玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响

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1、玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响【摘要】目的:通过比较玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞冷冻复苏、体外成熟、胚胎发育及细胞骨架的影响，寻求最佳的卵子冷冻方案。方法：玻璃化冷冻生殖泡期卵(GV)、成熟中期卵（MⅡ）及体外成熟卵(IVM-MⅡ），解冻复苏后，分别作体外成熟、体外受精（IVF）、胚胎培养或固定作免疫荧光标记，统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率、细胞骨架正常率。结果：GV冷冻组、MⅡ冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组复苏率差异无显著性（65%vs60.92%vs69.93%，P>0.05）。GV冷冻组的成熟率显著低于对照组（79.6%vs96.19%，P<0.01

2、）。GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P<0.01），且IVM-MⅡ冷冻组受精率显著低于MⅡ冷冻组（18.06%vs31.34%，P<0.01）。IVM-MⅡ冷冻组囊胚率低于MⅡ冷冻组和对照组，差异均有显著性（28.57%vs52.38%，P<0.05；28.57%vs57.14%，P<0.01）。GV冷冻组染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-MⅡ冷冻组（53.85%vs26.67%，P<0.05）。IVM-MⅡ冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组，差异均有显著性（P<0.05，P<0.01）。结论：GV卵先玻

3、璃化冷冻再体外成熟，其细胞骨架损伤较小，胚胎发育较好。【关键词】玻璃化冷冻；卵；细胞骨架；小鼠Abstract:Objective:Toevaluatetheeffectsofvitrificationontheratesofsurvival，invitromaturation(IVM)，developmentandcytoskeletonofmousefrozen-thaostsuitablecryopreservationprotocol.Methods:MⅡ，GVandIVM-MⅡaturation，invitrofertilization，embryocultivationorfix

4、edforimmunofluorescence.Theratesofsurvival，maturation，fertilization，blastulationandcytoskeletonalconfigurationaturationrateofGVgroupalfeatureofspindlesandchromosomesbetuchloentalcapacityofGVooctyesouse卵子冷冻能避免胚胎冷冻带来的伦理问题，而且增加供卵，并为那些因疾病需要切除卵巢或推迟生育的妇女提供生殖保险。卵子结构复杂，冷冻极易造成其不可逆的病变甚至死亡，卵母细胞成熟状态也会影响卵子冷冻结果。

5、成熟卵子和未成熟卵因其结构不同，对冷冻的耐受性也不同。理论上，冷冻未成熟GV卵似乎是更好的选择，但是也有报道指出GV卵对冷冻更为敏感[1-2]。因此本研究结合胚胎学和细胞骨架指标，探讨成熟阶段对卵子冷冻结果的影响以及GV卵冷冻时机的选择。1材料和方法1.1溶液的配制玻璃化冷冻的基础液为含20%胎牛血清（FCS）（北京中杉金桥生物技术有限公司）的磷酸盐缓冲液（PBS），体外成熟液（MEM）为含50μg/ml青霉素、75μg/ml链霉素、0.3mol/L丙酮酸钠、200mmol/L谷氨酰胺、20%FCS、0.075IU/mlFSH及1IU/mlhCG的α-MEM溶液，受精液为含4mg/ml牛血清

6、白蛋白（BSA）的KSOM液，卵裂液为含1mg/mlBSA的KSOM液，KSOM液的配制见文献[3]。除FCS外，其余试剂均来自美国Sigma公司。1.2实验动物昆明小白鼠，控制光照和黑暗各12h，雌鼠体重20～25g，雄鼠体重30～35g。1.3卵的收集雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）（宁波第二激素厂），10IU/只，44～48h后处死，刺破卵巢表面卵泡，收集生殖泡期（GV）卵置于MEM中，或再注射hCG，5IU/只，16～18h后处死，刺破输卵管的膨大部，收集中期成熟卵（MII）。1.4玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20%FCS(S)中冲洗2～3次后移入10%乙二

7、醇（EG）＋10%二甲基亚砜（DMSO）中停留30s，然后移入20%EG＋20%DMSO＋0.5mol/L糖中，用SOPS（超薄型开口拉细麦管，MINITUB，Germany）通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。解冻：在室温下依次将卵子移入含0.4mol/L糖、0.2mol/L糖、0.1mol/L糖的S及S中，各停留3min，再于37℃S中停留5min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟（IVM）、体外受精（