75亿(1)，目前全球约有3.15亿糖尿病人，预计到2030年将增长到4亿以上(2,3)，而2040年预计全球将有超过6亿人口患糖尿病(4)。糖尿病分为一型（胰岛素依赖型）和二型（非胰岛素依赖型）糖尿病，前者是由于胰岛β细胞失去功能导致胰岛素缺乏而引起血糖升高，后者是由于各种因素引起胰岛素信号异常、使外周组织对胰岛素的敏感性下降而使葡萄糖吸收功能下降或缺失，最终使血糖升高。目前，由于各种环境因素和长期不良的生活习惯而引起的代谢综合征，进而发展成为二型糖尿病，占据总糖尿病患者的90%以上。无论是一型糖尿病还是二型糖尿病，长期持续高血糖都会引起各种并发症，包括大血管病变（如冠心病、高血压、动脉粥样硬化、心肌病变等）和微血管病变（肾脏病、视网膜病变、神经病变、肝脏病变等）。其中，糖尿病性心肌病（DiabeticCardiomyopathy，缩写为DCM），一种独立于高血压、冠心病、粥样硬化等症状的由高血糖和/或高血脂等因素直接引起的心脏疾病，是由Rubler于1972年正式命名的(5)。DCM是引起糖尿病人死亡的主要原因，据统计最终死亡的糖尿病人超过一半以上都是因为心脏病变而死亡的。因此，有效应对DCM是降低糖尿病人死亡率的重要手段。然而，尽管大量研究对DCM的发病机制进行了广泛的探讨，包括在氧化应激、钙离子信号异常、线粒体功能紊乱、炎症反应、心肌细胞凋亡和坏死、自主神经病变等多个方面做了大量工作，却依然有许多尚不明确、有待深入分析的细节问题(6)。对DCM病理生理学进行深入分析，特别是充分阐明决定DCM发展关键节点中的关键信号通路和作用分子，是未来应对这一糖尿病并发症的基础。目前，市场上没有特异性针对DCM的药物，临床应对方案一般是采用治疗心脏病和/或糖尿病的药物，直接改善心功能或者通过降低血糖来减轻对心脏的损害(7)。然而，一方面，糖尿病引起的心脏病变与其他原因导致的心脏病有许多不同之处，仅仅通过心血管药物减缓症状，不能从根本上去除糖尿病引发的各种风险因素，无法切实解决糖尿病引起的心脏异常。另一方面，通过降低血糖虽然可以一定程度上缓解心脏疾病，但这种缓解一般在疾病早期阶段有效，而且临床上缺乏控制血糖与降低心血管疾病风险的充分证据(8)。更值得注意的是，有部分糖尿病人血糖无法得到有效控制，因此无法通过降1 华南理工大学博士学位论文低血糖来治疗DCM。由此可见，现有的治疗手段由于不是特异性针对DCM，因而作用效果有限，无法应对逐步壮大的糖尿病人群高发DCM给人类健康和社会经济带来的巨大影响，亟需通过精确阐述疾病发展的关键机制来开发针对性的新药，来预防或治疗糖尿病DCM。1.2糖尿病性心肌病的特征与诊断DCM是一种直接由糖尿病对心脏造成损伤的疾病，与糖尿病引起的冠心病、高血压、动脉粥样硬化等无关，主要特征是心肌肥大、纤维化重构等结构改变，以及心脏舒张和/或收缩功能的下降。糖尿病的不同病理刺激因素通过血液流动不断影响心脏，心肌细胞受损引起结构异常，结构发生改变则进一步导致心脏功能降低。早期心肌细胞可以通过代偿性肥大来维持心功能，而长期的结构和功能改变，使心肌细胞无法通过代偿机制弥补心脏功能，从而导致心力衰竭。1.2.1结构变化糖尿病最常见的特征是高血糖和高血脂，或者伴随血液胰岛素缺乏，或者伴随高胰岛素血症，这些血液的异常必然会对血液流经的器官（包括心脏）和组织造成负面影响(9)。首先，最容易受到影响的是具有收缩功能的心肌细胞，高浓度的葡萄糖会刺激心肌细胞发生一系列应激反应，特别是线粒体结构功能下降、钙离子释放/回收失常和氧化应激信号通路活化，心肌细胞伸缩功能异常。为维持心功能，心肌细胞通过肥大反应增强单个心肌细胞的收缩能力，心肌细胞横截面积和体积都有所增加。同时，氧化应激会导致心肌组织内产生过量的活性氧自由基（ROS），刺激细胞凋亡信号通路，使心肌细胞凋亡。接着，为了填补心肌细胞凋亡后形成的空缺，机体所具有的损伤修复机制会通过免疫系统释放特定的细胞因子，激活心肌成纤维化细胞，纤维化信号通路被活化，细胞外基质和胶原蛋白沉积增加(10)。随着疾病进展，心肌细胞受损越来越严重，数量逐步减少，而纤维化沉积则越来越多，心肌组织内毛细血管基底膜变厚，整个心脏顺应性降低，直接导致心脏输出量降低，无法满足机体正常工作所需要的营养和能量。在上述过程中，心脏内的其他细胞，包括内皮细胞、免疫细胞等也会受到影响而无法发挥正常的功能。最终，由于心肌细胞自身功能、心肌细胞和成纤维细胞的比例、内皮细胞和免疫调节细胞的作用都进入异常状态，不同细胞之间的通讯失常，严重纤维化的心脏发生心力衰竭。上述心脏组织内部细胞层面的结构变化，伴随而来的是心脏整体结构的改变。左心2 第一章绪论室（LV）表现的肥大（LVH）是较为容易观测到的特征(11)，心肌肥大伴随着收缩和舒张功能下降，而糖尿病心肌肥大对舒展功能的影响比其他原因导致的肥大更显著(12)。例如，在链脲佐菌素（STZ）诱导的一型糖尿病模型中，由于心室膨胀重构，室壁厚度下降和LV内径增加是最典型的特征(13)。而在二型糖尿病中，心室壁的密度增加，说明左心室质量升高很可能是由于胶原沉积而不是心肌组织肥大导致的(14)。实际上，无论是一型糖尿病还是二型糖尿病，心脏/体重比（HW/BW）或心脏重量/胫骨长度比（HW/TL）都显著升高。1.2.2功能变化心脏结构失衡必然导致心功能的降低，这一点在缺血性心脏病、压力负荷诱导的肥大、化学分子/激素诱导的心肌肥大、糖尿病诱导的心肌病等多种模型中都得到了充分的证明(15,16)。理论上，心功能的下降是发生在心脏结构改变之后，结构异常导致了心功能的失常。心肌细胞受损伤后凋亡，仅仅通过肥大代偿机制不能保持心脏正常功能。晚期，高度纤维化的心脏顺应性下降，伸缩性大大降低，功能受损严重。但是，在动物实验或者临床诊断等实际过程中，有可能先观察到功能异常，然后才见到明显的结构改变。这是因为，当心肌细胞受损后，对功能造成的影响，可以通过特定的方法检测到，而此时心脏内部轻微的损伤从结构上看不出来，还无法检测到。因此，在不同的研究中所出现的结构和功能改变先后顺序、发生时间等的不同，与不同研究所采用的动物模型、检测方法、研究手段密切相关。为了尽量使各研究之间结果的阐述有比较性，在实际研究中，充分考虑现有的各种研究手段，建立一套标准的检测分析方法是非常重要的。在DCM的发生发展过程中，普遍认为心脏舒张功能先下降，随后才出现收缩功能紊乱，也存在只发生舒张功能下降而不出现收缩功能异常的情况(17)。根据纽约心脏病学会（NYHA）的标准，DCM早期阶段几乎没有或者只有微弱的心功能异常（此时射血分数一般保持正常）的一级临床症状，即在没有明显心肌病变的时候舒张功能会轻微地下降(18)。舒张功能下降是DCM最主要的一个特征，主要表现为早期舒张充盈减少、心房充盈增加、等容扩张延长和室上性早搏增强，舒张功能的指标如左心室舒张末期压力（LVEDP）、左心室压力下降最大速率（dP/dtmin）、E/E'和E/A'都显著减弱(19)。舒张功能紊乱可以根据欧洲心脏病学会（ESC）舒张性心力衰竭诊断共识，采用诊断射血分数正常的心衰（HFpEF）的方法进行评估(20)。一般舒张功能紊乱持续发生后，会逐步引起收缩功能异常，并导致射血分数（EF）降低。在发病早期，严格控制血糖可以逆转舒张功能紊乱。所以，尽早检测到糖尿病人的舒张功能异常非常重要，有助于及早治疗，3 华南理工大学博士学位论文避免进入收缩功能紊乱阶段。有研究认为，糖尿病心脏早期舒张功能下降可能与收缩过程的解偶联（驱动早期松弛）有关，而不伴随腔室僵硬度的增加（导致更晚期的舒张期变化）(21)。因此，早期由于心脏松弛性能下降，以及心脏顺应性降低，使心脏无法正常舒张。相比于舒张功能，心脏收缩功能与多种因素相关，早期收缩装置解偶联并不足以使收缩功能下降。随着疾病的不断发展，具备伸缩能力的心肌细胞减少，细胞内钙离子、线粒体、能量供应均进入异常状态，心肌细胞数量的减少和功能的下降，伴随着间质纤维化导致心肌顺应性下降，心脏收缩功能才开始下降。1.2.3诊断方法从上述内容可见，DCM的发生发展是一个长期动态的过程，多个方面、多种因素、多个层面的影响造成了心肌病和心衰。然而，目前DCM的诊断标准依然不甚明确，没有被广泛接受的诊断方法，而是采用多种不同的方法来进行确证(22)。一般来说，首先，应该排除其他可以引起心脏结构和功能改变的心脏疾病，包括冠心病、高血压和动脉粥样硬化等。其次，选择合适的诊断技术来测定DCM相关的关键指标。通过观察心脏的结构变化，分析是否发生心脏变大、室壁变厚、胶原沉积增多等；采用心功能检测方法，评估舒张和收缩功能是否发生明显改变；通过血液或组织的生物标志物，明确与心脏疾病有关的分子表达或活性的改变。临床上，糖尿病人要发展到心衰，要经过多年的无明显症状阶段，因此在心衰症状出现前及早发现异常非常关键，然而目前一般DCM被确诊时都已经到了晚期，因而给该病治疗带来困难(23)。结构上，DCM心脏呈现肥大症状，心脏体积和重量增加，心室内腔体积扩大。一般衡量肥大的指标有左心室质量、心脏重与体重比率（HW/BW）、左心室后壁厚度（LVPW）、室间隔厚度（IVS）、左心室内径和心肌细胞体积等。临床上，非侵入式的方法在检测心脏结构上广泛使用。通过高灵敏的核磁共振成像（MRI），可以非常方便地检测到室壁运动的异常、几何学形态的变化和心室肥大症状。超声心动扫描技术（Echocardiography），例如组织多普勒成像（TDI），也可以较为可观的评估心肌肥大的情况。TDI比传统的超声波心动扫描技术能更灵敏地检测到舒张功能紊乱，可以在二尖瓣环附近检测到二尖瓣的运动。血压正常的糖尿病人二尖瓣环早期充盈显著低于正常人群(24)。在采用动物模型开展的科学研究中，通过解剖可以直接观察心脏的形态和结构改变，以组织化学染色和免疫染色的方法可以直观分析心脏组织内部结构的组成和细胞构成的改变，查看细胞和亚细胞结构的变化。此外，采用电子显微镜可以直接检测到细胞内线粒体、内质网、肌浆网等结构的细微变化。4 第一章绪论心脏功能的检测可以很好地反应DCM的状态。目前，一般测定收缩功能的技术的灵敏度低于舒张功能评价的技术，因此实际检测中更容易发现舒张功能异常。通过超声心动扫描技术可以测定舒张功能紊乱、二尖瓣流速、心脏顺应性和左心室扩张，从而反映局部和全局的收缩和舒张功能(25)。采用冠状动脉造影术，可以测定舒张功能指标如LVEDP等，也可以测定心脏内微血管病变。在实验研究中，通过小动物超声成像技术，可以方便的分析心脏的多项功能指标，例如LVEF、LVFS、E/E'、E/A等。采用活体超声波心动扫描技术检测活体糖尿病动物，或者分析糖尿病动物离体组织样本，都可以观察到类似的舒张功能异常(26)。而另一项广泛使用的、基于心脏插管的血液动力学检测方法是压力-容积联合分析，可以测定LVEF、LVEDP、左心室收缩末期压力（LVESP）、dP/dtmin、左心室压力上升最大速率（dP/dtmax）、平均动脉压（MAP）等舒张和收缩功能常数。这项技术会对动物造成一定的损伤，但是由于灵敏度高、结果可靠而广泛应用。目前，高灵敏度小动物超声成像技术（例如VisualSonicsVevo®2100成像系统）和血液动力学分析（例如基于米勒压力-容积导管的压力容积环检测技术）已经成为动物模型研究最常用的测定心功能的两种手段。采用生物化学、分子生物学和免疫学的方法，可以对DCM病变中发生改变的生物标志物分子进行分析。临床上，常用血糖、糖化血红蛋白、血脂、血液胰岛素等指标来评价机体代谢状态，并检测心脏损伤的标志物肌钙蛋白（TropninT）、脑钠肽/B型脑钠肽N末端（BNP/NT-proBNP）和乳酸脱氢酶（LDH），以及纤维化标志物基质金属蛋白酶（MMP）升高及其组织抑制因子（TIMP）下降，糖基化标志物β-O-连接葡萄糖酰胺（β-O-GlcNAc）的水平，以及表观遗传学特别是microRNA的变化，来反映糖尿病人心脏结构和功能的异常。在科学研究中，除了采用临床上常用的指标，还会根据研究目的增加不同的生物标志物，包括肥大、纤维化、炎症反应、氧化应激等多方面的标志物。生物标志物的检测一般通过生物化学方法（如酶动力学方法）、分子生物学方法（如实时定量荧光PCR和蛋白杂交技术）和免疫学方法（如酶联免疫吸附试验）等进行精确定量分析。1.3糖尿病性心肌病的发病机制1.3.1病理因素一型糖尿病由于缺乏胰岛素、糖吸收和代谢受损而导致血糖升高，二型糖尿病是由于多种因素引起胰岛素信号通路对胰岛素不敏感、葡萄糖吸收下降而促使葡萄糖蓄积在5 华南理工大学博士学位论文血液内，虽然形成机理不一样，但高血糖是所有糖尿病人都有的病理特征(27)。循环系统内葡萄糖浓度升高，会造成一系列的不良反应：长期高血糖或者血糖波动，对血管造成极大刺激，直接接触高糖的血管内皮细胞严重受损，进而影响血液循环和营养与能量的供应；使血液及血液流经的组织内蛋白、核酸等分子发生糖基化，形成晚期糖基化终末产物（AGE）而影响这些分子行使正常功能(28)；对于各种外周器官组织，包括心脏，慢性高血糖直接影响这些器官和组织的代谢底物供应，打破原有的生理代谢平衡，代谢紊乱诱发各种器质性疾病；高血糖诱导血红蛋白糖化，使之与氧的结合亲和力下降，导致细胞缺氧等。当然，高血糖对心脏的影响更多的是通过刺激多种激酶和转录因子而激活炎症、氧化应激、凋亡等通路而引起病变。高血脂是糖尿病另一大最常见的症状，主要表现为血液内甘油三酯（TG）和低密度/极低密度脂蛋白胆固醇（LDL/VLDL-CHO）显著升高，而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-CHO）明显降低。胰岛素促进肝脏和脂肪细胞合成脂肪酸，抑制脂肪酶活性而减少脂肪酸分解，因此胰岛素具有降低循环系统内自由脂肪酸的功能。胰岛素分泌不足，或者胰岛素抵抗使脂肪细胞膜上受体对胰岛素不敏感，胰岛素对脂肪分解的抑制作用减弱，游离脂肪酸生成增加，进入血液循环形成高血脂。血脂升高形成脂质毒性，对多种器官包括心脏造成损害，也反过来影响胰岛细胞分泌胰岛素，进一步使血液中糖脂比例失调。高血脂对心肌细胞的影响，还体现在心肌细胞对葡萄糖利用的减少，进一步通过Randle循环效应增加了对脂肪酸的吸收，但是心脏内脂肪酸代谢的速率小于脂肪酸吸收速率，使心脏内脂肪酸代谢中间产物如神经酰胺、甘油二酯及饱和脂肪酸过量富集，诱导长期慢性炎症反应(29)。多种因素刺激使心肌组织的氧化应激反应增强，活性氧自由基（ROS）水平显著升高，也是心脏结构和功能显著改变的重要原因(30)。生理状态下，机体循环系统、组织器官、细胞内的ROS水平会维持在适量而稳定的动态水平，通过激活细胞内的第二信使，发挥有益的生理功能，参与信号转导、细胞应答、细胞增殖与分化、代谢与免疫调控等作用(31)。病理状态下，如糖尿病发生时，能量代谢底物发生变化，糖脂代谢失衡，线粒体功能下降，氧化磷酸化效率降低，诱导产生大量ROS，并富集在细胞内。与此同时，高血糖和高血脂通过蛋白激酶C（PKC）和小分子G蛋白（Rac-1）直接激活NAPDH氧化酶（Nox），高血糖引起的AGE产物还通过与AGE的受体（RAGE）结合，直接激活细胞内氧化应激信号通路，增加ROS生成。与此同时，机体内清除ROS的机制也非常关键，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、6 第一章绪论过氧化氢还原酶（PRX）、硫氧还蛋白（TRX）等的浓度和活性显著降低，使机体无法及时清理细胞内的ROS，而研究也证实增强抗氧化能力可以有效减轻DCM病症(32)。ROS生成增加和分解减少两方面因素相叠加，使细胞内累积大量的ROS，对细胞造成各种影响：首先，促氧化状态直接导致促炎症细胞因子（包括TNF-α和IL-6）的生成和释放，接着激活下游的核因子活化B细胞κ轻链增强子（NF-κB）通路，心肌组织内巨噬细胞和T细胞募集增加，淋巴细胞浸润增强(33)；其次，ROS会直接激活心肌肥大和纤维化相关的信号通路，例如有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、MMP和结缔组织生长因子（CTGF），造成心肌肥大和纤维化；此外，更为重要的是，ROS增加会刺激细胞凋亡信号通路，促使心肌细胞凋亡。糖尿病还直接刺激炎症和引起免疫调节紊乱，损害心脏结构和功能。在STZ诱导的糖尿病模型中，巨噬细胞和淋巴细胞浸润增加，促炎症因子表达升高，而抗炎症的白介素（IL-10）表达降低(34)。饮食诱导的肥胖或二型糖尿病模型中也可以观察到显著的炎症反应，而具有抗炎症功能的脂联素（adiponectin）和γ-干扰素（γ-IFN）表达水平显著下降(35)。实际上，糖尿病人长期伴随着低水平的慢性系统性炎症反应，表现为细胞移动增强，炎症相关信号通路（如NF-κB等）活化，激活NLRP3炎性体（inflammasome），生成大量的促炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1等(36)。这些炎症因子进入循环系统，增加了对心肌组织的损伤。多项研究证实慢性心肌炎症也是DCM发生发展的关键因素(37,38)。炎症因子还促进ROS生成，引起心肌肥大、线粒体功能紊乱和内质网应激，诱导成纤维细胞增殖和胶原形成，形成一个恶性循环(39)。正常心脏内有多种免疫细胞：巨噬细胞、肥大细胞、B细胞、调节性T细胞（Treg）和树突状细胞等。DCM发生后，巨噬细胞和肥大细胞数量增加，心脏组织内的免疫细胞侵袭能力增强(40)。然而，目前各种免疫细胞在DCM发生发展过程中的具体作用依然有待研究。此外，DCM发病的病理因素还包括高胰岛素血症（二型糖尿病）、交感神经病变、内分泌/旁分泌失调、线粒体功能下降、钙离子释放和重吸收失常、细胞自噬功能失常等。例如，血管紧张素Ⅱ刺激各种血管生长因子(41)，导致ROS形成，而阻断肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）系统的激活可有效缓解间质纤维化，改善心脏收缩能力(42)。上述各种病理因素相互作用相互影响，使整个心脏从内到外发生显著改变，细胞之间的通讯紊乱，神经信号传递缺失，心脏原本所拥有的分泌功能被破坏，线粒体无法供应充足的ATP来维持心脏功能，钙离子传导的异常导致心肌收缩和舒张功能无法正常执行，细胞自噬功能失调导致无法重新利用细胞内的废弃物更新细胞成分，细胞新陈代谢紊乱，7 华南理工大学博士学位论文最终导致细胞凋亡坏死，DCM发展到心衰状态而引起死亡。1.3.2分子信号通路糖尿病性心肌病是一种多因素疾病，伴随着多种信号通路的改变。已有大量研究表明，高血糖和高血脂会直接或通过作用于其他配体分子而间接刺激细胞表面的不同受体，将刺激信号传导至细胞内，引起一系列下游信号的变化。图1-1、糖尿病性心肌病发生的病理学机制及信号通路变化（1）AGE/RAGE血液内高浓度的葡萄糖最直接的影响之一就是促进体内多种大分子物质，包括蛋白质、脂肪和核酸的糖基化。这是一个非酶催化的反应过程，是还原糖（糖尿病发生时主要是葡萄糖）与大分子的氨基发生“美拉德（Maillard）反应”而生成稳定的共价化合物，这些化合物被称为晚期（深度）糖基化终末产物（AGE）。AGE是一种广泛存在于机体内的物质，与糖尿病慢性并发症、动脉粥样硬化、阿尔兹海默症等多种疾病密切相关，也是伴随着机体衰老而逐步增多的一种独特的标志物。AGE的形成，不但直接使蛋白、核酸等失去或改变功能，还会通过与特定细胞膜上的AGE受体（RAGE）结合而激活细胞内信号转导通路，引起各种反应(43)。RAGE可以与多种配体结合，除了AGE，还包括高迁移率蛋白（HMGB1）、S100/钙粒蛋白以及β淀粉样多肽（Aβ）。目前已证实各种配体与RAGE的相互作用在多种疾病中起到重要作用，成为近年来疾病治疗的一个新的靶向通路。8 第一章绪论研究表明，糖尿病人的血清AGE水平与心室等容舒张时间、血管僵硬度、颈动脉内中膜层厚度成正相关(44,45)。AGE可以直接刺激ROS生成，而RAGE被激活后，细胞内NADPH氧化酶（Nox）被活化，也促进ROS生成。AGE-RAGE在细胞内抑制PI3K/Akt通路，激活MAPK（包括JNK、p38MAPK和p21/Ras-ERK1/2三个亚家族）和JAK2/STAT1/IRF1信号通路，引起下游的转录因子如NF-κB（受Akt、ERK1/2、p38MAPK激活）、AP-1（受JNK激活）、STAT1/3、NFAT等转入细胞核内，启动一系列基因如TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、血管内皮生长因子（VEGF）、E-selectin、也包括RAGE等的表达，引起多个生理生物学过程的异常而进入病理状态，加重DCM的发展，导致心衰而死亡。此外，AGE也直接通过转化生长因子-β（TGF-β）相关的机制促进纤维化，诱导成纤维细胞增殖和一型/三型胶原沉积(46)。（2）ERK1/2细胞外信号调节激酶（ERK）是属于MAPK家族的一员，该家族还包括p38MAPK和JNK两个信号通路。研究表明，ERK及其激酶MEK在DCM一般高度活化，在疾病的发生发展过程中起到重要作用，与特定基因表达、细胞周期调控、mRNA稳定性、细胞粘附和转移、心血管胰岛素抵抗、内皮功能紊乱等多个生理学和病理学过程紧密相关(47)。ERK信号通路通过Ras-Raf-MEK传递刺激而被激活：Ras是一种小G蛋白，正常情况下与GDP结合而处于失活状态，受到外界刺激（包括活性氧自由基、钙离子、蛋白激酶C等）时，在鸟苷酸交换因子（GEF）作用下转而与GTP结合，进入活化状态。GTP-Ras进一步使Raf磷酸化，进而激活MEK，磷酸化的MEK（MAPKK）最终引起ERK的磷酸化，引起炎症、氧化应激、肥大和纤维化。（3）AMPK腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一种广泛存在于真核生物体内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是生物体内最重要的全方位代谢平衡调控因子之一，对于维持机体的正常代谢非常重要(48)。AMPK是细胞能量感受器，可以感知周围ATP的浓度而做出不同反应。激活AMPK一般是为了降低能量消耗，此时分解代谢（葡萄糖吸收和糖酵解、脂肪酸氧化等）增强而合成代谢（糖异生、蛋白质和脂肪合成等）降低，以维持机体能量供应，应对不利环境。研究表明，除了代谢调控，AMPK还通过若干信号通路调控炎症反应，如可以使组蛋白乙酰化酶p300磷酸化、进一步阻断p300对NF-κBp65亚基的乙酰化，从而抑制NF-κB信号通路。活化的AMPK可以在不同组织和细胞中下调MAPK三个家族成员的磷酸化水平而抑制炎症。Janus激酶-信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）与9 华南理工大学博士学位论文炎症因子的表达以及相关信号分子的转导密切相关，而AMPK可以阻止这些信号通路的活化。此外，AMPK还可以激活自噬信号通路，阻断细胞器功能的紊乱和细胞毒性物质的累积(49)。由此可见，AMPK在对抗能量代谢不足和紊乱、炎症反应方面发挥非常关键的作用。当糖尿病引起DCM后，ATP含量下降，AMP/ATP比例升高，AMPK首先有可能会被激活，以应对机体能量不足的状况。但随着时间延长，ROS对细胞造成的损伤更加严重，炎症反应更加剧烈，线粒体结构功能降低，这些因素通过负反馈机制抑制AMPK信号通路。因此，当DCM进入失代偿阶段后，AMPK信号通路一般是下调的(50,51)。此时，机体正常代谢无法有效维持，炎症反应和氧化应激急剧增强。（4）PI3K/Akt磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt（蛋白激酶B）是一种受不同类型刺激而激活的信号通路，有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三种同功异构型，而Ⅰ型又分为α、β、γ、δ等四个亚型，以异二聚体的形式存在，参与调解细胞的许多基本生物学过程，特别是以作为胰岛素调控细胞代谢的关键信号通路而闻名。受细胞外配体信号刺激后，受体酪氨酸激酶（RTK）和GPCR会激活PI3K，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）转化成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），进而激活Akt和其它下游分子。此外，PI3Kα还可以直接作为蛋白激酶使底物如胰岛素受体底物-1（IRS-1）磷酸化。PI3Kγ还参与控制心脏中β肾上腺素受体（β-AR）的密度(52)。一般认为，正常心脏的代谢70%左右的ATP来自于脂肪酸，20-30%来自于葡萄糖。心肌细胞表面负责葡萄糖吸收的是葡萄糖转运子GLUT1和GLUT4（GLUT4含量最多），而脂肪酸的吸收依赖于脂肪酸转运酶FAT/CD36、脂肪酸结合蛋白FABP和脂肪酸转运蛋白FATP1。PI3K信号通路参与调控GLUT4和FAT/CD36(53)。PI3K/Akt信号被激活后，引起GLUT4和FAT/CD36从细胞内囊泡转移到肌膜上，增加葡萄糖和脂肪酸的吸收。当DCM发生后，心脏内PI3Kα基础活性下降，胰岛素介导的PI3Kα激活也同时降低，使糖脂代谢发生紊乱(54)。此外，PI3K还促进电压依赖钙离子通道（LTCC）活性，DCM状态下PI3K被抑制后，LTCC活性下降，细胞收缩性能大大减弱。在糖尿病小鼠中，增强PI3K活性可以阻断DCM发展，降低组织内过氧化物的生成(55)。Akt分为Akt1、Akt2、Akt3三个成员，作为PI3K下游的信号分子控制心脏中多个生物学过程。有研究认为Akt1促进生理性心肌肥大而抑制病理性心肌肥大(56)，而Akt2则主要负责调节心脏胰岛素/PI3K刺激的葡萄糖的吸收和代谢(57)。目前，有研究认为10 第一章绪论糖尿病心脏中Akt活性降低，也有研究认为糖尿病会激活心脏Akt信号，这或许与Akt成员作用差异、不同阶段的DCM所具有的不同的病理状态有关(58)。（5）TRPC3/Nox-2/ROS研究表明，经典瞬时受体电位通道（TRPC）、特别是TRPC3，在各种因素引起的心肌肥大、氧化应激和纤维化过程中起到重要作用(59)。TRPC是一种在G蛋白偶联受体（GPCR）或受体酪氨酸激酶受刺激后而活性增加的膜蛋白，受甘油二酯（DAG）及三磷酸肌醇（IP3）的激活，介导钙库操纵性钙离子内流（SOCE）。TRPC3与细胞内多种蛋白相互作用，与包括腺苷酸A2受体/环化腺苷酸（A2R/cAMP）、蛋白激酶G/环化鸟苷酸（PKG/cGMP）、磷酸二酯酶（PDE）、一氧化氮（NO）等在内的多个分子相互作用或受其调控，调节细胞内钙离子浓度，在特定疾病的发生中发挥关键作用，而通过激活PKG来抑制TRPC3则有助于抑制心肌肥大和纤维化，发挥心脏保护作用(60,61)。也有研究证实，活化T细胞核因子（NFAT）会上调TRPC，且在TRPC1/3/6的启动子区域发现了保守的NFAT序列(62)。TRPC3转基因小鼠受到压力负荷或者血管紧张素刺激后，心肌肥大显著高于野生型小鼠(63)，而钙神经素（calcineurin）缺失后TRPC3转基因小鼠的肥大程度显著下降，进一步说明TRPC通道的促肥大作用与calcineurin-NFAT相关。此外，TRPC3体外过表达也会引起细胞肥大，促进胚胎型基因的表达(64)，还可以激活钙蛋白酶（calpain）而引起细胞凋亡，促进缺血/复灌引起的损伤(65)。细胞内活性氧自由基（ROS）主要来自于线粒体呼吸链和Nox的活化。在生理无刺激状态下，Nox-2（gp91phox）与p22phox亚单位结合，防止被蛋白酶降解。当细胞受到外界刺激后，其他p47phox、p40phox、p67phox等亚单位以及小G蛋白Rac1结合并激活Nox-2，其中p47phox主要负责Nox-2复合物的形成(66)。在各种病理状态下，Nox-2被激活，导致细胞内ROS水平显著升高(67)，并影响TGF-β1引起的纤维化过程。由于在糖尿病及各种并发症中起到关键作用，因而Nox-2已经成为糖尿病治疗的一个靶点(68)。有研究认为，TRPC3与细胞内氧化应激状态紧密相关，这种作用是通过Nox-2的相互作用实现的。由于Nox-2的激活还需要钙离子的内流推动(69)，而TRPC3正好可以为Nox-2的激活提供钙离子(70)。TRPC3与Nox-2之间相互促进，增强Nox-2的表达会增加TRPC3表达和通道功能(71)。TRPC3不但增加Nox-2的稳定性，还和Nox-2形成复合物，在阿霉素引起的心肌萎缩和心脏毒性中，这一复合物起到非常关键的作用(72)。（6）其他信号通路此外，还有许多信号通路在糖尿病性心肌病中发挥作用。研究表明，缺氧诱导因子11 华南理工大学博士学位论文1（HIF-1）可增强在缺氧条件下细胞的生存能力，通过协同调节编码糖酵解酶(73)和丙酮酸脱氢酶（PDH）激酶1（PDK1）(74)等基因的表达而将代谢从氧化磷酸化转变为糖酵解。mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶标）是另一条保守的与细胞生长和存活紧密相关的信号通路，可以感受外界环境中营养和生长因子状况，促进细胞生长和增殖。mTORC1也可以作为一种细胞膜转运调控因子调节营养转运子的转运，促进如葡萄糖、氨基酸、脂蛋白和铁离子的吸收，与DCM的发展紧密相关(75)。叉头蛋白（FOXO）广泛存在于机体内，其核转运和转录活性受到翻译后修饰（PTM）的调控，包括磷酸化、乙酰化、泛素化、精氨甲基化和O-糖基化等。FOXO1与细胞增殖、细胞凋亡、氧化应激、能量代谢调控、免疫动态平衡、寿命延长等生物学过程紧密相关(76)，并受到AMPK的调控激活，使细胞能够表达对抗外部压力相关的基因(77)。FOXO1可以改变胰岛素抵抗型心肌细胞的葡萄糖代谢，通过激活PDK4抑制葡萄糖氧化，转向利用脂肪酸和乳酸作为能量来源，近期一项体内和体外相结合的研究表明糖尿病小鼠心脏内FOXO1活性增强(78)。此外，SIRT1是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的去乙酰化酶，属于沉默信息调节子2（SIR2）蛋白Sirtuin家族，这类蛋白能够去除蛋白质（包括组蛋白和非组蛋白赖氨酸残基）上的乙酰基。SIRT1调节重要的代谢信号通路，可以调控高血糖相关的多种蛋白质，抑制如p300、NF-κB、p38MAPK、Histone3、MMP-9、FOXO3a和p53等转录因子，另一方面也增加SERCA2a、ERK1/2/Homer1、eNOS、PGC-1α和AMPK的表达。因此，SIRT1具有减轻心功能异常的作用，是一种治疗糖尿病性心肌病的潜在靶标(79)。有研究还表明，SIRT1也可调节FOXO的活性(80)。1.3.3.代谢紊乱及调控信号通路心脏每天需要消耗约6kg的ATP，相当于其自身重量的约20倍(81)，其中90%以上的ATP在线粒体中生成。这些能量主要来源于脂肪、碳水化合物、蛋白、酮体或乳酸。正常心脏大约60-70%的能量来源于脂肪代谢，葡萄糖代谢占20-30%(82,83)。健康的心脏可以在不同能量底物之间快速切换，以适应不同的生理状态和条件。在空腹条件下，脂肪酸是主要的能量来源，饭后或在压力条件下心脏会增加对葡萄糖的利用。而在病理状态下，心脏能量代谢会由于不同的刺激或损伤发生各种改变(84)。此时，心脏首先会通过调整代谢酶和信号通路来应对病理环境，维持心脏正常功能，此即为代偿阶段。随着疾病发展恶化，各种催化酶和代谢通路过度失衡，心脏代谢维持能力下降，无法有效维持心脏功能，进入失代偿阶段。糖尿病性心肌病与其他原因，如心肌缺血/复灌、压力负荷、生长激素诱导等引起12 第一章绪论的心肌病变有诸多不同之处，这是因为糖尿病首先是一种代谢疾病，机体整体代谢失衡的同时，心脏原有的代谢平衡也被打破，出现糖脂代谢紊乱。研究表明，糖尿病心脏组织内的ATP水平大大降低(85)，无法为心脏活动提供充足的能量，使心脏收缩功能受损(86)。血液中胰岛素不足，或心脏进入胰岛素抵抗状态，心肌细胞表面GLUT4含量下降，心肌组织对葡萄糖的吸收减少，丙酮酸脱氢酶（PDH）激酶4（PDK4）表达升高，使PDH被磷酸化而失活，糖酵解过程被抑制(87,88)。有研究证实，糖尿病小鼠中甘油醛三磷酸脱氢酶（GAPDH）和HK-Ⅱ活性都显著下降(89,90)，与糖酵解过程被抑制的结论相吻合。最新研究表明，一型和二型糖尿病都会使心脏内PFK-2蛋白含量降低，而这种蛋白的下降是因为蛋白酶体和分子伴侣介导的自噬促进了PFK-2蛋白降解所致(91)，该研究还证实了体外高葡萄糖培养原代心肌细胞不影响PFK-2的水平，而糖尿病小鼠心肌内PDK4表达显著升高，抑制丙酮酸氧化。心脏具有良好的代谢适应能力，葡萄糖代谢通路被阻断后，心脏内过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）表达升高，使脂肪酸转运蛋白转录增强(92)，心脏会转而更多地依赖脂肪酸代谢产生能量(93)。而升高的脂肪酸氧化导致细胞内乙酰辅酶A和NADH增加，进一步激活PDK4而抑制糖代谢(94)。虽然脂肪酸代谢能产生更多的ATP，但是产生单个ATP，脂肪酸比葡萄糖需要消耗更多的氧(95)。而糖尿病时，血液中血红蛋白被糖基化后，氧气携带能力下降，对心脏的供氧低于正常状态，使得心肌组织进一步缺氧，对心肌组织造成损伤。同时，心脏对脂肪酸的吸收增加，但心肌细胞内脂肪酸代谢速度小于吸收速率，使细胞内甘油三酯含量升高，脂肪酸代谢中间产物积累。这种自由脂肪酸氧化产生的毒性中间代谢物会损害钙离子动态平衡过程和心肌细胞的收缩能力，这一现象称为“脂质毒性”，这类毒性加大了对心肌细胞的损伤(96)。此外，脂肪酸及其衍生物脂酰辅酶A、甘油二酯和神经酰胺的累积，会激活蛋白激酶C（PKC）、JNK、mTOR和NF-κB，使胰岛素信号通路被抑制(97,98)。当糖尿病发展到一定阶段后，心肌细胞线粒体丰度降低，功能受伤，氧化磷酸化功能降低，电子传递链组分减少(99)，使心脏能量供应严重不足而进入心衰状态。13 华南理工大学博士学位论文图1-2、糖尿病性心肌病中参与代谢调解的相关信号通路研究表明，机体内许多信号转导通路参与了代谢调控过程，这些信号分子通过感受代谢状态的变化而被激活或抑制，引起下游信号分子的级联反应，通过磷酸化、乙酰化、糖基化、甲基化等方式直接影响各种代谢酶的活性，或者通过转录因子调控代谢酶的表达水平，从而对细胞的代谢过程产生影响。例如，作为胰岛素下游信号通路的PI3K/Akt，可以促进葡萄糖转运蛋白GLUT1/GLUT4转位到细胞表面而影响葡萄糖代谢(100)。Akt还激活一些糖酵解酶的活性，例如Akt使HK更靠近线粒体而自身活性增强(101)，也直接使PFK-2磷酸化，从而增加果糖-1,6-二磷酸浓度，进一步增强PFK-1的活性(102)。有研究表明，AMPK除了通过影响糖脂吸收促进代谢，也可以直接激活心肌组织的PFK-2，在缺血条件下促进糖酵解(103)。ERK信号分子除了直接引起炎症纤维化外，也与糖酵解直接相关。ERK抑制PDK4，使PDH解除被抑制的状态，促进丙酮酸转变为乙酰辅酶A进入三羧酸循环(104)。PDK4的mRNA水平也与ERK活化水平相关，PDK4过表达可引起细胞死亡，提示ERK促进细胞增殖的能力也许与对PDK4的抑制有关。此外，HIF-1α、mTOR、FOXO、SIRT等都与代谢调控有着紧密联系(74,105)。上述各种信号通路之间通过相互作用，共同维持机体能量代谢的稳定和平衡。另一方面，机体代谢酶的含量和/或活性的改变，也可能影响分子信号通路，进而引起各种生物学功能异常和疾病。例如，肝脏特异性缺失葡萄糖激酶（GK）会上调Nox，下调胰岛素受体和AMPK信号激活而引起DCM(106)。而长链脂酰辅酶A合成酶-1（LCACS1）、脂蛋白脂肪酶（LPL）或FATP1过表达的小鼠，会发生类似糖尿病的症状，伴有心功能下降和心肌肥大、纤维化及脂肪变性的特征(107,108)，意味着代谢酶进入异14 第一章绪论常状态后激活了病理分子信号通路而引起病变。此外，丙酮酸激酶M2（PKM2）与广泛的信号通路激酶及转录因子相结合或相互作用，在生物体内发挥重要功能。1.4针对糖尿病性心肌病的药物开发1.4.1流行病学与治疗难题糖尿病与心衰的关联明显，这方面的研究最早可以追溯到1881年(109)。与非糖尿病人相比，糖尿病人发生心衰的几率高2-5倍(110)，临床证据表明糖尿病人心衰发生率为19%-26%（来源于EASD、ATLAS、SOLVD等大规模临床研究的数据）(111)。统计表明，糖尿病人群有10%以上发生DCM，而年龄超过64岁的人群发病率则超过20%(112)。基于全球庞大的糖尿病患者人群以及高速增长的趋势，DCM在人群中的总体发生率高居不下，已经成为严重危害人体健康和生命安全的重大疾病。近些年，随着对DCM病理生理学机制更深入的理解，对这一疾病的应对手段也逐步增多，药物治疗也更具针对性，例如调节特定代谢过程或针对心脏结构改变的治疗效果显著。但是，总体来看，DCM的治疗依然缺乏有针对性的药物，临床需求远未满足，因而针对这一适应症开发药物是一个相对新的领域。由于DCM是一种多因素诱发的、致病机制复杂的长期慢性疾病，因此在治疗上面临诸多难题。首先，目前缺乏特异性针对DCM的治疗药物，治疗心脏病的药物未考虑到糖尿病代谢紊乱的特征，因而效果有限。