大鼠cd36基因真核表达载体的构建及表达

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1、大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达【摘要】　　目的:构建大鼠CD36真核表达载体,并在293T细胞中表达。方法:应用RTPCR技术,从大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞提取的总RNA中,获得CD36基因编码序列片段,克隆至真核表达载体pEGFPN1中,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,通过荧光显微镜和r）为88000的细胞表面单链糖蛋白,属于B类清道夫受体,在体内血小板、内皮细胞以及巨噬细胞等多种细胞表面表达,因其能与多种配体结合而具有复杂的生物学功能［1］。CD36是血小

2、板反应素1（trombospondin1,TSP1）的受体,通过与TSP1在细胞表面发生特异性结合参与转化生长因子β1（transforminggroershambiosciences公司,293T细胞购自中科院细胞库,NR8383细胞购自ATCC细胞库。TRIzol试剂、Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;RTPCRKit购自promega公司;TaqDNA聚合酶和蛋白质Marker标准均购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa公司);限制性内切酶XhoⅠ、KpnⅠ、T4

3、DNA连接酶购自NEB公司;DNAMarker标准购自上海捷瑞生物工程有限公司;质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司;凝胶纯化回收试剂盒购自北京天根科技生化有限公司;羊抗大鼠CD36抗体和兔抗羊二抗购自Santa公司;ECL化学发光试剂盒购自Amershambiosciences公司;其余一般化学试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1引物设计与合成根据GenBank的大鼠CD36基因的序列（序列号为:NM_031561）设计合成引物,引物序列为:上游引物:5′CCGCTCGAGATGGGCTGCGATC

4、GGAAC3′,下游引物:5′GGGGTACCGTTTTTCCATTCTTAGATCTGCAAG3′,引物5′端分别加入XhoⅠ和KpnⅠ酶切位点(框线内部分)。引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。　　1.2.2总RNA提取及RTPCR扩增采用TRIzol一步法依照说明书提取NR8383细胞中的总RNA。取2μg的RNA用MMLV反转录酶反转录成cDNA,以此为模板,进行PCR扩增CD36基因。反应体系:10×buffer2μL,2.5mmol/LdNTP0.8μL,引物各0.4μL,5U/μLTa

5、q酶0.2μL,ddH2O15.2μL,模板1μL,计20μL反应体系。扩增条件:94℃30s变性,94℃30s变性,55℃30s退火,72℃1.5min延伸;循环30次;最后72℃延伸6min。PCR扩增产物电泳后,回收目的片段。　　1.2.3pEGFPN1CD36重组质粒的构建与鉴定用XhoⅠ、KpnⅠ分别酶切pEGFPN1和CD36基因片段,DNA凝胶回收试剂盒回收酶切片段。将回收片段按目的基因和载体浓度为1∶1,反应体系10μL,在T4连接酶作用下4℃连接12h,转化DH5α感受态菌。经卡那霉素筛选

6、,挑取阳性克隆菌落,摇菌提取质粒,进行XhoⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆送上海吉凯基因化学技术有限公司进行DNA测序,将完全正确的质粒命名为pEGFPN1CD36。　　1.2.4pEGFPN1CD36重组质粒转染293T细胞293T细胞用含有100mL/L胎牛血清的DMEM培养,转染前24h传代,接种入24孔板中,每孔2×105个细胞,待每孔细胞密度达到70%～80%时按Lipofectamine2000操作说明书进行质粒转染。培养48h后,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况并收获细胞。　

7、　1.2.5:DNAmarker;1:CD36PCR扩增产物.　　2.2重组质粒pEGFPN1CD36的构建与鉴定重组质粒pEGFPN1CD36经XhoⅠ、KpnⅠ双酶切后,出现2条片段,即1425bp和4695bp,酶切片段大小与预期值相符(图2)。DNA测序结果亦显示,已成功将CD36基因片段插入pEGFPN1质粒中,其编码序列与GenBank的大鼠CD36基因的序列相符。　　图2重组质粒pEGFPN1CD36的双酶切鉴定（略）　　M:DNAmarker;1:重组质粒pEGFPN1CD36;

8、2:XhoⅠ和KpnⅠ双酶切的重组质粒.　　2.3荧光镜检pEGFPN1CD36质粒在293T细胞中的表达转染48h后,荧光显微镜下观察,在转染空质粒pEGFPN1的293T细胞中可见绿色荧光在胞质表达(图3A),在转染重组质粒pEGFPN1CD36的293T细胞中可见绿色荧光在胞膜表达(图3B)。　　2.4r大小为115000的蛋白条带,而在转染空质粒的293