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单位密级：１０３６９？学号：２０１５２０１２１７０１１妾淺１中￡妨大ｆ２０１８届硕士研究生学位论文益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织ＡＱＰ３、ＡＱＰ５及ＭＵＣ５ａｃ的影响ＥＦＦＥＣＴＯＦＹＩＦＥＩＪＩＡＮＰＩＲＥＣＩＰＥＯＮＡＱＰ３、ＡＱＰ５ＡＮＤＭＵＣ５ＡＣＩＮＢＲＯＮＣＨＯＰＵＬＭＯＮＡＲＹＴＩＳＳＵＥＯＦＣＨＲＯＮＩＣＯＢＳＴＲＵＣＴＩＶＥＰＵＬＭＯＮＡＲＹＤＩＳＥＡＳＥＭＯＤＥＬＲＡＴＳ学科专业：中西医结合临床研究方向：中西医结合防治呼吸系统疾病导师：王胜教授主任医师硕士生：夏平凡论文完成单位：安徽中医药大学·２０１８年６月合月肥 密级：10369学号：20152012170112018届硕士研究生学位论文益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5ac的影响EFFECTOFYIFEIJIANPIRECIPEONAQP3、AQP5ANDMUC5ACINBRONCHOPULMONARYTISSUEOFCHRONICOBSTRUCTIVEPULMONARYDISEASEMODELRATS作者姓名：夏平凡申请学位级别：硕士学位指导教师姓名：王胜职称：教授主任医师学科专业：中西医结合临床研究方向：中西医结合防治呼吸系统疾病学习时间：2015/9/1起至：2018/6/30论文提交日期：2018/3/22论文答辩日期：2018/5学位授予单位：安徽中医药大学学位类型：医学硕士学位 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人，或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体均己在文中以明确方式标明。。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担丨丨学位论文作者（需亲笔）签名：Ｉ斗晷月＾曰导师（需亲笔）签名：年月日学位论文版权使用授权书本人完全了解安徽中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保，允许论文被查阅和借阅留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版＝本人授权安徽中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在＿年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密￥＿“”（请在以上方框内打Ｖ）学位论文作者（需亲笔）签名：％日丨＾年艾月；／导师（需亲笔）签名：＾年月日 目录中文摘要…………………………………………………………………1Abstract……………………………………………………………………3英文缩略词表……………………………………………………………7前言………………………………………………………………………81实验材料……………………………………………………………102试验方法……………………………………………………………122.1动物的饲养及分组………………………………………………122.2动物模型的构建…………………………………………………122.3给药方法…………………………………………………………122.4取材方法…………………………………………………………123指标检测和方法………………………………………………………133.1苏木精-伊红（HE）及阿尔辛蓝-过碘酸雪夫（AB-PAS）染色………………………………………………………………………133.2免疫组化…………………………………………………………133.3Real-timePCR……………………………………………………143.4Westernblot检测…………………………………………………164.统计学方法……………………………………………………………175实验结果………………………………………………………………175.1HE染色、AB-PAS染色结果……………………………………175.2免疫组化示:AQP3、AQP5及MUC5ac在支气管及肺组织中表达强度的变化………………………………………………………………20 5.3各大鼠支气管及肺组织中AQP3、AQP5及MUC5acmRNA表达变化……………………………………………………………………245.4各大鼠支气管及肺组织中AQP3、AQP5及MUC5ac蛋白表达变化……………………………………………………………………28讨论部分1.研究指标的意义………………………………………………………302.从肺脾两脏治痰的理论基础…………………………………………333.益肺健脾方组方特点及药物研究……………………………………354.气道黏液高分泌与慢阻肺……………………………………………39结论………………………………………………………………………39参考文献…………………………………………………………………41综述………………………………………………………………………48个人简介………………………………………………………………52致谢………………………………………………………………………53II 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响中文摘要1实验研究2目的:益肺健脾方对慢阻肺模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响1.2方法:将清洁的SD大鼠按随机分配原则分为7组（包括:空白对照组、模型组、益肺健脾方高剂量组、益肺健脾方中剂量组、益肺健脾方低剂量组、氨溴索组和地塞米松组），每组大鼠16只。大鼠均为6～8周并质量在200±20g，将大鼠在7天内正常饲养后在进行试验。其中第1天及第14天予以10％水合氯醛（0.5ml/100g）进行腹腔麻醉,麻醉成功后予以脂多糖(LPS)200μg／200μ1气管滴注，大鼠予以匀速旋转，使脂多糖均匀分布于肺部。在第2～30天，（空白组除外）大鼠每天予以两次烟熏处理，烟熏使用密封1m3烟室，上下午分别烟熏30分钟，每次15支（香烟使用红塔集团生产红梅烟，焦油量19mg,尼古丁1.2mg）。在造模20天开始，以低温番泻叶浸液给予大鼠灌胃处理（浓度1g/ml，按按1ml/100g体重给药），每日灌胃一次，持续30天。自此，总共造模49天。造模成功后予以大鼠灌胃治疗（空白组除外），治疗组分为益肺健脾方高剂量组、益肺健脾方中剂量组、益肺健脾方低剂量组、氨溴索组和地塞米松组。治疗6周后，予以取材。HE染色观察各组大鼠肺组织、支气管病理变化；AB-PAS染色观察各组大鼠支气管杯状细胞增生情况及黏蛋白分泌情况；RT-PCR方法检测大鼠支气管肺组织MUC5acmRNA、AQP3mRNA及AQP5mRNA的表达水平。Western-blot及IHC方法检测大鼠MUC5ac、AQP3及AQP5蛋白的表达水平。1.3结果1.3.1益肺健脾方对大鼠支气管及肺组织病理形态的影响HE染色显示，在模型组与空白组相比较当中，可见模型组大鼠支气管出现纤毛脱落、平滑肌增厚、炎性浸润及管腔狭窄等慢阻肺病理改变；与模型组相比，益肺健脾方高、中、低剂量组，均可缓解大鼠支气管病理学改变，并且随浓度的增加缓解越明显。地塞米松组与氨溴索组治疗效果较益肺健脾方高剂量组相当。AB-PS染色显示，可见模型组大鼠支气管内杯状细胞增生明显，并可见染色加深，而空白组杯状细胞未见明显增生；益肺健脾方高剂量组、益肺健脾方中剂量组、益肺1 中文摘要健脾方低剂量组、氨溴索组和地塞米松组可见杯状细胞增生较模型组减少，染色变浅。1.32益肺健脾方对大鼠肺组织及支气管中MUC5acmRNA、AQP3mRNA及APQ5mRNA含量的影响与空白组比较，模型组肺组织中MUC5acmRNA含量明显高于空白对照组，AQP3mRNA及APQ5mRNA含量较空白对照组明显降低（P<0.01）。益肺健脾方各剂量组大鼠肺组织及支气管中MUC5acmRNA含量较模型组均有不同程度的降低，其中益肺健脾方高剂量组、地塞米松组及氨溴索组MUC5acmRNA含量降低较明显（P<0.01）。相反的，与空白组比较，模型组肺组织中AQP3mRNA及APQ5mRNA含量明显低于空白对照组，益肺健脾方高、中、低剂量组与模型组比较，均可提高AQP3mRNA及APQ5mRNA含量（P<0.05）。1.33益肺健脾方对大鼠肺组织中MUC5ac、AQP3及APQ5蛋白表达水平的影响与空白组比较，模型组肺组织中MUC5ac蛋白表达明显高于空白对照组，AQP3及APQ5蛋白表达明显低于空白对照组（P<0.01）。益肺健脾方高、中、低剂量组大鼠肺组织中MUC5ac蛋白表达量较模型组均有不同程度的降低，其中益肺健脾方高剂量组、地塞米松组及氨溴索组MUC5ac蛋白表达量降低较明显（P<0.01）。相反的，与空白组比较，模型组肺组织中AQP3及APQ5蛋白表达量明显低于空白对照组，益肺健脾方高、中、低剂量组与模型组比较，均可提高AQP3及APQ5蛋白表达量（P<0.05），地塞米松组与氨溴索组肺组织AQP3及APQ5蛋白表达量较益肺健脾方组相当（P<0.05）。1.34药物安全性与正常组比较，中药各剂量组及西药组均未见大鼠肝肾功能损害。1.4结论益肺健脾方可以通过降低大鼠肺组织中MUC5ac蛋白表达量，并提高AQP3及APQ5蛋白表达量以缓解大鼠气道黏液的粘稠度，使大鼠更易排痰，并且改善大鼠气道纤毛脱落情况，减轻大鼠支气管平滑肌增厚、及炎细胞浸润，延缓大鼠气道重塑及肺功能下降。关键词:慢性阻塞性肺疾病；实验研究；益肺健脾方；肺脾两虚证；AQP3;AQP5;MUC5ac。2 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响Abstract1Experimentalstudy1.1ObjectiveToinvestigatetheeffectsofYifeiJianpiGranulesonthepathologicalchanges,themRNAandproteinexpressionchangesofAQP3andAQP5inlungtissueandexplorethemechanismofYifeiJianpiGranulesontreatingchronicobstructivepulmonary.1.2MethodsCleanSDratsweredividedinto7groupsaccordingtotheprincipleofrandomdistribution.