其次，降血糖药物效果不理想，缺乏临床数据支持，因此仅仅依靠控制血糖无法有效应对糖尿病引起的心脏疾病(113)。而且，当糖尿病人出现明显的心脏结构和功能紊乱症状时，实际上高血糖高血脂已经对心脏形成了不可逆转的伤害，此时再考虑用降血糖药物来对抗DCM的可行性已经非常低。第三，有些病人血糖控制难度非常大，导致DCM持续恶化，难以治疗。此外，目前DCM的发病机制依然有许多未明之处，一些潜在的关键细节问题有待阐述，因此给此病的治疗带来难度。总而言之，糖尿病并发的多种因素造成的心脏疾病，仅仅从单一角度考虑，很可能无法对抗其他病理因素带来的损害，因而效果有限。1.4.2现有治疗药物目前，市场上还没有特异性针对DCM病患的药物，一般临床治疗时，会根据病人的临床症状给予特定的药物。一方面，采用抗心衰、抗心肌缺血、抗心肌肥大等心血管疾病药物来治疗DCM的心脏病理症状，降低心脏结构的改变，恢复心脏正常功能。另一方面，基于DCM主要是由于糖尿病的高血糖引起，因此采用降糖药物来控制血糖以15 华南理工大学博士学位论文降低对心脏形成的损伤，是目前临床上的一种常用应对方式。当然，还有一些利用抗氧化能力（如维生素C、维生素E等）、降血脂（主要是他汀类）或者通过细胞移植的方法进行治疗。（1）心血管保护药物常用的心血管疾病（CVD）治疗药物，理论上都可以用来治疗DCM，包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）阻断剂，如血管紧张素转化酶抑制剂（ACEi）和血管紧张素受体阻断剂（ARB）(114,115)，以及钙通道拮抗剂(116)，甚至磷酸二酯酶抑制剂(117)。对心衰的治疗则应该根据疾病的严重程度、类型（舒张型或收缩型）及相关的症状如高血压等的状况，采用不同的策略进行治疗。冠状动脉介入疗法（PCI）可显著改善CAD病人的临床表现和症状。而ARB和ACEi对人的DCM疾病和动物模型均有一定的治疗效果(118,119)。就临床现状而言，目前应用较多的是β-阻断剂，已成为治疗糖尿病引起的心衰病症的主要药物(120)。例如，雷米普利可以降低改善二型糖尿病人血浆BNP的水平，改善心脏功能(118,119)，而卡托普利可以有效改善糖尿病大鼠的心脏结构和功能异常(121)。采用β1选择性阻断剂美托洛尔可以改善STZ诱导的DCM心功能紊乱(122)。（2）抗糖尿病治疗高血糖是引起DCM的主要原因，若干临床研究表明，良好的血糖控制可以降低糖尿病微循环系统并发症(123)。然而，严格控制血糖对大血管病变的效果依然有待研究。但由于微血管病变对DCM的发生发展也非常重要，因此严格的血糖控制对这一疾病理论上应该非常有益。目前可以用于对抗DCM的常用降糖药物包括磺酰脲类（如格列本脲）、二甲双胍、噻唑烷二酮类（如吡格列酮）、肠降血糖素（胰高血糖素样肽1，GLP-1）等，也包括二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂和钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）抑制剂等新型降血糖药物。二甲双胍可以激活AMPK和自噬途径，促进胰岛素抵抗的心肌细胞和心脏组织增加GLUT4的转运和对葡萄糖吸收，从而有效降低糖尿病人心衰风险(124,125)，也可以有效对抗糖尿病大鼠和小鼠的心肌病(50,126)。吡格列酮可以通过激活PPAR-γ而缓解心脏收缩功能紊乱、促进心肌对葡萄糖的吸收，改善动物模型的纤维化，阻断DCM的发展(127)。临床上，采用利拉鲁肽可以有效治疗心功能异常，而动物实验也证实了其对DCM具有较好的保护作用(128)。在大鼠模型中，GLP-1激动剂也可以抑制心肌细胞凋亡(129)。在胰岛素抵抗和肥胖小鼠模型中，DPP-4抑制剂可抑制纤维化和氧化压力，从16 第一章绪论而改善心脏舒张功能紊乱和心肌肥大(130)。但DPP-4抑制剂对DCM病人的治疗作用有待进一步研究。在一项针对二型糖尿病人分析SGLT2抑制剂艾帕列净对心血管疾病影响的临床研究（EMPA-REGOUTCOME）中，与安慰剂结合标准治疗组相比，艾帕列净结合标准治疗可有效降低初次心血管疾病发生率和死亡率，然而，艾帕列净治疗组生殖器感染几率升高(131)，使该药物使用受到限制。（3）其他治疗药物抗氧化剂是一种广泛用于辅助治疗各种疾病的功能性物质。基于氧化应激在DCM发生发展中的重要作用，目前临床实践或实验研究中都有大量采用抗氧化剂来对抗DCM的报道(132)。维生素E可以改善糖尿病大鼠的LVSP、LVEDP和dP/dt等心功能指数，显著降低心肌组织内氧化应激水平(133)。作为一种知名的抗氧化物质，白藜芦醇已经在多项动物实验中对DCM具有良好的治疗效果(134,135)。此外，由于高血脂也是糖尿病的病症之一，因此他汀类降血脂药物也常用来对抗糖尿病引起的各类并发症。多项临床实验证实，采用他汀类药物可有效降低糖尿病人的心血管事件死亡率，降低血管风险因子(136)，且对尚未发生心血管并发症的病人具有阻止发生心血管疾病的效果。在实验大鼠DCM模型中，阿托伐他汀可以减少心肌纤维化和心肌组织内炎症，改善左心室功能，且这一作用与LDL-C的降低无关(137)。同样，在这类疾病的大鼠动物模型中，氟伐他汀也可以减轻心功能异常和心肌间质纤维化(138)。虽然目前没有临床研究分析降脂药物治疗对DCM疾病治疗的功效，但基于血脂紊乱是DCM发生发展的重要原因，因此临床上采用他汀类降血脂药物来治疗DCM理论上也是极具希望的。1.4.3新型药物研发目前，糖尿病性心肌病已经成为严重影响公众健康的重大疾病，作为糖尿病人死亡的主要原因，却缺少有效的治疗药物，给临床诊疗带来极大困难。因此，开发新型药物来满足目前尚未满足的临床需求，是当前刻不容缓的事情。随着对DCM发病机制的深入研究，以及新技术的不断出现，未来有望快速开发出针对这一疾病的特异性药物。（1）天然产物由于DCM是一种由糖尿病代谢异常引起的多因素疾病，因此单独针对心脏病变或者单独降低血糖的药物都没有获得预期的效果。在人类发展历史上，采用天然来源的植物根茎叶对抗疾病有着悠久的历史，并从中获得了许多宝贵的药用资源。因此，采用现代技术从天然植物中提取特定的药用成分，其在抗炎症、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗17 华南理工大学博士学位论文感染等多方面具有显著的功效，成为目前新药研发的一大发展方向之一。而且，天然植物提取物一般具有多功能的特性，能够针对多种病理因素发挥作用，特别适合用于治疗DCM这类多因素疾病(139,140)。（2）代谢调控剂代谢调控药物是另一大在对抗DCM方面具有理论优势和潜在效力的药物。以曲美他嗪为代表的脂肪酸氧化抑制剂(141)，与糖尿病代谢异常引起并发症的理念相吻合，通过改变代谢底物利用方式、提高代谢效率、扭转糖尿病的代谢状态，从而使外周组织包括心脏能够应对因为代谢异常而导致的损伤和功能缺陷，因而较早就有研究者建议用于DCM的治疗(142)。实际上，TMZ作为已经上市多年的抗心衰药物，通过抑制脂肪酸β-氧化、借助Randle循环间接刺激葡萄糖代谢，充分利用葡萄糖高效率地生成ATP，满足心脏在缺血和缺氧状态下的能量供应。TMZ通过抑制氧化磷酸化、促进能量代谢从自由脂肪酸（FFA）转向葡萄糖，可减轻自由基和钙超载引起的心肌损伤，保留细胞内ATP和磷酸肌酐（PCr）水平，改善内皮细胞功能，抑制细胞凋亡。动物模型研究表明曲美他嗪可减轻心脏氧化压力和脂质毒性，改善心功能，因此可以抑制DCM的发生发展(143)。但是，未来还需要人体临床试验来证实这一耐受良好的药物对治疗和预防DCM疾病的效果。（3）靶向线粒体治疗药物线粒体是细胞内能量产生的“加工厂”，为机体内各种生物学过程提供能量。研究表明，由于心脏需要不断收缩、对能量要求极高，心肌细胞内线粒体数量显著多于体内其他各种细胞中的线粒体，线粒体功能对于心脏而言就显得更为重要。各种原因、包括糖尿病引起的心脏病，线粒体功能下降是较为常见的症状之一，也是导致心衰发生的关键因素。因此，开发靶向线粒体的治疗药物，用于对抗各种原因引起的心脏能量代谢不足而引起的心衰，也是一种极具发展前景的应对DCM的手段(144)。例如，抗氧化肽SS31（D-Arg-2',6'-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2）是一种带正电荷的自由基清除剂，能在线粒体中高水平富集，有效阻止舒张功能异常、纤维化和心肌肥大(145)。因此，SS31代表了一类具有恢复能量、使细胞能量工厂再充电的化合物。（4）细胞和基因治疗随着DCM病理机制研究的深入和新技术的发展，细胞和基因治疗也展现出良好的发展势头，有望成为对抗DCM的高效方法。细胞治疗、特别是采用干细胞技术来修复不同原因引起的心肌细胞损伤和凋亡前景广阔，有望实现心脏修复而维持其功能。基因18 第一章绪论治疗直接而特异地在分子和细胞水平改变心肌细胞应对外界压力刺激的能力，提高心肌细胞存活能力，增强心肌细胞收缩能力，增强钙离子调控蛋白活性，甚至将其他类型的细胞转化为心肌细胞，解决了一些信号通路无法通过药物来调控的难题，为DCM的治疗提供了另一种极具希望和发展前景的方式。例如，通过基因治疗导入神经生长因子可以保持微血管密度、心脏灌注、左心室舒张和收缩功能(146)。静脉注射表达Pim-1的载体可有效改善LV舒张功能，组织心肌凋亡、纤维化和心衰的发生(147)。1.5本课题的研究方案本课题为疾病发病机制探讨与新药研发相结合的科学课题，旨在充分利用天然产物中的单一成分提取物，通过药效学分析和安全性初步探讨，并阐述药物的可能作用机制，为糖尿病性心肌病的治疗寻找新型的应对方法。从甜叶菊（SteviarebaudianaBertoni）叶中提取的甜菊类化合物（Stevia），是一种安全有效的非热量非合成甜味剂(148)，其类似物异甜菊醇（Isosteviol）被广泛研究用于各种疾病的预防和治疗。本研究的主要对象为异甜菊醇钠（STVNa），是异甜菊醇的钠盐形式，自然状态下为白色粉末。异甜菊醇最初只能从天然植物——甜菊的叶子中采用特定的方法提取获得，后来经本实验室科技攻关，建立了半合成的方法(149)，并采用独特的方法获得更高水溶性的化合物，大大提高了异甜菊醇的生物利用度(150)。本实验室前期已经做了大量的科研工作，证实STVNa可以调节机体的多个生物学过程，具有广泛的生理学功能，在对抗心肌缺血、心肌肥大、脑缺血损伤等方面具有显著疗效。在采用异丙肾上腺素（ISO）诱导的心肌肥大的体外细胞模型中，抗氧化蛋白Prx2和Trx1都显著降低(151)，而STVNa可以明显提高这两种蛋白的表达，降低氧化应激水平；STVNa还能阻止心肌细胞动作电位的延长、调节钾离子瞬时外向电流（Ito）和L型钙离子通道而阻断心肌肥大(152)。同时，STVNa具有显著的对抗压力负荷（主动脉弓缩窄，TAC手术）引起的左心室肥大和纤维化作用（本实验未发表数据）。STVNa还可以增强ATP敏感性钾离子通道（sarcKATP）对钾通道开放剂吡那地尔的敏感性(153)，提高对心脏疾病的疗效。STVNa还可以通过抑制ERK1/2通路来抑制压力负荷引起的右心室肥大和肺动脉高压(154)，也能抑制线粒体裂解，增强病理状态下线粒体功能而缓解心肌肥大(155)。在缓解脑缺血损伤方面，STVNa同样具有显著效果：通过抑制神经元细胞凋亡而缓解瞬时或永久性局部脑缺血损伤(156)；通过抑制星形胶质细胞增生而治疗脑缺血/复灌损伤(157)；通过调节TLR/NF-κB信号通路、降低炎症反应而对抗永久缺血19 华南理工大学博士学位论文性脑损伤和外伤性脑损伤(158,159)；同时，STVNa还能通过下调miRNA-181b而增强圆柱瘤基因（CYLD）的表达，降低二氯化钴（CoCl2）对N2A小鼠神经母细胞瘤细胞的损伤(160)。其他实验室的研究也证实了异甜菊醇或其类似物对心血管疾病方面的疗效。例如，异甜菊醇对心肌缺血复灌具有明显的保护效果，减少梗死面积，其功能与ATP敏感钾离子通道（mitoKATP）开发有关(161)。甜菊提取物也可以促进GLUT4转运到细胞膜上而增加葡萄糖吸收，激活PI3K/Akt信号通路(162)。由此可见，STVNa是一种具有显著心脑血管保护作用的化合物，可以用于心脑血管疾病或者其相关病症的治疗。同时，异甜菊醇及其类似物或衍生物作为天然植物来源的各类化合物，已有部分研究认为其具有明显的降血糖作用。有研究表明，甜菊苷（SVS）可以改善高脂肪饮食引起的二型糖尿病的血糖和胰岛素水平，提高机体对胰岛素的敏感性(163)。异甜菊醇可以降低血浆葡萄糖的水平并缓解葡萄糖耐受不良，对Zucker二型糖尿病大鼠的高血糖有抑制作用，对正常Wistar大鼠无效，提示其降血糖效果可能与增加外周组织对胰岛素的敏感性有关(161)。与此相印证的是，在胰岛素刺激条件下，低剂量的甜菊苷可以促进肌肉组织对葡萄糖的吸收(164)。异甜菊醇的多个衍生物也具有一定的降血糖效果，可以改善静脉注射葡萄糖耐受不良(165)。还有研究认为异甜菊醇可以改善棕榈酸引起的胰岛α细胞功能紊乱，促进胰岛素受体（INSR）、胰岛素受体底物1（IRS1）和PI3K/Akt等基因的表达(166)。最新的一项研究认为甜菊提取物可以降低STZ诱导的一型糖尿病大鼠的血糖(167)。由此可见，甜菊提取物在降血糖（对抗糖尿病或代谢综合征等）和心脏保护（抗心肌缺血和心肌肥大等）方面都具有显著的效果，这一点正好与DCM的发生发展机制相吻合，因此如果采用一种单独的甜菊提取物如STVNa能够同时缓解高血糖高血脂和抑制心肌病变，将成为未来对抗DCM的有力工具。本研究推测STVNa可能通过抑制AGE产物引起的炎症和氧化应激、促进葡萄糖代谢而缓解DCM疾病。因此，本研究采用链脲佐菌素（STZ）诱导的大鼠一型糖尿病模型结合大鼠H9c2心肌细胞体外研究的方法，主要分析药物的作用效果和作用机制，并设置已经上市的抗心衰代谢调控药物曲美他嗪（TMZ）作为对照药物。首先通过动物模型验证STVNa对糖尿病引起的心脏疾病的保护作用，选择合适的指标和生物标志物，从肥大、纤维化、氧化应激、炎症等多方面分析药效，主要包括心功能测定、组织化学染色、免疫组化染色、半定量核酸扩增（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、生化分析等研究方法。同时，采用正常动物模型给予药物治疗特定时间，初步分析药物的安全性。接着，采用体外细胞模型分析药物的作用机20 第一章绪论制，观察不同条件下的细胞形态和活力，荧光探针染色测定细胞内ROS水平，ELISA测定特定蛋白的浓度，荧光定量PCR或蛋白电泳/杂交（SDS-PAGE/Westernblot）检测标志物或信号通路的改变等。最后，综合体内和体外实验结果，探讨DCM发生后AGE、ERK、NF-κB、AMPK、Nox-2/TRPC3等多个信号通路或关键分子的改变，以及药物对这些分子表达或活性的影响，全面验证药物作用的效果和机制。图1-3、本课题研究技术路线本课题所用的阳性对照药物曲美他嗪是一种已经上市多年、用于治疗心衰和心功能紊乱的小分子化合物。TMZ是代谢调节药物的典型代表，尽管有一定争议，但目前普遍认为是通过抑制了脂肪酸β-氧化最后一步的关键酶——3-酮烷酰辅酶A硫解酶（3-KAT）而抑制脂肪酸氧化(168-170)。根据1963年Randle等提出葡萄糖-脂肪酸循环（Randle循环）学说，葡萄糖氧化和脂肪酸氧化之间存在代谢竞争，糖尿病高血脂使心肌细胞脂肪酸氧化增加，细胞内乙酰辅酶A累积，抑制丙酮酸脱氢酶，三羧酸（TCA）循环速率下降，浓度升高的柠檬酸直接抑制磷酸果糖激酶，导致糖酵解被抑制。因此，TMZ抑制脂肪酸氧化后，葡萄糖氧化会增强，使氧的利用率增加，在缺氧条件下生成更多的ATP。在这种情况下，TMZ相当于逆转了糖尿病引起的心脏代谢紊乱，成为一种理论上非常理想的对抗DCM的药物，如果未来能够通过大规模临床研究充分阐述对21 华南理工大学博士学位论文DCM的疗效，很有可能成为老药新用的成功案例(171)。在分子机制方面，普遍证实TMZ可以激活AMPK信号通路，直接促进葡萄糖代谢过程(172)。但是，TMZ对不同原因引起的心脏病变中ERK信号分子的调节呈现不同的结果，可能与动物种类、疾病模型、细胞类型等因素相关(142,173)。此外，TMZ还增加miR-21的表达而缓解右心室病变(174)，调节线粒体膜通透性，增强线粒体功能(175)，降低细胞内氧化应激水平(176)，抑制中性粒细胞浸润，减轻炎症反应。基于上述各种原因，在目前没有专门治疗DCM药物的情形下，采用TMZ作为阳性对照药物，不但可以比较分析研究对象STVNa的性能，也可以进一步印证TMZ是否在对抗DCM方面具有独到优势，是较为合理、也极具参考意义的方案。1.6总结与展望糖尿病性心肌病已然成为极度危害健康的重大疾病，而目前缺医少药的情形正是导致糖尿病人致残率和死亡率高居不下的原因，如何针对这一病症的特点开发新药或者老药新用，是目前急需解决的问题。本实验室长期以来对天然来源的植物提取物异甜菊醇钠进行了广泛而深入的研究，在对抗心肌缺血/复灌损伤、心肌肥大等方面取得显著效果，结合其他实验室研究证实各种甜菊提取物对血糖、血脂、胰岛素等代谢病症的影响，在此基础上进一步分析探讨其对糖尿病引起的心肌病变的治疗效果及机制。通过本课题的研究，有助于理解DCM疾病发生发展的动态过程和病理机制，探讨采用天然植物提取物在缓解DCM方面的潜力和可行性，同时分析已上市抗心衰药物TMZ是否可能成为治疗DCM的潜力药物，为今后更有针对性地探明疾病关键节点、确立特异性标志物、寻找作用靶点、开发药物提供基础。22 第二章大鼠一型糖尿病性心肌病模型的建立与验证第二章大鼠一型糖尿病性心肌病模型的建立与验证2.1前言作为一种由高血糖引起的慢性心脏疾病，糖尿病性心肌病给人类健康带来巨大威胁。虽然临床医生已经深刻认识到这一疾病确切性和重要性，但对这一疾病的发生发展具体机制依然不够了解，特别是缺乏对大规模人群进行长期跟踪调查的临床数据。因而，有关DCM发病关键机制、发病动态过程、关键时间节点等因素的研究，必须通过动物、特别是啮齿类动物模型来模拟分析。一型糖尿病（Akita小鼠、NOD小鼠、BB大鼠、STZ诱导模型）还是二型糖尿病（ob/ob小鼠、db/db小鼠、Zuker大鼠、饮食诱导模型），尽管发病机制有所差异，但引起的DCM症状却非常相似，因此目前实际研究中更多地利用建模和操作更为简便的STZ诱导一型糖尿病来研究DCM的病理生理学，建立准确的诊断和预后方法，并开发有效的治疗药物。然而，即便是一型糖尿病引起的心脏病动物模型，不同的动物种属、诱导方法、研究周期、研究手段和评判标准，往往会得到大相径庭的研究结果。以大鼠一型糖尿病DCM为例，有的研究较早就观察到了心肌肥大和纤维化，而有的研究肥大和纤维化发生的时间较晚，心功能的改变时间在不同研究之间也有所不同。由于多数研究只设置一个时间节点，因而无法判断，这些差异的原因仅仅是因为检测时间的不同，还是由于诱导剂量和方法以及饲养环境的差异导致疾病本身发展的轻重缓急有所不同。这一状况，给相关的研究造成一定的不确定性，也给解释和比较不同研究之间的结果带来难度。表2-1显示了过去十多年中采用大鼠（SD或者Wistar）对DCM病理生理学和药物治疗方面进行研究的时间周期，可以看出，不同研究之间的时间节点差异很大。不同研究之间的周期差异大，一方面说明了DCM是一种复杂的多因素疾病，不同的实验条件会有不同的研究周期和结果，但另一方面也给同类研究带来了一定的难度，研究人员无法有效判断舒张和收缩功能开始出现异常的时间，无法准确把握心肌肥大和纤维化开始出现的时间点，从而也影响实验研究中对周期和长度的确定。因此，系统性研究DCM发生发展的动态过程，从而准确把握心脏在面临高血糖等代谢异常压力时是如何从代偿反应进入失代偿并最终发展成为心衰的关键节点，为药物开发提供更精准的设计思路。23 华南理工大学博士学位论文表2-1.STZ诱导的大鼠DCM研究周期及表型变化糖尿病诱导方式糖尿病持心功能情况结构变化参考续时间文献*2月龄雄性Wistar大鼠1周HW/BW、TG、TC、CK-MB、N/A(177)（70-90g），腹腔注射STZLDH和AST升高（65mg/kg）200-250g的Wistar大鼠，单2周ST波段升高，ST高度增加；CK-MB、LDH下降，(178)次腹腔注射STZ（55mg/kg）dP/dtmax和dP/dtmin均显著降GSH、SOD和过氧化低，LVEDP显著升高氢酶活性降低4周龄雄性Wistar大鼠，连16天HR、IVS、LVPWd、LVPW和肥大，凋亡；(179)续三次尾静脉注射STZFS均显著降低ROS/RNS、COX-2增（65mg/kg）加，SOD-1下降4周龄雄性Wistar大鼠，单16天HR、BW、CO和FS、EF及dp/dtN/A(180)次尾静脉注射STZ降低，ANP、BNP等升高（65mg/kg）8周龄Wistar大鼠，STZ单4周LVPWd、LVPWs、EF和FS均心肌细胞凋亡显著增(181)次腹腔注射（55mg/kg）显著下降加250克左右的SD大鼠，单次4周HR、SV、SW、CO和Tau，Pes、心肌细胞横截面积增(182)静脉注射STZ，剂量为EF及dp/dt降低，Ea升高加（肥大）65mg/kg体重250-270g的SD大鼠，禁食4周HR、LVSP降低，LVEDP升高，心肌间质和外围纤维(183)过夜后单次腹腔注射STZdp/dt幅度下降化增加（65mg/kg）230-270g的SD大鼠，禁食6周N/A心室壁变厚（肥大），(184)过夜后单次腹腔注射STZ心肌细胞和线粒体结（70mg/kg）构异常200-240g的Wistar大鼠，单6周N/APCNA阳性细胞增加，(185)次腹腔注射STZ（60mg/kg）纤维化沉积150-200g大鼠，单次腹腔注45天dp/dt、LVDP下降，心率减低，N/A(186)射（50mg/kg）STZ收缩血压升高300-330g的SD大鼠，STZ7周LVEDD、LVESD显著升高；LVEF心脏体重比显著增加，(187)（70mg/kg）腹腔注射显著下降肌丝不完整，线粒体形态失常6周龄的雄性SD大鼠，8周LVSP、+dp/dt、-dp/dt降低，肥大，纤维化(188)140-180g，单次腹腔注射STZLVEDP升高（65mg/kg）6-8周的Wistar大鼠单次腹腔8周心率降低，QT间期延长，LVEDP、心肌细胞凋亡增加，多(189)注射STZ（55mg/kg）LVSP、MAP升高，dp/dtmin和形核中性白细胞增加，收缩指数降低出血，肌小节破坏SD大鼠，单次静脉注射STZ8周E波速率、E/A、LVSP、LVPw、心肌肥大，纤维化沉积(190)（剂量为55mg/kg）LV外部直径、dp/dt显著下降200-250g的雄性Wistar大鼠，8周血压血脂升高，心率降低，收缩体重减轻，心肌肥大(191)尾静脉注射STZ（50mg/kg）力下降350-400g的雄性Wistar大鼠，8周LVID、LVIS、ISVT、PWTh、E/A炎症细胞增多，氧化(192)禁食6小时后，单次尾静脉升高；IVRT降低；EF和FS无显应激升高，纤维化显注射STZ（50mg/kg）著变化著225-250g的SD大鼠，禁食过8周动脉压、EF、CO、dp/dt下降，ANP/BNP升高，心肌(193)夜后单次腹腔注射STZLVEDP和Tau升高肥大，纤维化，心脏（60mg/kg）重量增加24 第二章大鼠一型糖尿病性心肌病模型的建立与验证表2-1.STZ诱导的大鼠DCM研究周期及表型变化（续）糖尿病诱导方式糖尿病持心功能情况结构变化参考续时间文献200-250g的Wistar大鼠，单10周N/A纤维化，线粒体结构失(194)次腹腔注射STZ（60mg/kg）常，炎症，氧化应激，凋亡增强250-280g的Wistar大鼠，单10周收缩压、舒张压、心输出量和N/A(195)次静脉注射（60mg/kg）的STZdP/dtmax等显著降低250-280g的Wistar大鼠，以12周LVP、LVEDP、PS等下降N/A(196)55mg/kg的剂量单次腹腔注射STZ200-250g的Wistar大鼠，静12周LVEDP升高，LVSP、dP/dt、HR纤维化，活性氧压力升(197)脉注射STZ（45mg/kg）升高高200-250g的Wistar大鼠，STZ12周收缩压和心率下降肥大，脂肪沉积增加(198)（60mg/kg）静脉注射220-250g的Wistar大鼠，腹12周LVDd、LVDs显著增加心肌肥大，纤维化(199)腔注射50mg/kg的STZ180-220g（6-7周）的SD大12周LVSP、+dp/dt、-dp/dt降低，心肌纤维化，心肌细胞(200)鼠，单次腹腔注射STZLVEDP升高凋亡；血管变稀；心肌（70mg/kg）肥大，心脏体重比增加；肌纤维降解，形态异常220-230g的SD大鼠，单次静12周LVSP、dP/dtmax、dP/dtmin下降，N/A(135)脉注射STZ（45mg/kg）LVEDP升高200g左右的SD大鼠，采用90天（13E/A下降胶原沉积增加，成纤维(201)AGE灌注，50mg/kg/天周）细胞增殖（纤维化）6周龄Wistar大鼠，尾静脉注20周N/A胶原纤维化增加，肌纤(202)射STZ（35mg/kg）维萎缩，肌小节长短不一，线粒体膨胀200-250g的SD大鼠，禁食过24周N/A心肌组织坏死，炎症(203)夜后单次腹腔注射STZ细胞浸润，肌小节和（45mg/kg）肌纤维重构*N/A，未检测相关指标。然而，目前对DCM发展过程进行动态分析的研究非常有限，只有极少数研究会设置两个以上的时间节点(204-208)。近期一篇研究对比分析了两个以上时间点糖尿病心肌病变的状态，但在时间点设置上没有考虑到糖尿病心肌病是一种慢性疾病的特点，时间周期相对较短，不能给相关研究提供充足的信息(40)。为了验证模型建立的成功与否，以及阐述DCM的发生发展过程，本研究利用研究中较为常用的单次腹腔注射剂量STZ的方式诱导Wistar大鼠一型糖尿病后，在不同的时间节点测定心脏结构和功能的变化，分析DCM主要特征指标的变化，验证模型的可靠性。同时，也有助于较为准确地掌握一型糖尿病大鼠DCM疾病发生发展的过程，特别是心肌肥大和纤维化出现的时间，以及舒张和收缩功能在不同时间点的表现。通过阐明DCM的疾病过程，有助于明确心脏如何从代偿阶段进入失代偿及心衰阶段，为同类研究提供参考。25 华南理工大学博士学位论文2.2材料与方法2.2.1动物180-210g的雄性Wistar大鼠（6-8周龄），购自广州中医药大学（实验动物生产许可证：SCXK（粤）2013-0020）和中山大学（实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2011-0029、实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2011-0112）。大鼠饲养在恒温（20-22℃）条件下，不同组动物以3-4只/笼分笼饲养，整个试验期间光照和黑暗（12小时/12小时）交替，同时给予充足的食物和水。每天观察动物活动情况，每周称量体重至少两次，并在特定的时间点测定血糖浓度。2.2.2试剂（1）动物实验链脲佐菌素（购自青岛捷世康生物科技有限公司，SigmaS0130，10g/瓶）；柠檬酸缓冲液100mmol/LpH4.5（广州杰特伟生物科技有限公司，100ml/瓶）；医用碘伏消毒棉球（青岛海诺生物工程有限公司，30枚/瓶）；戊巴比妥钠（北京华迈科生物技术有限责任公司，Merck进口分装，5g/瓶）；肝素钠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，185U/mg）；氯化钠（成都市科龙化工试剂厂，分析纯，500g/瓶）；磷酸盐缓冲液（PBS）粉剂（北京中原公司，1L/袋）。（2）组织化学染色甲醇、甲醛、1,2-丙二醇、二甲苯、无水乙醇等购自成都市科龙化工试剂厂（分析纯，500mL/瓶）；石蜡（德国Leica，1kg/包）；苏木素染色液（北京华迈科生物技术有限责任公司，Merck，500mL/瓶）；伊红（北京华迈科生物技术有限责任公司，Merck，500mL/瓶）；天狼猩红（北京华迈科生物技术有限责任公司，Sigma，5g/瓶）。（3）缓冲液、试剂与药物溶液配制生理盐水：准确称取0.89g的氯化钠，溶于1000mL的纯化水中，湿热高温灭菌后，2-8℃保存备用。链脲佐菌素溶液的配制：采取临用前即配即用的方式，在冰上操作，尽量避光。称取链脲佐菌素1g，加入100mM的柠檬酸缓冲液（pH=4.5）10mL，充分溶解，得到100mg/mL的溶液，冰上放置，立即用于注射实验动物。3%戊巴比妥钠溶液配制：精密称取0.3g的戊巴比妥钠，溶于10mL的生理盐水中，2-8℃保存备用，备用。26 第二章大鼠一型糖尿病性心肌病模型的建立与验证1%肝素钠生理盐水配制：精密称取0.2g的肝素钠，溶于20mL的生理盐水中，2-8℃保存备用，备用。（4）PCR检测试剂扩增引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列分别为：ANP（上游：5'-CAGCTCTCAAAGGACCAAGG-3'，下游：5'-TAAAACAACCTCAGCCCGTC-3'）；TGF-β1（上游：5'-GCAACAACGCAATCTATGAC-3'，下游：5'-CCCTGTATTCCGTCTCCTT-3'）；β-actin（上游：5'-CGAGTACAACCTTCTTGCAG-3'，下游：5'-GAGTCCTTCTGACCCATACC-3'）。即用型高保真PCR扩增试剂盒（含蓝色染料，1mL×5，GK8007）、琼脂糖、50×TAE电泳缓冲液、5×LoadingBuffer（GR0205-500）和DNALadder100bp-I（DL1001）均购自上海捷瑞生物工程有限公司。2.2.3仪器设备分析天平（梅特勒-托利多，型号：ML104）、电子分析天平（MetterToledo，型号：ML/04/02）、精密分析天平（MetterToledo，型号：XS/05）、pH计（上海雷磁有限公司，PhSJ-4A）、雪花制冰机（广州人福贸易有限公司，型号：XB-100）、超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司，型号：SB-120DT）、电热鼓风干燥箱（上海精宏设备有限的公司，型号：DHG-9146A）、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHG-9053A）、电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHP-9032）、高温灭菌锅（上海博迅实验有限公司，型号：YXQ-LS-50S）、MilliQ超纯水仪（美国Millipore，型号：ElixEssential10+A10）、冷冻冷藏冰箱（中国松下，型号：NR-B23SP1-S）、冷冻冰箱（中美科菱，型号：NR-B23SP1-S）、-86℃超低温冰箱（美国Thermo，型号：88300V）、-86℃超低温冰箱（中美科菱）、液氮罐（美国Thermo，Locator6plus）、磁力搅拌器（美国Thermoscientific）、小型二维振荡器（美国ThermoFisher公司，型号：4630-1CECN）、涡旋混合仪（美国ScientificIndustries，型号：G560E）、超净工作台（BoxunBJ-CDSERIES）、中低速离心机（Cence湘仪，型号：L500）、高速离心机（美国ThermoFisher公司，型号：MICRO21R）。血糖仪及配套试纸（罗氏诊断公司，型号：卓越型ACCU-CHEK®Performa）、外科手术设备（广州器化医疗设备有限公司）、小动物呼吸机（HarvardApparatus,Holliston,MA,USA）、小动物电子秤（永康市华鹰衡器有限公司，型号：ASC-30）、光纤冷光源喉镜（F-150S）、恒温加热垫（广州飞迪生物科技有限公司，型号：PLS-20A）、血液动27 华南理工大学博士学位论文力学分析仪（ADInstrumentsInc.）、PowerLab数据采集分析系统（ADInstrumentsInc.）、心功能检测导管SPR-838（美国MillarInstrumentsInc.）、组织脱水机（德国Leica，型号：TP1020）、石蜡包埋机冷台（德国Leica，型号：EG1150C）、石蜡包埋机热台（德国Leica，型号：EG1150H）、旋转式切片机（德国Leica，型号：RM2255）、多功能染色机（德国Leica，型号：ST5020）、光学显微镜（德国Leica，型号：DM4000-E1）、倒置生物显微镜（奥特光学，型号：BDS200-PN）、微量分光光度计（美国ThermoFisher公司，型号：NanoDrop2000）、微波炉（型号：广东格兰仕集团有限公司，P70D20P-TD）、PCR仪（美国应用生物系统公司，型号：ABI2720ThermoCycler）、核酸电泳仪（上海天能科技有限公司，型号：EPS300）、凝胶成像分析系统（美国ProteinSimple公司，型号：FluorChamM）。2.2.4耗材100mL、500mL、1000mL烧杯，100mL、500mL、1000mL蓝盖试剂瓶，100mL、500mL、1000mL量筒，1ml、5ml、10ml一次性注射器，4-0医用真丝编织线，一次性棉签，医用棉花，0.5mL/1.5mL/2mL离心管，玻璃培养皿，医用纱布，医用胶带，PE10塑料管，PE50塑料管，吸水滤纸，15/50mL离心管，20μL/200μL/1000μL枪头，胶头吸管。所有耗材购自有国内资质的厂家或经销商。核酸凝胶调用配套的耗材由北京六一生物科技有限公司提供。2.2.5一型糖尿病模型构建采用100mM的柠檬酸缓冲液（pH=4.5）配制链脲佐菌素（STZ）溶液：称取一定量的STZ后置于15mL或50mL的离心管内，加入适量柠檬酸缓冲液到离心管中，充分溶解（必要时超声处理），配制成20mg/mL的溶液。大鼠禁食过夜后，按照55mg/kg的剂量计算注射体积，通过腹腔注射STZ溶液。对照组大鼠（正常组），根据相同的体积计算方法，注射相应体积的柠檬酸缓冲液。2.2.6血糖浓度测定注射STZ前或注射后不同时间点，大鼠禁食过夜后，通过尾部采血测定血糖浓度。即大鼠固定住后，用刀片切割尾部，挤出适量的血液，用插入血糖检测仪的血糖试纸接触血液后，血液会被试纸吸收，过1-3秒后通过血糖仪读取血糖浓度。试验期间或实验结束时，均采用相同的方法测定血糖浓度。28 第二章大鼠一型糖尿病性心肌病模型的建立与验证2.2.7动物分组20只正常大鼠，按照下表所示分别饲养4、8、12和16周（每个时间点4-5只）。28只糖尿病造模成功的大鼠同样分别饲养4周（N=4）、8周（N=8）、12周（N=10）和16周（N=6）。在不同时间点分别检测心功能和心脏的病理学改变。2.2.8活体动物血液动力学和心功能检测实验结束时，采用心脏插管的方式测定心功能(209)。大鼠称重后，进行深度麻醉（戊巴比妥钠以3%的浓度配制，按照30-50mg/kg体重的剂量腹腔注射），采用2FrMillarMIKRO-TIP导管及配套的PowerLab系统（ADInstrument），测定动脉压、左心室压力和左心室舒张及收缩功能。舒张功能参数包括LVEDP、dp/dtmin、左心室松弛时间常数（Tau）；收缩功能参数包括LVESP、dp/dtmax。同时，对心率（HR）、MAP等指标进行分析检测。具体步骤为，大鼠麻醉后，腹部朝上固定于37℃恒温的平台上，经口插入导气管接上呼吸机。然后将三个外径为22G的不锈钢针状电极分别插入大鼠的左上肢、右上肢、左下肢的皮下，连接生物电放大器，通过十六通道的PowerLab记录系统监测大鼠的心电图。接着，在颈部及下肢腹股沟部位清除毛发，并用碘伏消毒后，将表皮剪破后，小心分离皮下组织和颈前正中肌肉，找到呈“T”型的三块肌肉，采用玻璃分针将颈总动脉剥离出来，并分离出足够的长度，远心端结扎后，用动脉夹夹闭近心端并穿线。用小型手术剪在血管壁上剪一小口，插入压力感受导管，沿着动脉不断插入直到进入左心室，通过微调位置，确保检测到稳定的压力-容积环，然后用已经穿好的线扎紧固定。同时，根据检测说明校准压力换能器。按照常用的钝性分离方法，用玻璃分针小心分离股动脉、穿线，结扎远心端，近心端用动脉夹夹闭后穿线备用，然后在靠近近心端结扎处的位置剪一“V”型小口，插入内含1%肝素生理盐水溶液的PE导管，松开动脉夹，并继续往里插入到股动脉并进一步深入腹主动脉，此时，可见PE导管有明显的血液波动，且屏幕出现比较稳定的动脉波形，在近心端用线固定导管避免脱出。2.2.9内脏分离与血浆制备完成心功能测定后，依然处于麻醉状态的大鼠，打开胸腔，从心尖处插入采血用注射器，抽取适量的血液，加入一定比例的肝素钠，在4℃下3000-5000g离心10分钟，将上清转移到另一离心管即为血浆，分装后-80℃保存备用。抽血完成后，放血使大鼠安乐死。快速分离心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏和主动脉29 华南理工大学博士学位论文血管等，用冰浴的磷酸盐缓冲液清洗，吸干水分后准确称重，并测定胫骨长度。