可变剪接分析PPT课件

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1、主要内容可变剪接介绍使用UCSCGenomebrowser分析可变剪接成因分析其它分析工具及数据库基因表达谱一、可变剪接介绍可变剪接(alternativesplicing)即一个mRNA前体通过不同的内含子去除方式可以获得不同成熟mRNA。可变剪接示意图可变剪接的生理意义可变剪接与基因表达的时空性息息相关，在不同时期，不同组织基因的表达形式可能不同，与物种发育的不同时期对应。可变剪接的调控与生物体的健康息息相关，其突变可以直接导致疾病。1.1可变剪接背景知识内含子剪接信号内含子剪接需要区分外显子及内含子，识别信号主要包括内含子5‘及3

2、’末端序列及中间分支点（branchsite）附近的序列。内含子剪接信号内含子5‘剪接点称为供体点（donorsite），3’剪接点称为受体点(acceptorsite)。内含子开始和末尾的两对碱基最为保守，大多数情况为GU-AG(约占99.24%),少数为GC-AG(约占0.7%),极少数为AT-AC（0.05%)。除了这两对保守碱基外，他们附近的碱基在不同物种间存在差异，但在物种内有保守性。如如脊椎动物5’剪接信号AGGUAAGU。内含子剪接信号分支点（branchsite）通常位于3‘剪接点上游50bp,处于一段富含嘧啶的区域，分

3、支点腺嘌呤附近区域为YNYURAY。剪接识别信号剪接体剪接由剪接体（spliceosome）催化完成。剪接体主要由几个核糖蛋白亚基组成，每个亚基都由RNA链和蛋白组成。另外还有几十个小多肽参与构成剪接体。剪接体分主要剪接体（majorspliceosome）和次要剪接体（minorspliceosome）。前者主要针对剪接信号为GU-AG模式的内含子，包括U1,U2,U4,U5,U6等亚基，后者主要对应AT-AC模式，由另外一组亚基组成。剪接过程，U1结合donorsite,U2结合branchsite,U4,U5,U6连结U1,U21

4、.2可变剪接的主要模式可变剪接主要有四种模式：内含子不切割5’或3’切点竞争外显子跳过外显子互斥可变剪接的主要模式内含子不剪切切点竞争外显子跳过外显子互斥可变剪接的结果由于采用不同的外显子，导致编码蛋白质的不同，有时会出现蛋白提前终止，起到分子开关的作用。1.3可变剪接的调控可变剪接的调控机制目前还不清楚。但越来越多的研究表明，可变剪接的调控是通过基因序列上的顺式作用元件和核内反式作用分子的相互作用进行的。可变剪接的调控主要的顺式作用元件有：ESE:exonsplicingenhancer外显子剪接增强子ISE:intronsplici

5、ngenhancer内含子剪接增强子ESS:exonsplicingsilencer外显子剪接沉默子ISS:intronsplicingsilencer内含子剪接沉默子反式作用因子SR蛋白因富含serine/arginine得名，该蛋白通常含有一至两个RNA识别模体（RRM，RNARecognitionMotif），羧基端有RS结构域（RS二肽富集区）。RRM负责介导RNA结合，决定各SR蛋白的底物特异性。RS结构域主要参与蛋白-蛋白相互作用。SR蛋白SR蛋白主要与外显子剪接增强元件ESE结合，通过直接招募剪接体蛋白或是拮抗剪接抑制因子

6、的作用来发挥作用。SR蛋白主要对5’位点的选择起作用：通过招募剪接体蛋白如U2AF或是U1-70K，在pre-mRNA的两个或多个5’可变剪接位点中促进选择使用距内含子3’端较近的5’位点。其它反式作用蛋白其它如hnRNP蛋白，多聚嘧啶序列结合蛋白(PTB)，CELF蛋白家族等等也有各自不同的调节作用。ESE与SR蛋白的作用模式可能是可变剪接调控中最普遍的调控形式。已有实验表明由于外显子中剪接增强子序列的突变不能与SR蛋白结合可以导致外显子的跳过（exonskipping）。二、可变剪接的分析可变剪接的分析主要包括剪接体序列的校正，剪接

7、体之间的比较，以及剪接机制的探索。剪接体序列的校正克隆试验得到的mRNA往往不是全长，测序反应也不能保证100%的正确，所以拿到一条序列首先要对其进行校正，尽可能保证使全长序列且无错误。校正可以通过剪接体序列与EST数据及基因组的比对进行。剪接体序列的校正与EST及基因组的比对可以到NCBI使用BLAST进行，根据多数原则进行修正。但这样做每次只能查看一条序列，没有一个总体的概念。因此我们推荐使用加州大学圣克鲁兹分校提供的GenomeBrowser进行。2.1UCSCGenomeBrowserGenomeBrowser是美国加州大学圣克

8、鲁兹分校（UniversityofCalifornia,SantaCruz）开发的一套基因组注释浏览工具。其特点是以基因组区域为单位把相关注释信息整合在一个直观的界面上。(http://genome.ucs