(including:blankcontrolgroup,modelgroup,highdosegroupofYifeiJianpirecipe,middledosegroupofYifeiJianpirecipe,lowdosegroupofYifeiJianpiprescription,ambroxolgroupanddexamethasonegroup)，Therewere16ratsineachgroup.Theratswere6weeksand8weeksandtheweightwas200±20g.Theratswerefednormallywithin7daysandweretested.Onthefirstdayandthe14day,10%chloralhydrate(0.5ml/100g)wasusedforabdominalanaesthesia.Aftersuccessfulanesthesia,lipopolysaccharide(LPS)wasinjectedwith200gg200200,andtheratswereuniformlyrotated,sothatlipopolysaccharidewasevenlydistributedinthelungs.Theratswerefumigatedtwiceadayonthe2ndday(excepttheblankgroup).Thesmokewasfumigatedinasealed1m3smokingroomfor30minutesinthemorningandafternoon.ThecigarettewasproducedbyHongtaGroup.Thetarcontentwas19mgandthenicotinewas1.2mg/g.Theratsweretreatedwithlow-temperatureSennaextractfor20days(1g/ml,1ml/100gbodyweight,onceadayfor30days).Sincethen,themodelhasbeenbuiltforatotalof49days.Afterthemodelwasestablished,ratsweretreatedbygastricperfusion(excepttheblankgroup,thetreatmentgroupwasdividedintothreegroups:highdosegroup,middledosegroup,lowdosegroup,ambroxolgroupanddexamethasonegroup.After6weeksoftreatment,materialsweretaken.LungtissueandbronchuspathologicalchangeswereobservedbyHEstaining.AB-PASstaining3 英文摘要wasusedtoobservetheproliferationofgobletcellsandmucinsecretioninthebronchiofratsineachgroup.TheexpressionofMUC5acmRNA-AQP3mRNAandAPQ5mRNAinratlungtissuewasdetectedbyRT-PCR.TheexpressionofAQP3andAPQ5proteinweredetectedbyWestern-blotandIHC.1.3Results1.3.1EffectofYifeiJianpionpathologicalmorphologyofratsHestainingshowedthat,Incomparisonbetweenthemodelgroupandtheblankgroup,Itcanbeseenthatthemodelgroupshowedciliasheddinginthebronchus.Smoothmusclethickening,inflammatoryinfiltration,lumenstenosisandotherslowobstructivepulmonarypathologicalchanges;Comparedwiththemodelgroup,YifeiJianpiprescriptionhigh,mediumandlowdosagegroup,Canalleviatethepathologicalchangesofthebronchiinrats,Andwiththeincreaseofconcentration,thereliefismoreobvious.TheeffectofdexamethasonegroupandambroxolgroupwasbetterthanthatofYifeiJianpiprescriptiongroup.AB-PSstainingshowsthat，Inthemodelgroup,theproliferationofgobletcellsinthebronchuswasobvious，Andyoucanseethatthestainisgettingdeeper,Intheblankgroup,thegobletcellsdidnotproliferateobviously.Theproliferationofgobletcellswasdecreasedinhighdosegroup,middledosegroup,lowdosegroup,ambroxolgroupanddexamethasonegroup，Thestainshrunk.1.3.2EffectofYifeiJianpiRecipeonthecontentofMUC5acmRNA,AQP3mRNAandAPQ5mRNAinthelungtissueandbronchusofratsComparedwiththeblankgroup,ThecontentofMUC5acmRNAinthemodelgroupwassignificantlyhigherthanthatintheblankcontrolgroup,ThecontentsofAQP3mRNAandAPQ5mRNAweresignificantlylowerthanthoseofthecontrolgroup(P<0.01).Comparedwiththemodelgroup,thecontentofMUC5acmRNAinlungtissueandbronchusofeachdosegroupofYifeiJianpirecipedecreasedtosomeextent,ThecontentofMUC5acmRNAinhighdosegroup,dexamethasonegroupandambroxolgroupwassignificantly4 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响decreased(P<0.01).Onthecontrary,Comparedwiththeblankgroup,ThecontentsofAQP3mRNAandAPQ5mRNAinthemodelgroupweresignificantlylowerthanthoseintheblankcontrolgroup.Comparedwiththemodelgroup,YifeiJianpirecipecouldincreasethecontentofAQP3mRNAandAPQ5mRNA(P<0.05).1.3.3EffectofYifeiJianpirecipeontheexpressionofMUC5acAQAQP3andAPQ5proteininLungtissueofRatsComparedwiththeblankgroup,theexpressionofMUC5acproteininthemodelgroupwassignificantlyhigherthanthatintheblankcontrolgroup.TheexpressionofAQP3andAPQ5proteinwassignificantlylowerthanthatofcontrolgroup(P<0.05).TheexpressionofMUC5acproteininlungtissueofratswithhigh,mediumandlowdoseofYifeiJianpirecipewaslowerthanthatofmodelgroup.TheexpressionofMUC5acproteininhighdosegroup,dexamethasonegroupandambroxolgroupwassignificantlydecreased(P<0.01).Onthecontrary,comparedwiththeblankgroup,theexpressionofAQP3andAPQ5proteininthelungtissueofthemodelgroupwassignificantlylowerthanthatintheblankcontrolgroup.Comparisonofhigh,middleandlowdoseofYifeiJianpiprescriptionwithmodelgroup,TheexpressionofAQP3andAPQ5proteinwasincreased(P<0.05).1.3.4DrugsafetyComparedwiththenormalgroup,nodamageofliverandkidneyfunctionwasfoundineachdosegroupandwesternmedicinegroup.1.4ConclusionYifeiJianpirecipecanreducetheexpressionofMUC5acproteinandincreasetheexpressionofAQP3andAPQ5proteininlungtissueofrats,soastoalleviatetheviscosityofratairwaymucus,makeiteasierforratstoexpelphlegm,andimprovethesheddingofratairwaycilia.Thebronchialsmoothmusclethickeningandinflammatory5 