融合基因gmcsfbzlf1重组腺病毒表达载体的构建

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1、融合基因GMCSFBZLF1重组腺病毒表达载体的构建：崔瑛王云刘成玉张东峰【摘要】目的构建粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和EB病毒即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法采用逆转录聚合酶链反应分别获得GMCSF和BZLF1编码序列的cDNA，应用剪接式重叠延伸(SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接，构建融合基因GMCSFBZLF1。将融合基因GMCSFBZLF1定向亚克隆至pAdTrackCMV质粒，在原核细胞E.coliBJ5183中完成穿梭质粒与骨架

2、质粒pAdEasy1的同源重组，构建融合基因GMCSFBZLF1真核表达载体pAdGMCSFBZLF1。将真核表达载体pAdGMCSFBZLF1转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAdGMCSFBZLF1。RTPCR鉴定感染重组腺病毒的293细胞中GMCSFBZLF1基因的表达。结果GMCSFBZLF1基因插入重组腺病毒表达载体的预期位置，且插入序列完全正确;感染重组腺病毒vAdGMCSFBZLF1的293细胞中检测到融合基因GMCSFBZLF1的转录表达。结论成功地构建了融合基因GMCSF

3、BZLF1重组腺病毒表达载体，为进一步探讨GMCSFBZLF1的功能提供了理论基础和实验依据。【关键词】疱疹病毒4型，人;粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;基因，即早;基因融合;遗传载体[ABSTRACT]ObjectiveToconstructhumangranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF)geneandEBVencodingimmediateearlygenes(BZLF1)fusedtoGMCSFBZLF1geneandthefusiongenerebinanta

4、denovirusexpressionvector.MethodsGMCSFcDNAandBZLF1cDNAid.TheshuttleplasmidandthebackboneplasmidpAdEasy1ologouslyinE.coliBJ5183cells,thenfusiongeneeukaryoticexpressionvectorpAdGMCSFBZLF1onstratedthatGMCSFBZLF1geneinsertedintheexpectedsiteintherebinantadenovirusexpress

5、ionvectorandtheinsertionsequenceightfurnishtherationaleandexperimentalevidenceforfurtherstudyonthefunctionofGMCSFBZLF1gene.　　[KEYCSF)主要由T细胞和巨噬细胞产生，是一种具有多种生物学活性的细胞因子，将GMCSF基因转入肿瘤细胞内，可以提高其免疫原性从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答[6]。本研究拟将GMCSF编码基因和BZLF1进行融合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体，深入探讨融合基因表达对EBV阳性肿

6、瘤细胞增殖的影响，从而为基因联合治疗EBV相关肿瘤提供实验基础和理论依据。　　1材料和方法　　1.1主要试剂、质粒和细胞系　　限制性核酸内切酶EcoRⅤ和BglⅡ，T4DNA连接酶，DL10000DNAMarker，DL2000DNAMarker，TaqDNA聚合酶，均购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA转染试剂盒Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。DMEM培养液、TRIzol、胎牛血清购自美国GIBCO公司。反转录酶为Promega公司产品。QIAEXⅡ纯化试

7、剂盒购自QIAGEN公司。携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV，E1区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdEasy1，大肠杆菌BJ5183和DH10B以及人胚肾293细胞，由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。EBV阳性B958细胞系日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。　　1.2引物设计　　根据GMCSF和BZLF1开放读码框序列，以DNAStar软件设计扩增人GMCSF和EBVBZLF1基因的特异性引物，并在GMCSF上游引物的5′端引入BglⅡ酶切位点和保护性碱基

8、GA，下游引物3′端删除终止密码TGA，引入linker;BZLF1下游引物5′端引入EcoRⅤ酶切位点和保护性碱基GC，上游引物3′端引入linker。linke