番茄自交系ynau335 对番茄斑萎病毒抗性的鉴定

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2016（5）：13-17中国蔬菜CHINAVEGETABLES研究论文番茄自交系YNAU335对番茄斑萎病毒抗性的鉴定11111112莫云容　张培欣　邓明华　杨正安　朱海山　张　宏　汤晓倩　文　玲31*马仲飞　赵　凯123（云南农业大学园林园艺学院，云南昆明650201；东川区经济作物技术推广站，云南东川654100；昭通市昭阳区园艺技术推广所，云南昭通657000）摘　要：番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）已成为近年来危害番茄生产的重要病害，鉴定和选育抗病品种是防治TSWV的有效途径。选取自主培育和引进的番茄品种（系），经过连续3a的大棚蓟马传毒和光照培养箱人工接种试验，鉴定番茄品种（系）对TSWV的抗性。结果表明，番茄自交系YNAU335对TSWV表现为免疫，其他品种全部表现为感病，而且在YNAU335人工接种和大田蓟马传毒叶片中并未克隆出TSWV核衣壳蛋白基因和小片段RNA3′端序列，而在其他感病品种（系）中均克隆出这2段序列。研究结果初步确定番茄自交系YNAU335为TSWV抗病品系，可作为TSWV抗病育种的番茄资源。关键词：番茄；番茄斑萎病毒；抗病育种；核衣壳蛋白基因；抗性鉴定番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，多个科1100多种单、双子叶植物，而且多种茄TSWV）是番茄斑萎病毒属（Tospovirus）中最重科园艺作物为TSWV的寄主（方琦等，2011；邱要的一种病毒，该病毒寄主范围广泛，可侵染100树亮等，2012；孙书娥等，2014；王立浩等，2016）。澳大利亚最早发现TSWV，随着传播介莫云容，女，硕士研究生，专业方向：蔬菜逆境抗性育种，E-mail：体西花蓟马的扩散，TSWV在世界大多数国家传moyunrong0408@aliyun.com播，并给当地番茄生产造成严重损失，已被列为*通讯作者（Correspondingauthor）：赵凯，博士，讲师，专业方向：蔬世界危害最大的十种植物病毒之一（张仲凯等，菜逆境抗性育种，E-mail：kailixian1023@aliyun.com1998；唐前君等，2010；曹金强等，2016）。种收稿日期：2015-12-09；接受日期：2016-03-04植者试图通过物理、化学和生物的方法控制蓟马基金项目：国家自然科学基金项目（31460525，31260481），云南省科技计划面上项目（2015FB144），云南省教育厅项目（2015Y187）来间接防治TSWV，但并不能有效抑制病毒的传cucumberwithdifferentconcentrationofMegestrolacetateand5kindsofhormones.TheresultsshowedthattherewerenochangesfoundinflowerandfruitunderMegestrolacetate.And2，4-Ddelayedthefloweringandkept-1flowerblooming.TherewasfasterfruitgrowthratiounderGA（100mg·L）treatment.Furthermore，corollaswerenotcompletelyexpandedunderNAAtreatment.However，therewereimprovementonfruitsettingandfruitexpansionunderchlorinepyrazoleureaandchlorobenzeneoxygenethanoicacidsodium.Theeffectivenessofsuitablehormoneconcentrationoncucumberfruitgrowthisinfollowingorder：chlorinepyrazoleurea＞chlorobenzeneoxygenethanoicacidsodium＞2，4-D＞NAA＞GA＞purewater(thecontrast).Amongthem，-1chlorinepyrazoleurea（10mg·L）dippingtreatmenthadthebesteffectoncucumberfruitgrowth，andits-1hormoneresiduedetectionwasincompliancewithEUstandard（0.01mg·kg）。