英文摘要cellinfiltrationwerealleviated,andtheairwayremodelingandpulmonaryfunctiondeclineweredelayed.Keyword:chronicobstructivepulmonarydisease;experimentalstudy;YifeiJianpiPrescription;lungandspleentwodeficiencysyndrome;AQP3;AQP5;MUC5ac.6 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响英文缩略词表AB-PASAlcianblue-periodicacidsthiff阿利新蓝-过碘酸雪夫氏染色AQPAquaporin水通道蛋白ILInterlukin白细胞介素FEV1Forcedexpiratoryvolumein1second一秒用力呼气容积FVCForcedvitalcapacity用力肺活量HEHematoxylin-eosin苏木精-伊红LPSLipopolysaccharide脂多糖mRNAMessengerRNA信使RNAMUCMucin黏蛋白PEFPeakexpiratoryflow最大呼气流速峰值TNFTumornecrosisfactor肿瘤坏死因子CDCDmolecules白细胞表面抗原IgAimmunoglobulinA免疫球蛋白AMEPmaximalexpiratorypressure最大呼气压MIPMaximalExpiratoryPressure最大吸气压EGFRepidermalgrowthfactorreceptor表皮生长因子受体P13Kphosphatidylinositol-3kinase磷脂酰肌醇3-激酶ASMCAirwaysmoothmusclecell气道平滑肌细胞RNARibonucleicAcid核糖核酸APAmmoniumperoxodisulfate过硫酸铵7 前言前言慢性阻塞性肺疾病(Chronicobstructivepulmonarydisease，COPD，慢阻肺)是一种以持续气流受限为主要临床特征、异常的气道炎症为主要病理特征的慢性疾病。慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD)指出，COPD在世界疾病死亡原因上逐步上升，现已至第四位，并且其发病率仍在上升[1]。加之人口基数大，人口老龄化等问题，COPD在年龄大于40岁的人群中的总体发生率为8.2%[2]，所以慢阻肺在我国的防治尤为重要。COPD的发病机制尚不完全清楚，目前认为与吸烟及空气污染有着很大关系，并且气道炎症、气道重塑等在其中有着重要作用。而稳定期的治疗也一直以支气管舒张为基石，治疗方法缺乏突破，患者稳定期气道炎症及气道黏液的高分泌状态一直存在，遂新的治疗方法的研发变得更加迫切[3]。祖国传统中医药在治疗慢阻肺时从患者整体出发，根据虚实辨证、脏腑辨证思想，祛邪同时兼有补益，达到肺脾同治，可以有效提高患者生活质量，达到远期治疗效果[4]。益肺健脾方在治疗慢阻肺患者的疗效过程中，本课题组已做初步探讨，由此，根据“肺通调水道、脾主运化水湿”等理论，以COPD痰饮生成异常为研究切入点，采用与痰饮密切相关的黏蛋白5ac（MUC5ac）和水通道蛋白3（AQP3）及水通道蛋白5（AQP5）为观察指标，从水液代谢角度探寻益肺健脾方对COPD的影响，这对于丰富慢阻肺的病机理论，深化益肺健脾方的疗效机制并从治疗学角度反证中医经典理论的科学内涵具有重要意义。COPD与中医学“咳嗽、喘证、肺胀”等疾病相对应[5]。中医学认为喘病的发生主要与外邪侵犯有关，病位在肺，导致肺失宣降而发为咳嗽，久咳导致则肺气虚弱，子盗母气，脾脏受累，导致脾运化功能失常，水谷精微不化则易生成痰饮，甚至痰饮与血瘀等病理因素同时存在，使患者病情更加难以治愈[6]。动物实验证实，益肺健脾方能抑制大鼠气道炎症的发展，延缓大鼠气道重塑，提高大鼠呼吸肌肌力及营养情况。在大量的临床试验中，益肺健脾方治疗稳定期COPD患者，也具有化痰、止咳，并减少患者急性发作及就诊次数，改善患者消化功能及营养状况方面有着明确的疗效[7-9]。而在药理学研究方面，益肺健脾方可以增强免疫力及消化功能，抗氧化、纤维化及炎症反应，增强呼吸力及胃肠蠕动方面均有疗效[10]。8 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响目前认为[11-12]，慢阻肺患者气道中均存在着气道杯状细胞的增生及痰液生成的异常。脾肺两脏与水液代谢及痰饮的生成有着密切关系，《医学从众录》有言：“痰之本，水也，源于肾；痰之动，湿也，主于脾；痰之行，气也，贮于肺。”说明肺气的宣发与肃降可以运化水液，水液运化失常则生为痰[13]。另外“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”，脾脏将水谷精微运化后上乘于肺，借助肺气的宣发肃降将水谷精微传送周身，如“若雾露之溉，内濡脏腑”。脾气失运则痰饮内生。所以在治痰之时应注重肺脾两脏，如《丹溪治法心要》:“实脾土，燥脾湿是治痰之本”[14]。由上分析，基于肺脾两脏在慢阻肺痰液生成中的重要作用，肺脾气虚和慢阻肺的气道黏液高分泌、水液代谢异常有一定的相关性，益肺健脾方可能通过水通道蛋白AQPs及黏蛋白MUC来改善慢阻肺的水液代谢异常状态[15]。既往在益肺健脾方治疗慢阻肺患者时，该方由玉屏风散及六君子汤加减而得。研究发现该方能降低慢阻肺患者痰液中性粒细胞数和IL-8、TNF-α水平[16-17]，改善呼吸功能及营养状态[18]，提示益肺健脾方在治疗慢阻肺患者时，可以通过改善患者痰液粘稠度，减轻患者气道炎症及气道的重塑。另有研究表明[19]，水通道蛋白AQPs与气道炎症、气道重塑等一系列病理改变有着密切关系，水通道蛋白表达的升高可以缓解气道的炎症反应及病理改变，而黏蛋白MUC5ac却与气道病理改变呈正相关。由此提出假设，益肺健脾方可以通过调节慢阻肺患者AQP3、AQP5及MUC5ac表达从而影响患者水液代谢及黏液的高分泌状态，水液代谢异常的改善又将影响患者气道炎症、气管重塑等一系列病理改变。所以本实验以水通道蛋白AQP3、AQP5及MUC5AC为观察指标，以“肺主通调水道，脾主运化水湿”为理论，探讨益肺健脾方对慢阻肺模型大鼠AQP3、AQP5及MUC5ac表达及病理改变的影响。9 实验部分实验部分益肺健脾方对大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响。1实验材料1.1实验动物清洁级的雄性SD大鼠112只（由安徽医科大学提供），体质量范围在（200±20）g1.2实验药物益肺健脾方（方中含黄芪、党参、白术、茯苓、半夏、陈皮、地龙、防风、款冬花、甘草；制成复方颗粒剂，分别为30g，15g，15g，15g，15g,10g，8g，10g，10g，10g）由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供草药，并由四川新绿色药业科技发展股份有限公司制成复方颗粒剂。加0.9%生理盐水配制成益肺健脾方高剂量组、益肺健脾方中剂量组、益肺健脾方低剂量组，含药量分别为3.2g/1ml、1.6g/1ml、0.8/1ml，剂量相当于临床用量的14倍、7倍、3.5倍；地塞米松：安徽鑫苑制药公司生产；氨溴索：美国雅培制药公司生产；番泻叶：中国齐鲁制药有限公司生产。1.3主要实验试剂水通道蛋白3（AQP3）、水通道蛋白5（AQP5）检测试剂盒由美国Bioword公司提供，货号BS3671、BS3477；Muc5AC由英国Abcam公司提供货号Ab24071。逆转录试剂盒（RevertAidTMfirstStrandcDNASynthesisKit）由美国Thermo公司公司提供，批号：00221108；苏木素染色试剂由安徽亿帆制药公司提供，批号:717105；伊红染色试剂由美国Thermo有限公司提供，批号:723132。1.4主要试验仪器切片机：LeicaRM2451德国显微镜：飞利浦70T荷兰纯水仪：飞利浦JEM20荷兰10 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响移液器：西门子RM3120德国微波炉：GEPLO20美国切片漂烘仪：K-560奥地利恒温箱：精宏公司DJK-9250B-2上海干燥箱：福马公司GHW-9250B上海冰箱：小天鹅JOD-350F中国电子天平：ANDBM-252日本搅拌器：恒联B80中国自动脱水机：爱华FTJ-301中国石蜡包埋机：益迪YD-6D浙江金华自动制冰机SCOTSMANTCS-180型意大利电泳仪伯乐1645056美国BIO-RAD转膜仪VE-186型Tanon普通PCR仪伯乐T100美国BIO-RAD低速小型离心机湘仪TGL-20M湖南高速冷冻离心机西格玛3K15浙江精度电子天平浙江天湖仪器公司微量移液器SOCOREXAM826瑞士紫外凝胶成像系统杭州奥盛仪器有限公司荧光定量PCR仪伯乐C1000美国BIO-RAD微孔板迷你离心机杭州奥盛仪器有限公司型号：MINI-P25PIKOPlateIlluminatorThermo琼脂糖凝胶批号：111860西班牙DL2000DNAMarker批号：B7301ATaKaRaTrizol批号：90802Invitrogen公司氯仿批号：20150120上海苏懿化学试剂有限公司11 实验部分2试验方法2.1动物的饲养及分组将清洁的SD大鼠按随机分配原则分为7组（包括:空白对照组、模型组、益肺健脾方高剂量组、益肺健脾方中剂量组、益肺健脾方低剂量组、氨溴索组和地塞米松组），每组大鼠16只。大鼠均为6～8周并质量在200±20g，将大鼠在7天内正常饲养后在进行试验。实验室温度及湿度保持在一定范围，温度在26℃左右，相对湿度为50%-75%；饮用水为自来水，饲料和垫料由江苏省协同医药生物工程有限公司提供。