将心脏横切成四等分，依次为心尖、心室第二块、心室第三块和心房，心室第二块采用10%的中性福尔马林固定，其余三块迅速放入液氮中，随后转移到-80℃长期保存备用。肝脏的一部分、左肾、肺脏采用10%的中性福尔马林固定。肝脏其余部分、右肾、主动脉血管经液氮预冷冻后转移到-80℃长期保存。2.2.10组织学分析采用PBS（0.1M，pH=7.4）配制的4%的福尔马林固定的左心室第二块，采用梯度乙醇脱水，经石蜡包埋后切片，然后进行苏木精/伊红染色（H&E染色）、天狼星红（0.1%）染色等分析(210)。（1）切片首先，将心脏组织放入4%的多聚甲醛溶液中固定24小时以上。然后放进包埋盒内，先后采用75%酒精1小时、85%酒精1小时、95%酒精2小时、95%酒精2小时、100%酒精2小时、100%酒精2小时、二甲苯+100%酒精2小时、二甲苯2小时、二甲苯2小时进行脱水和透明处理。然后，分别放在石蜡Ⅰ中45分钟、石蜡Ⅱ中45分钟、石蜡Ⅲ中1小时进行浸蜡处理。随后将熔化了的石蜡加进包埋模具少许，然后用加温的镊子将心肌组织从包埋盒中取出，迅速放进包埋模具的石蜡中，然后加蜡淹没组织。置于冷冻台上冷却，使之凝固。接着用刀片将蜡块进行修片，切去多余石蜡。将蜡块固定于切片机上，切成厚度为3μm的切片。然后将切好的组织薄片小心转移到放置了冰袋的水中，用镊子小心把片子上的气泡排除，避免把组织弄碎。将组织薄片贴附于做好标记的载玻片上，再转移到温水（38-42℃，接近石蜡熔点，有利于切片充分展开）中充分展开，再次贴附，然后把载玻片放置于晾片架上。室温晾干后，放进玻片盒中，保存备用。（2）苏木精伊红（H&E）染色首先，将待染色切片置于60℃恒温箱中烘烤1-2小时进行拷片，确保石蜡充分溶解。接着将切片置于切片架上，在自动染色机上进行染色，具体过程为：二甲苯处理10分钟，两次，目的是置换石蜡；无水乙醇5分钟，处理两次，置换二甲苯；接着95%乙醇处理5分钟、95%乙醇处理2分钟、85%乙醇处理2分钟；用自来水冲洗1分钟后，用苏木素染色液处理2分钟，自来水冲洗2分钟，1%盐酸酒精7秒；自来水冲洗3分钟；1%的氨水反蓝30秒；流水冲洗5分钟后，1%的伊红染色2分钟，自来水冲洗5秒；接着，经95%乙醇5秒、95%乙醇10秒、无水乙醇2分钟处理三次、二甲苯5分钟处理两次进行脱水透明。染色机运行停止后，从中取出切片，用中性树脂封片，置于显微30 第二章大鼠一型糖尿病性心肌病模型的建立与验证镜下观察。H&E染色结果采用Leica显微镜观察分析，放大倍数为400倍，每个切片选择5个以上不同区域，心肌细胞面积采用ImageProPlus6.0分析，即根据放大倍数校正标尺后，在每个区域选定10个以上的完整横切面心肌细胞，沿着细胞边缘划定封闭区域，软件统计计算划定区域的面积。（3）天狼星红（SiriusRed）染色按前述方法拷片并脱蜡至水后，自来水冲洗2分钟后磷钼酸水溶液分化1分钟，轻轻甩去液体，加入1%的天狼猩红-苦味酸染色60分钟后轻轻甩去染液，将切片在0.01M盐酸中浸泡4下，每次1秒。自来水冲洗后，采用同H&E中的脱水透明方法处理后，中性树脂封片，在显微镜下观察拍照。在显微镜（放大倍数为200倍）下观察染色情况，选择不含血管胶原的区域对每个样品随机拍摄5-10个视野，采用ImagePro分析胶原染色情况，即根据染色中胶原沉积的颜色（紫红色）选择颜色，用软件自动匹配出相同的颜色区域，然后软件自动计算胶原沉积区域颜色的面积和强度。2.2.11信使RNA（mRNA）表达水平检测（1）总RNA提取与浓度测定采用捷瑞生物科技有限公司的离心柱型总RNA提取试剂盒，根据说明书操作提取总RNA。具体步骤为：（a）称取50mg左右的心肌组织，采用玻璃研磨器将组织在冰上进行匀浆后转移到1.5mL离心管内；（b）按照每50mg组织加入1.0mLRnaEX的比例加入RnaEX，旋涡震荡30秒，室温（15-30℃）放置5分钟，确保样品充分裂解；（c）按照1mL的RnaEX加入200μL氯仿的比例加入氯仿，剧烈震荡30秒充分混匀，室温放置3-5分钟；（d）12000rpm、4℃离心5-10分钟，使溶液上下层充分分层；（e）将上层的450-500μL液体转移到另一个1.5mL离心管内，加入200μL无水乙醇，充分混匀；（f）然后全部液体（包括可能形成的沉淀物）全部转移到2mL离心管内的GenClean柱子内，室温放置2分钟，台式离心机8000rpm、室温离心1分钟；（g）取出柱子，倒掉收集管内的废液，将柱子放回收集管内，加入600μL的RWA洗液，台式离心机上8000rpm离心30秒；（h）重复步骤g一次；（i）小心取出柱子，将收集管内倒弃干净，在柱子放入收集管，12000rpm室温离心1分钟；（j）取出柱子，放入另一个无RNA酶（RNase-free）的1.5mL离心管内，在柱子内的膜中央加入30-50μL的DEPC水，60℃恒温箱内放置2分钟，使RNA充分溶解；（k）12000rpm室温离心1分钟，即得到总31 华南理工大学博士学位论文RNA溶液，测定RNA浓度后-80℃保存备用。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰，测定260nm波长处的吸光度，可以直接计算RNA的浓度，一般吸光度（OD）值为1相当于大约40μg/mL的单链RNA。例如，如果比色杯光路为1cm，采用DEPC水读取空白值，接着测定DEPC水溶解的样品的吸光度，根据260nm处的吸光度值即可计算出样品中RNA的浓度：RNA浓度（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。总RNA提取后，采用NanodropND-2000测定浓度。即打开分光光度计及配套电脑，选择核酸（RNA）检测模式，用EDPC水调节空白后，加入2μL左右的样品，点击测定，得到RNA浓度值，并记录260nm与280nm吸光度的比值，该比值为2.0左右时代表RNA纯度较高。总RNA的浓度和纯度进一步经过琼脂糖凝胶（0.8-1.2%）电泳验证。（2）逆转录采用逆转录试剂盒（RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit，ThermoFisher），根据说明书操作。首先，在0.2mL的PCR管内加入0.5-1μg的总RNA和1μL的Oligo(dT)18引物，然后补充双蒸水到12μL。在PCR扩增仪（AppliedBiosystems2720ThermalCycler）上，65℃加热5分钟。接着，取出PCR管，每管加入5×ReactionBuffer4μL、RiboLockRNaseInhibitor（20U/μL）1μL、10mM的dNTPMix2μL和RevertAidM-MuLVRT（200U/μL）1μL，总体积20μL。温和混匀后，在PCR以上42℃加热1个小时，70℃加热5分钟终止反应。得到的cDNA产物可以立即用于PCR扩增，也可以-20℃短期保存，或者-80℃长期保存。（3）PCR检测采用即用型高保真PCR扩增试剂盒（含染料，GenerayGK8007）进行PCR扩增，以检测特定基因的表达情况。在0.2mL的PCR管内加入cDNA0.5-1μL、上下游引物（10μM）各1μL、2×PCR预混溶液（Premix）10μL，补充双蒸水到20μL。温和混匀后，在PCR扩增仪上进行扩增，程序为：95℃预变性5分钟，94℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟扩增35-40个循环，最后72℃延伸10分钟。对于每个基因的退火温度，通过预实验进行优化确定，确保最合适的扩增效率，提高特异性。PCR扩增的产物立即采用琼脂糖凝胶（1%-1.2%）进行检测，加入上样体积25%的5×GelRed琼脂糖电泳加样缓冲液（Generay，GR0205-500）混匀后，每个孔以相同的混合液上样，电泳（恒压100-120V，25-30分钟）分离后，采用凝胶成像系统拍照后用ImagePro6.0分析电泳图，以β-actin基因作为内参，ImagePro软件统计目的条带的光密度值（DOI），半定量比较32 第二章大鼠一型糖尿病性心肌病模型的建立与验证每个基因在不同处理组之间的相对表达情况。2.2.12数据统计所有数据均以平均值±标准差表示，正常组与对应时间点的糖尿病组、不同时间点的糖尿病组之间的比较通过学生t检验分析，p<0.05代表具有显著性差异。所有数据采用GraphPad6.0进行分析。2.3结果2.3.1糖尿病心肌病的肥大和纤维化改变本研究对大鼠DCM的动态过程设定4、8、12和16周四个时间点，通过检测心肌组织的肥大和纤维化，明确动物模型构建是否成功。结果表明，一型糖尿病发生后，在第8周开始出现心肌肥大，表现为心肌细胞横截面积显著增加（图2-1），心脏体重比显著升高（图2-1）。同时，从第8周开始，心肌纤维化增强，胶原沉积增多（图2-2），到12周时纤维化进一步加剧（12周与8周对比），但16周与12周相比无显著性差异。CardiacHypertrophyatDifferentweeksNormalSTZ)2800mμ###$$(******###$$ae600**##rAlan400oitceS200ssorC0sssskkkkeeeeeeeewwww482611图2-1、糖尿病心肌肥大发展过程图片放大400倍，图中线段长度为50μm。**，***，与同时间点的正常组相比，p<0.01，p<0.001；##，###，与第4周糖尿病组相比，p<0.01，p<0.001；$$，与第8周糖尿病组相比，p<0.01。33 华南理工大学博士学位论文CardiacFibrosisatDifferentweeksNormalSTZ2.5##$$##$$***)***%2.0(soit1.5aR##ci1.0**torbi0.5F0.0sssskkkkeeeeeeeewwww482611图2-2、糖尿病心肌纤维化过程图片放大200倍，图中线段长度为100μm。**，***，与同时间点的正常组相比，p<0.01，p<0.001；##，与第4周糖尿病组相比，p<0.01；$$，与第8周糖尿病组相比，p<0.01。2.3.2糖尿病心肌病变的心功能下降心功能方面，如图2-3和表2-1所示，从第8周开始，舒张功能出现异常，表现LVEDP显著升高，dP/dtmin数值下降；第12周起发生收缩功能紊乱，表现为LVESP显著降低，dP/dtmax数值显著下降。由此可见，糖尿病性心肌病发生后，舒张功能紊乱比收缩功能紊乱更早出现，这与目前的研究报道相一致(211)。34 第二章大鼠一型糖尿病性心肌病模型的建立与验证图2-3、糖尿病先后引起心脏舒张和收缩功能下降*，**，与同时间点的正常组相比，p<0.05，p<0.01。2.3.3糖尿病心肌病变的肥大和纤维化标志物的变化此外，进一步分析心肌肥大的标志物BNP、纤维化相关因子TGF-β1的mRNA水平（图2-4），结果表明，从第4周开始，BNP的表达水平显著高于正常组，TGF-β1也有升高趋势（p=0.07），到第8-16周升高更位明显，但第16周和第12周之间无显著性差异。由此可见，糖尿病引起心脏组织肥大和纤维化，其分子水平的变化发生早于宏观层面的病理改变。35 华南理工大学博士学位论文表2-1、糖尿病大鼠在不同时间点的心功能参数4weeks8weeks12weeks16weeksNormalSTZNormalSTZNormalSTZNormalSTZRatsNumber446851056Bodyweight******292.5±12.5217.0±16.1307.2±19.3261.3±34.4350.7±40.8316.0±15.1431.5±53.1332.2±16.6(BW)HW/BW******2.85±0.122.99±0.162.74±0.143.23±0.262.78±0.093.20±0.162.77±0.113.03±0.09(mg/g)LVEDP#***2.8±2.45.4±2.26.8±1.810.2±2.32.8±1.08.0±3.81.9±0.86.1±1.4(mmHg)LVESP**121.4±8.2115.3±18.1124.7±11.4112.9±17.6139.3±7.8105.6±16.4140.1±7.6113.9±18.6(mmHg)dP/dtmin***-11260±883-9062±1850-12570±2061-8597±2529-12867±1856-8044±2308-11053±1137-7689±2700*(mmHg/s)dP/dtmax#*,#*,#11806±77511694±140210176±11689034±157911112±5488079±205911955±15178258±2298(mmHg/s)MAP*,$$*,$$120.4±8.0109.7±9.8126.5±17.1125.9±11.0123.3±4.797.2±15.1115.2±4.592.3±16.7(mmHg)HR#,$403.0±27.8367.7±33.5397.2±31.3372.9±23.4420.1±16.2403.5±23.4381.1±24.8392.8±32.7(bpm)注：*，**，***，表示与相应时间点的正常组相比p<0.05，p<0.01或p<0.001；#，表示与第4周的糖尿病组组相比p<0.05；$，$$，表示与第8周的糖尿病组组相比p<0.05或p<0.01。TGF-β1NormalSTZNormalSTZNormalSTZNormalSTZ4weeks8weeks12weeks16weeks)BNPexpression)TGF-β1expressionnniitt2.02.0cca***#a--ββ********#ssv1.5v(1.5(s*seeggn1.0n1.0aahhccdl0.5dl0.5ofofAANNR0.0R0.0mssssmsssskkkkkkkkeeeeeeeeeeeeeeeewwwwwwww482648261111图2-4、不同持续时间的糖尿病引起的BNP和TGF-β1表达的变化*，**，***，与同时间点的正常组相比，p<0.05，p<0.01及p<0.001；#，与第4周糖尿病组相比，p<0.05。36 第二章大鼠一型糖尿病性心肌病模型的建立与验证2.4讨论糖尿病是一种独立于高血压、冠心病和血管病变的疾病，与高血糖和/或高血脂对心脏引起的直接损伤有关。血液中高浓度葡萄糖对心肌细胞的影响是缓慢而持续的，从糖尿病发生高血糖到心脏功能和结构开始出现异常需要一定的时间，且这一时间段的长短并没有统一的定论，血糖浓度、血脂状况、病人（或动物）个体差异都会影响糖尿病心肌病变的发展过程。目前采用单次高剂量注射链脲佐菌素（STZ）诱导一型糖尿病来研究DCM是最常见的手段，但即便是同样采用大鼠的研究，不同研究之间所采用的周期也有很大差异。对于血糖升高后多长时间导致显著的心脏结构和功能的改变，各研究之间的结果有显著不同。在一项对SD大鼠一型糖尿病引起的心肌病变的时间动态研究中，经过2或6周便发现心脏收缩和舒张功能发生紊乱，心肌组织内有显著的炎症细胞浸润和纤维化胶原沉积(40)。另一项采用Wistar大鼠的研究，对诱导糖尿病后4、8、12周三个时间点进行分析，也在第4周就观察到了胶原沉积增加，细胞凋亡显著升高，相关基因表达也发生显著变化(205)，但该研究缺少心功能数据。本研究通过设置4、8、12、16周四个不同的时间节点，采用血流动力学检测方法性、通过测定左心室压力和容积的变动来动态反应心脏的功能，对每个时间节点的心功能和组织病理学进行分析，从而为一型糖尿病DCM的发生发展提供参考数据。结果表明，心功能的改变与已有研究相一致，即舒张功能紊乱先于收缩功能紊乱，舒张功能第8周已出现显著降低，而收缩功能直到12周才明显下降，到16周时，功能下降更加明显（与正常组相比较）。但是，心肌肥大和纤维化在第4周并不显著，而是从第8周起，心肌细胞横截面积显著增加，证实心肌肥大症状出现，天狼星红染色证实心脏组织已经出现明显的纤维化。到第12周时，心肌肥大和纤维化进一步恶化。此外，分子层面的改变发生早于宏观结构和功能的变化。尽管我们的研究是采用的Wistar大鼠，各时间点之间间隔较大（4周），但依然为采用STZ诱导各种大鼠DCM来研究疾病的病理生理学、疾病诊断、治疗药物提供了参考，也有助于判断和比较不同研究之间的结果。2.4.1糖尿病性心肌病的动物模型糖尿病，无论是一型糖尿病（T1DM）还是二型糖尿病（T2DM），都会引起心脏舒张和/或收缩功能的下降，促进心肌肥大和纤维化，增加心衰的风险，这种与冠状动脉疾病和高血压无关的并发症被称为糖尿病心肌病变，是糖尿病患者死亡的主要原因。尽管37 华南理工大学博士学位论文研究人员对DCM的认识逐步加深，但是其具体的生理病理学机制依然有待进一步研究。采用合适的动物模型，有助于充分阐明DCM的发病机制，为发现新的生物标志物、开发新的药物作用靶点奠定良好的科学研究基础，也为临床治疗糖尿病心肌病变乃至糖尿病引起的各种并发症提供新思路和新方法。目前，最常用的DCM研究模型是啮齿类动物，包括小鼠和大鼠(212)。由于啮齿动物不容易发生动脉粥样硬化，因而非常便于研究与冠心病无关的肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病对心脏的影响。这类动物模型一般通过遗传学手段或者化学方法来诱导糖尿病，由于血液中葡萄糖浓度升高，经过特定的时间后，即便没有发生高血压、冠心病等，高血糖也会对心脏造成直接损伤。由于小鼠容易饲养、繁殖周期短，遗传诱导糖尿病相对简单，无论是功能获得（gain-of-function）或者功能缺失（loss-of-function）模型都更容易获得，因而广泛用于糖尿病、特别是二型糖尿病及其并发症的研究。与小鼠相比，大鼠体积较大，检测其心功能更为简易，因此也广泛用于糖尿病、特别是一型糖尿病及并发症有关的研究。在实际研究过程中，应该根据科学研究的目的、所需要评估的指标、相关配套的科研条件来确定使用何种动物模型。在糖尿病引起的心脏疾病方面，T1DM和T2DM模型的心脏病理表型实际上大部分是相似的，例如两种模型心脏对脂肪酸的利用均增强，而对葡萄糖利用减少，钙离子信号调控失常，线粒体能量代谢受损，结缔组织增加，组织纤维化沉积显著。因此，这两种模型都常用于研究DCM的病理生理学机制。以大鼠作为研究对象，采用注射化学制剂、破坏胰岛细胞的方法制造T1DM模型，具有造模容易、心功能测定操作相对简便、给药方便、可以获得大量DCM研究数据等优势，因而广泛用于与DCM相关的病理生理学、各类组学、炎症与免疫、药物开发等各领域的研究。因此，本研究最终选择了一型糖尿病大鼠作为主要的模型。2.4.2大鼠一型糖尿病引起的心肌病模型目前，通过对大鼠注射链脲佐菌素（STZ）来诱导一型糖尿病，在特定的时间段分析心脏的病理表型，用于研究DCM的发病机制、各种药物特别是天然植物提取物对DCM的疗效，具有造模相对简便、操作流程简单、各项指标测定容易等优势，因而在科学研究中被广泛使用。为了有效诱导一型糖尿病，一般采用200克左右的雄性大鼠，禁食过夜后单次腹腔注射高剂量STZ（50mg/kg体重以上的剂量）的方式造模，注射STZ后的3-7天通过测定血糖浓度确认是否成功诱导糖尿病。心功能下降是DCM的诊断标准之一，也是判断临床和基础研究中对疾病确证或动38 第二章大鼠一型糖尿病性心肌病模型的建立与验证物模型建模成功与否的依据之一。糖尿病心肌病变收缩功能异常发生较晚，一般是在已经发生明显的舒张功能异常之后。当疾病发展到一定阶段后，心脏功能便开始出现异常，一般舒张功能先发生紊乱，接着收缩功能也失常。发展到晚期，心功能全方位下降，各项心功能指标都显著改变。DCM引起心功能的下降，与心脏结构变化紧密相关。心脏输出功能受影响后，机体所天然具有的代偿机制促使心脏做出适应性改变，即通过提高心肌细胞的体积来应对输出量下降的局面，这就是心肌肥大症状。本研究表明，糖尿病发生后，心肌细胞横截面积显著高于正常组，意味着心肌细胞体积增加，心脏-体重比率显著升高。与此同时，心肌肥大的标志物ANP和BNP的表达水平都显著升高，进一步印证了心肌肥大的发生。同时，当血液中葡萄糖含量大大升高后，血液状态发生显著改变，心肌细胞长时间接触这种异常的状态，刺激细胞内氧化应激状态和炎症反应，心肌细胞受损，发生凋亡或坏死。此时，受损心肌细胞的缺失同样会激活组织微环境的炎症和纤维化通路，心肌成纤维细胞增殖信号被激活，纤维化组织快速增加以填补心肌细胞缺失留下的空缺，具体表现为胶原蛋白沉积增加，细胞外基质大量积累。本研究的结果证实了上述理论，即糖尿病发生一定时间后，细胞外间质纤维化大大增强，纤维化信号通路表达升高而被激活，胶原蛋白的表达急剧上升。2.5本章总结通过本章的研究，证实了糖尿病性心肌病造模成功，并初步阐明了Wistar大鼠经单次腹腔注射STZ（55mg/kg）诱导一型糖尿病后引起心肌病变的发展过程，表明DCM最早期的变化出现在分子水平的基因表达改变，而后心肌细胞肥大，间质纤维化，最后发展到心肌重构。功能方面，舒张功能下降（第8周）早于收缩功能降低（第12周），这一研究结果与已有的大部分报道相一致。通过分析不同时间点心脏结构和功能的改变，初步建立了大鼠DCM发生发展的动态变化模型，为今后的同类研究提供重要参考。39 华南理工大学博士学位论文第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用3.1前言前已述及，目前市场上尚无特异性针对DCM的药物，因而亟需开发特异性药物来对抗这一病症。本研究在大鼠DCM模型构建成功，并分析了疾病的发展动态过程之后，继续以动物实验来分析STVNa对DCM的治疗作用，并探讨初步的作用机制。注射STZ一周并检测造模成功后，随机分组。根据本实验室前期采用STVNa治疗心肌肥大的研究确定最佳剂量(213)，而TMZ的剂量则根据文献确定(143)。采用药物治疗11周（糖尿病诱导12周），或者治疗11周后停止给药继续饲养4周（糖尿病诱导16周），测定心脏功能和结构的改变，并通过化学染色、免疫组化、生物化学和分子生物学手段分析药物对DCM的治疗效果，并初步分析可能的作用信号通路。通过本章的研究，结果表明，STVNa可以显著抑制DCM发生发展，降低高血糖对心脏造成的损伤，表现为抑制糖尿病引起的心肌肥大、组织间质纤维化、组织内氧化应激水平和炎症反应，同时也降低血液中的炎症因子。在部分指标上，STVNa效果优于阳性对照药物TMZ。此外，STVNa和TMZ对糖尿病引起的肝功能和肾功能下降都有一定的保护作用。但是，两种药物都没有影响血糖水平、血浆或组织的糖基化产物和血液胰岛素浓度。高血糖引起心脏组织内ERK和NF-κB被活化，AMPK信号受抑制，STVNa可以显著抑制ERK和NF-κB通路，但对AMPK无显著影响。而TMZ则进一步增强已经被高血糖激活的ERK磷酸化，同时激活AMPK磷酸化，抑制NF-κB信号分子。因此，两种药物通过不同的机制来实现心脏保护作用。3.2材料与方法3.2.1试剂、药液与耗材本实验所用动物、动物实验试剂、组织化学染色试剂、各类缓冲溶液、核酸电泳试剂参照第二章的材料和方法。异甜菊醇钠（STVNa，本实验室自制水针剂，规格5ml：12.5mg）；盐酸曲美他嗪（武汉峰耀同辉化学制品有限公司，规格50g/瓶）；即用型高保真PCR扩增试剂盒（含染料，1mL×5，GK8007），上海捷瑞生物工程有限公司；GenviewSYBRGreenPCRPremixHSTaq（1mL×5，GR1201-5ML），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；RIPA蛋白强裂解液（50mL，AR-0531）购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（BCAProteinAssayKit，#23225）购自ThermoFisherPierce公司。40 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用药物混合溶剂（Vehicle）的配制：溶解药物的溶剂的成分包括20%的1,2-丙二醇、25%的乙醇和55%的pH值为10生理盐水，分别量取20mL的1,2-丙二醇，25ml的无水乙醇，55mL的pH值为10生理盐水，混匀，常温保存备用。异甜菊醇钠（2mg/mL）：取浓度为2.5mg/mL的水针剂，加上述混合溶剂稀释1.25倍至2.0mg/ml，2-8℃保存备用，备用。曲美他嗪（2.5mg/mL）：称量盐酸曲美他嗪（MW=339.3）2.5g，加入药物溶剂1000mL，充分溶解，2-8℃保存备用，备用。蛋白电泳配套耗材来自Bio-Rad公司，PVDF膜（0.22或0.45μm）购自Millipore公司。3.2.2本研究用到的试剂盒清单表3-1、本研究用试剂盒清单名称厂家规格货号批次大鼠胰岛素ELISA检测青岛捷世康生物科技96TMM-0587R1201601试剂盒有限公司大鼠糖基化终末产物南京森贝伽生物科技96TSU-BN30822201605ELISA检测试剂盒有限公司大鼠肿瘤坏死因子α青岛捷世康生物科技96TMM-0180R1201604（TNF-α）ELISA检测试有限公司剂盒大鼠肿白介素6（IL-6）青岛捷世康生物科技96TMM-0190R1201604ELISA检测试剂盒有限公司大鼠肿C反应蛋白青岛捷世康生物科技96TMM-0370R1201604（CRP）ELISA检测试有限公司剂盒总抗氧化能力检测试剂南京建成生物工程研A015A015-2201605盒究所超氧化物歧化酶（SOD）南京建成生物工程研A001-3A001-3201605检测试剂盒究所乳酸脱氢酶（LDH）试南京建成生物工程研48TA020-2201605剂盒（微板法）究所还原谷胱甘肽（GSH）碧云天生物技术研究100TS0052030717170703检测试剂盒所丙二醛（MDA）检测试碧云天生物技术研究100TS0131122816170316剂盒所三磷酸腺苷（TAP）含量碧云天生物技术研究200TS0026111016170303检测试剂盒所甘油三酯（TG）检测试南京建成生物工程研96TA110-1201604剂盒究所41 华南理工大学博士学位论文表3-1、本研究用试剂盒清单（续）名称厂家规格货号批次总胆固醇（T-CHO）检测试南京建成生物工程研96TA111-1201604剂盒究所谷丙转氨酶（ALT）检测试南京建成生物工程研96TC009-2201604剂盒究所谷草转氨酶（AST）检测试南京建成生物工程研96TC010-2201604剂盒究所肌酐（Cr）检测试剂盒南京建成生物工程研96TC011-2201604究所尿素氮（BUN）检测试剂盒南京建成生物工程研96TC013-2201604究所3.2.3PCR引物本章所用引物，除了ANP、BNP和β-actin与第二章相同外，其他引物序列如表3-2所示。表3-2、本研究所用PCR扩增引物基因名称上游引物下游引物基因号扩增产物长度Nox-25'-CCAGTGAAGATGTGTTCAGCT-3'5'-GCACAGCCAGTAGAAGTAGAT-3'AF298656.3155p22phox5'-TGGCCTGATCCTCATCACAG-3'5'-AGGCACGGACAGCAGTAAGT-3'U18729250p47phox5'-TCACCGAGATCTACGAGTTC-3'5'-TCCCATGAGGCTGTTGAAGT-3'AY029167.1179SOD-25'-TTCAGCCTGCACTGAAG-3'5'-GTCACGCTTGATAGCCTC-3'NM017051122IL-1β5'-TGATGTTCCCATTAGACAGC-3'5'-GAGGTGCTGATGTACCAGTT-3'M98820378MCP-15'-ACCTGCTGCTACTCATTCACT-3'5'-CATCTTGCATTTAAGGATTTCT-3'M57441.1454VCAM-15'-TGGAGCAAGAAATTAGATAATGG-3'5'-CACATGTACAGGAGATGATGA-3'M84488.11076ICAM-15'-AGAAGGACTGCTTGGGGAA-3'5'-CCTCTGGCGGTAATAGGTG-3'BC081837.1332TGF-β15'-GCAACAACGCAATCTATGAC-3'5'-CCCTGTATTCCGTCTCCTT-3'NM021578301Smad-35'-ACAAGGTCCTCACCCAGATG-3'5'-TGGCGATACACCACCTGTTA-3'AF016189317CollagenI5'-TGCCGTGACCTCAAGATGTG-3'5'-CACAAGCGTGCTGTAGGTGA-3'Z78279469CollagenIII5'-CTGGACCAAAAGGTGATGCTG-3'5'-TGCCAGGGAATCCTCGATGTC-3'NM03208548242 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用表3-2、本研究所用PCR扩增引物（续）基因名称上游引物下游引物基因号扩增产物长度RAGE5'-ACTACCGAGTCCGAGTCTACCA-3'5'-GCTCTGACCGAAGCGTGA-3'NM0222982403.2.4SDS-PAGE/Westernblot检测试剂a.凝胶配制溶液：30%的丙烯酰胺、1.5M的Tris-HCl（pH=8.8）、1.0M的Tris-HCl（pH=6.8）、TEMED、5×SDS-PAGELoadingBuffer等购置广州鼎国生物技术有限公司。称取1g过硫酸铵（鼎国）溶解于终量为10mL的水溶液中得到10%的过硫酸铵溶液，该溶液可冷藏保存数周。称取1g的SDS（十二烷基硫酸钠，鼎国）溶解于终量为10mL的水溶液中得到10%的SDS溶液，该溶液可在常温保存数周。b.电泳缓冲液：5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液购自广州鼎国生物技术有限公司，配方为每升溶液含有15.1g的Tris、94g甘氨酸和5g的SDS（确保其终浓度为0.5%）。使用前稀释5倍。c.转膜缓冲液：配方为25mM的Tris、0.2M的甘氨酸、20%的甲醇，pH=8.5。先配制1MTris：称取12.1g的Tris加双蒸水100mL充分溶解，调节pH至11；接着，取12.5mL的1M的Tris溶液加入500mL的烧杯内，加入7.5g的甘氨酸和100mL的甲醇，补充双蒸水至400mL左右，调节pH值到8.5，转移到500mL的容量瓶中，加双蒸水定容至500mL。2-8℃保存备用。d.洗涤液（TBS/T）：首先配制10×TBS溶液，即称取24.2g的Tris和80g的氯化钠，转入1000mL烧杯内，加900mL左右的双蒸水，用玻棒搅拌充分溶解后，用浓盐酸调节pH值至7.6，然后转移到1000mL的容量瓶内，定容到1000mL，室温保存备用。使用时，先稀释10倍得到1×TBS溶液，再加入0.05%的Tween-20（1000mL溶液加入0.5mL的Tween-20），得到TBS/T洗涤液。e.封闭液（5%的脱脂奶粉）：称取脱脂奶粉5.0g，加入1×TBS/T溶液100mL，漩涡震荡确保充分溶解。f.第一抗体：本研究所采用的一抗购自SantaCruz、Abcam、CellSignalTechnologies、博士德、碧云天等公司。一抗使用TBS/T或封闭液进行稀释，稀释比例按照厂家的说明书并经过实际的优化。g.第二抗体：本研究所用的二抗为辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG，购自Abcam或Jackson公司，使用时以TBS/T进行适当比例的稀释。43 华南理工大学博士学位论文h.高灵敏度ECL化学发光试剂盒：购自ThermoFisherScientificPierce公司，使用时在暗盒内将A溶液和B溶液等体积混匀，使用时将PVDF膜浸没。3.2.5仪器除第二章所用仪器设备外，本实验还用到的仪器包括：实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司，型号：ABIQuantStudio3）、实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司，型号：ABI7500）、蛋白电泳与转膜系统（美国Bio-Rad公司，型号：PowerPacBasic）、酶标仪（铂金埃尔默公司，型号：EnSpire）。3.2.6动物造模与检测等动物饲养、诱导糖尿病、血糖测定、心功能检测、内脏分离与血浆收集、组织学染色分析、提取总RNA、逆转录、常规PCR与电泳检测等方法，与第二章相同。3.2.7分组与给药本实验旨在分析STVNa和TMZ对糖尿病引起的心脏病的治疗效果，研究方案包括治疗11周或治疗11周后停止给药4周（探讨停药后疗效的维持情况）。正常对照组和糖尿病组为第二章中12周和16周的正常及糖尿病大鼠；糖尿病异甜菊醇钠治疗组（STVNa）16只，注射STZ一周后开始，每天灌胃STVNa，给药两次，剂量为8mg/kg/天，连续给药11周后，随机选择其中10只测定心功能，处死后进行各种分析检测，6只继续饲养4周（从注射STZ开始计算，共饲养16周）后测定心功能并进行各种分析检测；糖尿病曲美他嗪治疗组（TMZ）16只，注射STZ一周后开始，曲美他嗪灌胃给药，每天两次，剂量为10mg/kg/天，连续给药11周后，随机选择其中10只测定心功能，处死后进行各种分析检测，6只继续饲养4周（从注射STZ开始计算，共饲养16周）后测定心功能并进行各种分析检测。另外，为测定STVNa对正常大鼠的影响，选10只180-200g的Wistar大鼠随机分成两个组（5只/组），一组给予生理盐水（每天灌胃两次），一组给予STVNa（一天灌胃两次，8mg/kg/天），饲养6周后处死，检测各项生化和分子生物学指标。3.2.8体重与生理常数测定所有正常组大鼠或诱导糖尿病的大鼠，注射STZ后1周、8周和12周或其他特定时间点测定血糖浓度。实验期间每周至少称量体重两次，每天观察动物活动情况以及是否有异常行为。同时，选择特定时间段测定每组动物的饮食和饮水情况。实验结束后，分离血浆测定各项血液生化指标，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），计算公式为：44 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用HOMA-IR=血糖浓度（mmol/L）×胰岛素浓度（mU/L）/22.5。3.2.9酶联免疫吸附试验（ELISA）检测（1）胰岛素将铝箔袋取出，在室温放置至少20分钟，取出所需酶标板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。设置标准曲线，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；每个待测样本，取50μL加入样本孔中；空白孔不加。除空白孔不加外，其余每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用不通气的膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱内温育60分钟。弃去孔内液体，在吸水纸上倒扣拍干后，每孔加满洗涤液（约350μL），静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15分钟。每孔加入终止液50μL，15分钟内，在450nm波长处测定各孔的OD值。根据不同浓度标准品的吸光度建立标准曲线，根据吸光度值计算各样品的胰岛素浓度。（2）晚期糖基化终末产物（AGE）铝箔袋在室温放置20分钟后，取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。标准品的稀释与加样：五个标准品浓度（稀释后各孔加样量都为50μL，浓度分别为150μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL），每个浓度设两个平行孔。在第1-2孔中分别加标准品溶液100μL，然后加入标准品稀释液50μL，混匀；第3、第4孔分别加标准品稀释液50μL，并从第1和2孔中各取100μL分别加到第3和4孔，充分混匀，弃去50μL；在第5-6孔中分别加标准品稀释液50μL，并从第3孔和4孔中先各取50μL分别加到第5-6孔中，混匀；在第7-8孔中分别加标准品稀释液50μL，并从第5孔和6孔中先各取50μL分别加到第7-8孔中，混匀；在第9-10孔中分别加标准品稀释液50μL，并从第7孔和8孔中先各取50μL分别加到第9-10孔中，混匀后从第9和第10孔中各取50μL弃掉。加样：根据操作说明书，空白对照孔除不加样品及酶标试剂，其余各步与样品孔操作相同。