红芸豆红细胞凝集素单体的分离纯化和性质研究

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1、红芸豆红细胞凝集素单体的分离纯化和性质研究【关键词】红细胞凝集素分离纯化凝血性质研究Abstract：ObjectiveTostudyaneethodforErythrohemagglutinin（PHA-E）productionfromPhaseolusvulgaris.MethodsPHA-EtheexcellentseedsofPhaseolusvulgarisbyextraction，ionexchangechromatographyandfinalgelfiltrationchromatography.Thepurity,themol

2、ecularinedbyelectrophoresis.Theabilityandtheinfluencingfactorofagglutinationinedby2%erythrocytesofhuman.ConclusionThepurifiedPHA-Eolecularidegelelectrophoresis.IsoelectricpointofthePHA-Eoteagglutinationofhumanerythrocytesat4μg/ml,butitsactivityonosaccharide.EDTAcaninhibitthe

3、abilityofagglutination,andZn2+canaccelerateit.ThesugarcontentofPHA-Eagglutinin；separationandpurification；haemagglutination；characterization植物凝集素(PhytohemagglutininPHA)是从豆科植物种子中提取的一种含糖蛋白质［1］。植物凝集素具有刺激外周血淋巴细胞RNA合成和有丝分裂［2］，促进免疫反应，使细胞凝聚，肿瘤细胞失活，以及诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子等生物学活性。文献［3］报道P

4、HA是由E、L两种亚基组成的四聚体蛋白质的混合物，按其亚基组成可分为L4、L3E、L2E2、LE3、E4具有相同物化性质和不同生物学活性的同工凝集素。其中PHA-E含有4个相同的E亚基，具有最强的红细胞凝集功能，没有白细胞凝集能力。由于凝集素单体较混合物PHA对于糖链具有更加特异的识别能力，可以作为分子探针，研究特异细胞膜受体的分布等，在免疫学、肿瘤、生殖生理、细胞生物学等许多方面得到应用，在医学、农业上呈现出巨大的应用前景。关于红细胞凝集素单体的分离纯化国内还未见报道，本研究改进和优化前人的提取和纯化方法，简化操作程序，从红芸豆中得到了凝血活

5、力较高的电泳纯红细胞凝集素单体。1材料与方法1.1仪器与试药UV1102紫外－可见分光光度计（上海天美科技有限公司），蛋白质纯化系统（上海琪特仪器分析有限公司），高速冷冻离心机（Eppendorf公司），MINI-PROTEINⅣ电泳系统（Bio-Rad公司）。红芸豆（购自甘肃兰州），低分子量蛋白标准（上海东风生物技术有限公司），蛋白质等电点标准（Pharmacia公司），两性电解质（pH3～9，Pharmacia公司），PHA-E（Sigma公司），DEAE-SepharoseFF、CM-SepharoseFF、SephadexG100（Ph

6、armarica公司），乙酰氨基葡萄糖（Sigma公司），人红细胞悬液由本实验室自制，其它试剂均为国产分析纯。1.2PHA-E提取过程1.2.1PHA-E粗提液制备将红芸豆粉碎，取100g粉末，加入1000ml的NaAc-HAc缓冲液(pH5.2，20mmol/L,0.14mol/LNaCl),分四次磁力搅拌浸取。合并浸取液，后用两层纱布过滤。收集滤液，调pH5.2，在4℃下10000rpm离心10min，取上清液，即得PHA-E粗提液。1.2.2CM-Sepharose层析取CM-Sepharose装柱(2.6cm×20cm)，用NaAc-H

7、Ac缓冲液（pH5.2，20mmol/L）平衡，将收集的PHA-E粗提液上柱。用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH6.0，20mmol/L）冲洗至没有蛋白质流出，再用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH7.2，20mmol/L）洗脱，收集蛋白质峰，调pH7.2.1.2.3DEAE-Sepharose层析取DEAE-Sepharose装柱(2.6cm×25cm)，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH7.2，20mmol/L)平衡，将1.2.2收集得到的蛋白质峰上柱吸附，用缓冲液冲洗至基线平衡。用含0～0.4mol/LNaCl

8、的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH7.2，20mmol/L)进行梯度洗脱，流速为5ml/min，收集活性峰，装入透析带中，4℃冰箱中PEG浓