每日予以饲料喂养，试验期间予以间断瓜子坚果类等喂食，满足大鼠习性，饮用水每日上午一换，平时垫料两日一换，灌番泻叶期间由于大鼠便次增多，垫料则一日一换。2.2动物模型的构建第1天及第14天予以10％水合氯醛（0.5ml/100g）进行腹腔麻醉,麻醉成功后予以脂多糖(LPS)200μg／200μ1气管滴注，大鼠予以匀速旋转，使脂多糖均匀分布于肺部。在第2～30天，（空白组除外）大鼠每天予以两次烟熏处理，烟熏使用密封1m3烟室，上下午分别烟熏30分钟，每次15支（香烟使用红塔集团生产红梅烟，焦油量19mg,尼古丁1.2mg）。在造模20天开始，以低温番泻叶浸液给予大鼠灌胃处理（浓度1g/ml，按按1ml/100g体重给药），每日灌胃一次，持续30天。自此，总共造模49天。2.3给药方法空白对照组：正常饲养。治疗阶段以生理盐水1ml/100g/d灌胃6周。模型对照组：模型建立后予生理盐水1ml/100g/d灌胃6周。益肺健脾方低剂量组：模型建立后予益肺健脾方0.8g/1ml/100g/d灌胃6周。益肺健脾方中剂量组：模型建立后予益肺健脾方1.6g/1ml/100g/d灌胃6周。益肺健脾方高剂量组：模型建立后予益肺健脾方3.2g/1ml/100g/d灌胃6周。地塞米松组：模型建立后予地塞米松混悬液0.0525mg/1ml/100g/d灌胃6周。氨溴索组：模型建立后予氨溴索混悬液1.4mg/1ml/100g/d灌胃6周。2.4取材方法所需器材：分离胶促凝管、EP管（1.5ml）、试管架、1ml注射器、血针、手术12 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响剪、镊子、止血钳、棉签、一次性移液器、电子秤、烧杯等。给药结束后，除去死亡大鼠，每组最终取8只大鼠进行取材。沿胸骨将大鼠胸腔打开，主意用干棉球随时擦干肺部血迹，将右肺3叶及全部取出，置于10%福尔马林中固定，注意试管内不留空气。3指标检测和方法3.1苏木精-伊红（HE）及阿尔辛蓝-过碘酸雪夫（AB-PAS）染色3.1.1制备石蜡切片:依次放入不同浓度酒精及二甲苯中制作蜡片备用。3.1.2苏木精-伊红染色：取切片，脱蜡至水，分别放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，后依次放入100%酒精、90%酒精、80%酒精各5分钟。最后苏木精染色15min，将细胞核染成蓝色。自来水洗去浮色。观察右下肺支气管及肺组织形态与病理学改变。3.1.3阿尔辛蓝-过碘酸雪夫染色先脱蜡至水，蒸馏水冲洗2分钟，后依次加入过碘酸、Schiff氏液进行染色，再加入2次重亚硫酸钠水溶液，水洗10分钟，最后苏木精染色3分钟，水洗后蓝化；封片时依次使用梯度酒精脱水，二甲苯透明处理；观察右肺支气管杯状细胞增生情况及黏蛋白分泌情况。3.2免疫组化（1）过3道二甲苯及每道15min，3道100-95-80乙醇每道5min；（2）将切片连同染色架一起放入烧杯中，自来水流水缓慢冲洗，洗去酒精，直到切片干净透明；（3）抗原高压修复；（4）将孵育盒中稍微装一点水，将切片一张一张拿出来，用免疫组化笔画一个圈圈住组织，放在孵育盒上；（5）PBS冲洗3遍（注意不要正对着组织冲，以免将组织冲掉）；（6）将切片甩干，加一抗；（7）PBS冲3遍后将片子甩干，加二抗；（8）PBS冲3遍，甩干后加染色剂；13 实验部分（9）衬然、分化、蓝化；（10）过3道无水乙醇，每道3min，苯酚-二甲苯3min，3道二甲苯，每道3min；（11）中性树胶封片；（12）显微镜下观察支气管杯状细胞增生情况及黏液分泌情况并拍照。3.3Real-timePCR3.3.1RNA的提取（1）先称取支气管肺组织50-100mg，将其剪碎、研磨，1mlTRIzol匀浆；（2）在温度为4℃条件下以12000rpm离心，持续10分钟。（3）加入氯仿，震荡使其均匀融合，在室温下放置3分钟。（4）再次在温度为4℃条件下以12000rpm离心，持续15分钟，取上清液。（5）后加入异丙醇，震荡使其均匀融合，在室温条件下放置10分钟。（6）再次在温度为4℃条件下以12000rpm离心，持续10分钟（7）加入乙醇（1mL75℅）,再次离心，去掉上清液。（8）待RNA沉淀。（9）加入20-50μLDEPC水,55℃促溶10分钟，-80℃保存备用。3.3.2RT反应（1）在EP管（2ml）中加入1ugRNA，在0.2mLEP管中，加入10μMOligo（dT）1μL、DEPC引物、开始离心。（2）在PCR仪中以65℃加热，水浴3分钟。（3）加入RNA酶抑制剂及逆转录酶。（4）在PCR仪器上进行反转录，分别为42℃60分钟，70℃5分钟。（5）取出上述反应液，即为cDNA，-80℃保存备用。3.3.3荧光定量PCR反应取出cDNA作为荧光定量的模板，反应体系如下：14 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响反应条件如下：3.3.4各检测指标引物3.3.5结果分析（1）包括扩增曲线、熔解曲线以及相对表达量。（2）、本次实验所使用的分析方法为：relativequantificationstudy，计算方法为2-△△Ct。15 实验部分3.4Westernblot检测3.4.1组织匀浆及蛋白提取剪取大鼠同一部位组织，称重，并且每个样品控制在100mg左右，并以1ml/100mg加入RIPA细胞裂解液进行裂解。后以12,000rpm进行离心离心，持续10分钟。取上清液。3.4.2电泳(1)蛋白质处理在蛋白样品中加入5XSDS-PAGE缓冲液，与蛋白比例1:1，并在100℃水中水浴10分钟，使蛋白质变形充分。(2)上样与电泳待蛋白质回复至室温，将变性蛋白质加入到SDS-PAGE胶加样孔，其中浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，分别为30分钟、60分钟。(3)转膜将待检测的蛋白质样品与PVDF膜与滤纸相比较，在合适位置剪取胶条，PVDF膜与滤纸；按照规定顺序逐层叠放，除去每一层的气泡，保持紧密贴合。以恒流电接通电源，进行转膜。(4)封闭转膜完毕后，小心将PVDF膜放入Western洗涤液中漂洗；再将15ml的脱脂奶粉浸没膜条，封闭并缓慢摇晃2小时。(5)一抗孵育按照说明书给出稀释比例，将个抗体逐一稀释，稀释完成后使用TBST洗膜3次，每次洗涤10分钟。(6)二抗孵育按照说明书给出稀释比例，将一抗进行稀释，并孵育1小时，后每次洗涤10分钟，洗涤三次、(7)蛋白检测参考相关说明书，使用ECL发光试剂盒来检测蛋白。(8)图片灰度值分析16 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响北京科创锐新生物凝胶成像系统的分析系统进行胶片条带的分析4.统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，若数据符合正态分布，方差齐，两两间比较采用t检验，组间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异具有统计学意义。5实验结果5.1HE染色、AB-PAS染色结果5.1.1右肺下叶支气管肺组织HE染色HE染色可见，空白组大鼠气道管腔规则、通畅，支气管黏膜未见纤毛脱落，平滑肌未见明显增厚，周围无炎细胞浸润（图1A,a）。模型组与空白对照组比较，可见大鼠气道管腔明显变形，纤毛脱落，支气管平滑肌增厚明显，周围可见大量炎细胞浸润，肺泡融合呈肺气肿改变（图1B,b）；益肺健脾方高、中、低剂量组，氨溴索组和地塞米松组气管局部轻度变形，管壁轻度增厚，上皮细胞少量脱落，部分纤毛倒伏，脱落不明显，部分肺泡融合，可见少量炎性细胞浸润，较模型对照组有不同程度改善，其中益肺健脾方高剂量组、氨溴索组和地塞米松组改善明显（图1C,c;图1D,d;图1E,e;图1F,f;图1G,g）。--A--a--B--b17 实验部分--C--c--D--d--E--e--F--f18 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响--G--g注：A(a):空白对照组B(b):模型对照组C(c)：益肺健脾方高剂量组D(d)：益肺健脾方中剂量组E(e)：益肺健脾方低剂量组F(f)：氨溴索组G(g):地塞米松组图1各大鼠支气管及肺组织病理学改变HE×200Fig1PathologicalchangesinbronchopulmonarytissueofratsineachgroupHE×2005.1.2右中肺支气管肺组织组织AB-PAS染色AB-PAS染色显示空白对照组大鼠支气管未见杯状细胞（图2A）；模型对照组大鼠支气管有大量杯状细胞增生（图2B）；益肺健脾方高中低剂量组、氨溴索组、地塞米松组均可见少量杯状细胞增生，与模型对照组相比，杯状细胞数量明显减少（图2C、D、E、F、G）。ABCD19 实验部分EFG注：A:空白对照组B:模型对照组C：益肺健脾方高剂量组D：益肺健脾方中剂组E：益肺健脾方低剂量组F：氨溴索组G：地塞米松组图2各组大鼠支气管肺组织AB-PAS染色AB-PAS×200Fig2bronchopulmonarytissueAB-PASstainingofeachgroupofratsAB-PAS×2005.2免疫组化示:AQP3、AQP5及Muc5ac在支气管及肺组织中表达强度的变化5.2.1AQP3在支气管及肺组织中表达强度的变化免疫组化显示空白组大鼠支气管及肺组织AQP3表达较高（图3A），模型组大鼠支气管及肺组AQP3表达强度较空白对照组明显降低（图3B），益肺健脾方高中低剂量组、氨溴索组、地塞米松组均可见AQP3表达强度提高，其中益肺健脾方高剂量组、地塞米松、及氨溴索组提高较明显（图3C、D、E、F、G）。AB20 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响CDEFG注：A:空白对照组B:模型对照组C：益肺健脾方高剂量组D：益肺健脾方中剂组E：益肺健脾方低剂量组F：氨溴索组G：地塞米松组图3AQP3在大鼠支气管肺组织中表达强度的变化Fig3ChangesofexpressionintensityofAQP3inratbronchopulmonarytissueIHC×4005.2.2AQP5在支气管及肺组织中表达强度的变化免疫组化显示空白组大鼠支气管及肺组织AQP5表达较高（图4A），模型组大鼠支气管及肺组AQP5表达强度较空白对照组明显降低（图4B），益肺健脾方高中低剂量组、氨溴索组、地塞米松组均可见AQP5表达强度提高，其中益肺健脾方高剂量组、地塞米松、及氨溴索组提高较明显（图4C、D、E、F、G）。