Keywords：Cumber；Hormone；Dippingflower；Growth；Quality—13—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org 研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES播（Soleretal.，2003）。目前防治TSWV经济、绿小片段RNA3′端序列克隆引物参照尹跃艳等色、有效的方法是培育TSWV抗病品种（Gordillo&（2013）合成：上游5′-TCACTGTAATGTTCCATStevens，2008）。AGCAA-3′，下游5′-AGAGCAATYGTGTCAATTT抗TSWV的番茄资源主要分布在秘鲁番茄和TATTC-3′。PCR反应体系：PrimeSTARMaxPremix智利番茄等野生番茄中，这两类番茄对TSWV的抗（2×）25μL，上下游引物各1μL，cDNA模版1性分别由不同的质量抗病基因控制（Stevensetal.，μL，加灭菌ddH2O至50μL。PCR反应条件：981991；Gordillo&Stevens，2008）。利用抗病品种中℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火5s，72质量抗病基因及连锁的分子标记，国外研究者已℃延伸1min，40个循环；最后72℃延伸5min。选育出一系列TSWV抗病品种（Aramburuetal.，跑胶回收，连接克隆载体，筛选阳性菌落并摇菌，2010；Lopezetal.，2011）。由于抗病基因对TSWV交于深圳华大基因科技服务有限公司进行测序，最有株系特异性，国外抗病品种对国内TSWV并不一后使用MEGA6.0构建TSWV核衣壳蛋白基因系统定有抗性。因此，选育适合国内TSWV抗病品种的进化树。工作显得迫切而重要。1.3.3　TSWV人工接种、大田蓟马传毒及抗性评价光照培养箱育苗前需充分灭菌，以保证培育的番1　材料与方法茄苗健康，不携带任何病害。光照培养箱育苗，1.1　试验田概况待幼苗长出10片真叶后，分两批处理，一批栽试验大棚位于云南农业大学教学实验农场蔬菜至大棚填有无土基质的水泥种植槽中，每个种植认知中心，棚内、棚外于2013年和2014年连续两槽宽50cm、长6m，作为一个小区，每个小区种年发生TSWV。植20株番茄，株距50cm，行距40cm，随机区组1.2　试验材料与试剂排列，3次重复，自然条件下，利用大棚内带毒供试材料为云南农业大学园林园艺学院番蓟马接种感病；另一批参照唐前君等（2010）的茄辣椒课题组选育的品种（系）6份：5号自交接种方法给番茄叶片接种TSWV，每个番茄自交系、YNAU335自交系、云杂8号、云抗1号、滇系选取10株，3次重复，以接种磷酸缓冲液为对番茄23号、滇番茄26号；引自亚洲蔬菜研究发照（CK）。展中心的自交系1份：CLN2037E。TSWV株系为因目前没有公开的TSWV病情指数调查标准，YNAU2015。而TSWV发病叶片上有典型的黑色坏死斑点，因此RNA提取试剂盒购于北京华越洋生物科技有本试验参考都业娟（2013）番茄坏死条斑病的病情限公司，cDNA反转录试剂盒（货号：RR047A）和指数调查方法，并加以修改。分别于光照培养箱人PCR高保真酶PrimeSTARMaxDNAPolymerase（货工接种20d后和大田移栽30d后根据病情分级标号：R045A）购于宝生物工程（大连）有限公司，准（表1）调查发病率和病情指数。克隆载体pEASY-BluntCloningVector购于北京全式发病率（%）=（发病株数/处理总株数）×100金生物技术有限公司，PCR引物由上海英骏生物技病情指数=〔∑（各级病株数×各级代表数）/（调术有限公司合成。查总株数×最高级数）〕×1001.3　试验方法表1　番茄斑萎病毒病分级标准1.3.1　RNA的提取及反转录　番茄叶片总RNA提分级级数TSWV的发病症状０无症状取及反转录按照试剂盒说明书进行。Ⅰ叶片上有不太明显的古铜色（黑色）小斑点1.3.2　RT-PCR引物设计、PCR程序、测序Ⅱ叶片上古铜色（黑色）的坏死斑点连成小片及序列比对　TSWV核衣壳蛋白基因全长序列Ⅲ植株叶片上病斑连成片，近2/3叶面积干枯坏死克隆引物参照唐前君等（2010）合成：上游Ⅳ全株干枯坏死5′-ATGTCTAAGGTTAAGCTCACTAAG-3′，下游1.3.4　数据处理　运用Excel软件计算数据的平均5′-TYAAGCAAGTTCTGYGAGTTTTGCC-3′。TSWV值及标准偏差，并作出柱形图；利用SPSS10.0软—14—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org 中国蔬菜CHINAVEGETABLES研究论文件中独立样本T检验比较各处理值与对照值差异的YNAU335对TSWV表现为免疫，其他品种（系）显著性。