代测样品稀释5倍，即先在待测样品孔中加入样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL。加样时，将样品加于酶标板孔底部，尽量避免触及内壁，轻轻晃动混匀。45 华南理工大学博士学位论文温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。洗涤液配制：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去孔内液体后甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒-1分钟后弃去，如此重复5次，拍干。加酶联抗体：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔不加。重复上述温育和洗涤过程。显色：在每个孔内先后加入50μL显色剂A和50μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光温育15分钟。终止：每孔加终止液50μL终止反应，可见孔内溶液蓝色转变为黄色。测定：加入终止液15分钟内，以空白孔调零，在酶标仪上以450nm波长测量各孔的吸光度。根据不同浓度标准品的吸光度建立标准曲线，计算各样品的AGE浓度。（3）肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶标板从冰箱取出放置20分钟后，取出所需板条，剩余板条放回4℃。在标准品孔内各加不同浓度的标准品50μL（按照说明书进行梯度稀释，浓度分别为：320、160、80、40、20、10nmol/mL）。在样品孔中加入待测样品50μL；空白孔不加。除空白孔外，每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用不透气封板膜封住后，37℃水浴锅或恒温箱温育60分钟。弃去孔内液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（约350μL），静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15分钟。每孔加入终止液50μL，15分钟内，酶标仪450nm波长处测定各孔的吸光度值。根据不同浓度标准品的吸光度建立标准曲线，计算各样品的TNF-α浓度。（4）白介素6操作步骤与肿瘤坏死因子α检测基本相同，标准品浓度分别为：160、80、40、20、10、5nmol/mL。（5）C反应蛋白（CRP）操作步骤与肿瘤坏死因子α检测基本相同，标准品浓度分别为：2400、1200、600、300、150、75μmol/mL。46 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用3.2.10组织总抗氧化（T-AOC）能力根据厂家操作说明书，采用比色法测定总抗氧化能力，提前溶解好即用型的试剂，部分情况下，所采用的试剂和样品体积根据实验需求按比例进行适当调整。具体步骤为，首先根据样品数量计算所需要的微孔板的孔数（每个样品均设定测定孔和对照孔），在足够数量的微孔板内分别加入试剂一100μL、试剂二100μL和试剂三应用液50μL，测定孔内再加入待测组织匀浆液5-20μL（各孔内加入的样品体积保持一致），混匀，37℃放置30分钟。然后，对照孔加入相同体积的样品，每孔再分别加入试剂四和试剂五各20μL。充分混匀后，室温放置10分钟，采用酶标仪测定520nm波长下的吸光度。根据测定孔和对照孔的吸光度值，采用如下公式计算以蛋白校正的组织总抗氧化能力：组织匀浆液的总抗氧化能力（U/mg蛋白）=[（测定孔OD值-对照孔OD值）/（0.01×30）×反应液总体积/取样量×样品测试前稀释倍数]/[待测样品的蛋白浓度（mg/mL）×加入体积（mL）]。3.2.11组织超氧化物歧化酶（SOD）活性超氧化物歧化酶活力采用WST-1法进行分析，根据厂家说明书进行操作。每次测定设置1-2个对照孔和对照空白孔，每个样品的测定设置测定孔和测定空白孔。首先，在微孔板内按下表加入试剂和样品：对照孔对照空白孔测定孔测定空白孔待测样品（μL）2020双蒸水（μL）2020酶工作液（μL）2020酶稀释液（μL）2020底物应用液（μL）200200200200试剂和样品加入后，充分混匀，37℃孵育30分钟，酶标仪450nm读取吸光度值（A）。接着，根据测定值计算SOD抑制率：SOD抑制率（%）=[（A对照-A对照空白）-（A测定-A测定孔白）]/（A对照-A对照空白）×100。组织样品的SOD活力，用蛋白浓度进行校正，计算公式为：SOD活力（U/mg蛋白）=SOD抑制率（%）/50%×反应体系稀释倍数（240μL/20μL）/待测样品的蛋白浓度（mg/mL）。3.2.12组织还原型谷胱甘肽（GSH）水平检测取组织匀浆液100μL，加入100μL试剂一，混匀后3500转/分离心10分钟，取上清液待测。上述离心后的待测样品，按下表加入各种试剂：47 华南理工大学博士学位论文空白孔标准孔测定孔试剂一（μL）10020μmol/L的GSH标准品（μL）100待测上清液（μL）100试剂二（μL）100100100试剂三（μL）252525加入各种试剂和样品后，充分混匀，室温静置5分钟，采用酶标仪在405nm下测定每个孔的吸光度值（OD）。根据下述公式计算组织中的GSH含量：组织GSH含量（μmol/mg蛋白）=[（测定OD值-空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）]×标准管浓度（20μmol/L）×样品前处理稀释倍数（2倍）/待测匀浆蛋白浓度（mg/mL）。3.2.13组织丙二醛（MDA）浓度测定（1）配制TBA储存液：TBA配制液室温放置直到完全溶解后，称取适量TBA，用完全溶解的TBA配制液配制成浓度为0.37%的TBA储存液，并通过剧烈漩涡震荡以促进溶解。配制好的TBA储存液室温避光保存，3个月内使用。（2）配制MDA检测工作液：根据待测定的样品和所需对照的数量，测定前，参考下表配制适量的MDA检测工作液（必要时可以通过漩涡震荡或者超声促进溶解，配制好的MDA检测工作液必须当天使用）：检测次数1次10次20次50次TBA稀释液150μl1500μl3000μl7500μlTBA储存液50μl500μl1000μl2500μl抗氧化剂3μl30μl60μl150μl（3）标准品的稀释：取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM等不同浓度的标准品溶液，用于确定标准曲线。当样品MDA的浓度比较高时，可设置更高浓度的标准品，如增加100、150和200μM的标准品浓度。（4）在0.5mL离心管内加入100μL的PBS或双蒸水等适当溶液作为空白对照，加入100μL上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入100μL样品用于测定；随后加入200μL的MDA检测工作液。（5）混匀后，压紧离心管盖子，在金属加热器100℃加热15分钟，或者通过沸水浴加热15分钟，期间防止液体溅出。（6）取出离心管，水浴冷却至室温，1000g室温离心10分钟。取200μL上清加入到96孔板中，酶标仪532nm测定吸光度。（7）组织内MDA含量的计算：首先根据标准曲线计算出样品溶液中的MDA含量48 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用后，然后根据已经测定的组织匀浆液蛋白浓度，通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量，单位为μmol/mg蛋白或μmol/mg组织。3.2.14组织三磷酸腺苷（ATP）含量检测按照说明书，每20毫克组织加入约100-200μL裂解液充分裂解组织，并用玻璃匀浆器进行充分匀浆。组织裂解后经4℃、12000g离心5分钟，取上清，BCA方法（参照3.2.21“蛋白裂解与浓度测定”部分）测定蛋白浓度后-20℃保存备用。（1）标准品的稀释：将待用试剂置于冰浴上缓慢融化，用ATP检测裂解液将ATP标准溶液稀释成0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10µM等几个浓度，当出现样品浓度超出标准溶液最高浓度值时，可以配置更高浓度的标准溶液。（2）ATP检测工作液的配制：按照每个样品或标准品需100μL的ATP检测工作液，根据样品和标准品数量计算和配制适量的ATP检测工作液。试剂冰浴融解后，取适量的ATP检测试剂，按照ATP检测试剂稀释液:ATP检测试剂=9:1的比例稀释，即将100μL的ATP检测试剂与900μL的ATP检测试剂稀释液混合，得到1mL的ATP检测工作液用于后续实验。所有操作在冰上完成。（3）ATP浓度的测定：首先，在检测孔内加入100μL的ATP检测工作液，室温放置3-5分钟。接着，加入20μL的样品或标准品，迅速用微量移液器混匀，至少间隔2秒后，用具有荧光检测功能的酶标仪测定RLU值（相对光单位）。根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度。为了消除样品制备时的误差，根据前期测定的样品蛋白浓度，以蛋白浓度来矫正样品中ATP的浓度，表示为nmol/mg蛋白的形式。3.2.15血浆甘油三酯（TG）分析根据说明书，在微孔板内操作，设定空白孔（2.5μL的蒸馏水）、标准孔（2.5μL的2.26mM的标准品）和样品孔（2.5μL的血浆），每孔加入工作液250μL，混匀后，37℃孵育10分钟，采用酶标仪在500nm波长下测定每个孔的吸光度值。根据如下公式计算样品中甘油三酯的含量：甘油三酯含量（mmol/L）=[（样品孔OD值-空白孔OD值）/（标准孔OD值-空白孔OD值）]×标准品浓度（2.26mmol/L）。3.2.16血浆总胆固醇（T-CHO）检测根据说明书，在微孔板内操作，设定空白孔（2.5μL的蒸馏水）、标准孔（2.5μL的5.17mM的标准品）和样品孔（2.5μL的血浆），每孔加入工作液250μL，混匀后，37℃孵育10分钟，采用酶标仪在510nm波长下测定每个孔的吸光度值。根据如下公式49 华南理工大学博士学位论文计算样品中胆固醇的含量：胆固醇含量（mmol/L）=[（样品孔OD值-空白孔OD值）/（标准孔OD值-空白孔OD值）]×标准品浓度（5.17mmol/L）。3.2.17血浆谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）测定根据说明书操作，每个样品设置测定孔和对照孔，在微孔板内37℃预热的基质液（ALT和AST采用各自的基质液）20μL，测定孔加入待测样品5μL，并用移液器反复吹打混匀，37℃下温育30分钟。接着，每孔加入20μL的2,4-二硝基苯肼液，对照孔加入待测样品5μL，用移液器吹打混匀，37℃下温育30分钟，每孔加入0.4mol/L的氢氧化钠200μL，轻轻晃动微孔板，混匀孔内液体，室温放置15分钟。然后，采用酶标仪在510nm波长下检测各孔的吸光度值。根据说明书提供的标准曲线计算ALT和AST的酶活力（U/L）。3.2.18血清肌酐（Cr）测定根据样品数量计算需要的微孔数，在微孔板内加入6μL样品（测定孔）、6μL标准品（标准孔）和6μL双蒸水（空白孔），接着每孔加入试剂一（酶溶液A）180μL，37℃孵育5分钟后，酶标仪546nm测定吸光度值（A1）。接着，每孔加入60μL的试剂二（酶溶液B），37℃孵育5分钟后，酶标仪546nm测定吸光度值（A2）。根据如下公式计算肌酐含量：肌酐（μmol/L）={[（测定孔A2-K×测定孔A1）-（空白孔A2-K×空白孔A1）]/[（标准孔A2-K×标准孔A1）（空白孔-A2-K×空白孔A1）]}×标准品浓度（μmol/L）。其中，K为稀释因子，K=（加样量+溶液A体积）/（加样量+酶溶液A体积+酶溶液B体积）=186/246。3.2.19血尿氮（BUN）检测在5mL离心管内，加入20μL双蒸水（空白管）、20μL的10mmol/L的BUN标准品（标准管）或20μL的代测样品（测定管），接着每管加入250μL的缓冲酶溶液。37℃水浴10分钟。然后，每管中分别加入1mL酚显色剂和1mL碱性次氯酸钠，充分混匀后37℃水浴10分钟。取出后，将管内液体吸取350μL置入微孔板内，采用酶标仪在640nm波长下读取吸光度。根据如下公式计算血浆中尿素氮含量：血浆BUN含量（mmol/L）=[（测定管OD值-空白管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）]×标准品浓度（10mmol/L）×样品稀释倍数。3.2.20实时荧光定量PCR检测基因表达总RNA提取、逆转录和城cDNA、常规PCR及电泳检测方法与第二章相同。对部50 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用分基因，如BNP、TGF-β1、IL-1β、MCP-1、Nox2、SOD-2等，进一步采用实时荧光定量CPR（GenviewSYBRGreenPCR2×PremixHSTaq，鼎国）检测验证。采用10μL或20μL反应体系，以10μL体系为例，加入2×Premix5μL、上下游引物各0.5μL、cDNA（稀释5-10倍）0.2-0.5μL，补充双蒸水到10μL。混匀后，在实施荧光定量PCR以上进行扩增反应：95℃预变性5分钟，40个循环的94℃15秒、60℃30秒，接着通过95℃15秒、60℃15秒、95℃15秒流程测定溶解曲线。以β-actin基因作为内参，通过2-△△Ct的方法比较各组之间基因表达的差异(214)。3.2.21蛋白裂解与浓度测定组织在4℃下匀浆，即称取一定量的心尖组织，按1mg组织加入10μLRIPA裂解液（鼎国）的比例加入相应的裂解溶液。裂解液中加入PMSF（鼎国）和蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）。组织充分裂解后，转移入1.5mL离心管，冰浴放置30分钟，期间每隔10分钟漩涡震荡一次。接着，3000g、4℃下离心10分钟。将上清转移到另一支新的1.5mL离心管，测定浓度后，-80℃长期保存备用。提取的蛋白裂解液，采用BCA方法（PierceBCA试剂盒）、按微孔板方案进行浓度测定。主要步骤为：（a）采用PBS将2mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）标准品进行2倍梯度稀释，依次得到2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/mL的标准品，PBS作为0浓度标准品；（b）根据标准曲线和样品数量，计算所需要的工作溶液，并按照BCA试剂A:B=50:1的比例配置BCA工作液；（c）将25μL的标准品和代测样品加入微孔板内，接着每孔加入200μL的BCA工作液，微孔板振荡器上震荡30秒，使液体充分混匀；（d）微孔板用封口膜封闭后，37℃孵育30分钟；（e）取出微孔板平衡至室温后，用酶标仪在562nm下读取吸光度；（f）根据各标准品的吸光度，扣除本底后绘制标准曲线，根据标准曲线公式计算代测样品中的蛋白浓度。3.2.22蛋白电泳与杂交（SDS-PAGE/Westernblotting）（1）配制蛋白凝胶：根据样品个数和上样量确定凝胶规格，将配胶玻璃板装配好后，按下表的配方配制凝胶：51 华南理工大学博士学位论文试剂名称分离胶（10mL）浓缩胶8%10%12%（5mL）双蒸水4.6mL4.0mL3.3mL3.4mL30%丙烯酰胺（W/V）2.7mL3.2mL4.0mL830μL1.5mol/LTirs﹒HCl（pH=8.8）2.5mL2.5mL2.5mL1.0mol/LTirs﹒HCl（pH=6.8）630μL10%的过硫酸铵100μL100μL100μL50μL10%的SDS100μL100μL100μL50μLTEMED溶液6μL4μL4μL5μL首先，根据预分离蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度，配制适当体积的分离胶。即按上表加入各种试剂，TEMED最后加入，混匀后，迅速将液体注入到预装好的凝胶玻璃板内（此过程中避免形成气泡），待液面升至绿色带中间后停止加液，并用水封住上层。待分离胶凝固（此时水层和分离胶的交界面可见一条带反光的折射线）后，倒出上层的水，用吸水纸吸干残留水。然后，按上表浓缩胶配方配制适量体积的浓缩胶溶液，加入TEMED后混匀，注入玻璃板内直到加满（注意排除气泡），然后插入合适大小的梳子。室温放置20-30分钟，确保浓缩胶凝固后，解除玻璃板卡槽装置，两手分别捏住玻璃板的中上靠近梳子的部位，竖直向上轻轻将胶板取出。（2）准备蛋白样品根据蛋白浓度值，每个样品取相同量的蛋白（30-50μg）置于0.2mL的PCR管内，加入适量的PBS到相同的体积（根据上样量和凝胶孔的大小调整蛋白体积），然后根据每个样品的蛋积加入25%（体积比例）的5×SDS蛋白上样缓冲液，充分混匀使SDS浓度稀释5倍。接着，在PCR仪上95℃以上加热变性5分钟。（3）电泳：将凝胶板装入配套夹板内，置于电泳槽中，加入适量的电泳缓冲液，确保两块凝胶板之间液面没过凝胶孔，将梳子拔出。接着，采用微量移液器，将样品依顺序加入样品孔。样品加入完毕后，盖上电泳槽盖子，接通电源。80V恒压电泳约30-60分钟，当肉眼可见蛋白样品条带浓缩成一条直线时，增加电压到110-120V继续电泳约90-120分钟，直到条带到达凝胶底部位置。（4）转膜：电泳结束后，取出凝胶，置于合适的容器内，加入适量的转膜缓冲液浸没。同时，剪裁一块合适大小的PVDF膜，用甲醇浸泡2-3分钟。接着，按照从负极到正极依次为海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序排列好，赶除气泡后，夹子夹闭。接通电源，采用恒流（200-300mA）2小时进行转膜。（5）封闭：转膜结束后，根据标准蛋白分子量（Marker）将膜分成不同分子量的条带，置于分隔塑料盒内。加入适量的TBS/T快速清洗后，用前述TBS/T配制的封闭52 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用液进行封闭，PVDF膜应充分浸泡在封闭液内。在脱色摇床上温和摇动，室温反应45-60分钟。接着，用TBS/T洗涤至少3次（洗涤液充分浸没PVDF膜，置于脱色摇床上温和摇动，每次10分钟），后续洗涤采用相同的方法。（6）孵育第一抗体：根据目的蛋白的抗体来源，加入特定比例稀释好的相应抗体（CollagenⅢ，ab7778，1:2000；CollagenⅠ，ab34710，1:2000；α-SMA，BA2359，1:1000；Peroxiredoxin2，ab109367，1:2000；Thioredoxin1，CST#2429，1:2000；phospho-ERK1/2，CST#4370，1:2000；ERK1/2，ab196883，1:2000；phosph-AMPKα1/2，AA393，1:1000；AMPKα1/2，sc-74461，1:500；RAGE，sc-365154，1:5000；β-actin，CST#3700，1:2000），充分浸没PVDF膜，在脱色摇床上温和摇动，2-8℃反应过夜（12-16小时）。TBS/T洗涤3次。（7）孵育第二抗体：根据第一抗体来源，分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（针对一抗为兔来源多克隆抗体）或山羊抗小鼠（针对一抗为小鼠来源单克隆抗体）的二抗（HRP-IgG）进行反应。二抗采用TBS/T稀释，比例为2000-3000倍。在脱色摇床上温和摇动，室温反应45-60分钟。洗涤3次。（8）化学发光显色：首先，在暗盒内，将ECL化学发光A液和B液等比例混合。接着，将洗涤过的PVDF膜用双蒸水稍微清洗后，尽量去除双蒸水，将膜置于暗盒内，使膜上的HRP能与化学发光液充分反应。在室温下避光反应3-5分钟后，采用Bio-Rad公司的ChemiDoc化学发光成像系统获取图像并拍照保存。（9）数据分析：采用ImageLab3.0进行图像分析。首先根据样品数量确定泳道数，选取合适的区域，通过软件自动识别程序识别目的条带后，通过数据分析表获得目的条带的光密度值。通过扣除本底的方式消除不同泳道之间背景颜色导致的差异。以β-actin蛋白最为内参对照，分析各组之间目的蛋白的表达量。3.2.23免疫组化染色（IHC）首先，参考前述“组织学分析”部分的方法进行脱蜡和水化。接着，用PBS缓冲液洗涤2次，每次5分钟。3%的H2O2室温孵育5-10分钟，确保内源性过氧化物酶活性被充分消除。蒸馏水冲洗切片，PBS浸泡5分钟。接着用电炉或者水浴锅加热10mM枸橼酸钠缓冲溶液（pH=6.0）至95℃左右，放入组织切片加热10-15分钟，进行煮沸热修复。以PBS冲洗切片，冲洗3次，每次5分钟（后续各步的冲洗与此相同）。然后采用5-10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育20分钟，甩去多余的血清，不用冲洗，滴加充足比例稀释的一抗工作液（8-OHdG，sc-393871，1:100；CD68，sc-20060，53 华南理工大学博士学位论文1:100），置于切片盒内，4℃孵育过夜，此期间避免切片上液体风干。按照说明书用PBS稀释生物素标记的二抗（1%BSA-PBS溶液稀释），再次用PBS冲洗切片后，滴加二抗覆盖整个样本切面，37℃孵育10-30分钟。PBS冲洗后，滴加适当比例稀释的辣根酶标记的链霉亲和素，37℃孵育10-30分钟。PBS冲洗，DAB显色试剂盒显色后，蒸馏水冲洗。接着用苏木素复染2分钟，盐酸酒精分化。随后参考第二章“组织学分析”中的方法进行脱水、透明、封片、镜检等操作。3.2.24数据分析与统计所有数据均以平均值±标准差表示。多个组之间首先进行one-wayANOVA分析，两组之间进行学生t检验分析，p<0.05代表具有显著性差异。所有数据采用GraphPad6.0进行分析。3.3结果3.3.1糖尿病引起大鼠体重下降及STVNa对体重的影响一型糖尿病的显著特征之一是随着糖尿病发生，体重增加相对较少甚至不增加。由图3-1可以看出，注射STZ后12或16周后，正常组大鼠体重平稳增加，而糖尿病组大鼠体重增加显著低于正常组。与糖尿病组相比，STVNa或TMZ治疗组体重增加更多，16周STVNa或TMZ治疗组体重显著高于糖尿病组，但并未达到与正常对照组相接近的水平。说明两种药物对糖尿病大鼠的基础代谢都有一定的影响，16周的效果相对更突出，但尚不足以使逆转病理状态恢复到正常水平。BodyweightincreasingBodyweightincreasing400500)350Normal)g(gt*STZ(t400##h300h#giSTVNagieTMZe**WWy250300dyodBo200B2001500206k1k1ekekeeeeeeWWWW图3-1、一型糖尿病引起的大鼠体重变化及药物对体重的影响*，**，与同时间点正常组相比，p<0.05和p<0.01；#，##，与同时间点STZ组相比，p<0.05和p<0.01。54 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用3.3.2血糖浓度一型糖尿病导致大鼠血糖浓度水平显著升高，12周时尽管已经有部分动物血糖浓度低于11.1mmol/L，但依然显著高于正常对照组（图3-2）。然而，在胰岛素依赖型一型糖尿病中，STVNa治疗不能有效抑制血糖浓度，TMZ对血糖也无显著影响，说明这两种药物无法降低一型糖尿病动物的血糖。在一项采用二型糖尿病作为动物模型的研究中，异甜菊醇可以一定程度降低血糖浓度，降低葡萄糖耐量(161)。本研究与之结果不一致，很可能是由于采用了不同的糖尿病模型，该研究采用Zuker二型糖尿病大鼠模型，血液胰岛素并不下降（非胰岛素依赖型），而本研究采用STZ诱导的一型糖尿病血液中胰岛素降低（胰岛素依赖型），因此异甜菊醇的作用可能与胰岛素浓度有关。Plasmalevelofglucose20)L/lo15*mmm(10esocu5lg0laZaZmTNMrSVToTNS图3-2、一型糖尿病大鼠血液葡萄糖浓度及药物对血糖的影响*，与正常组相比，p<0.05。3.3.3血浆胰岛素浓度及胰岛素抵抗指数与一型糖尿病血浆胰岛素水平下降的研究相一致，本研究表明，一型糖尿病大鼠血浆胰岛素水平明显降低（图3-3左），STVNa治疗不能有效提高血浆胰岛素浓度，表明其治疗不能恢复已经受到破坏的胰岛细胞功能。STVNa不影响胰岛素水平，与已有研究结果相吻合(161)。55 华南理工大学博士学位论文Insulinconcentrationsofplasma(FSI)25)L/20Um(***15nilusnI10ems5alP0laZaZmTNMrSVToTNSHOMA-InsulinResistance15)L/*Um×10L/lomm(5RI-AMOH0laZaZmTNMrSVToTNS图3-3、一型糖尿病大鼠血浆胰岛素浓度及药物对胰岛素的影响*，***，与正常组相比，p<0.05和p<0.001。胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）是反应体内外周器官或组织对血浆胰岛素信号通路反应的指标，本研究表明，一型糖尿病虽然没有二型糖尿病的高胰岛素血症的症状，但HOMA-IR指标依然显著高于正常组（图3-3右），表明胰岛素信号受抑制。同样，与STVNa或TMZ治疗不降低血糖浓度、不升高血浆胰岛素水平结果一致，这两种药物治疗都不能显著改善HOMA-IR指标。3.3.4STVNa提高心肌组织内ATP水平对心脏组织内的ATP含量检测，表明糖尿病大鼠心脏内ATP含量有降低趋势（无56 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用统计性差异），而STVNa可以使心脏组织内ATP含量显著升高（图3-4），TMZ也有类似的效果，在糖尿病能量不足时增强能量供应。CardiacTissueATPcontent0.3)e#ussi0.2t#g/lomn(0.1PTA0.0laZaZmTNMrSVToTNS图3-4、糖尿病心肌组织内ATP含量的改变#，与STZ相比p<0.05。3.3.5糖尿病对心功能的影响及药物的保护作用如图3-5所示，糖尿病会导致左心室功能显著下降，无论是12周还是16周，糖尿病大鼠的LVESP、LVEDP、dp/dtmax、dp/dtmin、MAP等都受到显著影响，12周糖尿病大鼠心输出量（CO）也显著降低（16周有下降趋势但无显著性差异）。LVEDP升高、dp/dtmin数值下降表明心脏舒张功能异常，LVESP降低、dp/dtmax数值下降意味着收缩功能下降。尽管无统计学显著性，但左室开始收缩至左室内压上升速率峰值时间（等容收缩期，Tau）也呈现相同趋势。经过11周治疗（诱导糖尿病后12周）后，或者治疗十一周后停止给药4周（诱导糖尿病后16周），STVNa可以显著改善心功能异常，完全或部分逆转上述各项发生异常的指标，但对心率无显著影响。同时，由图11可以看出，STVNa对心功能的保护效果优于TMZ，表现为12周时，STVNa对dp/dtmin、LVESP、dp/dtmax、CO等指标作用效果优于TMZ，16周的dp/dtmin、dp/dtmax、MAP、CO等指标作用效果优于TMZ（图3-5）。57 华南理工大学博士学位论文LVEDPdP/dtmin15Normal0STZ)s/)STVNag-5000gHH10***TMZmmmm(**(-10000Pni*D######m**E5t#VLd/-15000###p***d0-20000sssskkkkeeeeeeeewwww26261111dP/dtmaxLVESP20015000##)#)##s/g150gH*H**m*m10000m(m100(PxSaEm5000VtL50d/pd00sssskkkkeeeeeeeewwww26261111MeanArteryPressureCardiacOutput150000200#))g150ni100000##H#m/m**L###m100μ((PO50000**ACM5000sssskkkkeeeeeeeewwww26261111TimeconstantofventricularrelaxationHeartrate50025*40020))ms30015pm(b(uaR20010TH510000sssskkkkeeeeeeeewwww26261111图3-5、STVNa可以有效保护糖尿病引起的心功能紊乱*，**，***，与同时间点正常组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001；#，##，###，与同时间点STZ组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001。58 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用HeartWeight/BodyWeight4**##)*g/3gm(2WB/W1H0laZaZmTNMrSVToTNSCrossSectionalArea800***ANPβ-actin600##)2##mμ(400BNPASC200β-actin0laZaZmTNMrSVToTNSNormalSTZSTVNaTMZBrainnatriureticpeptideAtrialnatriureticpeptidenit1.0ni1.0tcc***a-a-at0.8**at0.8eeb###b/###/n0.6n0.6*###$$$oioisssser0.4e0.4rpp***###xxe0.2e0.2AANNRR0.00.0mmllaZaZaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNS图3-6、STVNa显著抑制糖尿病引起的心肌肥大（12周）H&E染色图片放大400倍，图中线段长为50μm。*，**，***，与正常组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001；#，##，###，与STZ组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001；$$$，与STVNa组相比，p<0.001。3.3.6STVNa可有效抑制糖尿病引起的心肌肥大糖尿病大鼠体内持续的高血糖流经心脏，对心脏的负荷增加，长时间的高负荷引起显著的心肌适应性肥大，并最终可能进入失代偿阶段。如图3-6所示，糖尿病组大鼠的心脏体重比（HW/BW）显著上升，心肌细胞横截面积增加。STVNa可以有效降低心脏体重比，减小心肌细胞横截面积。与此同时，PCR检测分析糖尿病组心肌组织内心肌肥59 华南理工大学博士学位论文大的生物标志物——心房利钠肽（ANP）和脑钠肽（BNP），两者的表达也显著上升。同样，STVNa治疗都可以显著抑制ANP和BNP的表达（图3-6），表明STVNa对糖尿病引起的心肌肥大有显著的抑制效果。TMZ也具有类似的抗肥大效果，但对BNP的抑制比STVNa效果差。有意思的是，给药治疗一段时间后停止给药继续饲养4周，两种药物都显示了一定的疗效（图3-7），表明药物的治疗能在停止给药后维持至少4周时间。但是，停药后，TMZ对ANP和BNP表达的抑制效果优于STVNa。HeartWeight/BodyWeight4)**##g/3###gm(2WB/W1H0laZaZmTNMrSVToTNSCrossSectionalArea800***ANP600###)2###mμ(400ABNPSC200β-actin0laZaZmTNMrSVToTNSNormalSTZSTVNaTMZAtrialnatriureticpeptideBrainnatriureticpeptidenit2.5ni1.5ct**ac-aat2.0**-aetbe/b/1.0no1.5nioi*#sss*#se##$r1.0erpp0.5x**##$$xee0.5AANNRR0.00.0mmllaZaZaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNS图3-7、STVNa停止给药后4周依然可显著抑制糖尿病引起的心肌肥大（16周）H&E染色图片放大400倍，图中线段长为50μm。**，***，与正常组相比，p<0.01，p<0.001；#，##，###，与STZ组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001；$，$$，与STVNa组相比，p<0.05，p<0.01。60 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用CardiacFibrosisPercentage2.5***2.0***$1.51.0###***0.5FibroticRatios(%)0.0alZZSTVNaTMNormSTTransforminggrowthfactorβ1TGF-β10.8Smad-30.6******CollagenI###0.4CollagenIII0.20.0β-actinmRNAexpression/beta-actinZZrmalSTVNaTMNoSTNormalSTZSTVNaTMZSmad-3CollagenICollagenIII0.40.60.8*******#***0.30.6###0.4######0.20.4###***0.20.10.20.00.00.0mRNAexpression/beta-actinmRNAexpression/beta-actinmRNAexpression/beta-actinZZZZZZrmalSTVNaTMrmalSTVNaTMrmalSTVNaTMNoSTNoSTNoST图3-8、STVNa显著抑制糖尿病引起的纤维化及相关基因mRNA的表达（12周）天狼星红染色图片放大200倍，图中线段长为100μm。*，***，与正常组相比，p<0.05，p<0.001；#，###，与STZ组相比，p<0.05及p<0.001；$，与STVNa组相比，p<0.05。3.3.7STVNa可有效缓解糖尿病引起的心肌纤维化糖尿病的高血糖持续刺激心脏，引起心肌细胞逐步凋亡坏死，心脏为了维持结构的完整性，成纤维细胞被激活，通过产生大量的胶原蛋白、形成细胞外基质而填补心肌细胞凋亡留下的空缺，从而导致心肌纤维化。天狼星红染色表明，糖尿病大鼠心肌纤维化显著（图3-8），心肌细胞间隙胶原大量沉积，表现为天狼星红染色图片中紫红色显著增加。STVNa治疗11周后，心肌组织纤维化程度显著下降。TMZ也可以显著抑制高血糖61 华南理工大学博士学位论文引起的心肌纤维化，但效果不如STVNa。CollagenI)eg6naCollagenI130KDh*cdlof4(CollagenIII138KDnitca-β/2##42KDIα-SMAnegallβ-actin45KDo0CalZaZmTNMrSVToTNSNormalSTZSTVNaTMZCollagenIIIα-SmoothMuscleActin)eg4n)a*e5hgcn***adl3h4ocf(dlniof3t2(cna-#itβ#c2##/IaII1-β/nA1egMalS-l00oαlZaZlCaaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNS图3-9、蛋白表达水平结果证实STVNa和TMZ对糖尿病引起心肌纤维化的抑制作用*，***，与正常组相比，p<0.05，p<0.001；#，##，与STZ组相比，p<0.05及p<0.01。在分子水平，PCR检测mRNA水平表明，糖尿病大鼠纤维化信号通路相关基因，如TGF-β1及其下游的信号分子Smad-3表达明显升高，细胞外基质沉积相关的一型胶原蛋白和三型胶原的表达都显著增强（图3-8）。与之相一致的是，Westernblot检测也证实，包括一型胶原蛋白、三型胶原以及平滑肌激动蛋白（α-SMA）的蛋白含量都显著升高（图3-9）。STVNa以抑制纤维化，减少天狼星红染色中的胶原蛋白沉积，抑制纤维化信号通路基因的表达，减少胶原蛋白沉积，抑制促纤维因子α-SMA的表达。TMZ也有显著的抑制纤维化作用，但对TGF-β1和三型胶原的mRNA抑制效果并不明显，表明TMZ抗纤维化的作用弱于STVNa。在蛋白水平，TMZ显著抑制TGF-β1和三型胶原，但对α-SMA的抑制效果弱于STVNa。与前述抑制肥大结果类似，停止给药4周后，STVNa和TMZ都依然维持了一定的治疗效果（图3-10），表现为降低心肌组织内纤维化沉积，抑制相关基因mRNA的表达水平。