AB21 实验部分CDEFG注：A:空白对照组B:模型对照组C：益肺健脾方高剂量组D：益肺健脾方中剂组E：益肺健脾方低剂量组F：氨溴索组G：地塞米松组图4AQP5在大鼠支气管肺组织中表达强度的变化Fig4ChangesofexpressionintensityofAQP5inratbronchopulmonarytissueIHC×4005.2.3MUC5AC在支气管及肺组织中表达强度的变化免疫组化显示空白组大鼠支气管及肺组织MUC5AC表达较少（图5A），模型组大鼠支气管及肺组MUC5AC表达强度较空白对照组明显升高（图5B），益肺健脾方高中低剂量组、氨溴索组、地塞米松组均可见MUC5AC表达强度降低，其中益肺健脾方高剂量组、地塞米松、及氨溴索组降低较明显（图5C、D、E、F、G）。AB22 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响CDEFG注：A:空白对照组B:模型对照组C：益肺健脾方高剂量组D：益肺健脾方中剂组E：益肺健脾方低剂量组F：氨溴索组G：地塞米松组图5MUC5AC在大鼠支气管肺组织中表达强度的变化Fig5ChangesofexpressionintensityofMUC5ACinratbronchopulmonarytissueIHC×4005.2.4各组大鼠支气管及肺组织中AQP3、AQP5及Muc5ac平均光密度值比较分析结果示:与空白组相比较，模型组大鼠肺组织及支气管组织中AQP3及AQP5的表达量明显下降(P<0.01)，光密度值减低；中药组与西药组大鼠肺组织及支气管组织中AQP3及AQP5的表达量均有不同程度的升高；而模型组大鼠肺组织及支气管组织中MUC5AC与空白组组比较明显升高，各治疗组MUC5AC表达均有不同程度下降，其中中药高剂量组、氨溴索组、地塞米松组下降明显。23 实验部分表-1各大鼠肺组织及支气管组织中AQP3、AQP5平均光密度值比较(x±s)Tab1TheexpressionofaverageopticaldensityvalueofAQP3andAQP5inbronchopulmonarytissue(x±s)组别nAQP3AQP5Muc5ac正常组60.51±0.0030.52±0.0030.33±0.003模型组60.25±0.004**0.29±0.003**0.50±0.006**中药高剂量组60.44±0.003##☆☆0.37±0.004##☆☆0.43±0.003##☆☆中药中剂量组60.40±0.007##0.35±0.007##0.44±0.003##中药低剂量组60.36±0.008##0.32±0.009##0.47±0.002##氨溴索组60.46±0.006##0.45±0.010##0.40±0.002##地塞米松组60.42±0.008##0.48±0.004##0.37±0.004##注:与正常组相比，**P<0.01；与模型组比较:##P<0.015.3支气管及肺组AQP3、AQP5及Muc5acmRNA表达的变化5.3.1各检测指标溶解曲线结果显示，各检测指标的熔解曲线均为特异性单一峰，且Tm值均大于75℃，表明扩增过程中既无非特异性扩增产物又无引物二聚体的产生，扩增产物均为特异性目的基因。图61.AQP3溶解曲线24 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响2.AQP5溶解曲线3.Muc5ac溶解曲线图61:AQP3熔解曲线；2：AQP5熔解曲线；3：Muc5ac熔解曲线Fig6MeltingcurvesofAQP3、AQP5andMuc5ac5.3.2各检测指标扩增曲线扩增曲线示:不同Ct的曲线显示出来就基本是平行的位移，其倾斜程度基本一致。图7。1.AQP3扩增曲线25 实验部分2.AQP5扩增曲线3.Muc5ac扩增曲线1：AQP3扩增曲线；2：AQP5扩增曲线；3：Muc5ac扩增曲线图7AQP3、AQP5与Muc5ac的扩增曲线Fig7AmplificationcurveofAQP3、AQP5andMuc5ac5.3.3PCR检测AQP3、AQP5及Muc5acmRNA表达变化分析结果示:与空白组相比较，模型组大鼠肺组织及支气管组织中AQP3mRNA及AQP5mRNA的含量明显下降(P<0.01)；中药组与西药组大鼠肺组织及支气管组织中AQP3及AQP5mRNA的含量均有不同程度的升高；而模型组大鼠肺组织及支气管组织中MUC5ACmRNA与空白组组比较明显升高，中药中高剂量组及西药组表达均有不同程度下降，其中中药高剂量组、氨溴索组、地塞米松组下降明显。表2。图8。26 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响表2益肺健脾方对AQP3及AQP5mRNA表达的影响Tab2EffectsofYiFeiJianPirecipeonthemRNAexpressionofAQP3andAQP5(x±s)组别nAQP3AQP5Muc5ac正常组61.00±0.101.00±0.091.00±0.19模型组60.24±0.03**0.27±0.04**2.10±0.30**中药高剂量组60.74±0.08##☆☆0.75±0.10##☆☆1.21±0.20##☆☆中药中剂量组60.50±0.08##0.65±0.06##1.73±0.27##中药低剂量组60.40±0.06##0.43±0.05##2.14±0.26##氨溴索组60.73±0.05##0.71±0.05##1.20±0.08##地塞米松组60.82±0.06##0.92±0.07##1.16±0.10##AQP3AQP5Muc5acMUC5AC图8各组大鼠支气管及肺组织AQP3及AQP5mRNA表达的比较Fig8ComparisonofthemRNAexpressionAQP3andAQP5inbronchopulmonarytissue1:正常组；2:模型组；3:中药高剂量组；3:中药中剂量组；3:中药低剂量组；3:氨溴索组；3:地塞米松组；注:与正常组相比，**P<0.01；与模型组比较:##P<0.01；27 实验部分5.4各大鼠支气管及肺组织中AQP3、AQP5及Muc5ac蛋白表达变化分析结果示:与空白组相比较，模型组大鼠肺组织及支气管组织中AQP3及AQP5的表达明显下降(P<0.01)；中药组与西药组大鼠肺组织及支气管组织中AQP3及AQP5的表达量均有不同程度的升高；而模型组大鼠肺组织及支气管组织中MUC5AC表达量与空白组组比较明显升高，中药低中高剂量组及西药组表达均有不同程度下降，其中中药高剂量组、氨溴索组、地塞米松组下降明显。表3。图9。表3益肺健脾方对AQP3及AQP5蛋白表达的影响Tab3EffectsofYiFeiJianPirecipeontheproteinexpressionofAQP3andAQP5(x±s)组别nAQP3AQP5Muc5ac正常组62.05±0.052.15±0.080.28±0.02模型组60.69±0.08**0.72±0.05**0.54±0.01**中药高剂量组61.66±0.05##☆☆1.77±0.07##☆☆0.35±0.04##☆☆中药中剂量组61.32±0.02##1.38±0.06##0.41±0.02##中药低剂量组60.91±0.08##0.95±0.09##0.48±0.03##氨溴索组61.63±0.06##1.78±0.05##0.35±0.03##地塞米松组61.73±0.08##1.82±0.05##0.32±0.04##图9AQP3AQP528 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响MUC5AC123456743kDaActin32kDaAQP336kDaAQP5130kDaMuc5AC图9、各组大鼠支气管及肺组织中AQP3、AQP5及MUC5AC蛋白表达量的比较Fig9ComparisonoftheproteinexpressionAQP3、AQP5andMUC5ACinbronchopulmonarytissue1：正常组；2：模型组；3：中药高剂量组；4:中药中剂量组；5：中药低剂量组；6：氨溴索组；7；地塞米松组注：与正常组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01。29 讨论部分讨论部分1.研究指标的意义1.1肺水通道蛋白结构与功能目前研究表明[20]，哺乳动物体内存在的水通道蛋白有数十种，其中在肺组织中有着大量的分布，常见的有AQP1、AQP3、AQP4及AQP5。肺水通道蛋白在结构上有着相似性，主要由一条单肽链在细胞膜形成6次跨膜，个跨膜区域相互连接形成一个环抱的“沙漏模型”，并有研究表明水分子可在此“沙漏模型”的孔道中实现跨膜转运[21-22]。研究表明，将小鼠的水通道蛋白基因敲除可致使小鼠肺泡毛细血管通透性明显下降，并有研究表明小鼠的气道湿度亦明显下降[23-24]。另外，近年来研究表明肺水通道蛋白与慢性阻塞性肺疾病有着密切的关系，参与了慢阻肺疾病发展的各个过程。1.2肺水通道蛋白与慢性阻塞性肺疾病关系1.21肺水通道蛋白与气道炎症关系目前研究认为，慢阻肺患者肺泡及支气管各种病理改变均与炎症有关[25-26]。而Town等人首次发现肺水通道蛋白AQP1及AQP5可随肺部感染的发生而表达降低[27]。金嫦娥等人[28]在烟熏诱导气道炎症所致慢阻肺模型大鼠，后与正常组比较可发现肺泡组织AQP5表达水平明显下降，这也说明气道炎症与AQP5的表达有着密切关系。[29]罗建红等人研究表明在用竹沥干预慢阻肺模型大鼠时，肺组织中AQP1、AQP4及AQP5与模型组比较明显升高，而个炎症指标如TNF-α、IL-6明显下降，说明水通道蛋白AQP1、AQP4及AQP5与炎症指标呈负相关性，并认为水通道蛋白表达的升高缓解了气道痰液潴留，间接影响了炎症的发展。[30]杨志军等人在药物治疗痰浊阻肺大鼠模型时，发现治疗组较模型组NO、TNF-α、ICAM-1的含量及COX-2的浓度均显著降低，AQP1及AQP5的表达反而升高，说明化痰药物的治疗可抑制炎症反应，并且炎症反应与水通道蛋白的表达呈负相关。