lrp16基因启动子活性分析

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1、LRP16基因启动子活性分析【摘要】本研究的目的在于分析LRP16基因不同启动子区域的活性，为深入研究LRP16基因的表达调控机制奠定基础。在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRP16基因转录起始位点5’侧翼区2.7kb的基因组序列，设计PCR引物，从健康外周血单个核细胞中克隆和亚克隆了LRP16基因的启动子分子，对各个长度相差400bp左右的亚克隆启动子片段调控荧光素酶表达的作用强度进行比较分析。结果获得了与GeneBank序列一致、长度为2.6kb的LRP16基因启动子DNA序列，其主要调控序列在

2、LRP16基因转录起始位点5’侧翼区的-200至-600bp。结论：LRP16基因启动子是一个典型的Ⅱ型启动子，其启动子活性在-200至-600bp区域最强。【关键词】基因表达　　AnalysisofLRP16GenePromoterActivity　　AbstractThestudyedtoanalyzethecharacteristicsofLRP16genepromoteranditsactivityinordertoexplorethepossibleregulationmechanismofLRP

3、16geneexpression.A2.6kbgenomicDNAsequenceofLRP165’-endNCBIbyBLASTsoftahealthyblooddonorDNAsampleplifiedbyPCR，thenidentifiedbyDNAsequencingandsemi-nestPCR.Theverifiedsequenceseachother.All7sequencesetotheseGenBankdescribed.Atlast，all7promotersequencesoterse

4、quencecanbefreelyobtainedfromNCBIdatabase.ItisconcludedthatLRP16promoterisastandardtypeⅡpromoteranditsactivityisstrongestintheregionfrom-200to-600bp.　　Keyoter；geneexpressionLRP16基因是于力等利用限制性酶切基因扫描（restrictionlandmarkgenomicscanning，RLGS）和cDNA末端快速扩增(rapidamp

5、lificationofcDNAend，RACE)技术克隆到的一条白血病相关基因［1-3］。该基因定位于第11号染色体长臂11区，其编码的基因翻译产物是一种核蛋白。此外通过SAGE（serialanalysisofgeneexpression）数据库分析还发现，LRP16基因在多种性激素相关的肿瘤中均有高表达［4］，提示LRP16基因与肿瘤发生密切相关。通过在乳腺癌细胞系中的研究发现，LRP16基因是一个雌激素受体β调控的下游基因［5］，作为进一步研究LRP16基因表达调控、活性及其生物学作用的前期工作，我

6、们克隆了LRP16基因启动子，并对LRP16基因启动子区域近2.7kb的DNA序列进行了分析。　　材料和方法　　主要试剂与仪器　　FPROGO2D型PCR仪（TechnolCambridgeLtd.公司产品）。质粒提取试剂盒（iniprepsDNAPurificationSystem产品），PCR产物回收试剂盒（-TEasyVector，Superfecttransfectionreagent，TD-20/20型Luminometer荧光素酶检测仪。　　人类基因组DNA的提取及引物设计　　选用健康献血员的

7、外周血分离单个核细胞，常规方法提取基因组DNA，并用HindIIIDNA酶切处理。　　LRP16启动子及亚克隆启动子序列钓取及引物设计　　LRP16启动子、亚克隆启动子序列的钓取以LRP16基因cDNA序列全长作为探针，在NCBI(http://.ncbi.nlm.nih.gov/)的HumanGenomicDatabase(.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中利用Blast程序进行搜索，下载并截取LRP16基因5’侧翼2.7kb基因组DNA序列。　　引物设计利用Primer软件包设计9个

8、上游引物和1个下游引物（上海生工生物工程公司合成），其中每个亚克隆启动子的序列长度相差0.4kb左右，引物名称和序列如下（括号内数字表示的是扩增产物长度，英文字母表示酶切位点，相对应的PCR产物分别为S0-S6）：　　LRP16基因启动子-荧光素酶报道重组子的构建　　采用上述引物扩增出7条3’端平齐，5’端不等大小相差200bp左右的启动子和亚克隆启动子DNA片段，将此片段克隆纯化并插入pGL3-Basic质粒构