全部感病甚至绝收（图1）。选取5号、YNAU335和CLN2037E自交系统计发病率和病情指数：2　结果与分析YNAU335的TSWV发病率和病情指数都为0；5号2.1　大棚自然感病条件下番茄对TSWV的抗性鉴定和CLN2037E自交系发病率均为100%，病情指数经过连续3a大棚自然感病鉴定，自交系分别为53.3和46.3。YNAU335YNAU3355号CLN2037E5号CLN2037E图1　田间番茄对TSWV的抗性鉴定2.2　人工接种TSWV的番茄抗性鉴定核衣壳蛋白基因和小片段RNA3′端序列，结果在人工接种TSWV后，除了自交系YNAU335，5号与CLN2037E叶片中均克隆出这2个核酸片其他品种（系）都表现感染TSWV的典型症状，而段，而在YNAU335中却未克隆出（图3）。进一步且植株生长被严重抑制（图2）。自交系YNAU335测序发现，5号和CLN2037E自交系中核衣壳蛋白的TSWV发病率和病情指数均为0，表现为免疫；基因和小片段RNA3′端序列完全相同，大小分别而5号和CLN2037E自交系的发病率分别为65%、为781bp和865bp。选取核衣壳蛋白序列构建系60%，病情指数分别为36.7、29.2，表现为感病。统进化树（图4），发现TSWV分离物YNAU20152.3RT-PCR鉴定番茄对TSWV的抗性及TSWV与来自昆明（AEK28762）（尹跃艳等，2013）和株系的确定意大利（ADB96076）的分离物的核衣壳蛋白序列分别选取大田和人工接种的5号、CLN2037E完全相同，而与另一个来自昆明的TSWV分离物和YNAU335自交系的叶片，RT-PCR克隆TSWV（HM594685）核衣壳蛋白（唐前君等，2010）的CLN2037E5号YNAU335121212CLN2037E5号YNAU335121212图2　番茄TSWV的人工接种抗性鉴定1，接种磷酸缓冲液（CK）；2，接种TSWV缓冲液。—15—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org 研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLESM123M456M123M4562000bp1000bp750bp500bp250bp100bpAB图3　番茄叶片TSWV核衣壳蛋白基因和小片段RNA3′端序列凝胶电泳结果A，大田自然感病番茄；B，人工接种番茄。M，Marker2000；1，5号自交系TSWV核衣壳蛋白基因；2，CLN2037ETSWV核衣壳蛋白基因；3，YNAU335TSWV核衣壳蛋白基因；4，5号自交系TSWV小片段RNA3′端序列；5，CLN2037ETSWV小片段RNA3′端序列；6，YNAU335TSWV小片段RNA3′端序列。克隆出任何条带（文章未列出），说明YNAU335对TSWV的抗性并不是由Sw-5基因控制。由于目前没有发掘出与Sw-7基因连锁的分子标记，课题组还不能确定YNAU335对TSWV的抗性是否是由Sw-7控制，后期还需继续研究YNAU335的抗性遗传机理。随着Sw-5基因的发现，国外选育了一系列抗TSWV番茄品种（Stevensetal.，1991；Spassova图4TSWV核衣壳蛋白序列的系统进化树etal.，2001）。TSWV生理小种存在地理差异性，同源率为98.84%，有3个氨基酸残基突变。而抗病品种中的抗病基因具有小种特性抗性，国外3　结论与讨论选育的抗病品种并不一定适合中国。最近几年，TSWV对国内番茄的危害日益严重，因此，选育番茄品种拉比作为YNAU335的亲本，引自以适合我国的抗病品种显得尤为重要。YNAU335对色列，由先正达公司选育，于2006～2009年在云TSWV表现为免疫，而且农艺性状良好，植株生长南番茄主产区元谋县国家科技综合示范园试种推健壮，为无限生长型，果实红色，最大单果质量可广，拉比除了具有稳产、优质等优良性状外，其他达335g，可用于今后番茄抗TSWV育种中。病毒病发病率为0（赵俊等，2011）。本课题组以拉比为亲本，经过连续7代自交，选育出纯合自交参考文献系YNAU335。课题组2012年偶然发现YNAU335曹金强，谢学文，柴阿丽，李宝聚．2016．番茄斑萎病毒病在宁夏可能对TSWV有抗性，2013～2015年连续3a对的发现与防治．中国蔬菜，（4）：87-89．YNAU335进行系统的抗性鉴别，以确定其对TSWV都业娟．2013．新疆番茄病毒病及植原体病害的研究〔博士论的抗性。文〕．石河子：石河子大学．方琦，董家红，丁铭，尹跃艳，张丽珍，李婷婷，苏晓霞，李展，目前TSWV抗病资源主要集中在秘鲁番茄和张仲凯．2011．