[31]胡文豪等人研究表明，在咳喘宁胶囊治疗慢阻肺模型大鼠时，大鼠血浆TNF-α、IL-8、mip-2等炎症因子含量较模型组降低，AQP5含量升高，也说明了水通道蛋白参与了参与了炎症反应。30 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响1.22肺水通道蛋白与气道气道黏液高分泌的关系在慢性阻塞性肺疾病患者中，气道粘液高分泌已经成为慢阻肺患者病情进展及死亡的独立危险因素。慢阻肺患者常伴有大气道杯状细胞的增生及小气道杯状细胞的化生使气道粘液分泌增加，其中以黏蛋白MUC5AC为代表，痰液粘稠度的增高，将使病情进一步进展[32]。水通道蛋白与黏蛋白有着密切的关系，近年来研究较多。鲁士友等人研究表明[33]，在寒饮蕴肺证大鼠模型当中，AQP1的表达水平下降，而黏蛋白MUC5AC的表达随着AQP1表达的下降而上升，并认为水通道蛋白与黏蛋白共同决定了气道黏液的粘稠度，气道黏膜细胞水分子转运作用下降和黏蛋白含量增加导致气道湿化不足，这也与寒饮伏肺的形成有着密切关系。王可[34]等在慢阻肺患者离体肺组织中研究发现，随着慢阻肺严重程度的增加，AQP5的表达逐渐下降引起气道湿化明显降低，而Muc5ac的表达呈逐渐上升的趋势，导致气道黏液的粘滞度逐渐增加，这就引起慢阻肺患者气道黏液排送的困难，加重慢阻肺患者病情。综合以上可见肺水通道蛋白可以增加气道湿化，与黏蛋白分泌密切相关。1.23肺水通道蛋白与肺功能的关系肺功能的下降是慢阻肺患者气喘呼吸困难的主要原因，肺功能的下降与气道炎症导致的气道纤维化、平滑肌增厚，肺泡顺应性的下降等病理改变关系密切[35]。詹少锋等人研究表明，在益肺化痰方治疗慢阻肺模型小鼠后与模型组比较，治疗组小鼠PIF、PEF和MV均有所上升，并且AQP5表达量越高，PIF、PEF和MV值越高，说明AQP5表达可以缓解小鼠肺功能的下降。王可[34]等人研究表明，在慢阻肺患者中，AQP5表达下调不仅与Muc5ac的表达呈负相关，并影响着患者的肺功能，随着患者肺功能的降低，水通道蛋白的表达量也随之降低，并阐明AQP5表达的降低及Muc5ac表达的增高将增加患者痰液粘滞度，痰液粘滞度的增加将为细菌定植提供条件，加重气道炎症，进而使患者肺功能进一步下降。以上研究均表明了肺水通道蛋白表达的异常影响着气道及肺泡的一系列病理改变，进而影响患者的肺功能。1.24肺水通道蛋白与气道重塑的关系气道重塑往往伴随着慢阻肺患者疾病的整个过程。研究表明，皮肤损伤后，31 讨论部分可检测到损伤部位AQP3表达量的增加，说明AQP3参与了皮肤损伤后的修复[36-37]。但在气道重塑方面未有研究直接表明与水通道蛋白有关，现代研究表明气道重塑主要与气道的反复炎症有关，长期的炎症刺激导致气道纤毛脱落，纤维结缔组织增生，气道重塑、狭窄，而水通道蛋白与气道炎症密切相关[25-26]。综合以上可以认为肺水通道蛋白表达的异常影响到患者气道的黏液高分泌状态及炎症反应，从而间接影响到患者气道重塑。1.3Muc5ac与慢性阻塞性肺疾病的关系慢阻肺患者的气道长在长期炎症刺激情况下，使患者大气道杯状细胞增生，小气道的上皮细胞亦可向杯状细胞化生，使气道黏蛋白表达增高，气道黏液粘稠度升高，引起气道的气流受限。气道阻塞，导致患者病情反复加重[38-39]。气道黏液中含有多种蛋白成分，其中以Muc5ac及Muc5b为主要。研究表明，IL-6介导JAK2依赖的自分泌及旁分泌可以增加黏蛋白的表达，另外IL-6、IL-17还可以通过ERK、NF-κB等信号通路分别使Muc5b及Muc5ac表达上调[40]。詹少锋等人[41]研究表明，慢阻肺模型大鼠与空白对照组大鼠比较时，模型组大鼠肺泡BALF中Muc5ac表达明显增高，认为IL-17可以引起大鼠气道炎症的发生，从而上调Muc5ac的表达，并且各种炎性因子引起的气道黏液分泌增加并不是单一的信号通路，这种过程涉及复杂的信号通路网，说明了慢性阻塞性肺疾病、气道炎症及气道黏液高分泌三者紧密联系，互相因果。冯立志[42]等人在益气化痰方干预慢阻肺模型大鼠时，发现益气健脾方可降低大鼠气道Muc5ac表达量，并且Muc5ac表达与AQP5的表达呈负相关，并认为TNF-α可以促进气道炎症反应，引起Muc5ac与AQP5表达量的改变。胡文豪[31]等人研究表明，慢阻肺模型大鼠与正常对照组比较，大鼠气道Muc5ac表达量明显升高，气道中IL-6、IL-8、MIP-2及TNF-α等炎性因子释放增加，说明慢阻肺模型大鼠气道内诸多炎性因子可引起大鼠气道黏液高分泌，而气道黏液高分泌状态又使大鼠气道纤毛组织破坏、痰液粘附，致使炎症反应进一步加重，说明气道炎症及气道黏液高分泌均是慢阻肺的病理特点。另外Muc5ac的表达与大鼠肺功能呈负相关，模型大鼠与对照组比较，大鼠潮气量（TV）及呼气峰流速（PEF）均明显下降。综合以上，可知杯状细胞增生、黏蛋白过度分泌已经成为慢阻肺病程中的一个独立危险因素，往往与气道炎症，气道结构的破坏有32 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响着密切关系。2.从肺脾两脏治痰的理论基础2.1痰饮的定义痰饮一词最早出现在张仲景《金匮要略》痰饮咳嗽病脉证并治第十二中，此时“痰”与“饮”并未分开，后世医家才逐渐将“痰”与“饮”定义分开[43]。认为痰饮皆为体内水液运化与输布出现问题，停聚于体内而形成的产物，其中稠浊浓厚者为痰，正如《景岳全书》所说:“饮清澈而痰稠浊”。痰与饮所致病也有所不同，如：“饮惟停积肠胃，而痰则无处不到”，说明了痰所致病的广泛性。痰又可分为有形之痰与无形之痰，有形之痰可见、可触、可闻，如能咳出的有行可见之痰；无形之痰则分布广泛，如患者头晕、头重、四肢麻木、梅核气等均属无形之痰作祟[44]。临床上喘病的病人亦可无痰咳出。但现代医学检查，如影像学可见患者远端支气管痰栓形成，此可认为是有形之痰，因其确实有行，亦可认为是无形之痰，因其不可触、不可见。2.2通调水道，痰饮可化何为肺通调水道，肺通调水道有赖于肺气的宣发与肃降，肺脏承接脾脏运化而来的水谷精微向上宣发则津液从口鼻及皮毛而出，肺的宣发功能正则口鼻呼吸正常，皮毛腠理得以濡润，开合有度，津液得行。肺的肃降功能使另一部分水液向下及向内布散，向下向内布散则脏腑得以濡养，如《血证论》所说:“肺为水之上源，上源清则下自清”。另一方面，肺的宣发与肃降功能有赖于肺气的推动，津液为气之载体，而气为津液运行之动力，如《医门法律》所说:“肺气肃清，则周身之气莫不服而顺行”。又有《济生方》曰:“治痰应先治气，气顺为先，分次导之，气顺津液流通，痰饮运下”。综合以上，说明肺脏的宣发与肃降功能正常则水液得以输布正常，肺气充足则周身之气顺，津液运行有力，反之则津液停聚，化而为痰。痰液的形成与肺朝百脉、主治节功能亦有着密切关系，肺肺朝百脉、主治节功能正常，全身血液才可会流于肺进行浊气与清气的交换，另外《灵枢·邪客》中论述道:“津液与血液同出于水谷之精微”。固有“津血同源”之说。血液有规律的回流、泵出，才可使津液输布顺畅。程正良等人也研究认为，长期咳喘的患者多为本虚标实，在咳嗽，咳痰的基础上大多伴有着血瘀的病理因素，痰阻与血瘀常同时存在，治33 讨论部分疗时应兼顾活血理气之药。由此可见肺朝百脉主治节功能正常，血液运行顺畅，则痰液亦不易生成[45-46]。2.3脾气健运，痰饮不生《灵枢·经脉别论》曰:“饮入于胃，游益精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺，通调水道，下输膀胱，水精四布，五经并行”。由此可见，脾气健运则可将水谷精微上注于肺，再由肺的宣发肃降功能使水液向上向下运行，濡养全身及脏腑组织。并将另一部分下注于肾，经肾气之气化作用，形成尿液。可见脾脏在水液代谢中的重要作用，脾气不运则水谷精微转运不畅，痰饮内生。另一方面，脾脏又为后天之本，生气之源，脾气虚弱则水谷精微不得上注于肺，母气不足，则子无所养，以致肺气亏虚，进而影响肺的宣发与肃降功能，宣发与肃降功能异常，则水液亦可停聚为痰。固有《景岳全书》:“盖痰涎所在，本由水谷，皆成血气，留而为痰”。遂在治疗痰证之时，宜兼顾治脾。如《丹溪治法心要》:“实脾土，燥脾湿是治痰之本”。现代医学对慢阻肺病人进行归类分析时，喘病病人多为本虚标实，其中以肺脾两虚证居多，占到38.3%。也说明了肺脾气虚在临床上较为常见。《景岳全书·痰饮》曰“虚实二字，不可攻者皆为虚痰”。指出在治痰之时应考虑虚实，虚则攻补兼施，化痰同时亦要补肺健脾，脾肺同治，痰饮可化[47-48]。2.4痰饮与其他脏腑的关系除脾肺两脏之外，痰的生成与其他脏腑亦有着密切关系。例如肾脏为水之下源，下源不通亦可影响肺主通调水道，另外脾主运化水湿、肺气宣发肃降均与肾阳的气化作用有着关系，肾阳不足则水饮停于肺则生为痰，停于胃、皮肤则可为饮。肝主疏泄，其用为阳，肝气条达则气机顺畅，若情志所伤，肝气被郁、气机受阻则亦可影响脾之运化，运化失常，痰饮内生；肺失宣降则水液停聚为痰。另外在三焦方面，《圣济总录痰饮统论》说：“三焦者，水谷之道路，气之所始终也”。说明三焦乃气机及水谷运行的通道，三焦功能正常，水液才能升降出入。若三焦气机不畅，水液运行不顺，则影响肺、脾、肾等脏腑对水液的输布作用，水液停于体内可生为痰饮[49]。由以上可见，水液的生成、运行与排泄需要人体各脏腑器官的参与，而脾肺两脏更为密切，如:“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”。遂本实验以益肺健脾之法治疗肺脾两虚模型大鼠，观察其水液代谢及黏液生成情况。34 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响3.益肺健脾方组方特点及药物研究:3.1组方特点益肺健脾方是由六君子汤合玉屏风散划裁而得，方中含有党参15g、黄芪30g、茯苓15g、白术15g、防风10g、陈皮10g、半夏15g、款冬花10g、地龙8g、甘草10g。本方中黄芪、白术、防风补肺益气固表，党参、茯苓补气健脾，陈皮、半夏、款冬花止咳化痰平喘，地龙平喘通络，甘草调和诸药，“助参芪成气虚之功”。全方共凑益肺健脾，兼顾止咳化痰祛瘀。3.2药物研究3.2.1党参《本草从新》曰“主补中益气，和脾胃，除烦渴。中气微弱，用以调补，甚为平妥”。现代研究表明[50]，党参在抑制血栓形成，降压、抗衰老、增进脾胃功能、提高机体免疫力等方面均有着作用，赵晓梅等人在党参治疗胃溃疡、低血压、高血脂各类病人实验中，有效率分别达到了90%、100%、92%，并久病导致的气虚乏力、久痢脱肛的肺脾气虚证型的病人在用党参等补益药治疗后能显著提高患者的机体免疫力。