除了一型胶原外，STVNa对TGF-β1、Smad-3和三型胶原mRNA的抑制都显著62 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用优于TMZ。CardiacFibrosisPercentage2.5***)%2.0(soit1.5aR**###cit1.0###**orbi0.5F0.0laZaZmTNMrSVToTNSTGF-β1Transforminggrowthfactorβ1ni1.5tca-aSmad-3te*b/1.0no*$$CollagenIisserp0.5**##CollagenIIIxeANR0.0β-actinmlaZaZmTNMrSVToTNormalSTZSTVNaTMZNSSmad-3CollagenICollagenIIIni0.8nit1.5nitt1.5c**ca*ca--a-atatae0.6eteb/b/1.0b/1.0*nnnoioiois0.4sssse*#s#$$errerpp0.5***##$$p0.5xxx##e0.2*##$$ee*A***##AANNNRRR0.0m0.00.0mmlllaZaZaZaZaZaZmTNMmTNMmTNMrSVTrSVTrSVToToToTNSNSNS图3-10、STVNa显著抑制糖尿病引起的纤维化及相关基因mRNA的表达（16周）天狼星红染色图片放大200倍，图中线段长为100μm。*，**，***，与正常组相比，P<0.05、p<0.01及p<0.001；##，###，与STZ组相比，p<0.01，p<0.001；$$，与STVNa组相比，p<0.01。3.3.8STVNa可降低糖尿病引起的氧化应激糖尿病导致大鼠心脏氧化应激水平大大提高，表现为STZ注射12周后心脏组织内总的抗氧化能力（T-AOC）显著下降、超氧化物歧化酶（SOD）活性明显降低，同时组织内脂质过氧化物——丙二醛（MDA）显著升高（图3-11）。STVNa显著提高糖尿病心脏抗氧化能力，甚至使GSH含量升高到超过正常组，同时明显降低MDA的含量，也有促进SOD活性的趋势。TMZ的总抗氧化能力显著小于STVNa，对GSH的提升和对63 华南理工大学博士学位论文MDA的抑制效果也比STVNa弱。由此可见，STVNa是一种高效的抗氧化剂。TotalantioxidantcapacitySODactivity15#60))nineitetorop10r40pggm/mU$/(U(520C*ODAO-ST00llaZaZaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNSTissueMDAcontentTissuetotalGSHcontent1.5600)*###n**iet)oor#rp1.0p400*ggm/m/lo#Mum(n0.5H200(SAGDM0.00llaZaZaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNS图3-11、糖尿病及STVNa和TMZ对心肌组织内抗氧化能力的影响*，**，与正常组相比，p<0.05，p<0.01；#，###，与STZ组相比，p<0.05，p<0.001；$，与STVNa组相比，p<0.05。进一步分析表明，糖尿病大鼠心脏内Nox-2、p22phox和p47phox的表达显著升高（图3-12），而SOD-2的表达则受到抑制。STVNa可以显著逆转这些基因的表达，表明这一药物具有调节氧化应激形成过程和逆转异常基因表达的功能。TMZ也具有类似的功能，但与STVNa相比，TMZ抑制Nox-2表达的效果更显著，对促进SOD-2表达的效果不如STVNa，意味着这两种药物可能通过不同的机制调节氧化应激水平。停止给药4周后，具有类似的作用效果（图3-13），但各组之间的p22phox表达无显著差异。64 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用Nox-2Nox-2nit0.25cp22phoxa-**at0.20eb/no0.15p47phoxi###s****###ser0.10pxSOD-2e0.05ANR0.00mβ-actinlaaZZmTNMrSVToTNormalSTZSTVNaTMZNSp22phoxp47phoxSOD-2ni1.5ni0.4nit1.5ttcc***caa-a--a**$atattee0.3ebb$$###b/1.0***###/1.0/nnno*###oioiiss0.2###s##$$$ss***s**eererrp0.5pp0.5xxx***ee0.1eAAANNNRRR0.00.0m0.0mmlllaZaZaZaZaZaZmTNMmTNMmTNMrSVTrSVTrSVToToToTNSNSNS图3-12、糖尿病及STVNa和TMZ对心肌组织氧化应激相关基因表达的影响（12周）*，**，***，与正常组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001；##，###，与STZ组相比，p<0.01，p<0.001；$，$$，$$$，与STVNa组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001。Nox-2niNox-2t2.0ca-ap22phoxt**e1.5b/noip47phoxs1.0s#e**rpxSOD-2e0.5##$$$*ANRβ-actinm0.0laZaZmTNMrSVToTNSNormalSTZSTVNaTMZp22phoxp47phoxSOD-2nit1.5ni2.5ni2.0ttccca-a-aaa2.0**-a##ttt*eee1.5b/1.0b/b/nn1.5noioio##$iss#s1.0ss**serer1.0er**p0.5ppxx##$$xee0.5e0.5AAANNNRRR0.00.00.0mmmlllaZaZaZaZaZaZmTNMmTNMmTNMrSVTrSVTrSVToToToTNSNSNS图3-13、糖尿病及STVNa和TMZ对心肌组织氧化应激相关基因表达的影响（16周）*，**，与正常组相比，p<0.05，p<0.01；#，##，###，与STZ组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001；$，$$，$$$，与STVNa组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001。65 华南理工大学博士学位论文此外，WesternBlot检测表明，抗氧化蛋白——过氧化物氧还蛋白peroxiredoxin2（Prx2）和硫氧还蛋白thioredoxin1（Trx1）在12周糖尿病大鼠心肌组织内表达水平显著降低，而STVNa或TMZ治疗11周都有一定的提高Prx2和Trx1表达水平的作用（图3-14），表明两种药物都有显著的抗氧化应激、抑制组织内ROS水平的作用效果。Trx112KDPrx222KDβ-actin45KDNormalSTZSTVNaTMZAnti-OxidantProteinExpressionni1.5tcNormala-β#STZ/)#neSTVNaoig1.0*sna****TMZsehrc*pdxleo0.5fn(ietorp0.012xxrrTP图3-14、STVNa/TMZ对糖尿病抑制的心肌Prx2和Trx1的影响*，***，与正常组相比，p<0.05，p<0.001；#，与STZ组相比，p<0.05。进一步采用免疫组化方法，对心肌组织进行8-OHdG（8-羟基脱氧鸟苷，DNA氧化损伤标志物）染色，表明糖尿病大鼠心肌组织内氧化损伤显著升高，而STVNa或TMZ都可以明显降低氧化损伤（图3-15）。综合各项指标分析，尽管两种药物抗氧化效果接近，但STVNa依然显示了一定的优越性。66 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用Cardiac8OHdGStaining83.010)D***OI(yt2.0108isnetnie1.0108*###***###vitaleR0laZaZmTNMrSVToTNS图3-15、免疫组化染色显示STVNa和TMZ具有显著的抗氧化作用8OHdG染色图中线段长为100μm。*，***，与正常组相比，p<0.05，p<0.001；###，与STZ组相比，p<0.001。3.3.9STVNa可显著抑制糖尿病引起的炎症反应炎症反应是一型糖尿病最显著的特点，包括急性炎症和长期低水平的慢性炎症。本研究通过酶联免疫吸附试验（ELISA）证实，一型糖尿病大鼠体内的炎症水平大大升高，表现为血液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）的含量显著增加（图3-16）。可能与蛋白处理过程有关，心肌组织内两种因子尽管无显著性差异，但也有升高的趋势。然而，另一种急性炎症反应的常用标志物——C反应蛋白（CRP）在在不同组别之间的67 华南理工大学博士学位论文统计结果并不显著，这与研究认为一型糖尿病CRP水平并不升高的结果相一致(215)，表明CRP与糖尿病及其并发的心脏病之间的关系有待考证。PlasmaTNF-αCardiactissueTNF-α300)30ni**e)tLorm/200pl20og##mm/nl##(oαm###-**F100n(10NαT-FNT00llaZaZaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNSCardiactissueIL6PlasmaIL-615)150nietor10)pL*g100m/ml/olo###mn##5(##m6-50n(LI6-LI00llaZaZaZaZTNMmTNMrmSVTrSVToToTSNSNCardiacTissueCRPPlasmaCRP2.5250)niet2.0)200oLrmp/l150g1.5omm/lu(o1.0100mPRu(C50P0.5RC00.0llaZaZaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNS图3-16、STVNa缓解糖尿病引起的循环系统和心肌组织炎症*，**，与正常组相比，p<0.05，p<0.01；#，##，###，与STZ组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001。68 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用IL-1βMCP-1VCAM-1ICAM-1β-actinNormalSTZSTVNaTMZIL-1βMCP-10.150.20nitnictac*-a-at***at0.15eb0.10e###/###*n***###***b/n###oi***soi0.10sssererp0.05pxex0.05eAANNRR0.000.00mmllaZaZaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNSVCAM-1ICAM-10.10ni0.8tnitc***ca-0.08aa-***tat0.6eeb/b/n0.06o###$$ni***oi###ss0.4s0.04s*###$er***###erppxxe0.02e0.2AANNRRm0.000.0malZaZlZaZamTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNS图3-17、糖尿病及STVNa/TMZ对心肌组织炎症相关基因表达的影响（12周）*，***，与正常组相比，p<0.05，p<0.001；###，与STZ组相比，p<0.001；$，$$，与STVNa组相比，p<0.05，p<0.01。进一步检测发现，糖尿病促使心肌组织内促炎症相关基因，包括IL-1β、MCP-1、69 华南理工大学博士学位论文ICAM-1和VCAM-1的表达水平明显升高（图3-17）。STVNa治疗可以大大降低循环系统和心肌组织内的炎症水平，抑制炎症相关基因的表达。此外，采用免疫组化分析巨噬细胞标志物CD68来阐述心肌组织内炎症细胞浸润情况，结果表明，糖尿病使心肌组织内炎症细胞浸润明显增强，而STVNa可以显著抑制糖尿病引起的炎症细胞浸润，恢复到接近正常的水平（图3-18）。TMZ对循环系统和心肌组织炎症的抑制效果与STVNa相似。类似的，停药后4周，两种药物依然有显著的抗炎症效果（图3-19）。CD68Staining74.010)pytu**i3.0107sorngetlnaim2.0107#er##viotnalfeo71.010R%(0laZaZmTNMrSVToTNS图3-18、STVNa显著抑制糖尿病引起的心肌组织炎症细胞浸润CD68染色图中线段长为100μm。**，与正常组相比，p<0.001；#，##，与STZ组相比，p<0.05，p<0.01。70 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用IL-1βMCP-1VCAM-1ICAM-1β-actinNormalSTZSTVNaTMZMCP-1IL-1βnit0.4ni1.0**ctac-aa-t***a0.8e0.3tbe/bn/on0.6ioi#s0.2s*se###sr***er0.4##$ppx**###$$$xe0.1e0.2AANNRR0.00.0mmllaZaZaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNSVCAM-1ICAM-1ninit2.0t0.25**cca**a--a0.20attee1.5b**b//nno0.15oi#is1.0*ssser0.10##$$er##$ppxxee0.50.05AANNRR0.00m0.0mllaZaZaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNS图3-19、糖尿病及STVNa/TMZ对心肌组织炎症相关基因表达的影响（16周）*，**，***，与正常组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001；#，##，###，与STZ组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001；$，$$，$$$，与STVNa组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001。3.3.10STVNa对血脂代谢无显著影响血脂异常是糖尿病人最常见的症状之一，一型糖尿病人也会出现血脂紊乱的现象，表现为胆固醇和甘油三酯水平升高。本研究进一步测定12周动物血浆中的甘油三酯和总胆固醇含量，从图3-20的结果可以看出，一型糖尿病血浆甘油三酯和总胆固醇含量也有升高的趋势（无统计学显著性差异），而STVNa不具有降低血脂水平的效果。71 华南理工大学博士学位论文TriglycerideTotalCholesterol1.03)0.8L)/lL/o2lo0.6mmm(m(0.4OGH1TC-0.2T0.00llaZaaZaTNTNmmrSVrSVoToTNSNS图3-20、一型糖尿病及STVNa治疗后对血脂无显著影响3.3.11STVNa可在一定程度上改善糖尿病引起的肾功能与肝功能下降糖尿病还会诱发显著的肝功能和肾功能异常。肝脏功能与糖脂代谢关系密切，高血糖非常容易引起肝脏脂肪代谢紊乱和脂肪肝，从而影响肝功能。通过测定谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST），发现12周糖尿病组血浆ALT有显著性升高，有趣的是，STVNa可以明显降低ALT的升高（图3-21）。AST呈现相同的趋势，但统计结果无显著性差异。同时，糖尿病患者经常并发肾功能下降，到晚期甚至发展到肾衰竭。通过分析血浆内的肌酐（Cr）和血尿氮（BUN）发现，糖尿病大鼠血浆中Cr和BUN明显高于正常组，而STVNa治疗组大鼠血浆Cr和BUN都显著降低（图3-22），表明STVNa对糖尿病诱发的肾脏病变有一定的缓解作用，这可能与其广泛的抗氧化机制有关。AlanineaminotransferaseAspartateaminotransferase1520*15)10##)L/L/UU((10TTLSA5A500llaZaaZaTNTNmmrSVrSVoToTNSNS图3-21、STVNa或TMZ对糖尿病引起的肝功能障碍的影响*，与正常组相比，p<0.05；##，与STZ组相比，p<0.01。72 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用PlasmaCreatininePlasmaureanitrogen(BUN)8015*#)**)60LL//l10loomm40##μm((rNCU520B00llaZaaZamTNmTNrSVrSVoToTNSNS图3-22、STVNa或TMZ对糖尿病引起的肾功能障碍的影响*，**，与正常组相比，p<0.05，p<0.01；#，##，与STZ组相比，p<0.05，p<0.01。3.3.12STVNa不影响糖尿病导致的晚期糖基化终末产物（AGE）糖尿病导致长期持续性高血糖，并最终使机体内的多种分子被糖基化修饰，形成晚期糖基化终末产物（AGE），刺激炎症和纤维化等过程。本研究采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法对AGE进行了检测，结果表明，一型糖尿病发生12周后，大鼠血浆中的AGE水平均显著升高，心脏组织AGE水平呈上升趋势（图3-23）。然而，STVNa或TMZ治疗不能有效降低AGE水平。因此，这两种药物均无法破坏葡萄糖对体内蛋白、脂肪、核苷酸的糖基化交联反应，很可能是通过AGE下游的其他机制来实现对心脏的保护作用。PlasmaAdvancedGlycationEndProductsTissueAdvancedGlycationEndProducts)2500150or)Lp***g2000m/*gm/μg(μ1500n100(ointaoirtta1000nrtec50nenoc500ncoEcGE0A0GlZaZAalZaZaTNTNMrmSVTMrmSVToToTNSNS图3-23、糖尿病及药物治疗对AGE浓度的影响*，**，与正常组相比，p<0.05，p<0.01。73 华南理工大学博士学位论文在糖尿病状态下，AGE引起心肌组织氧化应激、炎症和纤维化增加主要是通过激活AGE受体（RAGE）而实现的，而RAGE是心肌细胞表面的一种跨膜受体，可以与包括AGE在内的多种配体结合而被激活，从而刺激细胞内的各种下游信号通路。本研究进一步分析了RAGE的激活情况（图3-24）。结果表明，糖尿病显著促进RGAE的表达，无论是mRNA还是蛋白水平都明显升高。然而，STVNa或TMZ都不能显著抑制RAGE的表达水平。CardiacproteinlevelofRAGECardiacmRNAcontentofRAGE)e4ni0.8tgcnaa**-ahc3*te0.6dlb/****onf(oi2s0.4nistecrap-xβ/1e0.2EAGNARR00.0mllaZaZaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNS图3-24、STVNa对糖尿病刺激的RAGE的表达无显著影响*，**，与正常组相比，p<0.05，p<0.01。3.3.13药物作用的分子信号通路检测为了探讨STVNa治疗糖尿病心肌病变背后的作用机制，本研究进一步对氧化应激和炎症反应相关的上下游信号通路进行了研究，主要包括促炎症的NF-κB，促炎症和促细胞增殖的ERK，抑制NF-κB炎症反应并调节代谢的AMPK等。如图3-25所示，糖尿病导致心肌组织中ERK1/2（MAPK家族成员之一）和NF-κB信号通路被激活，ERK1/2磷酸化增加，NF-κBp65亚单位表达显著升高。STVNa治疗可以显著抑制ERK1/2信号通路，其磷酸化水平大大降低，同时抑制NF-κB信号通路。有趣的是，TMZ可以显著抑制NF-κB信号通路，但ERK1/2分子的磷酸化却显著增强，表明其活性进一步被激活。74 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用p-ERK1/242/44KDERK1/242/44KDNF-κB65KDβ-actin45KDNormalSTZSTVNaTMZp-ERK1/2tototalERK1/2NF-κBp65expression55)e**gn4**#$4aniht)ceca-gdl3***βn3of/a(56hK2*##pc2Rdl#EBo*-κ-f(#t/FK11NRE-p00llaZaZaZaZmTNMmTNMrSVTrSVToToTNSNS图3-25、糖尿病及药物治疗对ERK与NF-κB信号通路的影响*，**，***与正常组相比，p<0.05、p<0.01及p<0.001；#，##，与STZ组相比，p<0.05，p<0.01；$，与STVNa组相比，p<0.05。同时，糖尿病导致心肌组织内AMPKαThr172磷酸化水平显著降低（图3-26），表明糖尿病引起糖脂代谢紊乱，炎症反应增强。STVNa对AMPK信号通路无显著影响，而TMZ显著激活AMPK信号通路。由此可见，STVNa和TMZ虽然都可以一定程度提高心肌组织内ATP含量，但是两者可能是通过不同的信号通路起代谢调控作用。75 华南理工大学博士学位论文p-AMPK62KDAMPK62KDβ-actin45KDNormalSTZSTVNaTMZp-AMPKtototalAMPK)eg2.0na##hcd1.5lof(K1.0PM**A-t/0.5KPMA-0.0plaZaZmTNMrSVToTNS图3-26、糖尿病及药物治疗对AMPK信号的影响**，与正常组相比，p<0.01；##，与STZ组相比，p<0.01。3.3.14异甜菊醇钠对正常大鼠的影响为了进一步分析STVNa的安全性，本研究采用另一项实验，对正常大鼠给予STVNa给药6周后，通过组织化学和分子生物学检测来验证STVNa的安全性。结果表明，正常大鼠接受STVNa处理不会影响机体的各项生理功能常数，主要表现为STVNa对正常大鼠体重增长无显著影响，心肌组织经H&E和天狼星红染色结果也表明，STVNa对正常大鼠无任何不良影响（图3-27）。此外，无论是血浆还是心肌组织，STVNa对正常大鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素6（IL-6）都无显著影响（图3-28）。76 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用CrossSectionalArea500400)2m300μ(A200SC1000laaNormalNormal/STVNaBNmVroTN/SlamrNPoNCardiacFibrosisPercentage0.6)%(so0.4itaRcito0.2rbiF0.0laaNrmVoTN/SlamrNormalNormal/STVNaoN图3-27、STVNa不影响正常大鼠的体重、心肌细胞横截面积和纤维化染色图片放大200倍，图中线段长为100μm。PlasmaInflammationTissueInflammation)400Normaln)iLNormal/STVNaet25m/otg300p20p(gnm/oig15t200n(artnnoi10etc100arnton5eCc0no0-α-6Cα-6FL-IFILNNTT图3-28、STVNa对正常大鼠炎症无显症影响77 华南理工大学博士学位论文进一步通过PCR检测分析表明，口服给予STVNa持续六周，对心肌肥大、纤维化、氧化应激和炎症反应有关的基因mRNA表达无显著改变（图3-29）。ANPBNPTGF-β1Smad-3SOD-2Nox-2IL-1βVCAM-1β-actinNormalNormal/STVNa图3-29、STVNa对正常大鼠病理标志基因表达无显著影响78 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用3.4讨论糖尿病与心脏结构和功能的改变有直接的关联(216)，这一结构和功能的改变是一个动态发展的过程。高水平的葡萄糖浓度引起各种物质发生非酶催化的糖基化反应，形成晚期糖基化终末产物（AGE），AGE与心肌细胞表面的AGE受体（RAGE）结合并活化RAGE，ERK和NF-κB活化，AMPK转导受到抑制，进一步促进氧化应激增强，活性氧自由基（ROS）水平升高，心肌细胞代偿性肥大，心脏舒展功能紊乱。接着，心肌细胞凋亡增加，为了补偿心肌细胞凋亡导致的缺损，成纤维细胞增殖，胶原蛋白表达升高，纤维化沉积显著发生，心脏收缩功能也开始下降。最终，心脏进入失代偿状态，导致心力衰竭。作为一种多因素诱发的复杂疾病，目前尚缺乏有效的治疗药物。降血糖药物虽然有一定的效果，但是多项临床实验却并未证实这类药物对糖尿病心肌病变有切实的疗效(8)，而且临床上许多病人血糖无法得到有效控制。针对心肌缺血或冠心病等的抗心脏病药物用于治疗糖尿病引起的心肌病变时，由于未能考虑这一疾病的复杂性，导致临床效果也非常有限。因此，针对糖尿病心肌病变开发特异性药物，从多个方面抑制病理学发生发展过程，是一种切实有效也最有潜力的方式。通过本章的研究，证实了STVNa可以有效对抗糖尿病引起的心脏病，降低心肌肥大和间质纤维化，抑制氧化应激和炎症反应构成，减少心肌组织和细胞内的ROS水平，同时恢复心脏的舒张和收缩功能。STVNa不降低一型糖尿病大鼠的血糖和AGE水平，也不增加血浆胰岛素浓度。进一步分析发现，糖尿病大鼠心肌组织内ERK和NF-κB信号通路被激活，而AMPK磷酸化显著降低，表明心脏进入强氧化压力和高炎症反应状态，与氧化和炎症有关的信号通路转导紊乱。STVNa可以抑制ERK进而阻断NF-κB信号通路，对AMPK信号显示微弱的激活作用但无显著差异。而TMZ则激活ERK和AMPK信号通路，抑制NF-κB。激活ERK信号可能有助于心肌细胞存活，而AMPK的活化既有助于提高代谢效率也可以抑制NF-κB进而抑制炎症反应。由此可见，STVNa和TMZ虽然都具有抗氧化应激和炎症反应的效果，但两者是通过不同的信号通路实现的。3.4.1糖尿病心肌病变引起氧化应激和炎症反应血糖浓度升高后，长时间持续刺激心脏组织和细胞，氧化应激和炎症信号通路被激活，心脏内氧化分子如活性氧自由基（ROS）和炎症细胞因子如IL-6、TNF-α和MCP-1等大量产生，这些又反过来会进一步损害心脏的舒张和/或收缩功能，逐步发展成心肌梗79 华南理工大学博士学位论文塞、心肌肥大乃至心衰(217)。氧化应激和炎症反应的激活与核因子NF-κB、有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路的活化有关(218)。氧化应激在糖尿病引起的心脏损伤中起到关键作用(219,220)，过量的ROS会直接促进心肌细胞凋亡，并通过激活特定的分子信号通路而激发炎症和细胞凋亡，引起纤维化重构(221)。心肌组织内的氧化应激水平是一个动态平衡过程，其水平的高低由ROS的形成和清除共同作用决定。本研究表明，糖尿病会引起心脏氧化应激水平大大增加（表现为8-OHdG染色阳性增多、总的GSH水平下降等），这些ROS的生成与NADPH氧化酶的表达及活性增强、SOD表达及活性降低有关。而且，糖尿病大鼠心肌组织中MDA（丙二醛）含量大大升高，表明心脏内过氧化物过度累积，与心肌细胞内过氧化物沉积增多的结论相一致。同时，糖尿病使心肌组织内SOD-2表达都大大降低，活性有一定下降，总抗氧化能力明显减弱，Prx2和Trx1的表达均显著下降，细胞无法及时清除过量生成的ROS，氧化应激水平剧烈升高。由此可见，糖尿病发生后，ROS生成增多，清除能力下降，过度的氧化应激对心肌细胞造成严重损伤。已有研究表明，甜菊类物质或曲美他嗪都可以通过抑制氧化应激而起到对心脏或其他疾病的保护作用。例如，甜菊苷（Stevioside，SVS）具有很强的抗氧化能力(222)。异甜菊醇的抗氧化能力或许与其对线粒体的保护有关(223)。本实验室的多项研究也证实这些结果。曲美他嗪也是一种能够高效抑制氧化应激的药物，通过抑制葡萄糖和脂肪酸氧化，曲美他嗪可以治疗缺血性心衰(224)。此外，TMZ降低氧化压力，减少细胞毒性，改善肾功能等，是通过同时激活Akt、eNOS和HO-1而发挥作用的(225)。本研究的结果表明，作为一种经过广泛验证的抗氧化剂，STVNa可以非常好地抑制细胞内ROS水平的升高，其机制可能与促进SOD-2的表达和活性有直接的关系，因为无论是SOD-2的mRNA水平、SOD活性、GSH含量，还是Prx2和Trx1的表达水平，STVNa治疗组都显著升高。有趣的是，TMZ作为一种代谢调节剂，也可以有效降低组织细胞内的氧化应激水平，这也许与其抑制脂肪酸氧化、促进糖代谢从而间接地恢复细胞内氧化还原水平有关，但TMZ也可以抑制氧化磷酸化关键酶亚单位的表达、小幅提高SOD-2的表达，且TMZ对Nox-2的抑制效果显著高于STVNa，说明TMZ也具有直接的抗氧化作用。总体来看，与TMZ相比，STVNa具有更显著的抗氧化能力，特别是在提高SOD-2的表达方面效果显著。从两种药物对Nox-2和SOD-2的不同影响来看，STVNa或许更多地依靠对ROS的清除而起作用，相反TMZ则更多地依赖于抑制ROS生成达到效果。80 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用此外，糖尿病心肌病变的另一大特点是伴随着显著的局部炎症反应，特别是长时间、低水平的炎症状态会使心脏结构和功能逐步恶化，机体内炎症相关的细胞因子和趋化因子表达都显著升高(226)。本研究结果证实，一型糖尿病大鼠循环系统和心肌组织内炎症因子含量大幅度升高，心肌组织内炎症因子的表达水平也显著增加。STVNa治疗均可以降低机体系统性炎症，抑制心肌组织内炎症因子基因的表达，减少炎症细胞浸润，有利于降低心肌组织损伤。TMZ也具有类似的抗炎症效果。3.4.2STVNa对糖尿病大鼠机体代谢及内脏损伤的保护作用本研究证实，一型糖尿病大鼠体重增长减缓甚至停滞，实验结束时体重显著低于正常大鼠。STVNa或TMZ对糖尿病大鼠的体重增长有一定的促进作用，但远远没有达到正常大鼠的水平。同时，两种药物对于血液葡萄糖浓度和血浆胰岛素水平也没有显著影响，也没有降低血液或心脏组织内的晚期糖基化终末产物浓度。因此，这两种药物不是通过降低血糖或影响常规代谢实现对心脏的保护作用。此外，一型糖尿病大鼠血脂也有升高的趋势（统计学无显著性差异），而且有研究证实降血脂药物（如他汀类）在降低血脂的同时对心脏起到一定的保护作用(227,228)，说明降低血脂、改善机体整体代谢异常也能缓解各种因素包括高血糖引起的心功能下降。但是，本研究证实，糖尿病大鼠血脂有轻度的升高，而STVNa和TMZ两种药物都不能降低甘油三酯和总胆固醇含量，意味着其心脏保护作用与血脂代谢无关。本研究还证实，STVNa对糖尿病引起的肝功能和肾功能障碍有一定的保护作用，表现为抑制肝肾功能相关的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和血尿氮等指标。异甜菊醇或其甜菊类物质与机体代谢及内分泌的关系长期以来广受关注，例如有研究认为甜菊糖甙具有胰岛素样作用机制和抗氧化活性，提高SOD和过氧化氢酶活性(162)。甜菊醇对葡萄糖转运有显著的作用(164)，并且可能直接作用于胰岛β细胞而促进胰岛素分泌(229)，有研究认为这与调控乙酰辅酶A羧化酶有关(230)。甜菊醇还能通过抑制NF-κB通路而降低组织炎症(163)，改善胰岛素信号和抗氧化机制而抑制(231)。也有研究认为，异甜菊醇通过可以调节胰岛α细胞内与胰高血糖素合成有关的基因表达，从而对抗糖尿病(166)。同样，TMZ在内分泌方面也具有一定的有益效果。研究认为，TMZ可以显著抑制雨蛙素引起的胰岛细胞凋亡(232)，减轻胰腺炎症状。TMZ对各种原因引起的肾脏损伤也有一定的治疗效果(233-235)，这或许与其调节代谢、抗氧化的机制直接相关。综上所述，STVNa和TMZ对糖尿病引起的肾脏和肝脏损伤都有一定的保护作用。然而，由于两种药物都降低了血浆的炎症水平和组织的氧化应激状态，因此目前还无法81 华南理工大学博士学位论文判断两者对肝脏和肾脏的保护作用是因为给药后改善了循环系统中的炎症和氧化水平而改善肝肾组织的结构功能异常，还是由于药物直接对肝脏和肾脏组织起到保护作用，或者同时通过这两种机制起作用，这些内容依然有待深入分析。3.4.3STVNa分子作用机制的初步分析本研究通过动物实验表明，STVNa和TMZ都具有明显的治疗DCM的效果，而且两者的治疗作用都不是通过降低血糖、升高胰岛素或者抑制晚期糖基化终末产物（AGE）来实现的，其具体机制有待进一步深入分析。但从初步的结果来看，这两种药物有着不同的作用机制。首先，在糖尿病导致ERK1/2信号通路活化的情况下，STVNa可以显著抑制这一通路的激活，而TMZ则极大促进ERK1/2信号通路活性。其次，糖尿病大鼠心肌组织内AMPK信号通路受到抑制，AMPK磷酸化水平大大降低，STVNa对AMPK通路无显著影响，而TMZ则增强AMPK的磷酸化。第三，作为促进炎症反应的NF-κB通路，同时也是ERK下游的信号分子，糖尿病条件下活性显著增强，而STVNa和TMZ都可以抑制这一信号通路。最后，与清除活性氧自由基紧密相关的锰超氧化物歧化酶（SOD-2），在糖尿病条件下，其活性和表达水平都明显下降，而与ROS生产紧密相关的Nox-2表达则显著升高。两种药物都可以在mRNA水平提高SOD-2的活性和表达，抑制Nox-2的表达，但STVNa对SOD-2的效果优于TMZ，对Nox-2的抑制作用不如TMZ，意味着STVNa更多可能地通过清除ROS降低氧化应激水平，而TMZ更多地通过阻止ROS生成而减轻氧化应激。从总抗氧化能力考虑，STVNa是一种比TMZ更有效的抗氧化剂，但两者之间的细微差异有待深入研究。ERK1/2在DCM发生发展过程中起到重要作用(47)，但这一作用是两方面的。多数研究认为ERK1/2在DCM状态下被激活，其作用是促进疾病发生、是有害的，ERK1/2的磷酸化激活与心肌细胞凋亡、心肌肥大、纤维化及氧化应激有关(236,237)；但也有研究认为ERK1/2的活化是有益的，对DCM的发展起到抑制作用(238,239)。本研究证实糖尿病激活ERK1/2，STVNa可以抑制ERK1/2信号通路，这与一项异甜菊醇抑制异丙肾上腺素（ISO）诱导的大鼠动脉平滑肌增殖的结果相吻合(240)。STVNa可以通过抑制ERK1/2来实现抗氧化和抗炎症的效果。与STVNa相反，TMZ会进一步激活已经被糖尿病刺激的ERK1/2，这一激活可能有助于细胞的存活。与本研究一致的是，有研究证实TMZ确实通过同时刺激ERK1/2和AMPK信号通路而对抗缺血-复灌引起的心肌损伤(173)，但也有研究认为TMZ抑制糖尿病刺激的ERK的激活(142)，这种差异可能与动物模型、药物剂量、研究方案等相关，具体差异有待进一步分析。82 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用AMPK信号通路是调控糖脂代谢的能量感受器，对维持心肌组织内能量代谢平衡状态具有重要的作用，同时还具有抑制氧化应激和炎症的效果(241,242)。糖尿病发生后，心脏代谢功能紊乱，AMPK信号通路被抑制，心肌细胞对葡萄糖的吸收减少、对脂肪的吸收增加。TMZ激活AMPK信号通路已经过诸多研究证实(172,173)，但目前尚未有STVNa对AMPK信号通路影响的报道。本研究表明，STVNa不能显著促进AMPK的活性，但与以往结论一致的是，TMZ可以增强AMPK磷酸化，降低心肌炎症反应。NF-κB途径是一种与炎症反应紧密相关的信号传导通路，在DCM中发挥重要作用，其活性受ERK分子激活，而受AMPK信号分子抑制(243)。有研究表明，无论是一型糖尿病还是二型糖尿病，外界刺激（主要是持续的高葡萄糖水平）使心肌组织内的炎症水平大幅度升高，与之相伴的是NF-κB通路的激活。该通路的关键成分，NF-κBp65表达增强，进入细胞核内的水平显著升高，从而促进与炎症、氧化应激、纤维化有关的基因表达。本研究结果表明，无论是STVNa还是TMZ，都具有显著的抑制NF-κB信号通路活化的作用，前者可能是通过抑制ERK而抑制NF-κB，而后者则通过激活AMPK来抑制NF-κB引起的炎症反应。3.4.4异甜菊醇与血糖、胰岛素及糖尿病本研究证实，STVNa不会降低一型糖尿病大鼠的血糖，不升高血浆胰岛素水平，对AGE也无显著影响。然而，对于异甜菊醇或甜菊类物质，各研究之间有着不同的结论，本研究与以往的部分研究结果有着不一致的地方，主要体现在对不同动物模型的血糖浓度、糖耐量等指标的影响上。