侵染水鬼蕉花朱顶红的番茄斑萎病毒属病毒的智利番茄等野生番茄中，抗性遗传规律分别由显性电镜和DAS-ELISA诊断．园艺学报，38（10）：2005-2009．质量基因Sw-5和Sw-7控制，而且2个基因并不连邱树亮，王孝宣，杜永臣，高建昌，国艳梅，朱德蔚，胡鸿，李宝锁，打破Sw-5抗性的TSWV突变生理小种并不能聚，石延霞．2012．番茄斑萎病毒TSWV的鉴定及抗病种质的筛选．园艺学报，39（6）：1107-1114．打破Sw-7基因（Boiteux&Giordano，1993；Canady孙书娥，李萌，朱春晖，谭新球，刘勇，张德咏．2014．番茄斑etal.，2001；Hoffmannetal.，2001）。本课题组使用萎病毒YN-1株系GN/Gc基因的克隆与分析．植物保护，40与Sw-5连锁的共显性SCAR标记（Dianeseetal.，（1）：65-69．2010），对自交系YNAU335进行分析，结果并未唐前君，孙书娥，刘勇，谭新球，肖启明，谢丙炎，张德咏．2010．—16—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org 中国蔬菜CHINAVEGETABLES研究论文番茄斑萎病毒核衣壳蛋白基因的克隆与分析．植物保护，36specific，co-dominantSCARmarkerforassisted-selectionofthe（5）：65-69．Sw-5（Tospovirusresistance）geneclusterinawiderangeoftomato王立浩，张正海，毛胜利，曹亚从，堵玫珍，张宝玺．2016．甜椒accessions．MolecularBreeding，25（1）：133-142．抗番茄斑点萎蔫病毒的种质创新．中国蔬菜，（2）：19-23．GordilloLF，StevensMR．2008．ScreeningtwoLycopersicon尹跃艳，董家红，徐兴阳，端永明，张仲凯．2013．昆明番茄斑萎peruvianumcollectionsforresistancetoTomatospottedwiltvirus．病毒不同分离物N基因遗传多样性分析．西南农业学报，26PlantDisease，92（5）：694-704．（1）：159-162．HoffmannK，QiuWP，MoyerM．2001．Overcominghostand张仲凯，方琦，吴自强，何云昆，李云海，黄兴奇．1998．云南主pathogen-mediatedresistanceintomatoandtobaccomapstothe要茄科作物病毒种类及其分布．云南大学学报：自然科学版，MRNAofTomatospottedwiltvirus．MolecularPlantMicrobe20（2）：128-131．Interactions，14（2）：242-249．赵俊，杨向东，木万福，陈光平，唐正富，杨龙，杨长楷．2011．LopezC，AramburuJ，GalipiensoL，SolerS，NuezF，RubioL．2011．高抗病毒病番茄新品种拉比．中国蔬菜，（1）：39．EvolutionaryanalysisoftomatoSw-5resistance-breakingisolatesofAramburuJ，GalipiensoL，SolerS，LopezC．2010．CharacterizationTomatospottedwiltvirus．JournalofGeneralVirology，92（1）：ofTomatospottedwiltvirusisolatesthatovercometheSw-5210-215．resistancegeneintomatoandfitnessassays．PhytopathologiaSolerSJ，Cebolla-CornejoJ，NuezF．2003．ControlofdiseaseMediterranea，49（3）：342-351．inducedbyTospovirusesintomato：anupdateofthegeneticBoiteuxLS，GiordanoLDB．1993．Geneticbasisofresistanceagainstapproach．PhytopathologiaMediterranea，42（3）：207-219．twoTospovirusspeciesintomato（Lycopersiconesculentum）．SpassovaM，PrinsTW，FolkertsmaRT，Klein-LankhorstRM，Euphytica，71（1-2）：151-154．HilleJ，GoldbachRW．2001．