另有研究表明[51]，党参可抑制金黄色葡萄酒菌，大肠埃希菌，肺炎克雷伯等各种细菌活性，并且在小鼠应激引起的咳嗽治疗当中，党参提取物可以起到一定的抑制咳嗽症状的作用，在观察小鼠病理学改变时，党参提取物可以使小鼠支气管纤毛活力增加，排痰量增加。[52]另外在贫血模型大鼠治疗当中，党参煎剂可以促进大鼠红细胞生成，并且与浓度呈相关性，血红蛋白也随之增加。党参对大鼠的记忆及活动情况也有着一定作用，可以明显提高大鼠记忆能力，并且可以抗惊厥、抗抑郁等疗效。3.2.2黄芪《本草纲目》：“元素曰:黄芪甘温纯阳，其用有五:补诸虚不足···”黄芪当中含有黄芪多糖、黄芪甲苷、氨基酸、核黄素等成分，在调节免疫力，抗疲劳，抗衰老等方面都有着广泛的作用。研究表明[53]，在肺部感染患者治疗过程中，治疗组分为普通西药组与西药组联合黄芪煎剂组，结果显示联合黄芪煎剂组患者血液中各种炎性指标NEUT%、CRP等可下降更明显，并在慢阻肺患者治疗结果中，联合黄芪煎剂的治疗组患者其总有效率更高，能明显改善患者气喘症状及生活质量。35 讨论部分消化系统方面，黄芪建中汤可明显改善大鼠胃粘膜的病理改变，缓解大鼠胃粘膜萎缩，升高SDH、和LDH等活性[54]。黄萍等人研究表明[55]，在黄芪甲苷处理大肠埃希菌感染的大鼠时，与模型组比较，大鼠活动能力及生存率明显升高，血液中中性粒细胞数目增加，炎性因子TNF-α的含量随之下降。刘璟等人在用黄芪甲苷干预支气管哮喘模型大鼠时，大鼠体内IL-10、IL-12表达增高（P<0.05），CD86、CD80与IL-4表达降低（P<0.05），说明黄芪甲苷可调节大鼠免疫力达到缓解支气管哮喘的作用。3.2.3茯苓《神农本草经》:“主胸胁逆气，忧恚惊邪···，久服安魂养神，不饥、延年”。茯苓含有茯苓糖、茯苓三萜等。[56]研究表明茯苓具有利尿、抗氧化、抗菌、增强免疫力及抗肿瘤等作用，在茯苓提取物可增加大鼠血清内IL-2及TNF-α因子含量，从而调节大鼠免疫力。在肝纤维化模型大鼠治疗组当中，茯苓提取物治疗组与模型组比较，能有效降低HCS细胞增殖，大鼠的肝纤维化过程得到延缓。另有研究表明，给予大鼠茯苓水煎液灌胃后，大鼠尿中K+含量随着水煎液的浓度增高而增高，NA+/K+随之下降[57]。茯苓提取物还可以提高大鼠林细胞增殖，腹腔巨噬细胞的活性也随之增加，说明茯苓提取物对大鼠的免疫功能也起到作用。另外茯苓提取物可以在不影响MAO的活性情况下使大鼠血清中T-SOD及CU-SOD活性增加，说明茯苓提取物可以明显提高抗氧化等作用，延缓衰老。而在抗肿瘤方面，茯苓提取物治疗组与模型组比较，茯苓提取物通过提高免疫监视能力，使血清中自然杀伤细胞(NK)活性增加，从而提高抗肿瘤能力[58]。3.2.4白术《本草汇言》:“白术，乃扶植脾胃，散湿除痹，消食除痞之要药”。白术含有水溶PAM-1和PAM-2，脯氨酸、淫羊藿次苷、三萜类成分、香豆素类化合物等。陈东杰等人[59]在治疗慢阻肺肺脾气虚型大鼠时，与单纯西药组比较，加用参苓白术散治疗组患者气喘等症状明显改善，患者食欲及呼吸力增加，并且患者嗳气、大便不成形等症状亦可改善，说明参苓白术散在治疗肺脾气虚型大鼠时不仅可以改善慢阻肺症状，还可以提高患者一般生活水平。白术提取物可以促进小肠的运动功能，而对胃的排空作用起到抑制作用，说明白术提取物对消化功能具有积极作36 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响用。在腹水大鼠模型当中，白术提取物可以促进电解质排除，消除大鼠腹水症状。赵桂芝等人研究表明[60]，白术醇提取物腹腔注射大鼠后，发现大鼠痛阈值明显升高，并与模型组比较，治疗组大鼠疼痛部位肿胀程度明显下降，说明白术醇在抗炎镇痛方面有着一定作用。李惠等人研究表明[61]，在参苓白术散联合西药治疗脾虚痰瘀型大鼠时，与模型组比较，治疗组FPG、HbA1c、HOMA-IR、LEP水平均有所下降（P<0.05），说明参苓白术散可以缓解胰岛素抵抗，调节大鼠内分泌代谢等作用。3.2.防风《本草汇言》:“防风，散风寒湿痹之药也”。防风温而不燥，甘温不峻，又被称为“风中之润剂”。防风含有色原酮、香豆素、挥发油等各种物质。防风具有显著的解热作用[62]，在发热大鼠给予防风提取物治疗，可以有效降低大鼠体温，并且高剂量组与阿司匹林效果相当。并且防风对大鼠进行干预，可以明显提高大鼠疼痛阈值。防风还可以有效提高大鼠免疫能力，通过IL-2作用提高NK细胞活性，并且大鼠不存在剂量依赖。另外防风提取物具有抗菌作用，对金黄色葡萄酒菌、肺炎双球菌等均具有抑制作用[63]。郭军雄等人[64]在药物治疗溃疡性结肠炎大鼠时，将治疗组分为痛泻要方组与痛泻要方祛防风组，两组与模型组比较均可降低肠粘膜TLR-4及大鼠血清TNF-α、IL-1β表达水平，而两治疗组之间比较，痛泻要方组治疗效果更佳（P<0.05），说明防风在痛泻要方中对治疗溃疡性结肠炎有着重要作用，可能抑制TLR-4受体表达从而影响下游炎症因子在大鼠血清中的含量。3.2.6陈皮《本草纲目》:“橘皮，苦能泄能燥，辛能散，温能和，其治百病”。陈皮含有黄酮类、多糖类、挥发油、生物碱等多种物质。陈皮提取物在呼吸系统疾病中有着积极作用，比如陈皮素可以抑制气管痉挛、舒张支气管等作用；橙皮苷能抑制肺部细菌生长等；并且陈皮挥发油在大鼠肺纤维化中可起到一定的治疗作用。宋玉鹏等人[65]在陈皮提取物对大鼠胃肠组织进行干预时，发现陈皮提取物可以有效的促进大鼠胃肠组织活性。何少玲[66]等人在陈皮提取物干预血瘀证大鼠时，陈皮提取物中高剂量组对血瘀证大鼠血液粘度有一定降低作用，并可以降低大鼠血沉，改变纤维蛋白原含量。37 讨论部分3.2.7半夏《药性论》:“消痰，开胃健脾，止呕吐，去胸中痰满，下肺气，主咳结”。半夏含有各种氨基酸、有机酸、油脂类等成分。邓青南等人[67]脂多糖诱导气道炎症时，发现模型组大鼠肿瘤坏死因子TNF-α在大鼠支气管中异常表达，并且大鼠气道Muc5ac表达异常升高，水通道蛋白AQP5的表达明显降低，使大鼠气道黏液粘稠度增高，而半夏提取物可以降低大鼠气道Muc5ac表达并且升高AQP5的表达，并且肿瘤坏死因子TNF-α亦随Muc5ac的降低而降低，说明半夏提取物可以通过改善大鼠气道黏蛋白及水通道蛋白的表达情况从而使大鼠痰液更易排送，减轻大鼠气道炎症。周建龙等人[68]研究表明，在简历急性肺损伤大鼠模型后予以半夏提取物治疗，发现半夏提取物可以增加大鼠气道AQP5的表达含量，而TNF-α与AQP5的表达呈负相关，半夏提取物治疗组大鼠肺水肿明显减轻。3.2.8款冬花《本草纲目》:“主咳逆，古今方用为温肺治嗽之最”。款冬花含有三萜和倍半萜类、黄酮类、酚酸类、生物碱类等物质，有止咳平喘、抗炎、抗肿瘤、保护神经等作用。款冬花具有平喘及化痰止咳等作用，可能与款冬酮的抑制炎症及舒张支气管的作用有关。XueShuiyu等人研究表明[69]，款冬花具有较好的止咳平喘作用。贺润丽等人研究表明[70]，款冬花提取物正丁醇高剂量组、氯仿高剂量组(6g/kg)能显著减少小鼠咳嗽次数并延长小鼠咳嗽潜伏期，差异有统计学意义（P<0.05），并且氯仿高剂量组治疗大鼠排痰量亦明显增多，说明氯仿可以稀释痰液及促进大鼠排痰。3.2.9地龙《本草新篇》:“蚯蚓乃至微之物，实至神之物。”地龙主要含有蛋白质、氨基酸、脂类、酶类、微量元素等化合物,具有有平喘降压、解热镇痛、抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、增强免疫等[71]。王莉等人研究表明[72]，在支气管哮喘模型大鼠中，地龙治疗组可以降低大鼠气道平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA)及纤维连接蛋白(FN)表达量从而缓解大鼠气道重塑及气喘症状。陈艳虹等人[73]在苏子降气汤治疗痰浊阻肺型慢阻肺患者时，加入地龙、全蝎等药物后可使患者咳痰症状减轻更明显，患者活动量及生活质量明显提高。38 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响3.3甘草《本草正》:“得中和之性，有调补之功，故毒药得之解其毒，刚药得之和其性”。甘草主要含有三萜类、黄酮类、生物碱、等各种化学物质。具有镇咳平喘、降低回肠收缩活动性、抗心律失常、抗炎等作用[74]。朱雪峰等人[75]研究表明在甘草提取物治疗肠道感染模型的大鼠时，大鼠肠道内T淋巴细胞及B淋巴细胞增值率随药物浓度增加而增加，NK细胞杀伤力也随之提高，肠道内细菌浓度随之下降，说明甘草提取物可以通过增加免疫细胞增值率及NK细胞杀伤力来降低肠道内细菌含量。4黏液高分泌与慢阻肺的关系杨晓敏等人研究表明[76]，慢阻肺模型大鼠支气管肺组织中TNF-α释放及EGFR、P13K、AKT的磷酸化均与气道黏液的高分泌有着正相关性，说明大鼠气道黏液的高分泌状态可引起种炎性因子的释放或者通路的激活，从而影响大鼠支气管的病理改变及炎性反应。王可等人研究表明[34]，慢阻肺患者气道黏液高分泌状态与AQP5及MUC5AC的表达有着密切关系，二者共同决定了慢阻肺患者气道黏液的粘滞度，气道黏液的高分泌状态与AQP5的表达呈负相关，而MUC5AC的高表达却提升了慢阻肺患者气道黏液的粘滞度，导致患者痰液难以排送，从而为细菌的定植提供了条件，并且在黏液高分泌的状况下，抗菌药物的治疗效果也随之下降，使患者气道病理改变进一步加重。另有研究表明[77]，益肺健脾方可以降低大鼠气道IL-13的表达而减轻大鼠气道炎症的发展；并可以抑制NF-κB等信号通路从而减轻大鼠气道炎症反应及黏液高分泌，提高大鼠FEV0.3/RVC的比值，缓解大鼠气道病理改变[78]。结论1.通过大鼠HE染色及AB-PAS染色可见益肺健脾方可以减轻大鼠气道炎症改变，缓解气道重塑及肺组织的肺气肿改变；并在减少大鼠气道杯状细胞过度增生，降低黏蛋白的表达起着一定作用，免疫组化及RT-PCR、WB检测可知益肺健脾方可以增加大鼠支气管肺组织中AQP3及AQP5的表达，而降低MUC5AC的表达，AQP3、AQP5与MUC5AC的表达呈负相关。2.既往已有研究表明水通道蛋白AQPs与黏蛋白MUC均与慢性阻塞性肺疾病各39 讨论部分病理特征及改变有着密切关系，二者共同影响了气道炎症、气道重塑及气道黏液的粘稠度；基于本实验结果推断，实验中益肺健脾方可以通过调节水通道蛋白AQP3、AQP5与黏蛋白MUC5AC的表达从而影响大鼠气道黏液高分泌状态，气道黏液高分泌状态的改善将缓解大鼠气道炎细胞浸润、纤毛倒伏脱落、支气管平滑肌增厚及肺泡过度充气等一系列病理改变，延缓慢阻肺病程的进展，也与本实验结果相一致。