在治疗糖尿病及并发症方面，有研究表明，异甜菊醇可以降低血浆葡萄糖的水平，对Zucker二型糖尿病大鼠的高血糖有抑制作用(161)。另一项研究采用正常大鼠测定静脉注射葡萄糖耐量（IVGTT），表明异甜菊醇及其衍生物具有不同程度的抗高血糖效果，可以降低静脉注射葡萄糖耐受不良(165)。有研究表明，异甜菊醇可以抑制棕榈酸诱导的胰高血糖素分泌，减轻棕榈酸对胰岛素分泌的抑制作用(166)，且使胰岛素受体（INSR）、胰岛素受体底物1（Irs1）、PI3K调节亚单位多肽1（Pik3r1）、Akt1等基因表达显著升高。而一项采用高脂肪负荷诱导的大鼠高血脂和高血糖模型进行的研究表明(244)，异甜菊醇降低空腹血糖、空腹胰岛素、TC、LDL和胰岛素抵抗指数，升高HDL水平，血液葡萄糖水平下降，胰岛素分泌不受影响。与这些研究有所不同的是，本研究证实异甜菊醇不能降低一型糖尿病大鼠的血糖浓度，对升高的胰岛素抵抗指数也无抑制作用。这一差异很可能是由于采用了不同的糖尿病模型导致：已有研究主要采用高脂肪饮食诱导的83 华南理工大学博士学位论文代谢综合征或胰岛素非依赖性二型糖尿病模型，而本研究采用了胰岛素依赖性一型糖尿病。由于一型糖尿病血浆内胰岛素水平下降，可能影响异甜菊醇对葡萄糖的作用效果。因此，我们推测异甜菊醇对葡萄糖代谢的影响，与胰岛素和葡萄糖自身的浓度相关，正如一项甜菊醇的研究所证实的(164)。当然，不同的动物种属、研究周期、研究手段和方法都可能影响实验结果。未来，我们将进一步验证不同浓度的胰岛素和/或葡萄糖对异甜菊醇作用的影响。异甜菊醇已经被证实具有治疗心肌缺血/复灌损伤(245)、抑制癌症(246)、对抗炎症(247)、局灶性脑缺血(248)和抗菌作用(249)。本实验室的研究也证实了异甜菊醇具有脑缺血保护、线粒体功能保护的作用(155,156)。事实上，甜菊类物质与糖尿病及并发症相关的研究较为广泛。甜菊苷（SVS）可以改善高脂肪饮食引起的二型糖尿病的血糖和胰岛素胰岛素抵抗(163)，其作用机制是抑制脂肪组织NF-κB信号通路（显著降低IKKα/β蛋白磷酸化水平）。在肥胖Zuker大鼠中，SVS不影响胰岛素，但可以显著抑制葡萄糖水平(164)。有研究认为，SVS的降血糖作用归因于对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）的抑制(250)，PEPCK是肝脏糖质新生的限速酶。在最新的一项研究中，甜菊叶提取物可以降低STZ诱导的大鼠糖尿病的血糖和糖基化物质的水平(167)，但由于该研究所用提取物为复杂的多成分混合物，因而无法判断降血糖的是什么物质。本研究所采用的阳性对照药物TMZ作为一种已经上市的药物，多项研究均表明不存在降血糖或升高胰岛素的效果，本研究也证实TMZ对血糖和胰岛素无任何影响，而且TMZ应用的药代动力学及安全性研究较为充分(251,252)。研究证实，曲美他嗪是长链3-酮脂酰基CoA硫解酶（3-KAT）的部分抑制剂，增加丙酮酸脱氢酶（PDH）活性和葡萄糖代谢速率(253)，氧消耗降低，氢离子增加，细胞内酸化降低钙离子聚集。TMZ通过调节炎症反应降低自由基引起的心脏损伤，保护心脏对抗心肌细胞的坏死和凋亡，抑制心肌重构。糖尿病心脏内FFA浓度显著增加，对心肌组织造成毒性，导致细胞膜损伤、内皮功能紊乱、组织炎症和心功能下降。减少血浆FFA浓度和心脏的脂肪酸氧化，同时刺激葡萄糖和乳酸吸收，可以降低心脏毒性(254)。通过本研究，证实TMZ可以激活糖尿病抑制的心肌组织内AMPK信号通路活性，并进一步抑制NF-κB的激活，从而缓解心脏代谢能力下降导致的心功能异常。3.4.5异甜菊醇钠的安全性STVNa是提取自甜菊叶中的天然化合物，甜菊叶中还含有甜菊醇及其衍生物等一系列具有不同程度甜度的物质。这一系列物质由于是天然植物提取物，已经被全球多个84 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用国家包括南美、东南亚和中国使用多年，安全性非常有保障。近些年来，也有大量研究对甜菊叶中提取的各类化合物进行了多方位的评价，包括药物分子检测方法的建立、药代动力学和毒代动力学等研究都证实这些天然提取物无任何显著的毒副作用。例如，甜菊叶提取物和甜菊苷对实验动物的繁殖能力、性行为、生育、胚胎数量、或后代的繁殖和生长没有任何影响(255,256)。本项目研究的是异甜菊醇钠盐，而异甜菊醇的毒副作用、消化与吸收、分布与代谢等都已经有较多的研究。在大鼠中，通过静脉注射8mg/kg的异甜菊醇，血浆药物浓度在0.5-80µg/mL（相当于1.57-250.45µM）之间，半衰期约为406分钟(257)。一项研究采用4mg/kg的剂量，口服或静脉注射异甜菊醇的方式给药，认为口服生物利用度约为60.4%(258)。甜菊苷和甜菊醇也经过了大量的遗传检测，两者都不与DNA直接反应，不具有遗传毒性，在极高浓度下也不会破坏染色体(259)。经细菌、培养的哺乳动物细胞和小鼠检测表明，甜菊苷也没有致突变性(260)。培养的动物细胞或器官研究表明甜菊醇没有DNA损伤活性(261)，而急性和慢性大鼠毒性研究也表明甜菊苷是安全的(262,263)。人体药代动力学研究表明，健康个体单次口服纯化的RebA、甜菊苷或混合的甜菊苷吸收后，代谢成葡萄糖醛酸通过尿液排泄，或者代谢成甜菊醇通过粪便排出(264)，这些研究都未显示任何毒副作用。为了进一步验证STVNa对正常动物的影响，本研究给予正常大鼠一定时间的药物处理，接着通过组织病理学分析和分子生物学检测手段证实了STVNa并不影响正常大鼠的各项指标，包括炎症、氧化应激、肥大和纤维化有关的参数都无明显改变。因此，STVNa作为一种提高了溶解度和生物利用度的异甜菊醇化合物，在安全性得到有效保障的条件下，随着对各种疾病治疗药效学和药理学研究的深入，未来可以用于多种疾病的预防或治疗。3.4.6糖尿病性心肌病药物开发糖尿病引起的心脏病是一种复杂的、多因素诱发、多机制并存的病症，发病机制依然未得到充分的阐明，也是一种目前尚无有效药物治疗的疾病。目前临床上降血糖药物针对糖尿病人，心脏保护药物针对心脏病人，因此当发生糖尿病心肌病变时，可能合并两种类型的药物进行治疗。但无论是降糖药还是对抗心脏病的药物，或者两者联合使用，都未取得良好的治疗效果。但由于该疾病是导致糖尿病人死亡的主要原因，因此开发一种特异性针对DCM的药物、应对目前临床尚未满足的需求，显得尤为必要。目前，虽然尚无特异性针对DCM的药物上市，但已经有大量的研究开始针对这一85 华南理工大学博士学位论文疾病开发药物。这些药物包括降血糖药物、抗心脏病药物、各种抗氧化制剂和代谢调节剂，每种药物都显示了一定的治疗效果。然而，降糖药物对DCM的作用未获得足够的临床支持，而且有的糖尿病人采用降糖药无法有效降低血糖；抗心衰药物只针对心脏病变，没有考虑到糖尿病的高血糖和血脂紊乱等特殊因素，因而效果有限；抗氧化剂药物治疗效果也未能获得足够的临床数据支持，且生理状态的活性氧自由基是重要的信号转导分子，因此如何有效控制活性氧的合理水平也非常关键；代谢调节药物（包括本研究所用的对照药物曲美他嗪）理论上可以通过调节代谢、增强细胞能量供应的效率而对抗心肌病变，但目前依然处于理论推测和早期研究阶段，离临床产业化依然有较远的距离。总而言之，现有的各种药物对DCM虽然有一定的疗效，但是能够特异性治疗这一多因素疾病的药物依然缺乏。异甜菊醇钠是从天然植物甜菊叶中提取的单一成分化合物，经过独特工艺成盐处理后大大提高了溶解度。由于来源天然，使用历史悠久，安全性有充分的保障；同时大量研究证实这一化合物具有抑制多种致病因素的优势，因此采用这一化合物来治疗DCM是一种较为理想的选择。通过动物水平的药效学和初步的药理学分析，证明STVNa可以显著改善糖尿病引起的心脏结构和功能异常，其作用与抑制炎症、氧化应激和纤维化相关的ERK1/2及NF-κB信号通路有关，未来我们将继续深入分析这一药物的作用机制，明确作用靶点。3.5本章总结综上所述，本研究通过大鼠DCM模型的研究，证实了STVNa具有显著的治疗DCM的作用，其效果与目前临床用于治疗心衰和心肌梗死、近些年有研究者建议作为DCM治疗制剂——曲美他嗪相近，部分指标甚至更好。两种药物都具有明显的抑制氧化应激和炎症反应的作用，同时缓解甚至完全抑制心脏结构和功能的异常。进一步研究证实，这两种药物都不能降低血糖、提高血浆胰岛素或者抑制AGE，至少在一型糖尿病模型中是如此。同时，两者之间的作用机制有着显著区别，STVNa更多的是抑制促进细胞炎症和氧化应激的上游信号ERK分子来缓解DCM，而TMZ则通过激活AMPK调节糖脂代谢、抑制氧化应激和炎症来对抗DCM。基于上述研究结果，未来本课题可以开展如下动物水平的科研工作：（1）STVNa对二型糖尿病或代谢综合征引起的心脏疾病的作用效果及机制；（2）STVNa对DCM模型中胰岛素信号通路的影响，重点是不同浓度的葡萄糖和胰岛素对STVNa作用的影响86 第三章异甜菊醇钠对糖尿病性心肌病的保护作用及潜在机制；（3）STVNa对细胞能量代谢（包括葡萄糖和脂肪酸的吸收与氧化）的深入影响；（4）STVNa对不同心脏细胞类型（心肌细胞和成纤维细胞）及其不同细胞之间的通讯的影响。87 华南理工大学博士学位论文第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用4.1前言糖尿病性心肌病一般是早期发生舒张功能异常，后期发生收缩功能紊乱、心肌重构和心衰。心肌纤维化、细胞外基质（ECM）增加、胶原沉积都与心功能的下降紧密相关，但这些生物学反应过程一般发生在DCM的中期和晚期，其早期舒展功能和结构变化的具体机制依然不够明确。而且，这些结构和功能的异常变化，实际上都是由于高血糖对心肌组织内各种细胞、特别是心肌细胞作用的结果(7,265)。采用整体动物模型研究，在早期一般无明显的病理学症状，而且一些检测手段的灵敏度和精密度无法有效鉴别出结构、功能、信号转导的异常。采用体外细胞模型可以弥补整体动物模型在DCM发生早期研究方面的局限性，有助于理解糖尿病发生后的短时间内心脏内某种细胞的结构和功能变化，明确循环系统中高浓度的葡萄糖对细胞的影响，从而揭示DCM病理生理学。同时，尽管采用整体动物模型研究可以充分明确心脏整体功能特征的变化以及一些病理学相关的信号通路。然而，体内动物模型受各种生理条件、生物化学刺激因素的复杂影响，很难研究DCM疾病发生发展的单一机制因素，在准确评估药物对某条信号通路的影响、分析药物作用机理方面也受限于体内各种不同微环境的影响。例如，心脏的心肌细胞或成纤维细胞等不同细胞类型对外界刺激或某种药物的反应可能完全不同，心肌组织检测不到某一些差异有可能是由于两种细胞相反的反应相互抵消的结果。相反，体外细胞模型则可以通过控制生理、物理或化学刺激因素而准确分析心肌细胞对单独一种刺激因素或特定药物的生物力学、化学反应。只有通过体外细胞模型的研究，才能精确分析不同糖尿病因素与功能紊乱的关系（如高血糖和/或高血脂如何直接影响功能特性），并快速评估缓解心功能异常药物的效果。此外，众多生物力学的研究如分析单个心肌细胞的收缩性和顺应性等，也必须采用体外细胞模型。目前，采用体外细胞模型来研究DCM导致的细胞凋亡、ROS形成等已经成为一种广泛使用、非常可靠的研究手段(266,267)。这些细胞培养模型一般采用的葡萄糖浓度在20-40mM之间，其中最常用的是25mM、30mM和33mM等浓度(184,268-271)，这些浓度与动物或人体糖尿病条件下的血糖浓度较为接近。一般为了排除渗透压对细胞的影响，会采用同等浓度的D-甘露糖或者L-葡萄糖作为对照。本章主要采用大鼠H9c2心肌细胞系为对象，在培养基中添加较高浓度（接近动物88 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用或人体糖尿病的血糖浓度）的葡萄糖来模拟体内高血糖条件。由于是一种单一的细胞系，没有机体内的复杂的循环系统影响和组织微环境，排除了复杂的相互作用，因此有利于研究特定因素对细胞的影响。而且，细胞传代培养相对动物研究而言更为简便，周期较短，分组给药相对容易。为了验证常用的葡萄糖浓度的有效性，本实验首先采用不同浓度的葡萄糖确定了合理的浓度范围后，通过不同的药物浓度来研究STVNa或TMZ对DCM的作用影响及其可能的作用机制。通过本章的研究，证实了动物实验的结果，表明STVNa和TMZ都可以有效抑制H9c2心肌细胞肥大、纤维化、氧化应激和炎症因子的表达，降低高糖引起的细胞活力的下降。STVNa通过抑制ERK和NF-κB降低炎症和纤维化，大大增强SOD的表达而提高ROS的清除能力，同时对糖酵解过程有明显的促进作用，这一作用与刺激己糖激酶和磷酸果糖激酶的活性有关。TMZ则激活ERK和AMPK信号通路，保持细胞活力并维持细胞代谢稳定，同时抑制NF-κB、Nox-2和TRPC3、降低细胞内ROS水平。此外，高糖引起细胞内PI3K/Akt信号转导通路被抑制，两种药物都对这一信号通路有一定的促进作用。4.2材料与方法4.2.1试剂（1）细胞培养相关试剂：DMEM培养基（Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium，SH30021.01）、DMEM/F12培养基（SH30023.01）、胰酶（SH30042.01）、青链霉素双抗（SV30010）、PBS磷酸缓冲液（SH30256.01）购自HyClone公司；胎牛血清（500mL，10270-106）购自ThermoFIsherGibco公司。（2）CCK-8细胞活力检测试剂购自碧云天生物技术有限公司（500次，C0038）和北京聚合美生物科技有限公司（500次，MF128）。（3）H2DCF-DA荧光探针染料（100mg，D399），购自ThermoFisherMolecularProbes公司。（4）DAPI染料（10mg，D3571），购自ThermoFisherMolecularProbes公司。（5）异甜菊醇钠，本实验室自制水针剂。（6）盐酸曲美他嗪，购自武汉峰耀同辉化学制品有限公司，作为阳性对照药物。（7）D-葡萄糖（500g），购自青岛捷世康生物技术有限公司。（8）D-甘露糖（50g），购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。89 华南理工大学博士学位论文（9）核酸提取与纯化试剂：Trizol总RNA提取购自南京诺唯赞生物科技有限公司（RNAisolaterTotalRNAExtractionReagent）和上海捷瑞生物工程有限公司（RnaEx总RNA提取试剂）。（10）逆转录与PCR扩增试剂：cDNA一链合成试剂盒（HiScript1stStrandcDNASynthesisKit）和荧光定量PCR预混试剂盒（SYBRGreenReal-TimePCRMix）购自南京诺唯赞生物科技有限公司。（11）细胞裂解液（CelLytic™MTCellLysisReagent，C3228）和蛋白酶抑制剂（P8340）购自Sigma-Aldrich公司。（12）蛋白电泳与Westernblot试剂：参照第二章的“材料与方法”部分。（13）2-脱氧葡萄糖（2-DG，10），购自南京森贝伽生物科技有限公司。（14）3-(3-吡啶)-1-(4-吡啶)-2-丙烯-1-1（3PO）（2mg，T3260），购自TargetMol公司。（15）紫草素（Shikonin，25mg，BZP0186），购自合肥博美生物科技有限责任公司。（16）寡霉素（Oligomycin，10mL，Lot180417，），购自南京森贝伽生物科技有限公司。（17）脂质体转染试剂Lipofectamine2000：购自ThermoFisherLifeTechnoligies公司。（18）小干扰核苷酸（siRNA）：根据参考文献设计针对AMPK(272)和Akt(273)分基因的siRNA序列，siRNA由吉玛基因公司合成。AMPK-siRNA的序列为：正义链5'-AUGAUGUCAGAUGGUGAAUTT-3'，反义链5'-AUUCACCAUCUGACAUCAUTT-3'。AKt-siRNA序列为：正义链5'-UGCCCUUCUACAACCAGGATT-3'，反义链5'-UCCUGGUUGUAGAAGGGCATT-3'。阴性对照NC-siRNA序列为：正义链5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反义链5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。4.2.2耗材细胞培养瓶（25/75cm2）、细胞培养板（6/12/24/96孔）、一次性移液管（5/10/25mL）、离心管（15/50mL）等均购自NEST公司；0.5/1.5mL离心管、0.2mLPCR管、0.2mLPCR八连管等购自Corning旗下Axygen公司；0.2mLPCR板购自LifeTechnoligies公司；其他各种耗材购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司。90 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用4.2.3仪器设备细胞培养箱（ThermoFisher311）、超净工作台（苏净安泰SW-CJ-2FD）、冷冻冷藏冰箱（海尔）、-80℃超低温冰箱（海尔DW-86W100）、液氮罐（金凤科技YDS-50B-125）、倒置荧光显微镜（明美M1-BGU-LED-M112）、普通光学显微镜（上海光学厂SOID/37XB）、中低速离心机（湘仪H1650-W）、台式高速离心机（ThermoLegendMicro17R）、多功能酶标仪（Chaomate4300）、紫外分光光度计（PekinElemerLambda365）、普通PCR仪（ThermoABIVeriti）、实时定量荧光PCR仪（ABTQuantStudio3）、细胞能量代谢分析仪（AgilentSeahorseXF96）、蛋白电泳与转膜系统（Bio-RadPowerPacBasic）、凝胶成像分析系统（Bio-RadChemidoc）、雪花制冰机（宁波新芝XB-30）。其他仪器与第二章和第三章相同。4.2.4细胞培养、传代与计数H9c2细胞系（购自中科院细胞所，来源为ATCC），小于3-4代的细胞采用液氮长期保存，根据常规的细胞冷冻保存和复苏程序进行H9c2细胞的冻存与复苏(274,275)，在实验过程中根据需要可以冻存或复苏不同代数的细胞以便不同实验的开展。本实验所采用的细胞为8-12代。细胞采用DMEM基础培养基（葡萄糖浓度为5.5mmol/L）培养，加入10%的胎牛血清（FBS），同时加入适量的青链霉素混合液（终浓度为100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素）。细胞培养于37℃、95%的空气/5%的二氧化碳条件下。当细胞覆盖率达到70-80%时进行传代培养，约每三3-4天传代一次，采用一传三的方式。采用血球计数板，对适当稀释后的细胞悬液计数，确保接种到培养板或培养瓶内的细胞数量在合理水平。4.2.5高糖培养细胞的分组与药物处理（1）糖溶液的配制：A.配制D-葡萄糖母液：称取一定量的葡萄糖，加入适量体积的PBS，充分溶解，使终浓度为5M溶液；取5M溶液稀释5或10倍，得到1M和0.5M的溶液。B.配制D-甘露糖母液：称取一定量的甘露糖，加入适量体积的PBS，充分溶解，使终浓度为5M溶液；取5M溶液稀释5或10倍，得到1M和0.5M的溶液。配置好的糖溶液，保存与2-8℃，一个月内使用。（2）药物溶液配制：A.称取异甜菊醇钠（MW=354.95）0.0036g，加入无菌的PBS缓冲液1mL，得到91 华南理工大学博士学位论文10mM的药物溶液；接着，分别采用10倍稀释的方式（取100μL，加入PBS900μL）依次得到1mM、100μM、10μM和1μM的药物溶液。B.称取盐酸曲美他嗪（MW=339.26）0.0034g，加入无菌的PBS缓冲液1mL，得到10mM的药物溶液；接着，分别采用10倍稀释的方式（取100μL，加入PBS900μL）依次得到1mM、100μM、10μM和1μM的药物溶液。配置好的药物溶液，2-8℃保存，三个月内使用。（3）分组情况：A.葡萄糖浓度探索分组：在分析不同浓度葡萄糖对细胞活力的影响时，在96孔板3中接种100μL细胞（含3-5×10个细胞）并过夜贴壁后，分别加入不同浓度的葡萄糖或相应浓度的甘露糖，由于DMEM培养基中本身含有5.5mM的葡萄糖，为了描述方便，本研究将以加入的葡萄糖作为标示浓度（下述的葡萄糖浓度均为标示浓度），在96孔板内的添加方式如下表所示（采用PBS校正各孔之间加入糖溶液体积的差异）。标示浓度05102550100150200（mM）实际浓度5.510.515.530.555.5105.5155.5205.5（mM）糖溶液及-0.5M0.5M1M1M5M5M5M加入体积1μL2μL2.5μL5μL2μL3μL4μLB.药物浓度探索分组：在药物作用的准确浓度未确定以前，先采用不同浓度的药物来检测对正常或高糖培养的H9c2细胞的影响。本实验首先摸索了10个浓度的药物（μM）：0、0.01、0.1、1、5、10、25、50、100和1000。以96孔板100μL的细胞培养基为例，这10个浓度的药物加入方法分别为：不加任何药物溶液，1μM的药液1μL，10μM的药液1μL，100μM的药液1μL，100μM的药液5μL，1mM的药液1μL，1mM的药液2.5μL，1mM的药液5μL，10mM的药液1μL，10mM的药液10μL。各孔之间加入药液体积的差异通过补加PBS进行校正。C.用于机制研究的分组：采用25mM的葡萄糖浓度作为高糖组（HG），同时可以设置50mM的更高浓度葡萄糖组（HG50），并以25mM甘露糖（HM）作为渗透压参照组，设定1、10和50μM高中低三个不同浓度的药物进行后续的机制研究，在不同目的的实验中采用不同浓度和体积的药物溶液处理，具体见后续方法。4.2.6细胞活力测定采用96孔板培养细胞（100μL），并经过高糖培养和/或药物处理后，每孔加入10μL的CCK-8试剂，37℃继续培养1-4个小时（具体时间根据细胞数量、细胞状态等因素决92 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用定），待孔内培养基的颜色转变成均匀的、充分溶解的棕黄色时，采用酶标仪，在450nm波长下读取吸光度。以正常细胞作为参照，比较高葡萄糖或药物对H9c2细胞活力的影响。每次实验中，每个不同处理条件的平行做2-3孔，每个实验重复3次。4.2.7细胞内ROS水平检测采用H2DCF-DA（2',7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate）荧光染色来检测细胞内ROS的水平。适当数量的H9c2心肌细胞接种96孔板后，经过血清饥饿、高糖和/或不同浓度药物处理后，去掉孔内培养基，PBS洗涤2-3次。同时，采用PBS配制10μM的H2DCF-DA溶液，加入到96孔板内，50-100μL/孔，37℃继续培养30分钟。接着，用DAPI染料（5μg/mL，PBS配制）对细胞核进行复染，37℃孵育30分钟。PBS洗涤三次后每孔加入100μL的无血清培养基。在倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况，激发光为490nm左右的蓝光，发射波长为520nm（绿色荧光）。DAPI染色细胞核，激发光为340nm（紫外线），发射波长为488nm（蓝色荧光）。同时采用显微镜配套的相机拍摄照片（每孔拍摄5-10张），包括明视野下的正常细胞。采用ImagePro分析荧光强度，以DAPI染色的细胞核的多少和荧光强度进行校正。4.2.8细胞裂解液的总抗氧化能力测定参照第三章的方法，采用比色法测定细胞裂解液的总抗氧化能力（T-AOC）。根据测定孔和对照孔的吸光度值，采用如下公式计算细胞裂解液总抗氧化能力：组织匀浆液的总抗氧化能力（U/mg蛋白）=[（测定孔OD值-对照孔OD值）/（0.01×30）×反应液总体积/取样量×样品测试前稀释倍数]/[细胞裂解液蛋白浓度（mg/mL）×加入体积（mL）]。4.2.9细胞培养上清液乳酸脱氢酶（LDH）活性测定参照第三章的方法，适当修改后测定细胞培养上清中的LDH活性。LDH活性单位定义为“每升培养上清在37℃条件下与基质作用15分钟，反应体系中产生1μmol丙酮酸为一个活力单位”。因此，活力单位计算公式为：细胞培养上清液的LDH活性=（测定空OD值-对照孔OD值）/（标准孔OD值-空白孔OD值）×标准品浓度（0.2mM）×1000。结果表示为每升细胞培养上清中的LDH活性单位（U/L）。由于标准品单位为mmol/L，而活力单位中丙酮酸计算方式为μmol，因此通过乘以系数1000来计算每升中的活力单位数。93 华南理工大学博士学位论文4.2.10总RNA提取、逆转录与实时定量荧光PCR检测经过高糖和/或药物处理的细胞，采用移液器将细胞培养基吸出后，加入PBS洗涤1-2次。根据细胞数量情况，每孔加入500-1000μL的Trizol裂解液，并用吸头反复吹打贴壁的细胞，使细胞充分裂解。接着，将细胞裂解液转移到1.5mL的离心管内，室温静置5-10分钟。然后，加入100-200μL的氯仿（体积为裂解液的20%），并在漩涡震荡器上震荡15秒，室温静置2分钟以上。接着，在4℃、12000×g条件下离心10-15分钟，使溶液分成上下两层。取上层液体转移到另一1.5mL离心管，加入250-500μL的异丙醇，轻轻混匀管内液体，室温静置10分钟。4℃、12000×g离心10分钟，弃上清。加入500-1000μL的75%的乙醇，温和洗涤沉淀，4℃、7500×g离心5分钟，弃上清，然后重复用75%的乙醇洗涤一次。去掉75%的乙醇（尽量用吸头吸取干净）后，在超净工作台内自然风干，加入适量的DEPC水溶解RNA（可以在60-65℃条件下孵育5-10分钟，促进溶解）。提取的总RNA样品，分装后，在-80℃长期保存备用，短期（3个月以内）也可以在-20℃条件下保存。采用NanoDrop2000微量分光光度计测定提取的RNA浓度和纯度。接着，采用一管化逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA。逆转录体系为10μL。首先，在0.2mL的PCR管内加入总RNA500ng和4×gDNAwiperMix2μL，然后补充DEPC水到8μL。在普通PCR扩增仪（ThermoCycler2720）上42℃处理2分钟。接着，加入5×qRTSuperMixII2μL，混匀后，25℃处理10分钟，50℃处理30分钟，85℃处理5分钟。完成逆转录后的混合液，储存于-20℃备用。实施定量荧光PCR在QuantStudio3（LifeTechnologies,Ltd.）上进行。反应体系为10μL：qPCRMasterMix5μL、cDNA（稀释5-10倍）0.5μL、上下游引物（10μM）各0.5μL、双蒸水3.5μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟，接着95℃30秒、60℃30-60秒（40个循环），最后72℃延伸10分钟。最后，通过溶解曲线鉴定扩增产物的特异性和单一性，程序为：95℃变性30秒，70℃反应1分钟，然后升温至95℃（每0.2℃采-△△Ct集一次荧光）。以正常组的内参基因作为对照，按照2方法(214)统计各组织间mRNA水平的差异。4.2.11蛋白提取纯化与浓度测定采用细胞裂解液提取H9c2细胞的总蛋白。首先，吸头吸取上清，废弃，然后加入一定量（2-3mL）的提前冰浴冷却的PBS（0.1M，pH=7.4）溶液洗涤一次后弃去。接94 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用着，根据细胞密度情况（六孔板或十二孔板），每孔加入100-200μL的细胞裂解液（主要成分为50mM的Tris（pH7.4）、150mM的NaCl、1%的TritonX-100、1%的脱氧胆酸、0.1%的SDS），裂解液中加入终浓度为1mM的PMSF以及1倍浓度的蛋白酶抑制剂混合物。采用移液器吸头反复吹打混匀，将裂解液转移到1.5mL离心管内，漩涡震荡器震荡混匀5-10秒。然后置于冰上30分钟，在此期间每隔10分钟左右漩涡混匀一次。接着，10000×rpm、4℃离心10分钟，此时细胞碎片将与细蛋白裂解液分离。将离心管内的液体转移到另一离心管内，根据第三章的方法测定蛋白浓度后，分装成若干份，部分-80℃长期保存，部分-20℃短期保存。4.2.12蛋白电泳与Western杂交分析参考第三章的方法，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，每孔加入等量的、30-50μg的蛋白。电泳分离的蛋白转移到PVDF膜（0.22μm或0.45μm，Millipore）上。接着，采用5%的脱脂奶粉（TBST配制）室温封闭1小时。TBST洗涤三次，每次5-10分钟。采用第一抗体进行孵育：anti-phospho-ERK1/2（CST#4370，1:2000）、anti-ERK1/2（Abcam#196883，1:2000）、anti-NF-κBp65（ProteinTech#10745-1-AP，1:1000）、anti-phospho-AMPKα（CST#2531，1:2000）、anti-AMPK（SantaCruzsc-74461，1:1000）、anti-phospho-Akt（CST#9271，1:2000）、anti-pan-Akt（CST#4691，1:2000）、anti-Nox2（SantaCruzsc-130543，1:1000）、ant-TRPC3（SantaCruzsc-514670，1:1000）和anti-β-actin（CST#3700，1:1000），4℃过夜。TBST洗涤三次，每次5-10分钟。加入HRP（辣根过氧化物酶）标记的第二抗体（抗小鼠或抗兔的IgG），室温孵育45-60分钟。TBST洗涤三次，每次5-10分钟。采用增强型化学发光检测试剂盒（ECL）孵育PVDF膜（孵育时间根据目标蛋白的浓度、显示试剂的灵敏度等进行调整），通过化学发光成像仪对目标条带进行曝光成像。采用ImagePro和ImageLab对目标蛋白进行定量分析，每孔上样量的差异通过内参蛋白β-actin来校正。4.2.13细胞能量代谢仪测定心肌细胞糖酵解细胞在没有氧气参与的情况下通过糖酵解生成ATP、乳酸和氢离子。细胞能量代谢分析系统通过测量细胞外酸化速率（ECAR）以进行糖酵解检测。首先，将细胞接种到Seahorse96XF细胞培养微孔板（95孔，每孔80μL），细胞覆盖率为30-50%，在生长培养基中培养过夜（37℃、5%的CO2），使细胞贴壁。然后，按照实验设计的需求分组后，分别加入葡萄糖、甘露糖（渗透压对照）和/或药物，继续95 华南理工大学博士学位论文培养48小时。检测细胞代谢前一天，在UtilityPlate中加入SeahorseXF校准液后，测试版放回UtilityPlate上，在细胞培养箱中放置过夜，使探针水化。检测当天，提前打开代谢仪和电脑进行预热。同时，根据操作说明书，采用SeahorseXFBaseMedium配制检测液，加入所需要的底物，在37℃水浴中用NaOH调节pH值至7.4。接着，取出培养了48小时的细胞，在显微镜下观察无异常状态后，吸出细胞培养基，加入相同体积的检测液，在无CO2的培养箱（37℃）培养1小时。根据说明书，配制1μM寡霉素（Oligomycin，ATP合成酶抑制剂）、1.5μM氟羰基氰化物苯腙（FCCP，脱偶联剂）、1μM抗霉素A（antimycinA，电子传递链抑制剂）和100nM鱼藤酮（rotenone，电子传递链抑制剂），然后按照实验设计加入测试板上A、B、C、D四个加药孔内。然后，运行程序，将测试板和加了校准液的UtilityPlate放入，进行自动探针校准。当软件提示后，将UtilityPlate更换为细胞培养板，按照既定程序完成检测。采用Wave软件和GraphPad对实验数据进行分析处理。4.2.14糖酵解及氧化磷酸化抑制与药物作用研究糖尿病引起的高血糖导致心肌组织糖酵解过程受到抑制，并进而使心肌组织内ATP含量降低，一般认为采用高葡萄糖培养的H9c2细胞的糖酵解过程也同样被抑制，葡萄糖整个代谢过程受损。为了进一步验证STVNa、是否对糖酵解或后续的氧化磷酸化有影响，本研究采用特定的糖酵解和/或氧化磷酸化抑制剂来抑制H9c2细胞的葡萄糖的酵解和氧化过程，考察在药物存在或不存在情况下细胞的生理病理状态。（1）2-脱氧葡萄糖抑制己糖激酶496孔板接种H9c2细胞100μL，约1×10个/孔，37℃、5%的二氧化塘条件下培养6小时以上，让细胞充分贴壁。同时，配制0.5M的2-脱氧葡萄糖，往96孔板内分别加入0、1、2、3、4、5μL，不足5μL用PBS补足5μL，使2-DG的终浓度分别为0、5、10、15、20、25mM。培养24或48小时，采用CCK-8检测细胞活力。每个浓度分别做2-3个平行孔。根据不同浓度2-DG对细胞活力的影响（代表糖酵解被抑制的程度），选择一个合适的浓度进行后续试验。采用选定的最适2-DG浓度，将细胞接种96孔板，2-DG加入到细胞的同时加入STVNa或TMZ药物，来测定药物的作用。分别在8个孔内加入：PBS、2-DG、2-DG+1μM的STVNa、2-DG+10μM的STVNa、2-DG+50μM的STVNa、2-DG+1μM的TMZ、2-DG+10μM的TMZ、2-DG+50μM的TMZ。确保所有孔中加入的PBS、2-DG和药物总体积相同。培养48小时后，根据前述方法测定细胞活力。96 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用（2）3PO抑制磷酸果糖激酶采用与2-DG研究相类似的方式，配制0.5mM的3PO溶液，往接种了细胞的96孔板内分别加入0、1、2、3、4、5μL，不足5μL用PBS补足5μL，使3PO的终浓度分别为0、5、10、15、20、25μM，培养48小时后测定浓度，选择最适宜的3PO浓度。采用选定的最适3PO浓度，将细胞接种96孔板，3PO加入到细胞的同时加入药物（两种药物高中低三个浓度），来测定药物是否对磷酸果糖激酶的抑制有恢复作用。（3）紫草素（Shikonin）抑制丙酮酸激酶采用与2-DG研究相类似的方式，配制1mM的Shikonin溶液，往接种了细胞的96孔板内分别加入0、1、2、3、4、5μL，不足5μL用PBS补足5μL，使Shikonin的终浓度分别为0、10、20、30、40、50μM，根据细胞活力选择适宜的Shikonin浓度。采用选定的最适Shikonin浓度，将细胞接种96孔板，Shikonin加入到细胞的同时加入药物（两种药物高中低三个浓度），来测定药物是否对丙酮酸激酶的抑制有恢复作用。（4）Oligomycin抑制氧化磷酸化复合物五（ComplexV）参照已有的研究(276)，配制100mM的Oligomycin母溶液后，稀释成1mM和0.1mM的使用容液。往接种了细胞的96孔板内分别加入0.1mM的Oligomycin0、1、2.5、5μL和1mM的Oligomycin1和2μL，不足5μL用PBS补足5μL，使Oligomycin的终浓度分别为0、1、2.5、5、10、20μM。采用选定的最适Oligomycin浓度，将细胞分成8个组，根据实验要求采用不同大小的细胞培养板接种细胞后，Oligomycin加入到细胞的同时加入药物，来测定药物是否对被抑制的ComplexV有恢复作用。4.2.15核酸干扰（RNAi）检测本研究进一步采用小干扰核苷酸（siRNA）抑制AMPK和/或Akt信号通路关键蛋白，以分析这些信号通路对于DCM的作用、以及STVNa或TMZ的保护作用是否依赖于这些信号通路。参照H9c2相关研究中用到的siRNA转染方法进行转染(277)。H9c2细胞（5-10×410个/mL）接种到细胞培养板内，过夜培养使细胞充分贴壁。转染时，首先将脂质体（Lipofectamine2000）以1:50的比例与Optim-MEM培养基（不含血清）混合，将2μM的siRNA以1:50的比例与Optim-MEM培养基混合（siRNA浓度变为40nM），在室温下放置5分钟。接着，将上述的两种混合液等体积混合（siRNA浓度变为20nM），在室温下放置20分钟。然后，将培养板内的细胞培养基吸出，加入适量的上述siRNA与Lipofectamine2000的混合液，充分覆盖细胞，37℃、5%的培养箱内培养6小时。吸出97 华南理工大学博士学位论文孔内的培养基，加入生长培养基，并根据实验需求加入不同物质造模，并实施药物处理。4.2.16数据统计所有体外细胞实验至少重复三次，每次实验设置2-3个平行重复。所有数据以“平均值±标准差”表示。不同组之间的差异采用单向方差分析（ANOVA）进行检测，两个组之前通过学生t检验分析差异。p值小于0.05表示有显著性差异。