间歇低氧对肝脏损伤机制及自噬在肝脏中作用机制的探讨-硕士论文

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1、分类号：R56学校代码：10062密级：学号：2012601124学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：间歇低氧对肝脏损伤机制及自噬在肝脏中作用机制的探讨TITLEInvestigationofthemolecularmechanismoofIHinducedhepaticinjureandtheeffectofautophagyinLiver一级学科：临床医学二级学科：内科学呼吸系病论文作者：邵红霞指导教师：吴琦教授导师组成员：孙昕主任医师陈怀永研究员天津医科大学研究

2、生院二〇一六年五月中文摘要目的：阻塞性睡眠呼吸暂停（Obstructivesleepapnea，OSA）是常见的呼吸系统疾病，据统计有超过10%的人群罹患此病。OSA对于身体的严重危害及致死率增加，主要是因为OSA常合并糖尿病，代谢综合征，心血管系统疾病等。目前很多证据显示，由于OSA患者发生了气体交换障碍（反复低血氧和高碳酸血症）的病生理改变，即慢性间歇低氧（chronicintermittenthypoxia，CIH），导致前炎症因子产物增多，血管内皮功能紊乱，氧化应激，代谢调节异常和胰岛素抵抗等。因为肝脏在人体是十分重要的代谢器官

3、，肝细胞对各种内源性和外源性刺激如病毒感染、炎症、营养等非常敏感，现有很多报道OSA与肝脏的非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）有关。本研究旨在通过间歇低氧动物模型探讨间歇低氧引起的肝脏损害，对肝脏药物代谢酶细胞色素酶P450（CytochromeP450，CYPs）的影响及作用机制，从自噬角度对间歇低氧的作用做了进一步探讨。我们的实验证实糖皮质激素受体（glucocorticoidreceptor，GR）对大鼠肝脏细胞色素酶P450（Cyps）的表达有重要的调控作用，并且对自噬有

4、一定影响，所以我们又通过人的正常肝细胞LO2细胞初步探讨糖皮质激素在人肝脏细胞CYPs代谢的影响及自噬中的作用。方法：1.建立间歇低氧（intermittenthypoxia，IH）大鼠模型，将30只大鼠采用随机数字表法随机分为2组（按照每组15只分组）：IH组和对照组。2.大鼠肝脏组织进行固定、包埋、病理切片，然后进行苏木素-伊红(HE)染色，观察肝组织形态学改变。3.通过实时定量PCR方法测定炎症因子、Cyps、NF-κB、核受体的相对基因表达量。4.使用实时定量PCR法分析肝脏自噬相关蛋白的基因表达。5.将人正常肝细胞LO2肝细胞

5、进行常规培养，然后传代，将传代细胞按顺序分别接种于6孔板，根据加入药物不同，分为对照组，糖皮质激素（地塞米松，DEX）组和糖皮质激素+糖皮质激素受体拮抗剂（DEX+R）组；对照组：正常细胞培养；DEX组：加入地塞米松进行培养；DEX+R组：在DEX组基础上加用糖皮质激素受体拮抗剂。I6.通过倒置显微镜观察人肝细胞LO2细胞形态的改变及生长情况变化并进行拍照。7.通过实时定量PCR方法测定肝细胞LO2细胞Cyps的相对基因表达量。8.使用实时定量PCR法分析测定肝细胞LO2细胞自噬相关蛋白的基因表达。结果：1.对照组和间歇低氧组大鼠肝组织

6、病理形态学改变：对照组：肝小叶结构完整，窦状隙及汇管区未见明显增宽及结构紊乱，肝细胞胞膜完整，胞质丰富，胞核形态正常，与正常肝组织无差异；间歇低氧组：肝小叶结构完整，窦状隙呈轻度增宽，肝细胞结构完整，汇管区可见少许炎细胞浸润，以淋巴细胞为主，少许肝细胞胞质稀疏。2.肝组织炎症介质mRNA相对表达量的改变：IH组IL-1β、IL-6、TNFαmRNA相对表达量较对照组升高。3.肝组织NF-κBmRNA相对表达量的改变：IH组NF-κBmRNA相对表达量较对照组显著升高。4.核受体mRNA相对表达量的改变：IH组PXR、GR、CARmRNA

7、相对表达量较对照组下调。5.细胞色素氧化酶P450（Cyps）mRNA相对表达量的改变：IH组Cyp1A2、Cyp2D4、Cyp3A2mRNA相对表达量较对照组下降有统计学差异；Cyp2C9、Cyp2C19mRNA相对表达量与对照组相比无明显差异。6.细胞自噬相关基因（Atg）相对表达量的改变：IH组与对照组相比，AMPK，mTOR，Beclin1，Atg5，Atg12，Atg13，ULK1均有相应改变但无统计学意义，LC3与WIPI的变化有统计学意义。7.肝LO2细胞生长情况：地塞米松组LO2细胞生长变形，呈梭形生长，而加入糖皮质激素

8、受体拮抗剂组，LO2细胞生长与对照组相同，为正常细胞形态。8.肝LO2细胞Cyps表达：通过荧光实时定量PCR详细阐述了各组人细胞色素酶P450（hCYP450）中hCYP1A2、hCYP2C9、hCYP2