由此也反正了“肺主通调水道，脾主运化水湿”的经典中医理论。40 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响参考文献[1]VestboJ,HurdSS,AgustiAG,etal.Globalstrategyforthediagnosis,management,andpreventionofchronicobstructivepulmonarydisease:GOLDexecutivesummary.AmJRespirCritCareMed,2013,187:347-365.[2]ZhongN,WangC,YaoW,etal.PrevalenceofchronicobstructivepulmonarydiseaseinChina:alarge,population-basedsurvey.AmJRespirCritCareMed,2007,176:753-760.[3]叶海勇,王胜.中医药治疗慢性阻塞性肺疾病概况.中医药临床杂志,2013,25:1149-1151.[4]AnX,ZhangAL,MayBH,etal.OralChineseherbalmedicineforimprovementofqualityoflifeinpatientswithstablechronicobstructivepulmonarydisease:asystematicreview.JAlternComlpementMed,2012,18:731-743.[5]乐永红,杨慧琴,李风森.慢性阻塞性肺疾病稳定期中医证型分布规律研究.实用中医内科杂志,2011,4:100-102.[6]单丽囡,刘小红,钟亮环.培土生金法配合西药治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期的临床观察.湖北中医杂志,2007,29:26-27.[7]吴蕾,林琳,许银姬,等.健脾益肺Ⅱ号治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期178例临床研究.中医杂志,2011,52:1465-1468.[8]LiSY,LiJS,WangMH,etal.EffectsofcomprehensivetherapybasedontraditionalChinesemedicinepatternsinstablechronicobstructivepulmonarydisease:afour-center,open-label,randomized,controlledstudy.BMCComplementAlternMed,2012,12:197.[9]杨珺超,王真,楼雅芳,等.益气健脾颗粒联合西药治疗慢性阻塞性肺病稳定期肺脾气虚型60例临床观察.中医杂志,2013,54:1933-1936.[10]王本祥主编.现代中药药理学.天津:天津科学技术出版社，1997:1144-1147.[11]MartinC，Frija-MassonJ，BurgelPR.Targetingmucushypersecretion:newtherapeuticopportunitiesforCOPD?.Drugs.2014，74(10):1073-1089.41 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益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响常伴有大气道杯状细胞的增生及小气道杯状细胞的化生使气道粘液分泌增加，其中以黏蛋白MUC5AC为代表，痰液粘稠度的增高，将使病情进一步进展[5]。杨晓敏等研究表明[6]在益肺健脾方治疗慢阻肺模型大鼠时，与模型组相比治疗组大鼠肺组织黏蛋白MUC5A表达明显下降，肺泡灌洗液IL-13含量减低，并且与MUC5AC密切相关的STAT6蛋白磷酸化也明显降低。并阐明了益肺健脾方可通过抑制IL-13→STAT6→MUC5AC的信号通路，从而抑制黏蛋白的过度分泌。另有研究表明，气道黏膜杯状细胞的化生与EGFR→P13K→AKT信号通路有着密切关系，EGFR、P13K与AKT磷酸化的增强往往提示气道粘液分泌的增加，并在中药制剂治疗慢阻肺模型大鼠时治疗组分为健脾益肺化痰方与化痰方两组，其两组与模型组比较EGFR、P13K与AKT磷酸化水平降低，MUC5AC表达下降；但两组之间比较时健脾益肺化痰方明显优于化痰方，表明了慢阻肺模型大鼠治疗时在兼顾脾肺两脏、标本同治情况下效果更优。赵娜妹等人研究表明[7]，在益肺健脾化痰方治疗慢阻肺模型大鼠时，对比模型组大鼠排痰量明显减少，此实验更加直观的观察到益肺健脾方治疗对痰液分泌的影响，并且效果优于化痰方，这与杨晓敏实验结果相似。综合以上可见益肺健脾法可以降低气道黏蛋白表达，延缓病情发展。3、益肺健脾法对肺功能的影响肺功能是慢性阻塞性肺疾病诊断标准，肺功能低下的患者往往出现活动后气喘呼吸困难，活动耐量下降，严重影响患者生活质量。李配等人研究表明[8]，在用化痰方和健脾益肺化痰方治疗慢阻肺模型大鼠时，两组均可增加大鼠FRV0.3/FVC的比值，健脾益肺化痰方效果更好，并认为大鼠肺功能的下降与肺泡顺应行的下降、膈肌疲劳及气道阻塞有着密切关系，痰液阻塞使气道纤毛组织对痰液的排送功能下降，增加细菌定植风险，并且使抗生素杀菌效果降低，致使粘液分泌与气道炎症反复发生，益肺健脾化痰方在治痰的同时兼顾治本，化痰又补益脾肺，使患者痰液可化、呼吸有力，延缓肺功能进一步下降。林国辉研究表明[9]，在长期接受呼吸机辅助通气治疗的患者往往存在膈肌疲劳，在抗感染、化痰、解痉平喘治疗后肺功能改善不明显，而在联合中药方剂益肺健脾方治疗后，患者FEV1、MEP、MIP值均较单纯西药治疗有所提升，并CAT评分下降，林国辉认为根据脾主运化水谷理论，通过益肺健脾法增强了患者脾主运化功能，肌肉营养得到保证，可减轻患者呼吸肌疲劳，缩短呼吸机辅助通气治49 综述疗时间，可使患者尽早脱机。4、益肺健脾法对患者一般状况及机体免疫的影响机体营养的消耗也是伴随着慢性阻塞性肺疾病的一个长期过程，长期肺部炎症、黏液过度分泌均可消耗体内蛋白质等营养物质，并且慢阻肺患者常伴有肺脾两虚，脾主运化功能下降，脾不能升清则营养生成不足，如何改善慢阻肺患者营养状况、提高生活质量在慢阻肺治疗过程当中起着重要作用[10]。潘素琼等人[11]在选取94例AECOPD患者进行治疗观察，将患者分为常规西药加肠内营养支持治疗患者组及在此基础上加用益肺健脾方治疗的患者组，研究表明两组治疗后与模型组比较均可提高患者血液中ALB、PA、TFN的含量，但两治疗组之间比较，加用益肺健脾方组患者血液中ALB、PA、TFN的含量提高更明显，由此可以推断，两组之间的差异并不是单纯营养摄入不足导致，可能与益肺健脾方增强脾主运化功能从而促进肠胃消化及吸收有关。陈小梅等人研究表明[12]在慢性阻塞性肺疾病稳定期患者常规西药治疗同时加用益肺健脾方可增加外周血中CD4+表达、减低CD8+表达，CD4+/CD8+比值相对增加，并且对患者进行随访，得出加用益肺健脾方患者门诊就诊次数降低、CAT评分提示患者生活质量明显增加。这都说明加用益肺健脾方可以使患者在长期治疗过程中提高免疫力，并生活质量得到明显改善。曹福凯等人研究表明[13]，慢阻肺肺脾两虚模型大鼠运用益肺健脾方治疗后与模型组相比较，不仅可增加外周血中CD4+表达、减低CD8+表达，而且可以明显增加血清中IgA、IgG、IgM含量，提示益肺健脾方可以提高大鼠免疫功能。5、现代研究表明，慢性阻塞性肺疾病是累及全身的慢性疾病，而中药治疗慢阻肺遵从整体观念，治病求本、标本同治，在改善患者气喘呼吸困难症状的同时从肺主通调水道、脾主运化等角度提高患者生活质量，从而达到远期治疗目的。由此可知益肺健脾法在治疗慢阻肺患者有着独特的优势。参考文献:[1]熊玲玲.益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的防治作用及机制探讨[D].安徽中医药大学,2014[2]王胜,熊玲玲,任薇,朱春冬,李春颖,周群.益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠气道炎症和气道黏液高分泌的影响[J].中国中西医结合杂志,2015,35(08):50 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个人简介个人简介基本信息：姓名：夏平凡出生年月：1991.02性别：男籍贯：安徽肥西学历：硕士专业：中西医结合临床主要学习与工作经历：2007.09-2010.06就读于濉溪县第二中学2010.06-2015.05就读于安徽省中医药大学2015.09-2018.06就读于安徽中医药大学研究生班中西医结合临床专业。攻读学位期间发表的学术论文目录:夏平凡,王胜.肺水通道蛋白与慢性阻塞性肺疾病，[J]中医药临床杂志,2017.12.1995-1997.52 益肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠支气管肺组织AQP3、AQP5及MUC5AC的影响致谢本研究及学位论文是在我的导师王胜教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选取到项目的最终完成，王老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。在此谨向王老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。在此，我还要感谢在临床上给予悉心教导的季红燕主任，朱春冬老师、任薇老师、李春颖老师、周群老师、方东革老师及干部呼吸内科全体医护人员。另外还要感谢邓雪师姐、张星星师姐、丁宁师兄及同门李姗姗和王海宇的帮主与支持。另外还要感谢师妹金铮、张玉新、沈宏的无私帮助。在论文即将完成之际，我的情绪无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮忙，在那里请理解我诚挚的谢意！最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，多谢你们！53
