ebv lmp2a和bzlf1融合基因重组腺病毒表达载体的构建

《ebv lmp2a和bzlf1融合基因重组腺病毒表达载体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、EBVLMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建【摘要】目的构建EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸（SOE）技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接，构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrackCMV质粒上，在原核细胞E.coliBJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy1的同源重组，构建融合基因Z2A真核表达载体

2、pAdZ2A。经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAdZ2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切，电泳后可观察到长31kb和4.5kb两条DNA条带，测序鉴定结果表明序列正确；从感染重组腺病毒vAdZ2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBVLMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体，为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。【关键词】疱疹病毒4型人潜伏膜蛋白2A基因BZLF1基因融合表达载体［ABSTRACT］ObjectiveToconstructZ2Are

3、binantadenovirusvectorandstudytheeffectofZ2AexpressiononEBVassociatedtumor.MethodsBothLMP2AandBZLF1cDNAB958celllinebyRTPCR,andthefusiongene(LMP2AlinkerBZLF1)id,293cellsentsonstratedthatZ2Ahadinsertedintheexpectedsiteandtheinsertionsequencean;LMP2A;gene,BZLF1;genefusion;exp

4、ressionvectorEB病毒（EBV）是具有B淋巴细胞嗜性的疱疹病毒，为重要的DNA致瘤病毒，与多种人类恶性肿瘤,如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌（NPC）、何杰金病、免疫缺陷病人的B淋巴细胞瘤、胃癌及肝癌等的发生有关。EBV对宿主细胞的感染有潜伏感染和裂解期感染两种类型。研究表明，EBV阳性癌组织中主要以潜伏感染的形式存在，EBV基因组存在于几乎所有的癌细胞，因此可以EBV基因组或编码产物为靶点对EBV相关肿瘤进行特异性治疗[1～3]。本研究拟将EBV潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)进行融合，进而构建融合基因的重

5、组腺病毒表达载体，为进一步探讨融合基因表达对EBV阳性肿瘤细胞增殖的影响提供实验基础。现将结果报告如下。1材料和方法1.1主要试剂、质粒和细胞株本文T4DNA连接酶、λDNA/HindⅢ、DL2000Marker、限制性内切酶EcoRⅤ、BglⅡ均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA转染试剂盒lipofectamine2000购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒为Promega公司产品。携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV，E1区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdeasy1，大肠杆菌BJ5183和DH10

6、B以及人胚肾293细胞由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。EBV阳性B958细胞系日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。1.2引物设计根据LMP2A和BZLF1开放读码框序列[4，5]，DNAStar软件设计扩增EBVLMP2A和BZLF1基因的特异性引物，并在LMP2A上游引物的5′端引入BglⅡ酶切位点和保护性碱基GGC，下游引物3′端删除终止密码TAA，引入linker；BZLF1下游引物5′端引入EcoRⅤ酶切位点和保护性碱基GC，上游引物3′端引入linker。linker(Gly4Ser)3为编码15个

7、氨基酸组成的疏水性多肽的DNA序列，序列为5′GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGC3′。LMP2A上游引物P1序列为：5′GGCAGATCTATGGGGTCCCTAGAAATGGTG3′，下游重叠引物P2序列为：5′GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCTACAGTGTTGCGATATGGGGT3′。BZLF1上游重叠引物P3序列为：5′GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCA

8、GCATGATGGACCCAAACTCGAC3′，下游引物P4序列为：5′GCGATATCTTAGAAA