广州地区汉族人群肺癌易感性标记物cyp1a1、cyp2e1和gstm1与肺癌关系的病例对照研究

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1、广州地区汉族人群肺癌易感性标记物CYP1A1、CYP2E1和GSTM1与肺癌关系的病例对照研究：王德全　陈思东　汪保国　蔡旭玲　冼雪珍【摘要】　　［目的］探讨广州地区汉族人群谷胱苷肽硫转移酶（GSTM1）、细胞色素P4501A1（CYP1A1）和细胞色素P4502E1（CYP2E1）基因多态性与肺癌易感性的关系。［方法］选取中山大学附属第一医院、广州市肿瘤医院、广州市红十字会医院等医院的广州籍新发肺癌病人91例及同期上述各医院的同性别非肺部疾患病人91例作对照，采用聚合酶链式反应（PCR）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术检测CYP1A1、CYP

2、2E1和GSTM1的基因多态性。［结果］与野生型的CYP1A1相比,突变型肺癌OR为1.51(0.76～3.01),CYP2E1C2C2基因型与C1C1基因型比较，其OR为5.48(1.21～25.23)，GSTM1基因缺失型的OR值为1.26（0.69～2.30），而三者联合作用时，则可增加患肺癌的危险，其OR值为3.97(0.94～16.79)，但无统计学意义（P>0.05）。［结论］CYP1A1、CYP2E1和GSTM1的某些基因型增加了患肺癌的危险性，但尚未达到统计学的显著性水平,说明它们均不是肺癌个体易感性的主效基因，而是次效基因。【

3、关键词】基因多态性　肺肿瘤　病例对照研究　　1材料与方法1.1研究对象病例于广州市肿瘤医院、广州市红十字会医院、中山大学附属第一医院等2000年至2001年广州籍新发肺癌病人91例，其中男性60例，女性31例。年龄22岁~84岁。对照组1：1匹配于同期同一医院非肿瘤非肺部疾患的病人，性别相同，年龄±2岁。对照组91例，其中男性60例，女性31例，年龄最小22岁，最大82岁。两组间的年龄和性别的分布差异无显著性。1.2样本的采集采集实验对象的静脉血8ml~10ml，于4℃冰箱静置分离血清及血凝块，取血凝块于-70℃冰冻保存。1.3DNA的制备新鲜血凝块

4、或冰冻血凝块室温解冻后，采用DNA酚抽提方法提取DNA。1.4CYP1A1基因型的检测引物序列：5′?鄄CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT?鄄3′和：5′?鄄TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT?鄄3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体积及反应条件：ddH2O8.5μl，10×Buffer5.0μl，dNTPs1.0μl(0.01μmol)，引物2种各10.0μl（3.125×10-5μmol）(0.655μM)，Taq酶0.5μl（2.5U），模板5.0μl。94℃预变性2min，然后用94℃50s（变性）、54℃

5、50s（退火）、72℃60s（延伸），进行30个循环，最后72℃7min。PCR扩增产物用MSPI酶切：扩增产物10μl，（10U）MsPI内切酶1μl，10×Buffer2μl，ddH2O2μl1000g，离心数秒，加石蜡25μl，37℃水浴1~3h，65℃水浴10~15min终止酶切，取8μl酶切产物点样用1.8%琼脂凝胶作电泳分析。结果判断：野生型为340bp，突变型140，200bp2个片段，杂合型为140，200，340bp3个片段。1.5CYP2E1基因多态性检测引物设计：CYP4502E1PstI/RsaI型引物：5′?鄄CCAGTCG

6、AGTCTACATTGTCA?鄄3′，5′?鄄TTCATTCTGTCTTCTAACTGG?鄄3′。PCR反应条件：ddH2O8.5μl，10×Buffer5.0μl，dNTPs1.0μl(0.01μmol)，引物4种各10.0μl（3.125×10-5μmol）（0.655μM），Taq酶0.5μl（2.5U），模板5.0μl。94℃预变性2min，然后用94℃50s（变性）、54℃50s（退火）、72℃60s（延伸），进行30个循环，最后72℃7min。PCR扩增产物的酶切:总体积15μl：扩增产物10μl，（10U）RsaI内切酶1μl，10×B

7、uffer2μl，ddH2O2μl1000g，离心数秒，加石蜡25μl，37℃水浴1~3h，65℃水浴10~15min终止酶切，取8μl酶切产物点样用1.8%琼脂凝胶作电泳分析。结果判断：PCR产物长度为410bp，经RsaI酶切后，在紫外光下可见三种情况：①出现360bp和50bp的两条亮带，此为C1C1野生型纯合子；②只出现410bp的亮带，此乃C2C2突变型纯合子；③若出现上述的全部三条亮带，此为C1C2杂合子。1.6GSTM1基因多态性检测两对引物（见表1）分别特异性扩增GSTM1基因片断（215bp）及参照基因β?鄄globin（β?鄄珠蛋

8、白、268bp），由上海生物工程公司合成。1.6.1PCR扩增ddH2O18.5μl，10×Buffer5.