人参classiii几丁质酶gchi1基因克隆及原核表达分析

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1、农业与技术第33卷第12期2013年12月人参classIII几丁质酶Gchi1基因克隆及原核表达分析*王南，董园园，姚娜，刘秀明，王法微，李海燕(吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春130118）摘要：几丁质（N-乙酰氨基葡萄糖线性聚物）是病原真菌细胞壁的主要成分，几丁质酶通过破坏细胞新物质的沉积，激发寄主植物的抗病反应，使病原真菌细胞壁中的几丁质降解。植物几丁质酶具有广泛的生理活性。几丁质的酶基因工程成为目前抗真菌基因工程研究热点之一。本研究通过几丁质酶基因的克隆，构建原核表达载体pET-28a(+)-GchiI，利用IPTG诱导表达，

2、经PAGE分析表明，该基因表达的蛋白分子量为34kD左右，其表达产物主要以包涵体的形式存在。抑菌圈试验发现，IPTG浓度为0.6mmol/L时抑菌效果最佳。本研究对利用基因工程技术培育抗病作物品种，提高作物抗病性具有重要参考价值。关键词：人参；几丁质酶；基因；分析中图分类号：S567.51文献标识码：A1前言对pET-28a(+)质粒进行双酶切，然后进行去磷酸化处理，构几丁质（N-乙酰氨基葡萄糖线性聚物）是病原真菌细胞建重组载体pET-28a(+)-Gchi1。将此重组载体转化感受态大肠壁的主要成分，几丁质酶通过破坏病原真菌菌丝尖端新合成的杆菌，筛选阳性克隆并进行

3、PCR及酶切鉴定，将鉴定后质粒几丁质，使病原真菌细胞壁中的几丁质降解；破坏细胞新物质送至上海生工公司完成测序鉴定。的沉积，致使病原体死亡，且所产生的细胞壁碎片具有诱导作2.2.3目的蛋白的诱导表达及检测[1]用，可激发寄主植物的抗病反应。植物几丁质酶具有广泛的将含有表达载体pET-28a(+)-GchiI的大肠杆菌振荡培养至[2][3]生理活性，尤其在植物抗病方面具有重要作用。OD600=0.6时，加入终浓度分别为0.4、0.6、0.8和1.0mM/L的研究发现几丁质酶参与植物的发育调控：植物几丁质酶基因IPTG。30℃，200rpm/min振荡培养，诱导表达5h

4、后，离心收的表达具有组织特异性，参与了植物的发育调控。如几丁质酶参集菌体，菌体以含0.2mg/ml溶菌酶和10mMDTT的磷酸钠缓与了胡萝卜和云衫的体胚发育过程。几丁质参与共生作用：几丁冲液(20mM，pH7.2)悬浮，反复冻融4次，以超声波破碎后质酶可以降解固氮菌的结瘤因子，Minic等研究苜蓿中的几丁质的样品离心，收集上清液进行PAGE检测。酶对某些结瘤因子具有降解作用。所以几丁质酶通过控制结瘤因2.2.4目的蛋白活性鉴定子水平来使植物与根瘤菌达到共生平衡，而不产生过量的根瘤。目的蛋白对真菌的抑制采用透明圈法测定，将锈腐菌接种此外，几丁质酶对结瘤因子的降解具有

5、专化性，可能是决定根瘤到PDA培养基，使其在25℃下生长1周左右。用直径1cm沾[5]菌的寄主专化性的因素之一。本研究旨在通过构建几丁质酶表有上清液的滤纸放到菌丝边缘，以沾有无菌水的滤纸为对照，达载体制备几丁质酶，用于抗真菌等方面的相关研究。一周之后观察生长情况。以平板上菌落周围抑菌圈的有无和大2材料与方法小确定菌株是否诱导表达几丁质酶，以及所产几丁质酶的活性。2.1实验材料3结果人参由吉林农业大学基因工程实验室培育。大肠杆菌菌3.1人参Gchi1基因扩增及重组表达载体pET-28a(+)GchiI的鉴定株为DH5-α，原核表达载体pET-28a(+)、BL21均

6、是由吉林经PCR扩增的Gchi1基因片段经过1%琼脂糖凝胶电泳农业大学生命科学学院基因工程实验室保存。质粒小提试剂检测，结果图1A显示能够扩增出897bp大小的特异核酸片段盒、ExTaq酶、solutionI连接酶、限制性内切酶、分子量标准与预期相符。将构建的重组载体进行酶切鉴定后，能够获得约DL-2,000购自大连宝生物公司。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷897bp的大小的条带与预期结果相一致，结果见图1B。将菌落（IPTG）等均购自北京鼎国生物公司。植物基因组DNA小量PCR及双酶切检测均呈阳性的pET-28a(+)GchiI质粒进行测序，提取试剂盒、DNA切胶

7、回收试剂盒及清洁试剂为美国Axygene测序结果表明pET-28a(+)GchiI重组载体构建正确，且具有正公司产品。引物和测序均由上海生工公司完成。确的读码框。2.2实验方法2.2.1人参Gchi1基因扩增按GenBank中人参GchiI基因序列（GeneID:DQ532359）及pET-28a(+)原核表达载体的多克隆位点设计特异引物,并在引物两端分别加酶切位点。上游引物序列为5'CAATTAggATCCATggCATCTCATTTgTCg3’，含有XhoⅠ酶切位点（下划线）。下游引物序列为5'CTATATCTCgAgTCACACATCgCTCTTgAT3’含

8、有BamH