微生物转化虎杖苷粗提物生成白藜芦醇的研究

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时间:2018-05-03

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1、微生物转化虎杖苷粗提物生成白藜芦醇的研究作者:袁润蕾,徐萌萌,孙艳娟,李猷,孙启玲,万端极【摘要】  目的利用一株根霉菌对虎杖苷粗提物进行液态发酵,使虎杖苷转化成白藜芦醇。方法采用单因素实验确定氮源种类及添加量,通过正交实验法优化发酵条件。结果在10%虎杖苷粗提物中添加1.5%的尿素作为氮源,采用薄层色谱法(TLC)确定在优化发酵条件下转化时间为26.8h,通过高效液相色谱法HPLC证明虎杖苷转化为白藜芦醇,转化率95.8%。结论虎杖苷粗提物可以通过微生物发酵得到白藜芦醇。【关键词】虎杖苷;白藜芦醇;根霉菌;微生物转化  Abstract:

2、ObjectivePolydatininPolydatinextractionedtoresveratrolinliquidstatefermentationbyR.nigricans.MethodsThekindandtheappendmateofnitrogensourceedbythesinglefactorexperiment.Theconditionsoffermentationizedbyorthogonalexperiment.ResultsCarbamideumnitrogensourceandtheappendmateiz

3、edconditionthetransformationtimeedtoResvertrolbyhighperformanceliquidchromatographyandthetransformationratecouldreach95.8%.ConclusionPolydatininPolydatinextractioncanbetransformedtoresveratrolbymicrobialtransformation.  Keyation虎杖为蓼科植物PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.的干燥根茎,别

4、名苦杖根、活血龙、大虫杖等[1]。其中重要的活性成分为二苯乙烯类的白藜芦醇(Resveratrol)和白藜芦醇苷(Polydatin),也叫虎杖苷。白藜芦醇是一种活性多酚类物质[2],具有明显的降低血脂,预防心脑血管疾病以及抗癌等重要作用,是目前世界上一种最新的药用保健活性物质,有望发展成为抗癌新药[3]。目前,该产品国际市场需求量大,具有良好的市场前景。天然白藜芦醇主要以葡萄糖苷(虎杖苷)的形式存在于虎杖中,虎杖中的白藜芦醇含量在0.1%~0.2%左右,虎杖苷的含量在2%左右,虎杖苷的含量明显高于白藜芦醇。理论上,采取化学法能将虎杖苷转化

5、为白藜芦醇,但其工序繁杂并生成大量的异构体,造成分离纯化困难,生产成本非常高,不被认可。目前,生物法是直接利用虎杖进行带渣发酵,通过根霉菌分泌的酶切断白藜芦醇苷的糖苷键,转化得到白藜芦醇(图1),该法存在发酵体积庞大、成本高、发酵浓度无法提高等问题[4]。因此本课题利用虎杖苷粗提物进行发酵,可以提高发酵体系中虎杖苷的含量、缩小发酵体积、提高发酵效率,更易于白藜芦醇这种医药中间体的工业化,为生产白藜芦醇提供了一种便捷、有效的方法。  1器材与方法  1.1仪器与药品DOINEX高效液相色谱仪;AN0298分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司

6、);虎杖(湖北省药材公司);虎杖苷标准品、白藜芦醇标准品(成都思科华有限责任公司);其它试剂均为分析纯;无机盐浓缩液:KH2PO40.1%,MgSO40.05%,(NH4)2SO40.1%;虎杖苷粗提物(粉末状,虎杖苷含量14.78%)。  1.2菌种编号T-34,由四川大学生物资源与生态环境教育部重点实验室提供,从自然界分离筛选得到,经鉴定为一株根霉菌。  1.3方法  1.3.1虎杖苷和白藜芦醇的TLC检测方法虎杖苷和白藜芦醇的TLC法薄层色谱[5]条件,展开剂:醋酸乙酯-丙酮-醋酸体积比为6∶2∶0.5;显色剂:3%磷钼酸无水乙醇溶液

7、,110℃显色3min[5]。  1.3.2虎杖苷和白藜芦醇的高效液相色谱法HPLC检测方法色谱柱C18柱(4.6mm×150mm),柱温25℃,流动相甲醇-水为40∶60;流速1ml/min,进样量20μl,检测波长305nm。根据标准样的峰面积和进样浓度作回归曲线,白藜芦醇的回归方程为Y=1.40×108X+1.21×104,相关系数r=0.999913,在20~100μg/ml范围内和峰面积成线性关系;虎杖苷的回归方程为Y=9.61×107X-1.84×105,相关系数为r=0.99982,在20~100μg/ml范围内和峰面积成线性

8、关系。  1.3.3氮源的选择  以10%虎杖苷粗提物添加1%无机盐浓缩液作为发酵培养基,分别在培养基中添加1%的硝酸铵、氯化铵、大豆粉、酵母膏、硫酸铵、尿素等氮源,180r/m

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