论如何确立甘草细胞培养物黄酮含量测定方法

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1、论如何确立甘草细胞培养物黄酮含量测定方法摘要:目的建立一种简单快速测定甘草细胞培养物中黄酮含量的方法。方法采用超声乙醇浸提法提取黄酮类物质，根据悬浮培养的甘草细胞中黄酮成分的结构和光谱特性，利用10％氢氧化钾为显色剂，在410nm波长处测定样品中黄酮含量。结果吸光度值与黄酮含量呈良好线性关系（r=0.9994）；回收率为98.08%，RSD为1.6%（n=5）；测定结果在80min内稳定。结论该方法操作简便、耗时少，可快速测定甘草培养物中黄酮含量。关键词:甘草悬浮培养黄酮分光光度法Abstract：ObjectiveAspectrophotometrymetho

2、dfordeterminationofflavonoidsinthesuspensioncelloflicoriceogenicagentandabsorbanceinedetryat410nm.ResultsTheresultsshog/ml(r=0.9994)andtheaveragerecoveryethodissimple,convenientandsuitablefordeterminationofflavonoidsinthesuspensioncelloflicorice.Keyetry　　药用甘草为豆科甘草属多年生草本植物，以根和茎入药。临床及药

3、理研究证明，甘草中主要药用成分之一的黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌、抗衰老、抗氧化以及美白的作用［1～3］。由于掠夺性采挖，天然甘草资源已严重匮乏，而人工栽培周期长，占用土地资源。因此，一个很有前景的办法就是通过细胞大规模培养生产甘草黄酮及其它次生代谢物。目前，在甘草愈伤组织诱导与分化方面已有不少报道，而有关悬浮培养获得甘草黄酮的研究较少。其中有关黄酮类化合物的测定方法主要有高效液相色谱法［4］和比色法［5］。前者主要用于测定单一黄酮类成分；后者用于测定总黄酮。比色法大多采用亚硝酸钠－铝盐显色体系测定，此方法较繁琐耗时且不适用于缺少邻二酚羟基的黄酮类化合物的测定［

4、6］。本实验根据甘草细胞培养物中黄酮化合物主要成分的结构特征和光谱特性，利用10%氢氧化钾为显色剂，芦丁为标准品，测定甘草细胞培养物中黄酮含量，该方法简单快速，为甘草细胞次生代谢调控和大规模培养研究过程中黄酮的检测提供了便可靠的方法。现报道如下。1材料与方法　1.1器材甘草悬浮细胞，由新疆胀果甘草GlycyrrhizainflataBat.种子萌发的下胚轴诱导得到愈伤组织，建立其悬浮细胞系，本实验室保存。UV-2100型紫外可见分光光度计（UNICOCORPORATION），KQ-100DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），离心机（SIGMA）。芦丁

5、（SIGMA），氢氧化钾,亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，乙醇等均为分析纯。　1.2供试样品溶液的制备准确称取60℃干燥至恒重，研磨并过100目筛X的甘草悬浮培养细胞0.5g，加75%乙醇15m1，超声提取60min。取出，放冷至室温，补足损失溶液。取提取液5ml于5000r/min转速下离心5min后，取上清液2.5ml于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。　1.3悬浮培养甘草细胞黄酮成分定性分析参照文献［7，8］进行显色反应，并按文献［5］利用亚硝酸钠－铝盐为显色剂对供试液显色并在400～500nm波长进行扫描。　1.4悬浮培养甘草细胞黄酮

6、含量测定　　1.4.1检测波长的选择准确吸取标准品溶液、供试品溶液各1ml，分别置10ml容量瓶中。将两份溶液分别标记为1，2号，按标准曲线制备显色溶液，并在200～500nm波长间进行扫描。　　1.4.2标准曲线的制备准确称取60℃干燥至恒重的芦丁对照品50.0mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。准确吸取5ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准品溶液。准确量取标准品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分别置于10ml试管中，再各加0.5ml10%KOH溶液，充分摇匀显色5min后，用甲醇定容至10ml，摇匀，用

7、UV-2100分光光度计测定其在410nm处的吸收值。以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线。1.4.3精密度、加样回收率及稳定性实验取同一批甘草细胞培养物分别制备5份样品溶液，按标准曲线方法显色，在410nm处测定吸光度值，考察精密度；准确量取已知黄酮含量的1ml提取液5份，分别加入一定量的芦丁标准品，按标准曲线制作方法显色，测定吸光度计算黄酮含量，得出回收率；将已测样品于室温放置10，20，40，80min后，测定样品吸光度，考察稳定性。2结果　2.1悬浮培养甘草细胞黄酮成分定性分析通过黄酮类化合物特有的显色反应能够定性地判断其含有的成分。悬浮培养甘

8、草细胞供试液进行的显色反