所有数据采用GraphPad6.0进行分析。4.3.结果4.3.1不同浓度葡萄糖对H9c2细胞活力的影响本研究采用高浓度的葡萄糖模拟糖尿病状态下的高血糖，为选择合适的葡萄糖浓度，首先采用不同浓度的葡萄糖培养H9c2细胞24-48小时，测定细胞活力。结果如图4-1所示，与正常葡萄糖浓度（5.5mM，标示为0浓度）的对照组（NG）相比，不同浓度的葡萄糖对H9c2细胞活力有不同程度的影响，呈现葡萄糖浓度越高、细胞活力越低的趋势。加入5mM和10mM的葡萄糖对细胞活力无显著影响，而加入25mM以上的葡萄糖时细胞活力显著降低，25nM葡萄糖组的细胞活力下降为正常对照组的75%左右。甘露糖对细胞活力无显著影响，但当浓度到达200mM，细胞活力也显著降低，表明过高浓度的糖导致的渗透压升高使细胞活力下降。为模拟动物糖尿病状态，保持与体内动物模型研究的血糖浓度水平的一致性，后续各项研究均采用加入25mM的葡萄糖浓度作为体外心肌细胞高血糖培养的条件。图4-1、不同浓度的葡萄糖或甘露糖对细胞活力的影响*，**，与0mM浓度的葡萄糖或甘露糖相比，p<0.005，p<0.01。98 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用4.3.2STVNa对高糖抑制的H9c2细胞活力的作用接着，采用添加25mM的葡萄糖模拟高血糖培养细胞，以不同浓度的药物处理细胞，分析药物对高糖抑制的细胞活力是否有恢复作用。结果如图4-2所示，STVNa一定程度的恢复由于高糖培养降低的细胞活力，TMZ对细胞活力的提升效果优于STVNa（表现为10和50μM的作用效果，TMZ高于STVNa），STVNa最有效的浓度为1-10μM（更高浓度CV值变大），TMZ最有效的浓度在10-50μM之间。当药物浓度到导1mM时，细胞活力大大降低，表明过高浓度的药物具有细胞毒性。STVNaonHighGlucose-InducedCellInjuryHG150STVNaTMZyt#########il#####ib######ai100##V***evitale50RlleC0GGMMMMMMMMMMMMMMMMMMNHnnμμμμμμmnnμμμμμμm0015050010015050011012501012501111图4-2、不同浓度的药物对高糖诱导的细胞损伤的影响*，与正常（NG）组相比，p<0.05；#，##，###，与高糖（HG）组相比，P<0.05，p<0.01及p<0.001。4.3.3STVNa显著抑制高糖引起的细胞膜损伤通过测定细胞培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）的含量，可以反映细胞膜的完整程度，细胞损伤发生时，细胞膜遭破坏，通透性增加，更多的LDH会释放到细胞外。实验表明，高葡萄糖培养的H9c2细胞上清内LDH水平显著升高，而STVNa处理后，上清中LDH浓度显著降低（图4-3），表明STVNa可以有效降低高葡萄糖引起的细胞损伤。50mM的葡萄糖浓度组与25mM浓度相比，LDH浓度无显著区别，表明当葡萄糖浓度达到一定水平后，更高的浓度并不会造成更大损伤，这与前述的糖浓度摸索实验（图4-1）99 华南理工大学博士学位论文结果相吻合。TMZ也具有较强的降低细胞膜损伤的作用，且效果比STVNa稍好。LDHinCellMediaSupernatant2500)L/2000**U(*n*o1500it*a*rt##n1000**ec#no500C0GMG50MMMMMMMMNHHμμμμμμμμG01000100H1a151Z15aNaaZMZZNVNNMTMMVTVV/T//T/TTSTTG/S//S/SGHGGGNHHGHGGNHH图4-3、STVNa及TMZ显著降低高糖引起的细胞损伤*，**，与正常（NG）组相比，p<0.05，p<0.01；#，与高糖（HG）组相比，p<0.05。4.3.4STVNa对过氧化氢抑制的H9c2细胞活力的作用为了进一步分析STVNa或TMZ对细胞损伤的保护作用，采用过氧化氢（H2O2）直接诱导H9c2细胞损伤，加入不同浓度的药物，测定细胞活力。结果如图4-4所示，200μM的H2O2使细胞活力下降约30%，三个浓度的STVNa均未使细胞活力恢复，而10μM和50μM的TMZ可以显著恢复细胞活力。令人意外的是，400μM和800μM的H2O2虽然也是细胞活力降低，但是活力下降的程度却低于的200μM的H2O2，具体原因有待进一步分析。100 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用TheeffectsofSTVNa/TMZonH2O2-inducedH9c2cellinjury1.5ytilib######ai1.0**##**###**##V******e***************vitale0.5RlleC0.0GMMMMMMMMMMMNμμμμμμμμμμμ000001001005000015151248H2O2STVNaTMZH2O2-200μM图4-4、过氧化氢引起的细胞损伤及药物的保护作用**，***，与正常（NG）组相比，p<0.01，p<0.001；##，与200μM的H2O2组相比，P<0.05，p<0.01及p<0.001。4.3.5STVNa及TMZ对正常H9c2细胞活力的影响为分析药物STVNa或TMZ是否对正常的H9c2细胞有影响，采用不同弄的药物处理正常细胞。结果表明，在50μM以下，不同浓度的STVNa或TMZ会明显提高H9c2的细胞活力（图4-5），但当STVNa浓度到达100μM后，细胞活力反而明显下降，表明高浓度的药物对细胞具有一定的毒性。101 华南理工大学博士学位论文Normalcellwithdrugtreatment150**********yt********i***li***bai100V***evitaleRl50leC000.11510255010000.115102550100aZNMVTTS图4-5、不同浓度的药物对正常H9c2细胞的影响*，**，***，与0药物浓度组相比，p<0.05，p<0.01，p<0.001。4.3.6STVNa有效抑制高葡萄糖引起的H9c2细胞肥大和纤维化体外研究结果表明，高葡萄糖同样会引起H9c2细胞肥大，主要表现为细胞横截面积增加，肥大标志物ANP和BNP表达升高（图4-6）。与动物水平研究结果一致，STVNa可以降低心肌细胞肥大，减少H9c2细胞的横截面积，显著抑制ANP和BNP的表达。TMZ具有相似的抗肥大效果。102 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用H9c2cellareas)%200(a***e***r#######a150#####ecafru100sllece50vitale0RGMG00100010051a151Z15NHHGaNaaZMZZHNVNNMTMMVTVV/T//T/TTSTTG/S//S/SGHGGGNHHGHGGNHH)ANP)BNPninittc2.0c2.0a-a-atat**eeb1.5***b1.5*ssv(*v##**(s##s##e1.0e1.0#ggnnaahhc0.5c0.5dldlofofAAN0.0N0.0RGMG5001000100RGMG001000100mNHHa1aa1a5Z1ZZ1Z5mNHH5a1aa1a51Z15GNMGNZMZZHNVNNM/TMMHNVNNMTMMVTVV/T/T/TVTVV/T//T/TT/STTGGGGT/STTG/SG/S/SH/SG/S/SGHGGNHHNHHGHGGGHGGNHHNHH图4-6、STVNa和TMZ显著抑制高糖引起的心肌细胞肥大*，**，***，与正常（NG）组相比，p<0.05，p<0.01，p<0.001；#，##，###，与高糖（HG）组相比，p<0.05，p<0.01及p<0.001。与此同时，高糖还导致激活纤维化信号通路，主要表现为TGF-β1、Smad-3、一型胶原和三型胶原的mRNA水平上升（图4-7）。尽管部分组别之间无统计显著性差异，但STVNa和TMZ可以抑制上述大部分纤维化信号通路相关基因的表达。103 华南理工大学博士学位论文)TGF-β1)Smad-3ninittc2.5c2.0aa--at**ateeb2.0b1.5s***s**vv((1.5**#*sse#e1.0ggn#na1.0#ahhcc0.5dl0.5dlofofAAN0.0N0.0RGMG001000100RGMG5001000100mNHH5a1aa1a5Z1ZZ1Z5mNHHa1aa1a5Z1ZZ1Z5GNMGNMHNVNNM/TMMHNVNNM/TMMVTVV/T/T/TVTVV/T/T/TTSTTGT/STTG/S//S/SGHGG/S/S/SGHGGGNHHGNHHGHGGGHGGNHHNHH)CollagenI)CollagneIIIninittc2.0c2.0aa--aatteeb1.5b1.5ssvv(**(sse1.0e1.0#ggnnaahhc0.5c0.5dldlooffAAN0.0N0.0RGMG5001000100RGMG5001000100mNHHa1aa1a5Z1ZZ1Z5mNHHa1aa1a5Z1ZZ1Z5GNMGNMHNVNNM/TMMHNVNNM/TMMVTVV/T/T/TVTVV/T/T/TT/STTGT/STTG/SG/S/SGHGG/SG/S/SGHGGNHHNHHGHGGGHGGNHHNHH图4-7、STVNa和TMZ抑制高糖引起的心肌细胞纤维化基因表达*，**，***，与正常（NG）组相比，p<0.05，p<0.01，p<0.001；#，与高糖（HG）组相比，p<0.05。4.3.7STVNa抑制高糖引起的H9c2细胞氧化应激活性氧自由基（ROS）是引起心肌细胞功能紊乱的重要原因，而高糖一般会引起心肌细胞内显著的ROS升高。本研究采用ROS的荧光染色指示染料——H2DCF-DA——染色表明，高葡萄糖浓度培养H9c2细胞会引起细胞内ROS水平显著升高（图4-8），表明细胞氧化应激增强。而采用STVNa处理可以显著降低细胞内ROS水平，并具有明显的剂量效应。同时，测定细胞裂解液的总抗氧化能力以及抗氧化水平标志物GSH的含量，表明高糖条件下细胞抗氧化能力下降，代表抗氧化能力的GSH浓度也降低，而STVNa可有效提高细胞的抗氧化能力和GSH含量（图4-9）。TMZ具有类似的抗氧化效果，染色结果显示抑制细胞内ROS和Nox-2表达的效果优于STVNa，但提高SOD-2表达上不如STVNa。104 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用H2DCF-DAStaining250000yti**s**n200000etnI150000ecnec100000*s#e###r*##o50000ul##F0GMG00100010051a151Z15NHHGaNaaZMZZHNVNNM/TMMVTVVT/T/TTSTT/luuu/S//S/SGGllGNGGGHGGNHH图4-8、STVNa显著抑制高糖引起的细胞内ROS强度图片放大200倍。*，**，与正常（NG）组相比，p<0.05，p<0.01；#，##，与高糖（HG）组相比，p<0.05，p<0.01。105 华南理工大学博士学位论文TotalantioxidantcapacityCellLysisTotalGSH)5nie6)tno*##i#r#e4p*##*###to##grm##p*#/l4g3*o****m#m*##/μ*U(2(***tC***n2##etOA1n-oTc0H0SGMG5010a110501011050GGM5001000100NHHaaaZZZZNH25a1aa1a51Z15GNMGGNZMZZHNVNNM/TMMHHNVNNMTMMVTVV/T/T/TVTVV/T//T/TT/STTGTSTTG/S/S/SGHGG/S//S/SGHGGGNHHGNHHGHGGGHGGNHHNHH图4-9、STVNa显著提高细胞抗氧化能力和还原状态*，**，***，与正常（NG）组相比，p<0.05，p<0.01及p<0.001；#，##，###，与高糖（HG）组相比，p<0.05，p<0.01及p<0.001。相应的，高糖培养的细胞内促进氧化应激的酶及其辅助因子Nox-2、p22phox和p47phox的表达都有显著升高或呈现升高的趋势，而超氧化物歧化酶2（SOD-2）的表达显著降低（图4-10）。STVNa和TMZ对这些基因的表达有有显著的逆转效果，表明这两种药物可以降低高葡萄糖升高的氧化应激水平。)Nox-2)p22phoxninittc2.5c1.5a-*a-aatte2.0ebbssvv1.0(1.5****(sseeg#gn1.0##naahh0.5ccdl0.5dlooffAAN0.0N0.0RGMG001000100RGMG001000100mNHH5a1aa1a51Z15mNHH5a1aa1a51Z15GNZMZZGNZMZZHNVNNM/TMMHNVNNM/TMMVTVV/T/T/TVTVV/T/T/TT/STTGT/STTG/S/S/SGHGG/S/S/SGHGGGNHHGNHHGHGGGHGGNHHNHH)p47phoxn)SOD-2itnic2.5tac2.5-aa*-tae2.0teb2.0bs***s##v(vs1.5(1.5es#eg#g##n1.0n1.0aahhcc*****dl0.5dl0.5ofofAAN0.0N0.0RGMG5010a110501011050RGMG001000100mNHHGaaaZZZZmNHH5a1aa1a51Z15NMGNZMZZHNVNNM/TMMHNVNNMTMMVTVV/T/T/TVTVV/T//T/TT/STTGGGGT/STTG/SG/S/SH/S/S/SGHGGNHHGNHHGHGGGHGGNHHNHH图4-10、STVNa逆转高糖引起的氧化应激相关基因表达*，**，***，与正常（NG）组相比，p<0.05，p<0.01及p<0.001；#，##，与高糖（HG）组相比，p<0.05，p<0.01。106 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用4.3.8STVNa有效抑制高葡萄糖诱导的H9c2细胞炎症基因的表达高葡萄糖培养的H9c2细胞，显著激活炎症通路相关基因的表达，包括IL-1β、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1等基因的表达都显著升高（图4-11）。由此可见，高糖是促进炎症的关键因素。而STVNa或TMZ处理细胞后，都显示有一定的抑制炎症反应的效果，体现在两者可以不同程度地降低上述几个基因的表达水平。)IL-1β)MCP-1ninittc2.0c2.0aa--aatteeb1.5**b1.5s**sv(###*v(s#s*#e1.0eg1.0gnnaahhc0.5c0.5dldlofofAAN0.0N0.0RGMG001000100RGMG5001000100mNHH5a1aa1a5Z1ZZ1Z5mNHHa1aa1a5Z1ZZ1Z5GNMGNMHNVNNM/TMMHNVNNM/TMMVTVV/T/T/TVTVV/T/T/TT/STTGT/STTG/S/S/SGHGG/S/S/SGHGGGNHHGNHHGHGGGHGGNHHNHH)nICAM-1)VCAM-1itnitca2.5c2.0-a-atate2.0**ebb1.5s*sv(v(1.5sseegg1.0na1.0nahhcc0.5dl0.5dlofofAAN0.0N0.0RGMG5010a110501011050RGMG001000100mNHHaaaZZZZmNHH5a1aa1a5Z1ZZ1Z5GNMGNMHNVNNM/TMMHNVNNM/TMMVTVV/T/T/TVTVV/T/T/TT/STTGTSTTG/S/S/SGHGG/S//S/SGHGGGNHHGNHHGHGGGHGGNHHNHH图4-11、STVNa和TMZ抑制炎症基因的表达*，**，与正常（NG）组相比，p<0.05，p<0.01；#，与高糖（HG）组相比，p<0.05。4.3.9STVNa对RAGE基因的表达无显著影响第三章动物水平的研究证实，STVNa和TMZ均不能降低血浆或心脏组织内的AGE水平，对其受体RAGE的表达也无显著的抑制作用。体外细胞实验进一步证实，高葡萄糖培养H9c2细胞，RAGE的表达水平有所升高，但两种药物都不能显著抑制其表达（图4-12），表明其对心脏的保护作用确实不是通过降低RAGE表达实现的。107 华南理工大学博士学位论文)RAGEnitc2.5a-ateb2.0**s************v*(1.5segna1.0hcdl0.5ofAN0.0RGMG001000100mNHH5a1aa1a51Z15GNZMZZHNVNNMTMMVTVV/T//T/TTSTTG/S//S/SGHGGGNHHGHGGNHH图4-12、STVNa和TMZ不影响RAGE的mRNA水平*，**，***，与正常（NG）组相比，p<0.05，p<0.01及p<0.001。4.3.10STVNa抑制、TMZ激活糖尿病性心肌病激活的ERK信号通路ERK信号通路是与细胞增殖、凋亡、炎症、氧化应激及心肌纤维化重构紧密相关的信号通路，在不同的条件下具有不同的功能。目前多数研究都认为糖尿病状态下ERK信号通路被激活，且与AGE-RAGE系统高度活化有关(278)。为了验证高血糖是否导致ERK1/2信号通路激活，从而引起一系列的炎症反应，促进ROS水平升高，通过WesternBlot检测分析了高葡萄糖对ERK1/2信号通路的影响。结果表明，25mM和50mM的葡萄糖浓度促使ERK1/2的磷酸化显著增强，50mM激活程度比25mM更高（图4-13）。STVNa处理细胞，可以显著抑制ERK1/2的磷酸化水平，但对正常细胞的ERK1/2无显著影响。而TMZ会大大促进ERK1/2信号通路，磷酸化水平显著上升。这些结果进一步验证了动物体内研究的结果，两种药物对ERK有着完全相反的效果，表明ERK信号通路在糖尿病性心肌病中具有复杂多样的功能。108 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用phospho-ERKtototal-ERKNF-kBp65expression)e500ni250gtn##c*aah400-200**β/)cnedloig300*##n150ofsa##(sh#*ercK*#####R200*pdl100xE-**eoft/###n(K100i50eRtEor-p0p0GMG5010a110500100GMG5010a1105010110501Z15ZNHHGaNaaZMZZNHHGaNaaZMZZHNVNNM/TMMHNVNNM/TMMVTVV/T/T/TVTVV/T/T/TTSTTGT/STTG/S//S/SGHGG/S/S/SGHGGGNHHGNHHGHGGGHGGNHHNHH图4-13、STVNa和TMZ对ERK及NF-κB信号分子的作用*，**，与正常（NG）组相比，p<0.05，p<0.01；#，##，与HG组相比，p<0.05，p<0.01。4.3.11STVNa及TMZ抑制糖尿病性心肌病激活的NF-κB信号通路NF-κB信号通路是与炎症、氧化应激、纤维化紧密相关的转录因子，当机体或细胞受到外界刺激后，炎症损伤和氧化应激会激活NF-κB信号，其活性有效成分转入细胞核，进一步刺激与炎症、氧化应激、纤维化有关的信号通路基因的表达。高葡萄糖培养的H9c2细胞NF-κB的核心成分p65的表达显著升高，而STVNa或TMZ处理细胞后，NF-κBp65被显著抑制（图4-13），表明两种药物都具有抑制NF-κB转录因子信号通路的作用。4.3.12TMZ显著激活AMPK信号通路AMPK是调节细胞糖脂代谢平衡的重要分子，大量研究表明包括糖尿病在内的各种因素导致的心脏病变都呈现AMPK信号通路被抑制的情形。本研究分析表明，高葡萄糖培养心肌细胞，AMPKαThr172磷酸化水平显著下降，证实高糖会引起细胞代谢功能紊乱（图4-14），AMPK无法发挥正常的调控作用。STVNa对AMPK磷酸化有轻微的促进，但统计结果无显著性差异，而TMZ显著刺激AMPK信号通路。进一步，采用针对AMPK的siRNA敲低其表达后，TMZ（10μM）对高糖引起的细胞活力降低的恢复作用消失，而STVNa的细胞活力保护作用下降微弱。因此，TMZ对心肌细胞的保护作109 华南理工大学博士学位论文用至少部分是通过激活AMPK实现的。siAMPKeffectsonCellviabilityphospho-AMPKtototal-AMPK)1.5e200gyntia#lih*b###############cai1.0@@150v***dlll***ofe(cK100evP**it0.5M**alAe-tR/50KP0.0MGG0CK0CKNH1NP1NPAaiMZi-0N/sM/sMpV0iAT0iAT1/s/1/sGMG5001000100/Sa0GZ0NHHa1aa1a5Z1ZZ1Z5N1HM1GNMGVaTZHNVNNMTMMHTN/MVTVV/T//T/T/SVGTT/STTGTH//S/S/SGHGGGSGGNHHH/HGHGGGNHHH图4-14、TMZ显著激活高血糖抑制的AMPK信号通路*，与正常（NG）组相比，p<0.05；#，###，与HG组相比，p<0.05，p<0.001；@@，与HG/TMZ10组相比，p<0.01。4.3.13STVNa和TMZ都通过激活PI3K/Akt信号通路保护心肌细胞作为胰岛素下游分子，PI3K/Akt信号通路对细胞增殖和存活起到重要作用。有研究表明，糖尿病心脏中Akt信号通路活性下降(181)。但也有研究认为糖尿病条件下，心脏中I3K/Akt信号通路被激活(279)。体外研究证实高葡萄糖培养的心肌细胞，Akt磷酸化水平下降(280)。本研究表明，高葡萄糖条件下，Akt磷酸化被抑制，而STVNa和TMZ都可以一定程度上激活Akt的磷酸化（图4-15）。采用针对Akt的siRNA抑制Akt表达后，STVNa和TMZ对高糖引起的细胞活力下降的恢复作用都消失，表明两种药物对细胞的保护作用确实与Akt有关。110 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用siAkteffectsonCellviabilityphospho-Akttototal-Akt1.5)200ytielginb############a##ai1.0$$$@@@h150*V*********Ced##vilto###alf100(e0.5tRk**llA-et/50CtkA0.0-ttpGG0Ck0Ck0NHa1iNiA1iNAZiN/s/sM/s/sGG100100V00/T00NHa15Z15T1111NaaMZZ/SaaGZZVNNTMMGNNHMMTVV//T/TVV/T/TSTTGHTT//S/SHGG/S/SGGGHHHHHGGGGHHHH图4-15、STVNa和TMZ均可激活高血糖抑制的Akt信号通路*，**，与正常（NG）组相比，p<0.05，p<0.01；#，##，###，与HG组相比，p<0.05，p<0.01及p<0.001；$$$，与HG/STVNa10组相比，p<0.001；@@@，与HG/TMZ10组相比，p<0.001。4.3.14STVNa和TMZ对ROS相关的TRPC3/Nox-2的影响研究表明，高葡萄糖培养会使心肌细胞Nox-2表达升高(281)，而TRPC3与Nox-2紧密联系，共同促进细胞内ROS的生成(71)。由于STVNa和TMZ均可以不同程度地抑制Nox-2的mRNA水平，为此，本实验进一步分析了高糖对Nox-2和TRPC3蛋白表达的影响，以及两种药物的作用。结果表明（图4-16），STVNa可以一定程度降低Nox-2的蛋白水平，但对TRPC3无显著影响；而TMZ可以同时抑制Nox-2和TRPC3。由此可见，STVNa对Nox-2的抑制可能与TRPC3无关，而TMZ则通过同时抑制Nox-2和TRPC3，降低ROS生成的效果更显著。111 华南理工大学博士学位论文Nox-2expressionni400tca-β/)300**neoginsashe200rcpdl###x#eof#n(100ietorp0GG100100a15Z15NHNaaMZZVNNTMMTVV/TTSTTG///SSHGGG//HHHGGHHTRPC3expressionn250it*ca-200β/)neogin150sa#sh#ercpd100xleof(ni50etorp0GG100100a15Z15NHNaaMZZVNNTMMTVV/TTSTTG////S/SHGGGHHHGGHH图4-16、STVNa和TMZ对Nox-2/TRPC3表达的影响*，**，与正常（NG）组相比，p<0.05，p<0.01；#，与HG组相比，p<0.05。4.3.15STVNa及TMZ对糖酵解的影响DCM还表现为糖脂代谢紊乱，糖酵解过程被抑制，脂肪酸氧化增强。采用Seahorse细胞能量代谢分析仪对糖酵解进行检测，发现高糖培养的H9c2细胞糖酵解水平有所下降（p=0.075），而STVNa处理后，糖酵解能力极大增加图（4-17）。令人意外的是，TMZ处理的H9c2细胞并没有恢复高糖抑制的糖酵解，可能TMZ抑制脂肪酸氧化而提高葡萄112 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用糖代谢的机制涉及到多方面的因素（如与其他细胞之间的相互作用等），在单独的心肌细胞中不能促进糖酵解。STVNaExtraCellularAcidificationRate###20)ni###15m/Hp8m(6RA4CE20GMG00001515NHHaaZZNNMMVVTTTT///S/SGGHHGGHH图4-17、STVNa显著促进糖酵解过程###，与HG组相比，p<0.001。进一步采用各种糖酵解关键酶的抑制剂来分析两种药物对糖酵解的精确影响。首先，采用己糖激酶抑制剂——2-DG抑制糖酵解，以细胞活力检测为主要手段，分析STVNa和TMZ是否可以通过己糖激酶影响糖酵解过程。结果表明，15mM的2-DG使细胞活力下降近50%左右，而STVNa和TMZ都有显著的恢复细胞活力的作用（图4-18），说明两者都可以促进己糖激酶的活力。接着，用磷酸果糖激酶抑制剂3PO抑制糖酵解，15μM的3PO使细胞活力下降40%以上，低浓度（1μM）的STVNa有显著的提高细胞活力的作用，而TMZ不能逆转3PO引起的细胞活力下降（图4-18）。进一步采用shikonin113 华南理工大学博士学位论文来抑制丙酮酸激酶（PK），30μM的shikonin使细胞活力下降将近50%，但STVNa和TMZ都不能恢复细胞活力（图4-18）。综上所述，糖酵解对细胞存活极为关键，但糖酵解抑制剂与过氧化氢引起的细胞损伤有着不同的机制，STVNa和TMZ对糖酵解的影响不同，前者作用于己糖激酶和磷酸果糖激酶，后者只对己糖激酶有作用。2-DGinducedH9c2injury3POinducedH9c2injury1.51.5ytytililiibb1.0*###ai1.0ai***#####*v#vll****#*#*ll*************e***ec*********c******e***evi0.5*********vi0.5ttalaleeRR0.00.0llaMMMMMMMMMMMaMMMMMMMMMMMmmmmmmμμμμμμrm5μ0μ5μ0μ5μ1μ0μ0μ1μ0μ0μr505051105011050o11221515o1122NN2-DGSTVNaTMZ3POSTVNaTMZ2-DG(15mM)3PO(15μM)ShikonininducedH9c2injuryOligomycininducedH9c2injury1.51.5ytytililiibbai1.0ai1.0vl******vl*****ll******ec***ec******e******************e*********vi0.5vi0.5ttalaleeRR0.00.0llaMMMMMMaMMMMMMMMMMMmμμμμμμmμμμμμμμμμμμr100100r00000100100o1515o123451515NNSTVNaTMZShikoninSTVNaTMZShikonin(30μM)Oligomycin(1μM)图4-18、糖酵解以氧化磷酸化抑制剂诱导细胞凋亡及药物的作用*，**，***，与正常组相比，p<0.05，p<0.01及p<0.001；#，##，###，与2-DG（15mM）、3PO（15μM）、Shikonin（30μM）或Oligomycin（1μM）组相比，p<0.05，P<0.01及p<0.001。4.3.16STVNa及TMZ对氧化磷酸化的影响采用线粒体ATP合成酶（复合物V）抑制剂——寡霉素（Oligomycin）处理H9c2细胞，抑制氧化磷酸化过程。结果表明，1μM浓度的寡霉素使细胞凋亡显著增加，细胞数量明显减少，CCK-8测定的细胞活力值也显著降低（图4-18）。STVNa和TMZ两种药物都无法恢复细胞活力，说明不能恢复寡霉素抑制的氧化磷酸化活性。114 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用4.4.讨论目前，DCM的体外模型一般是模拟高血糖（或者结合一定程度的高血脂），通过高葡萄糖和高脂肪酸培养心肌细胞，分析对细胞活力和凋亡、钙信号通路和ROS的影响(282,283)，可以较为准确地分析不同剂量的药物对高糖诱导细胞损伤的保护作用及其潜在机制。本章利用大鼠H9c2心肌细胞为对象，以高浓度葡萄糖加入到培养基内模拟糖尿病的高血糖状态，排除其他干扰因素，研究糖尿病性心肌病对心肌细胞的影响，分析STVNa的作用效果及潜在机制，并与TMZ进行比较。结果表明，高糖对心肌细胞造成一定的损伤，引起特定病理基因异常表达，改变若干信号转导通路，并引起细胞代谢紊乱。STVNa和TMZ两种药物都显示了较好的心肌细胞保护效果，包括抑制肥大、提高细胞活力、减少ROS、缓解炎症和纤维化相关信号通路传导的异常以及增强心肌细胞代谢能力等。然而，两种药物也显示了不同的作用机制，STVNa抑制ERK和NF-κB，阻断炎症和纤维化，提高SOD-2表达水平，增强ROS清除能力，促进糖酵解特别是提高己糖激酶和磷酸果糖激酶活性。而TMZ则激活ERK和AMPK，增强细胞增殖能力，抑制NF-κB降低炎症水平，抑制Nox-2和TRPC3的表达，极大抑制ROS的生成能力，同时激活己糖激酶调节细胞代谢，对心肌细胞起到较好的保护作用。4.4.1高糖培养心肌细胞引起的信号通路改变ERK信号通路功能广泛，可参与调控细胞减数分裂、有丝分裂和有丝分裂后的功能(284)，与细胞生长、增殖、分化、迁移和存活紧密相关。高葡萄糖（HG）培养H9c2细胞会产生细胞毒性，促使细胞凋亡，ROS水平升高，线粒体膜电位降低，同时ERK1/2磷酸化水平上升。一些抗氧化剂如hispidin或硫氢化钠，以及ERK抑制剂U0126都可以明显抑制HG引起的心肌细胞损伤，增强细胞活力，减少凋亡细胞的数量和ROS的形成。因此，抑制ERK1/2通路可以降低ROS的产生(285-287)。然而，也有大量研究表明ERK1/2具有抗凋亡效应，其激活对高糖引起的心肌细胞损伤起到保护作用(239)。糖尿病条件下的心肌梗塞（MI）和心肌缺血复灌（I/R）模型中，ERK1/2也因为其促存活效应而起到心脏保护作用(288)。这种ERK1/2的不同效果，可能与不同刺激因素引起的ERK1/2活化程度、细胞内分布和持续时间有关(289)。尽管不同ERK信号通路在DCM中的作用尚未取得一致结论，但长时间的DCM导致NF-κB被激活、AMPK受到抑制是多数研究所公认的，体外细胞模型的研究也与之115 华南理工大学博士学位论文一致。高糖或糖基化白蛋白培养的心肌细胞，炎症反应和纤维化增强，细胞内ROS升高，这都与NF-κB信号通路的活化有关(290-292)。同时，高糖培养的心肌细胞AMPK磷酸化被抑制(293,294)，细胞抗氧化和抗凋亡能力大大下降。因此，能够显著抑制NF-κB并激活AMPK的药物，将成为对抗DCM的有效药物。目前普遍认为，特定配体与细胞膜上的受体（如表皮生长因子受体）结合而激活PI3K/Akt信号途径，将磷脂酰肌醇4,5-双磷酸（PIP2）转变成1,4,5-三磷酸肌醇（PIP3）(295)。PI3K和Akt蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，已经成为生物医药研发关注的焦点。在高葡萄糖和高糖基化产物培养的心肌细胞中，PI3K/Akt信号通路活性明显降低(278,296,297)，胰岛素促进的葡萄糖吸收下降，使心肌细胞更多地依赖脂肪酸供应能量。本研究证实已有的结论，表明高葡萄糖培养H9c2细胞48小时后，Akt磷酸化被抑制，意味着与胰岛素信号转导有关的分子被抑制，使心肌细胞糖脂代谢调控失常。此外，高葡萄糖引起细胞内氧化应激水平升高，产生大量的ROS而造成细胞损伤(267,298)。研究表明TRPC3与Nox-2相互作用相互促进，在不同病理条件下刺激细胞生成ROS。在高葡萄糖培养的心肌细胞中，不但Nox-2表达显著增强(299,300)，RPC3表达也显著升高(298)。本研究证实，高糖培养的H9c2细胞Nox-2和TRPC3表达均显著上升，直接促进细胞内ROS水平升高。4.4.2STVNa及TMZ对高糖诱导的心肌细胞信号转导紊乱的作用本研究表明，高葡萄糖培养H9c2细胞48小时后，ERK1/2被磷酸化而激活，NF-κB通路活性也显著增强，AMPK、PI3K/Akt信号通路被抑制，这与动物模型证实一型糖尿病12周后ERK和NF-κB被激活的结果相吻合。同样，STVNa显著抑制ERK和NF-κB，激活PI3K/Akt，但对AMPK无显著影响；而TMZ显著抑制NF-κB而刺激ERK、AMPK和PI3K/Akt信号，同时抑制NF-κB。这些结果进一步印证了动物实验的结论，表明各种信号通路分子在DCM发生发展中的作用与多种因素有关，而STVNa和TMZ通过影响不同的信号分子而起到保护心肌细胞的作用。此外，STVNa可以有效抑制Nox-2表达，而TMZ可以同时抑制Nox-2和TRPC3的表达。根据这些结果，可以推测，STVNa在清除ROS方面效果优于TMZ，而TMZ在抑制ROS生成上更有优势，TMZ可以通过抑制TRPC3，降低钙离子内流引起的ROS生产，使Nox-2表达降低、稳定性下降，从而降低细胞内氧化应激水平。天然产物提取的化合物是代谢调节剂的重要来源，已经有大量研究证实了天然化合116 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用物在调节糖脂代谢、治疗肿瘤方面的潜力(301)。STVNa作为一种天然植物提取物，也同样具有这方面的潜力，然而目前尚无研究报道异甜菊醇或类似物与糖酵解之间的关系。有研究认为，异甜菊醇具有降低血糖的作用(161)，减轻糖尿病动物的葡萄糖耐受不良。此外，大量研究也证实了异甜菊醇的类似物如甜菊醇、甜菊苷等在调节糖脂代谢方面的效果，提高胰岛素敏感性并促进葡萄糖吸收(161,164)。但也有研究认为，甜菊类物质对葡萄糖吸收无显著影响(302)。由此可见，STVNa及同类物质对葡萄糖代谢的调控，在动物体内可能涉及到多种因素，体内信号通路的转导过程也可能受到整体代谢状态的影响，因此采用体外模型分析能够更好确定STVNa对特定分子信号的影响。本实验室已完成的一项基于急性分离豚鼠心肌细胞的研究表明，STVNa促使肌浆膜上ATP敏感的钾通道（sarcKATP）对钾通道开放剂吡那地尔（pinacidil）的敏感性增加，从而有助于提高跨膜电流，产生显著的保护心肌(152)。而且STVNa可以保护H9c2细胞的线粒体功能完整性(155)。在近期另一项采用H9c2细胞分析异甜菊醇对线粒体保护作用的研究中，将三苯基膦（triPP）共价偶联到异甜菊醇上制备成多种化合物，可以促进细胞线粒体膜电位去极化，从而对抗心肌梗塞具有显著的保护作用(223)。在另一项研究中，科研人员分析了甜菊醇（Steviol）对SH-SY5Y细胞（人神经母细胞）和HL-60细胞（急性骨髓性白血病细胞）的葡萄糖转运的影响(303)，表明甜菊醇具有类似胰岛素样的作用，促进GLUT4转运到细胞膜从而增强葡萄糖吸收，该作用是通过激活PI3K/Akt通路而实现的。此外，研究者针对四种不同来源的甜菊醇类商业化产品R97、R60、SG和TRU，分析表明0.5-5mg/mL的浓度对细胞活力无影响（表明无显著毒性），而1mg/mL的浓度可以显著促进葡萄糖吸收，促进GLUT4蛋白转运到细胞膜上（胰岛素样活性）。这四种化合物明显增强IGF-1R、PI3K和Akt的磷酸化，但不影响AMPK的磷酸化(162)。与这些结果相吻合的是，本研究表明STVNa可以提高Akt的磷酸化水平，但对AMPK的活化无显著影响。