ThetomatogeneSw5isamemberCanadyMA，StevensMR，BarineauMS，ScottJW．2001．Tomatoofthecoiledcoil，nucleotidebinding，leucine-richrepeatclassofspottedwiltvirus（TSWV）resistanceintomatoderivedfromplantresistancegenesandconfersresistancetoTSWVintobacco．LycopersiconchilenseDun．LA1938．Euphytica，117（1）：MolecularBreeding，7（2）：151-161．17-25．StevensMR，ScottSJ，GergerichRC．1991．InheritanceofageneforDianeseEC，FonsecaMEN，GoldbachR，KormelinkR，Inoue-resistancetoTomatospottedwiltvirus（TSWV）fromLycopersiconNagataAK，ResendeRO．2010．Developmentofalocus-peruvianumMill．Euphytica，59（1）：9-17．ResistanceIdentificationofTomatoInbredLine‘YNAU335’toTSWV11111MOYun-rong，ZHANGPei-xin，DENGMing-hua，YANGZheng-an，ZHUHai-shan，ZHANG11231*Hong，TANGXiao-qian，WENLing，MAZhong-fei，ZHAOKai12（CollegeofLandscapeandHorticulture，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，Yunnan，China；Dong-3chuanDistrictCashCropsTechnologyExtensionStation，Dongchuan654100，Yunnan，China；HorticulturalTechnologyExtensionStationofZhaoyangDistrict，Zhaotong657000，Yunnan，China）Abstract：Recently，Tomatospottedwiltvirus（TSWV）hasbecomeaseriousdiseasehazardingtomatoproduction.Identificationandselectivebreedingofdisease-resistantvarietiesisaneffectiveapproachtocontrolTSWV.Thisexperimentselectedtomatovarieties（lines）bredbyourgroupandintroducedfromothercountries，throughvirustransmissionbythripsingreenhouse，andartificialinoculationinilluminationincubatorfor3consecutiveyearstoidentifythediseaseresistanceagainstTSWV.Theresultsindicatedthatinbredline‘YNAU335’wasimmunetoTSWV，whiletheothervarietieswereallsusceptibletoTSWV.Furthermore，thenuclearproteingeneandsmallRNA3′flanksequencesofTSWVinleavesof‘YNAU335’werenotcloned.Onthecontrary，these2sequenceswereclonedinothertomatoleaves.Theresultspreliminarilydemonstratedthat‘YNAU335’wasresistanttoTSWV，andcouldbeusedasdiseaseresistanttomatoresourceinresistantbreedingagainstTSWV.Keywords：Tomato；Tomatospottedwiltvirus；Diseaseresistantbreeding；Nucleocapsidproteingene；Resistanceidentification—17—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org