人外周血单核细胞分离技术

《人外周血单核细胞分离技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、人外周血单核细胞分离1.抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血A:20mL于50mL离心管中，以2000r/min离心20min,吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10〜12.5mL。2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀A中的细胞中加入Hank's液（不含Ca2+、Mg2+,pH7.2〜7.6）体积比仍未1:1,混匀，制成细胞悬液。B:无菌抗凝血与HankS液或PBS以1:1体积在试管中混匀。另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于

2、其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000r/min离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出P

3、BMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2/3。混匀后离心1500r/min离心10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。再用同样洗涤?^洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血

4、小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2mL含20%小牛血清的Hank1液（或含10%胎牛血清及25mmol/Lhepas的RPMI-1640液3〜4mL）重新混悬细胞37C、5%CO2孵育箱中培养2〜3h后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640液3〜4mL,按需调定细胞密度，于37C、5%CO2孵育箱中培养备用。4.单核细胞的纯度与细胞活力的鉴定取一定体积的细胞悬?^送做流式细胞CD14、CD56等检查，以测定所得细胞的纯度。取1滴细胞悬液置于血细胞计数板

5、内计数。以台盼蓝拒染法检测细胞活力。取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液混匀，加盖片，显微镜高倍镜检，活细胞不着色，折光强；死细胞被染成蓝色，体积略膨大。