本研究所采用的阳性对照药物曲美他嗪，对代谢的调节作用被认为是与抑制长链脂酰辅酶A硫解酶相关(168)。有研究表明，TMZ能够激活p38MAPK和Akt信号通路而减轻心脏功能紊乱(304)，而同时激活AMPK和ERK可以保护心肌缺血-复灌引起的损伤(173)，TMZ也可以通过激活AMPK而保护心肌细胞免遭缺氧-复氧引起的损伤(172)。大量体外研究也证实了TMZ对心肌细胞的保护作用。有研究认为，TMZ可以抑制缺氧-复氧（H/R）引起的H9c2细胞凋亡，其机制与促进microRNA-21表达增加、从而激活Akt信号通路有关(305)。在一项步长脑心通胶囊（BNC）与TMZ对比研究中，TMZ可117 华南理工大学博士学位论文以显著抑制过氧化氢引起的H9c2细胞的损伤(306)。一项研究采用棕榈酸诱导心肌细胞线粒体损伤，促进线粒体裂解，线粒体体积减少而每个细胞的线粒体数量增加，TMZ增加线粒体体积、降低线粒体数量，表明TMZ可以有效促进线粒体融合，恢复线粒体功能(307)。缺氧/再供氧会促使H9c2细胞产生大量ROS并发生凋亡，40μM的TMZ可以抑制细胞凋亡，其机制与细胞内SOD增加进而减少了ROS有关。同时，TMZ还抑制缺氧引起的过度自噬，激活Akt和mTOR信号通路(308)。本研究也表明TMZ可以激活ERK、AMPK和Akt信号分子，印证了上述研究结果，说明TMZ通过激活抗凋亡、抗炎症和抗氧化应激信号通路而起到心肌细胞保护作用。4.4.3不同条件诱导的心肌细胞损伤及药物的保护作用通过体外细胞实验，本研究证实了STVNa和TMZ都可以有效保护H9c2心肌细胞免遭多种刺激引起的损伤，主要体现在：（1）直接测定细胞增殖活力，各种刺激因素不同程度的降低H9c2细胞活力，而STVNa和TMZ能够完全或部分恢复细胞活力；（2）通过测定细胞培养上清中的LDH含量，表明高葡萄糖培养对细胞膜造成损伤，细胞培养基内的LDH含量升高，STVNa或TMZ都可以降低高糖对细胞膜造成的损伤；（3）高葡萄糖培养H9c2细胞还形成脂质毒性，表现为细胞内脂质过氧化标志物MDA增多，而STVNa或TMZ处理细胞后可以显著降低细胞内脂质沉积。心肌细胞凋亡或坏死等损伤在各种疾病（如心肌梗塞、晚期心衰、致心律失常性右心室发育不良和阿霉素引起的心脏病变等）引起的心肌结构和功能异常的病理生理学过程中起到关键作用(309)，而不同的刺激因素可能通过不同的机理导致细胞损伤，通过激活不同的信号通路诱发细胞凋亡或坏死(310)。此过程一般都是通过激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase），并进一步活化其他家族成员和若干其他关键蛋白，连接死亡受体、释放细胞色素c或增加内质网应急，最终导致细胞裂解(311)。Bcl-2家族成员是细胞色素c释放及下游caspase激活的主要调控因子，包括促凋亡的Bax、Bid和抗凋亡的Bcl-2、Bcl-xL成员。已有研究表明，过表达Bcl-2可以保护心肌细胞免遭阿霉素或缺氧诱导的细胞死亡(312,313)。本研究证实了高糖、H2O2或抑制能量代谢过程均会使心肌细胞活力下降。有意思的是，本研究发现，200μM的H2O2对细胞活力的抑制效果优于400和800μM，具体原因有待进一步分析。同时，各种病理刺激因素诱导心肌细胞凋亡或坏死、并促使细胞损伤引起心肌病变的确切机制依然有待明确。已有研究表明，异甜菊醇可以缓解心脏缺血-复灌引起的损伤，降低血清中LDH和肌酐激酶（CK）的活性，意味着心肌细胞损伤程度降低(245)。本实验室也从多个方面118 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用证实了STVNa具有显著的心肌细胞保护作用(151,152,155)，而且其作用机制涉及到多个方面，包括抑制细胞内的氧化应激（降低ROS水平）、缓解各种刺激因素引起的钙稳态失衡、调节钾离子和钙离子通道、抑制炎症反应信号通路和细胞凋亡通路等。本章结果表明，STVNa可以缓解高糖引起的细胞活力下降，但是对H2O2引起的细胞损伤无显-著的保护作用。在细胞能量代谢过程中，氧气被Nox催化生成超氧阴离子（O2），而-SOD则负责将O2转变为H2O2，再由GPX（谷胱甘肽过氧化物酶）、CAT、PRX等催化生成水和氧气。基于STVNa大大提高SOD-2的表达，结合动物实验结果，因此推测-STVNa抗氧化的主要过程是促进O2转变为H2O2，抑制ROS生成方面的作用相对较小。尽管动物实验表明STVNa可以促进Prx2和Trx1表达，但可能这一促进作用与机体内其他因素有关，因而在体外STVNa无法减少H2O2引起的心肌细胞损伤，其中的具体细节依然有待探讨。曲美他嗪已经被证实对多种刺激引起的心肌细胞损伤具有保护作用(314)。研究认为，TMZ对心肌细胞凋亡的保护作用与增强Bcl-2和microRNA-21的表达有关(315)，或者与抑制caspase-3/9活性有关(316)，也有研究认为TMZ可以抑制PTEN而阻止细胞凋亡(305)。本研究表明，TMZ既可以降低高糖引起的细胞活力下降，也能显著抑制H2O2引起的细胞损伤，说明TMZ可以有效清除H2O2，其机制有待进一步明确，但可能与直接促进Prx2和Trx1表达有关。对不同的糖酵解抑制剂抑制葡萄糖代谢而引起的细胞活力下降，两种药物表现不同：STVNa和TMZ对2-DG引起的细胞损伤都有保护效果，对Shikonin引起的损伤则无明显的作用，而对3PO引起的损伤，特定浓度的STVNa（如1μM）可以明显降低3PO引起的细胞活力下降，而TMZ则无显著作用。对氧化磷酸化抑制剂Oligomycin（ComplexV抑制剂）引起的细胞损伤，STVNa和TMZ都没有明显的逆转、缓解或恢复作用。糖酵解抑制剂通过抑制葡萄糖生成丙酮酸、阻断后续的氧化而降低细胞能量利用效率，氧化磷酸化抑制剂则通过阻断电子传递链上ATP的生成而降低细胞能量供应，导致细胞活力下降。不同因素诱发的细胞凋亡有不同的机制，而STVNa和TMZ在高糖、H2O2、糖酵解抑制、氧化磷酸化抑制等因素引起的细胞凋亡中具有不不同的效果，说明STVNa或TMZ对一些己糖激酶或磷酸果糖激酶抑制剂引起的细胞损伤的保护作用，很有可能是直接通过激活这两个酶而起作用的。4.4.4STVNa对葡萄糖吸收与代谢作用的分析通过本章体外细胞研究，表明STVNa能够激活Akt信号通路，而Akt具有在胰岛119 华南理工大学博士学位论文素刺激下进一步促进GLUT4转运到细胞膜增加葡萄糖吸收的功能(317,318)。但本研究第三章的动物实验却又证实STVNa不能降低一型糖尿病的血糖，这里表面看来存在互相矛盾的地方，需要更多实验来分析不同模型、不同生理状态、细胞间相互作用等因素对Akt及其GLUT4转运的影响。此外，TMZ会激活AMPK和Akt。目前普遍认为，AMPK也与葡萄糖的吸收紧密相关，在收缩等条件刺激下，被激活的AMPK可以刺激心肌细胞内GLUT4转移到细胞膜上而促进对胞外葡萄糖的吸收(317,318)。因此，TMZ为何也没有降低一型糖尿病大鼠的血糖，依然有待深入研究。但总体而言，在特定疾病状态下激活心脏内AMPK和Akt信号转导，会起到心脏保护作用。例如，有研究认为，AMPK和Akt介导的葡萄糖吸收在心肌缺血预适应（IPC）对复灌损伤的保护过程中起到关键作用(319)。在糖尿病状态下，如前所述，AMPK和Akt信号被抑制，葡萄糖吸收下降，这也是心脏受损的初始原因之一。本研究尚未分析STVNa或TMZ对葡萄糖吸收的影响，因而无法判断在不同浓度葡萄糖和/或胰岛素条件下培养的H9c2细胞，葡萄糖吸收是否会发生明显改变，以及两种药物是否会改变心肌细胞对葡萄糖的吸收。根据动物实验的结果，STVNa和TMZ在一型糖尿病模型中都没有明显的降血糖效果，说明激活AMPK和/或Akt并不一定必然增加对糖的吸收。一方面，这两种药物即便能促进心脏对葡萄糖吸收，或许其作用效果也不足以降低循环系统中的高血糖，因为血糖降低更多的依赖于肌肉和脂肪组织对葡萄糖吸收，因此这两种药物对AMPK和Akt信号通路的作用或许具有组织和器官特异性；另一方面，GLUT4的转运和葡萄糖的吸收，受到多种因素的影响，是各种信号分子相互作用的结果，在整体动物水平，仅仅激活某个信号分子，或许尚不足以促进GLUT4转移到细胞膜上，因而无法增加对葡萄糖的吸收。例如，一项研究表明AMPK的作用与能量底物水平紧密相关(320)。此外，AMPK和Akt的亚型在葡萄糖吸收中起到不同的作用，例如Akt2主要负责促进GLUT4的转运，而且葡萄糖和胰岛素的浓度也是决定糖吸收的关键(321)，在一型糖尿病胰岛素下降、血糖浓度升高的情形下，STVNa和TMZ对AMPK和Akt特定亚型的作用以及对葡萄糖吸收的影响依然有待深入研究。此外，本研究还表明STVNa可以促进葡萄糖的酵解过程（高葡萄糖培养细胞抑制糖酵解）。糖尿病导致心脏更多地依赖脂肪酸代谢产生能量，因而心脏效率下降，不但ATP无法及时生成，还因为脂肪酸中间产物的积累对细胞形成毒性。此时，如果能够提高糖酵解能力，提高葡萄糖的利用率，可以在血红蛋白携带氧气能力降低后继续维持心脏能量供应。同时，尽管糖尿病心脏对葡萄糖的吸收下降了，但因为胰岛素作用缺失，120 第四章异甜菊醇钠对高葡萄糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用细胞内葡萄糖酵解和丙酮酸氧化的速率下降得更加剧烈(99)，导致细胞内葡萄糖转向己糖胺生物合成通路，促进ROS产生和AGE的形成，损害SERCA2a、RyR2和钙离子释放通道(322)，也可能降低SERCA2a的表达，引起心脏功能紊乱。因此，STVNa促进糖酵解过程，提高己糖激酶和磷酸果糖激酶活性，可能有助于减轻细胞内己糖胺生物合成途径，减少ROS和AGE对细胞造成的损伤。4.4.5体外细胞模型作为DCM研究的局限性高糖培养H9c2细胞已经成为体外研究糖尿病引起的心脏疾病的重要手段。然而，采用体外细胞模型来研究糖尿病性心肌病，也存在一定的局限性。首先，DCM是一种复杂的多因素疾病，机体内各种因素相互影响相互作用导致疾病发生发展，任何病理生理学的变化都与循环系统或者局部微环境的状态变化紧密相关。而H9c2细胞作为一种单一的细胞株，虽然可以模拟高血糖条件下心肌细胞的病理变化，但由于缺少与其他细胞的相互作用的微环境，导致体外细胞的研究结果不一定能完全反映体内的实际情况。例如，心脏内心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞等之间的相互作用对DCM的动态发展非常关键，细不同类型细胞之间的通讯无法通过体外模型来研究。其次，体外细胞模型一般作用时间都是若干天，即便延长研究周期，一般最多1-2周，细胞增殖和凋亡的周期决定了无法长时间高糖培养心肌细胞。因此，细胞培养的研究不能完全代表实际糖尿病诱导心肌病时所需要的长达数周乃至数月的真实条件。此外，H9c2细胞是一种可以无限传代的细胞系，与心肌细胞不能分裂繁殖的特性不同，因此不能完全反映心脏组织内心肌细胞的生理病理功能，作为DCM研究工具具有一定的局限性。尽管如此，由于H9c2细胞培养简单，传代方便，所获得的多数研究结果可以反映动物心脏组织水平的实际情况，因此得以广泛采用。未来，随着细胞培养技术、细胞分离与检测技术的进步，或者采用细胞共培养的方式，体外细胞模型将更加完善。4.5.本章总结通过体外模型分析，本研究证实，高浓度的葡萄糖会导致H9c2心肌细胞活力下降，细胞内ROS水平增加，脂质过氧化物沉积增多，而STVNa能够一定程度改善高糖引起的细胞活力下降，抑制高糖引起的细胞内氧化应激，对糖酵解过程也有显著的促进作用，表明STVNa在对抗糖尿病性心肌病方面都具有一定的潜力，有望成为对抗这一疾病的有效手段。而TMZ也显示了良好的心肌细胞保护效果。在机制方面，STVNa抑制ERK、NF-κB、Nox-2，激活Akt分子，而TMZ则抑制NF-κB、Nox-2和TRPC3，激活ERK、121 华南理工大学博士学位论文AMPK和Akt通路。本研究对DCM的病理生理学、未来药物开发等方面都有一定参考价值。首先，DCM作为一种发病机制复杂、缺少有针对性的治疗药物的高发病症，如何针对其发病特点、特别是综合考虑各种因素开发特异性药物，是解决DCM的关键。本研究表明，STVNa和TMZ都可以降低高糖和其它刺激对心肌细胞的损伤，而且这种保护作用是因为药物干预了肥大、纤维化、氧化应激、炎症等多方面的病理刺激因素，符合DCM复杂疾病药物开发的趋势和要求。第二，本研究阐述了高糖培养心肌细胞，可导致心肌细胞多个信号通路发生改变，与现有的多数研究结果一致，进一步印证这些信号通路可能在DCM病理过程中发挥关键作用，为未来针对这些信号通路的特定分子设计药物提供了参考，而STVNa与TMZ之间对信号通路影响的差异，提示这两种药物在对抗DCM方向可能会有不同的药理效果，未来开发应该有不同的侧重点。第三，从代谢角度考虑，开发代谢调控药物，很可能是对抗DCM的有力手段。本研究表明STVNa和TMZ都有调节细胞代谢的作用，但两者有有所不同。如果能将信号转导通路和能量代谢之间的关联系阐述清楚，很可能极大加快药物研发速度和成功率。本研究依然有较多问题需要进一步阐述，例如：（1）STVNa精准的抗氧化机制如何？STVNa是通过减少ROS的生成，还是增加ROS的清除，或者两者兼而有之而起到抗氧化作用？（2）STVNa对Akt或AMPK不同亚型信号分子的激活是否有不同的作用？STVNa对细胞代谢的影响，是否与不同的生理病理条件有关？（3）TMZ促进糖代谢的机制，是因为抑制了脂肪酸代谢（通过Randle循环）而激活糖代谢，还是对糖代谢有直接的提升作用？（4）Nox-2/TRPC3在高糖培养的心肌细胞中作用的具体机制如何？TMZ是否影响Nox-2和TRPC3之间的相互作用？未来，如能进一步深入探讨上述问题，将有助于确切阐明DCM发生发展的关键病理过程和药物的作用机制。122 结论与展望结论与展望结论通过本课题的研究，初步阐明了链脲佐菌素诱导Wistar大鼠的一型糖尿病性心肌病（DCM）的发展动态过程，验证了异甜菊醇钠（STVNa）和曲美他嗪（TMZ）对DCM的治疗效果，并对相关作用机制进行了初步的阐述。本研究主要结论如下：1、采用STZ（55mg/kg剂量单次腹腔注射）诱导雄性Wistar大鼠一型糖尿病，在第4周肥大和纤维化标志物表达显著升高，而宏观上的肥大和纤维化第8周才出现显著性差异，表明分子水平的变化早于宏观结构的改变。同时，心脏舒张功能第8周开始下降，而收缩功能直到12周才显著降低，说明舒张功能异常发生早于收缩功能异常。此外，第16周的肥大、纤维化和心功能与第12周无显著差异。2、STVNa显著抑制一型糖尿病引起的心肌肥大、纤维化、氧化应激和炎症反应，缓解心功能紊乱，具有明显的心脏保护效果。TMZ也具有同类作用，但总体效果STVNa优于TMZ。而且，停止给药4周后，两种药物都维持了一定的治疗作用。3、STVNa和TMZ都不降低一型糖尿病大鼠的高血糖，对胰岛素和AGE浓度也无显著影响，对血脂代谢也无明显作用。但STVNa对糖尿病引起的肾功能和肝功能下降也有一定的保护作用。4、STVNa可以减少高糖对心肌细胞造成的损伤，但对H2O2引起的损伤无显著的保护作用。同时，STVNa还降低高葡萄糖引起的肥大、纤维化、氧化应激和炎症反应相关基因的表达。TMZ也可以降低高糖对心肌细胞的损伤，并缓解异常基因的表达，同时对H2O2引起的损伤也有明显的保护效果。5、STVNa抑制高血糖和高葡萄糖诱导的ERK1/2、NF-κB信号分子和Nox-2蛋白表达，激活Akt信号转导通路，从而抑制炎症反应和氧化应激；TMZ通过激活AMPK来抑制NF-κB，降低炎症，激活ERK1/2和Akt促进细胞存活，抑制Nox-2和TRPC3而抑制氧化应激。6、高糖培养会一定程度上抑制心肌细胞的糖酵解过程，而STVNa显著促进糖酵解，其作用很可能是通过激活己糖激酶和磷酸果糖激酶的活性而实现的。123 华南理工大学博士学位论文图5-1、STVNa保护糖尿病性心肌病的作用机制图STVNa通过抑制ERK、NF-κB和Nox-2而抑制炎症反应和氧化应激，同时激活Akt信号，提高细胞存活能力。创新之处本研究是一项基础研究与应用研究相结合的课题，针对糖尿病性心肌病这一重大的临床适应症，选择天然植物来源的单一成分提取物，进行药效学和药理学的研究。本研究具有一定的创新性，也取得了一定的研究成效，为后续研究奠定了良好基础。1、首次系统性地分析了DCM长期发展的动态变化过程。目前，各种研究采用不同的动物模型、不同的糖尿病诱导方法、不同的时间点来研究DCM，给不同研究之间结果的阐述造成困难。尽管有研究对不同时间DCM的发展做了初步分析(40)，但该研究只设立了2周和6周两个时间点，这与DCM作为一种长期慢性疾病的特点契合度不够，因此不能充分阐述DCM从起始到心衰的全过程。本研究设置4、8、12、16周四个时间节点，初步阐明了肥大、纤维化、舒张和收缩功能紊乱出现的大致时间，证实分子水平的生物标志物的出现早于宏观水平的变化，提示通过测定特定的分子标志物，比传统超声心动图或核磁共振方法能更早的诊断DCM，有助于尽早介入该疾病的治疗。2、首次证实了STVNa对DCM的治疗效果，并且在一型糖尿病模型中，其作用与胰岛素、降血糖或糖基化产物无关，而与抑制ERK/NF-κB信号分子、进一步阻断炎症124 结论与展望和纤维化通路有关，也与激活Akt信号通路而抑制心肌细胞凋亡相关。STVNa作为一种天然植物提取物，经本实验室前期研究证实在抗心脑血管疾病方面有显著效果，也有研究报道异甜菊醇或类似物具有降低血糖和胰岛素抵抗的效果，但本研究首次证实STVNa可以有效对抗糖尿病引起的心脏结构和功能的病变，其保护作用是直接作用于心脏，而与血糖、胰岛素、糖基化终末产物无关，这一点与之前的其他模型取得的研究结论有所不同，表明这类物质的作用较为复杂，与其分子结构、疾病模型、病理状态等各种因素相关。此外，与以往各类甜菊类物质相关研究一般对象提取的混合物有所不同的是(167)，本研究STVNa为单一成分，安全性好，半合成方法路线明确，工艺成熟，因而成药性更强。3、本研究探讨了曲美他嗪对大鼠一型糖尿病引起的心脏病的作用效果，并首次发现TMZ抑制TRPC3并降低Nox-2表达水平，起到抗氧化应激的作用。尽管有较多研究对TMZ用于糖尿病引起的心脏病的治疗进行了分析(142,143,171,323,324)，但这些研究中，有的仅仅是基于TMZ的作用机制提出假设，而临床研究仅分析了TMZ对心脏功能的保护作用，无法判断TMZ是由于纠正了糖尿病的代谢紊乱而起到保护心脏的作用还是直接作用于心脏。本研究采用STZ破坏胰岛细胞、使血液胰岛素水平降低诱发高血糖，这种模型排除了胰岛素敏感性对TMZ作用的影响，表明TMZ是通过直接激活ERK、AMPK、Akt等通路而抑制TRPC3/Nox-2等ROS生成相关蛋白的表达，减轻心肌细胞损伤、维持心脏代谢功能而实现对DCM的治疗。作为一种已经上市的抗心衰药物，如果能通过“老药新用”的方式开发新的如DCM这类适应症，将是一种快速而有效的方法。但是在真正将之用于临床治疗DCM疾病，还必须从多个方面进行深入验证，包括各种动物疾病模型分析和大规模的临床研究。展望本研究初步分析了STVNa对STZ诱导的糖尿病引起的心肌病的治疗作用及潜在机制，并结合阳性对照药物TMZ进行多角度分析，对两种药物的未来产业化开发具有较大的参考价值。但是，本研究以药效学分析为主、同时初步探讨药物作用机理的课题，尽管已经在药理学方面获得了一些初步结论，但无论是DCM的发病机制，还是STVNa和TMZ的作用机理，都有许多需要进一步研究之处。首先，目前普遍认为，DCM发病的机理依然有许多未被阐述清楚的地方，特别是糖尿病通过何种机制抑制葡萄糖代谢而依赖脂肪酸氧化产能，此期间心脏功能下降如何125 华南理工大学博士学位论文逐步发展演变的，各种分子信号通路又是如何在动态发展中做出反应的。正是由于DCM发病机制复杂，因素多样，信号通路有时被抑制，有时又被激活，导致各种研究往往得出互相矛盾的结果，增加了研究的难度。本研究尽管设置了不同的时间点，阐述了发生心肌肥大、纤维化、舒张和收缩功能紊乱的时间，但16周的时间依然不足以充分阐述长期高血糖如何深度影响心脏功能致心衰发生的。其次，虽然一型和二型糖尿病引起的心脏病的病理特征高度相似，目前采用一型糖尿病开展DCM相关研究的数量甚至超过二型糖尿病，但相同的病症并不代表完全一样的病因，胰岛素缺乏和胰岛素抵抗影响着完全不同的信号通路，因而对于DCM的治疗也需要充分考虑两种模型的差异。本研究证实，STVNa不能降低STZ诱导的糖尿病大鼠的血糖浓度，对糖基化终末产物（AGE）及受体（RAGE）也无显著影响。但已有少量研究表明，异甜菊醇或甜菊提取物可以降低二型糖尿病大鼠或小鼠的血糖浓度，提高胰岛素敏感性和糖耐量能力。由此可见，本研究所观察到的STVNa不能降低一型糖尿病大鼠血糖，并不能推广到二型糖尿病模型。甜菊提取物可能是通过提高胰岛素敏感性而起到降糖的作用，当胰岛素不足时其降糖效果也丧失。此外，由于STVNa是不同于其他甜菊提取物的单一成分化合物，因此未来需要采用二型糖尿病模型来验证是否对胰岛素抵抗模型有效。同时，STVNa作用的精确机制，也需要通过更多手段来分析和验证。而对于TMZ，目前缺少其作用效果与血糖、糖基化产物等关联性的研究，因而也无法准确判断TMZ在糖尿病及各种并发症中的具体作用过程，这方面的研究有待进一步深入开展。第三，对于STVNa对ERK、Akt等不同分子信号通路的影响，以及对这些信号分子不同亚型的作用，依然需要进一步用更多的手段来多方面分析，明确其作用的具体靶标。同样，本研究证实TMZ激活ERK、AMPK及Akt，与以往研究基本一致，但是也有研究认为TMZ是抑制ERK信号通路的。而我们也首次发现TMZ可以抑制TRPC3的表达，阐述了其抑制ROS的可能机制。因此，即便是上市多年的“老药”，依然有可能存在新的作用机制。本研究也引出了一些令人感兴趣的问题。例如，AMPK是促进葡萄糖和脂肪酸代谢的，因此TMZ抑制脂肪酸氧化与激活AMPK是相互矛盾的，在实际情况中那种机制起主导作用，有待进一步明确。又如，二甲双胍激活AMPK可以降血糖，但TMZ却没有降糖效果。此外，当抑制脂肪酸氧化的TMZ与糖酵解抑制剂共同处理H9c2细胞时，并没有发生非常明显的活力下降或凋亡，说明还有其他因素发挥作用。这些结果提示未来还可以深入研究TMZ作用的新机制。126 结论与展望第四，本研究探讨性地分析了STVNa和TMZ对高葡萄糖培养H9c2细胞的糖酵解的影响，令人意外的是STVNa显著促进糖酵解，而TMZ却没有明显的效果。进一步分析发现，STVNa对己糖激酶抑制剂和磷酸果糖激酶抑制剂引起的细胞活力下降有恢复作用，TMZ对己糖激酶剂引起的细胞活力下降有恢复活性，说明两种药物可能对糖酵解过程中的关键限速酶活性有明显的促进作用。但是，这一初步的结论尚需要更多的酶学、生物化学和分子生物学手段来进一步证实。综上所述，本研究对糖尿病性心肌病及其治疗药物开发方面取得了一定的成效，有了初步的结论，也为后续的研究提供了方向。未来，本实验室将继续对上述问题进行深入分析，期望在DCM机制及相关药物开发方面有更大突破。127 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华南理工大学博士学位论文CompAltMed.2013;2013:802784.307.KuzmicicJ,ParraV,VerdejoHE,López-CrisostoC,ChiongM,GarcíaL,JensenMD,BernlohrDA,CastroPF,LavanderoS.Trimetazidinepreventspalmitate-inducedmitochondrialfissionanddysfunctioninculturedcardiomyocytes[J].BiochemPharmacol.2014;91(3):323-36.308.WuS,ChangG,GaoL,JiangD,WangL,LiG1,LuoX,QinS,GuoX,ZhangD.Trimetazidineprotectsagainstmyocardialischemia/reperfusioninjurybyinhibitingexcessiveautophagy[J].JMolMed(Berl).2018;96(8):791-806.309.ReeveJL,DuffyAM,O’BrienT,SamaliA.Don'tloseheart–therapeuticvalueofapoptosispreventioninthetreatmentofcardiovasculardisease[J].JCellMolMed.2005;9:609-22.310.FischerU,JanickeRU,Schulze-OsthoffK.Manycutstoruin:acomprehensiveupdateofcaspasesubstrates[J].CellDeathDiffer.2003;10(1):76-100.311.SamaliA,ZhivotovskyB,JonesD,NagataS,OrreniusS.Apoptosis:celldeathdefinedbycaspaseactivation.CellDeathDiffer.1999;6(6):495-6.312.ChenZ,ChuaCC,HoYS,HamdyRC,ChuaBH.OverexpressionofBcl-2attenuatesapoptosisandprotectsagainstmyocardialI/Rinjuryintransgenicmice[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2001;280(5):H2313-H20.313.KunisadaK,ToneE,NegoroS,NakaokaY,OshimaY,OsugiT,FunamotoM,IzumiM,FujioY,HirotaH,Yamauchi-TakiharaK.Bcl-xlreducesdoxorubicininducedmyocardialdamagebutfailstocontrolcardiacgenedownregulation[J].CardiovascRes.2002;53(4):936-43.314.SuQ,LiL,ZhaoJ,SunY,YangH.EffectsofTrimetazidineonPDCD4/NF-κB/TNF-αPathwayinCoronaryMicroembolization[J].CellPhysiolBiochem.2017;42(2):753-60.315.MaN,BaiJ,ZhangW,LuoH,ZhangX,LiuD,QiaoC.Trimetazidineprotectsagainstcardiacischemia/reperfusioninjuryviaeffectsoncardiacmiRNA‑21expression,AktandtheBcl‑2/Baxpathway[J].MolMedRep.2016;14(5):4216-22.316.LiuYC,LiL,SuQ,LiuT,TangZL.TrimetazidinepretreatmentinhibitsmyocardialapoptosisandimprovescardiacfunctioninaSwinemodelofcoronarymicroembolization[J].Cardiology.2015;130(2):130-6.317.HeidrichF,SchotolaH,PopovAF,SohnsC,SchuenemannJ,FriedrichM,CoskunKO,vonLewinskiD,HinzJ,BauerM,MokashiSA,SossallaS,SchmittoJD.AMPK-ActivatedProteinKinaseanditsRoleinEnergyMetabolismoftheHeart[J].CurrCardiolRev.2010;6(4):337-42.318.HuangJP,HuangSS,DengJY,HungLM.Impairmentofinsulin-stimulatedAkt/GLUT4signalingisassociatedwithcardiaccontractiledysfunctionandaggravatesI/RinjuryinSTZ-diabeticrats[J].JBiomedSci.2009;16:77.319.JiL,ZhangX,LiuW,HuangQ,YangW,FuF,MaH,SuH,WangH,WangJ,ZhangH,GaoF.AMPK-regulatedandAkt-dependentenhancementofglucoseuptakeisessentialinischemicpreconditioning-alleviatedreperfusioninjury[J].PLoSOne.2013;8(7):e69910.320.HermannR,MestreCorderoVE,FernándezPazosMLM,ReznikFJ2,VélezDE,SavinoEA,MarinaPrendesMG,VarelaA.DifferentialeffectsofAMP-activatedproteinkinaseinisolatedratatriasubjectedtosimulatedischemia-reperfusiondependingontheenergeticsubstratesavailable[J].PflugersArch.2018;470(2):367-83.321.NelsonBA,RobinsonKA,BuseMG.DefectiveAktactivationisassociatedwithglucose-butnotglucosamine-inducedinsulinresistance[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab.2002;282(3):E497-E506.322.BidaseeKR,ZhangY,ShaoCH,WangM,PatelKP,DincerUD,BeschHRJr.DiabetesincreasesformationofadvancedglycationendproductsonSarco(endo)plasmicreticulumCa2+-ATPase.Diabetes.2004;53(2):463-73.323.WenmengW,QizhuT.Earlyadministrationoftrimetazidinemaypreventoramelioratediabeticcardiomyopathy[J].MedHypotheses.2011;76(2):181-3.324.ZhaoP,ZhangJ,YinXG,MaharajP,NarraindooS,CuiLQ,TangYS.Theeffectoftrimetazidineoncardiacfunctionindiabeticpatientswithidiopathicdilatedcardiomyopathy[J].LifeSci.2012;92(11):633-8.142 攻读博士学位期间取得的研究成果攻读博士学位期间取得的研究成果一、已发表（包括已接受待发表）的论文，以及已投稿、或已成文打算投稿、或拟成文投稿的论文情况（只填写与学位论文内容相关的部分）：相当于学被索作者（全体序发表或投稿刊发表的卷期、位论文的引收作者，按顺题目号物名称、级别年月、页码哪一部分录情序排列）（章、节）况TangSG,LiuXY,YeIsosteviolamelioratesJM,HuTT,diabeticcardiomyopathyin2018Jul;1JEndocrinol.第二、三章SCIYangYY,ratsbyinhibitingERKand238(1):47-60.HanT,TanNF-κBsignalingpathwaysW.TangSG,TrimetazidineProtectsRatsLiuXY,AgainstDiabeticWangSP,JPharmacol2CardiomyopathyThrough待发表第三章SCIWangHH,Sci.InhibitingNox-2/TRPC3JovanovićPromotedOxidativeStressA,TanW.注：在“发表的卷期、年月、页码”栏：1如果论文已发表，请填写发表的卷期、年月、页码；2如果论文已被接受，填写将要发表的卷期、年月；3以上都不是，请据实填写“已投稿”，“拟投稿”。不够请另加页。二、与学位内容相关的其它成果（包括专利、著作、获奖项目等）143 华南理工大学博士学位论文致谢到了如今我这样的年纪，再攻读一个博士学位，说来确实不易。很多事情需要坚持才能做完，我也终于坚持走到了这一步。中途当然有过挫折，甚至想放弃，之所以能够把学位论文研究做下来，导师谭文教授的鼓励起到了莫大的作用。当然，在这个过程中，我认识了很多人，实验室那些老师和同学，他们身上所具有的优秀品质的确鼓励了我前进的脚步，也是我在这些年最大的收货之一。再说，科研也是一项有意思的工作，它会强化你分析问题和解决问题的能力，而我能坚持在实验室做这么几年，真正静下心来做一些基础和应用相结合的研究，无非还是对这些工作有一定的热爱之情，也能从中学到更多东西，否则是难以持续的。我们把不忘初心这样的话失常挂在嘴边，也会不断提醒自己保持对这个世界最纯真的认识。可是，当时光飞速而过时，我们却经常忘记了最初的想法，失去了来时的路。因此，不忘初心实际上是很难的。当初考取华工的博士，我意识到似乎是在走一段十多年前未走完的路，做以前没有做完的一项工作。我当然知道需要付出很多努力，可能面对一个不是特别熟悉的领域，甚至不知道结果如何，但我想开始一项需要坚持多年的任务，未尝不是对自己最好的锻炼，而即便是以往从未了解过的很专业的学术知识，以及从来没有做过的实验，掌握之后都会有或多或少的成就感。我也曾不断地想，博士学位到底意味着什么，也许有很多人认为意味着很多甚至质变，然而我知道我依然是原来的我，从不曾改变。一如既往，我希望未来如果有人认可我的所做过的工作，或者提供一些良好的机会，主要不是因为我拿到了博士学位，而是因为我的品质，以及长期以来对工作和生活的态度。实际上，这是起点，而不是终点。我希望未来能继续保持对科学和技术的热爱，保持一颗不断学习、能及时吸取新知识的心，还有独立思考的能力和充足的想象力。说了这么多，我似乎忘记了要感谢的人。实际上，要感谢的人很多，一一把姓名罗列出来似乎没有必要。这其中，除了导师谭文这么多年的言传身教，实验室还有给予多方面指导意见的老师，一起在学校做实验的同学，一起交流探讨问题的同行者，有毕业了的，有还在学校继续学习的，能够在这期间结识这么多人，也是我的荣幸。这几年，我知道有很多人在关注我，有认识十多二十年的老友，也有刚认识不久的新朋，在此，我感谢各位，如果此时你看到我的致谢，就知道我说的是你。在读博士之前，我已经工作了近十年，能够重新进入学校学习，离不开广州纳泰生物医药技术有限公司陆阳博士144 致谢和其他几位领导的鼓励和支持。此外，我读硕士期间的导师和师兄弟、师姐妹们，大学期间的多位同学，都给了我巨大的力量。最后一段话，来自青年作家卢思浩，与各位共勉：是的，你我都知道这个世界充满了不公平，贫穷，现实，无助，但我要你明白，这个世界永远不止这样，我要你看到光明，梦想，努力和希望。没有人能回到过去重新活着，但你我都可以从现在起，决定我们未来的模样。就像慢吞吞的绿皮火车，也许他很慢，但时间总会到达你的那一站。唐盛高2018年12月145 －ＩＶ２答辩委员会对论文的评定意见糖尿病心肌病作为糖尿病人死亡的主要原因之一，因此亟需开发新型的治疗药物以满足临床需求一。异甜菊醇钠是种天然植物提取物，具有抗氧化、抗炎症、抗纤维化等多种功效，探索其在治疗糖尿病心肌病应用方面有较大的意义。该学位论文选题针对糖尿病引起的心肌病变，选择异甜菊醇的钠盐来进行治？疗，并探讨潜在的作用机制。通过体内和体外研宄，证实了异甜菊醇钠可以显著抑制Ｉ型糖尿病心肌病－，发现其作用与抑制ＥＲＫ／ＮＦｋＢ信号和激ｋ活Ａｔ信号通路而抑制心肌细胞凋亡相关。冋时，ＳＴＶＮａ在糖代谢方面也具有调控作用？该论文选题新颖，目的明确。论文逻辑淸晰，设计合理，研宄方法合理，论述准确，结论可信，文献综述较为全面，论文撰写符合规范，该生熟练掌握了相关越础理论及专业技术，具备独立从小科研工作的能力，在答辩中表现良好，逻辑清晰、语言流畅。经过答辩委员会认真讨论一，无记名投票，致同意通过该论文答辩，建议授予理学博士学位。论文答辩日期０／２■０：２汉年月／日答辩委员会委员共Ｔ人，到会委员穸人Ｊ表决票数：优秀（厶）票（〇）票；良好＞）票格（〇）票（３；及；不及格“表决结果（打优秀（）；良好及格（）：不及格（）决议：同意授予博士学位（＼／３不同意授予博士学位（）—Ｌ－１－＿＿—■■：＿＿＾－第丨１页共１３页
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