灵芝多糖对糖尿病大鼠肾组织tgf

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　　灵芝多糖对糖尿病大鼠肾组织TGF作者：毛春谱，李小毅，张红梅，林桂芬，李伟【摘要】目的观察转化生长因子β1(tgf-β1)及ⅳ型胶原（co-ⅳ）在糖尿病大鼠肾组织中的表达及灵芝多糖干预后的影响。方法腹腔注射链脲佐菌素（stz）诱导大鼠造成糖尿病模型，分组予不同剂量灵芝多糖（glp）进行治疗性灌胃。8周后，用免疫组化方法和rt-pcr方法检测各组大鼠肾皮质tgf-β1、co-ⅳ的蛋白和mrna表达。结果糖尿病组大鼠肾小球tgf-β1、co-ⅳ蛋白和mrna表达较正常对照组明显升高（p＜0.01）；灵芝多糖各组较糖尿病组表达降低（p＜0.01）。结论灵芝多糖可能通过下调糖尿病大鼠肾脏中tgf-β1和co-ⅳ的表达，减少细胞外基质积聚，起到对糖尿病大鼠肾脏保护作用。【关键词】灵芝多糖；糖尿病肾病；转化生长因子β1；ⅳ型胶原　　abstract：objectivetoinvestigatetheexpressionsoftransforminggroalucidumpolysaccharides（glp）onsuchchanges.methodsdiabeticratmodelg/kg）andtheratslyandtreatedinedbyimmunohistochemistryandrt-pcrmethods.resultsparedrnatgf-β1、co-ⅳsignificantlyincreasedinglomeruli（p＜0.01）.theabnormalexpressionsoftheseproteins、mrnaaticallyimprovedindiabeticratsbyglptreatment（p＜0.01）.conclusionglphassomerenalprotectiveeffectondiabeticrats，throughinhibitionofexcessivedepositionofglomeruliextracellularmatrixbyinhibitingtheexpressionoftgf-β1anddecreasingthesynthesisofco-ⅳ.　　keyalucidumpolysaccharides；diabeticnephropathy；transforminggroalucidumpolysaccharides，glp）、三萜类化合物、灵芝酸、腺苷等，其中glp是最有效的活性成分之一。灵芝的药理活性大多和glp有关，其具有广泛的药理活性［1］，能提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抗氧化［2］，抗辐射和降低血脂［3］等作用，但对dn的作用报道很少。本研究采用免疫组化和rt-pcr方法观察灵芝多糖不同剂量组对糖尿病大鼠肾组织的转化生长因子β1（transforminggroa公司），灵芝多糖（河北保定施达科生物工程技术有限公司，批号：rm051215）。一抗分别为兔抗大鼠tgf-β1、co-ⅳ 抗体、sp-6001试剂盒及dab试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），totalrna提取试剂、rt-pcr试剂盒（大连宝生物有限公司）。leicaq组，n＝10），灵芝多糖低剂量组（glp-1组，n＝10），灵芝多糖中剂量组（glp-2组，n＝10），灵芝多糖高剂量组（glp-3组，n＝10），分笼饲养。dm组和glp-1、glp-2、glp-3组大鼠在禁食12h后，于左下腹腔一次性注射stz（溶于0.1mmol/l柠檬酸缓冲液，ph4.4）60mg/kg，72h后，尾静脉采血测随机血糖≥16.7mmol/l，持续3d以上作为模型纳入本实验。c组仅予以等量柠檬酸缓冲液腹腔注射。40只大鼠经检测均造模成功。模型成立3d后glp-1、glp-2、glp-3组分别给予灵芝多糖水溶液100，200，400mg/kg剂量进行治疗性灌胃，c组和dm组用等体积生理盐水灌胃。所有大鼠实验期间自由饮水进食，不使用胰岛素及其他降糖药物。每隔1周测量体质量（body，行he染色和免疫组化。　　2.5免疫组化研究采用sp二步法，石蜡切片厚4μm后常规脱蜡至水，3％h2o2阻断内源性过氧化物酶后，微波加热暴露抗原，滴加一抗tgf-β1（1∶100）、co-ⅳ（1∶120），4℃冰箱过夜，pbs洗片后滴加二抗，37℃孵育1h，dab显色控制在3～5min，复染、脱水、透明、封片。以吸光度值（a）表示，显色强度用leicaqrna核苷酸序列，pcr引物用primerpremier引物设计软件设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（见表1）。表1大鼠转化生长因子-β1(tgf-β1)、co-ⅳ及β-actin引物序列（略）　　取肾皮质100mg，加液氮研碎后，用trizol(大连宝生物工程有限公司)提取总rna。提取的总rna测od值：od260/od280值在1.8～2.0之间。分别取1μg总rna以amvl(大连宝生物工程有限公司)为逆转录酶作逆转录反应，cdna产物保存于-20℃。优化pcr扩增条件，使pcr扩增在对数期内进行。分别进行tgf-β1、co-ⅳ与β-actin扩增。在dna扩增仪(eppendorfmastercylergradient)上进行pcr扩增。tgf-β1的反应参数为94℃2min，94℃45s、62℃45s、72℃45s共35个循环；co-ⅳ的反应参数94℃2min，94℃45s、64℃45s、72℃45s共35个循环；β-actin反应参数为94℃2min，94℃45s、57℃45s、72℃45s共35个循环。取pcr扩增产物5μl在1.5%琼脂糖中电泳，imagemastervds成像系统摄影存盘后应用计算机图像分析软件(totallabv1.01)行灰度扫描分析。以目的基因与β-actin的pcr产物条带灰度volume之比作为反映目的基因mrna水平的相对指标。 　　2.7统计学处理计量资料用±s表示，应用spss13.0统计软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。　　3结果　　3.1一般情况和常规生化指标dm组大鼠在实验期间多饮、多尿、多食、体质量减轻、毛色无光泽、生长发育迟缓等症状十分明显。8周时dm组与c组相比，bg，ki，hba1c，uaer显著升高，而k组大鼠较c组系膜细胞显著增生，系膜基质增多，肾小动脉内膜增生，管壁增厚，毛细血管腔狭窄，glp各组较dm组上述病理改变有不同程度改善。　　3.3免疫组化结果免疫组化染色显示阳性颗粒主要定位于肾小球和肾小管：dm组较c组比较，tgf-β1、co-ⅳ棕黄色颗粒染色强度明显升高，染色面积增多(p<0.01)；glp各组较dm组相比均不同程度降低(p<0.01)。结果见表3及图1。　　3.4rt-pcr结果8周时，与c组相比，dm组tgf-b1mrna、co-ⅳmrna表达增多；与dm组相比，glp各组tgf-b1mrna、co-ⅳmrna表达减少(p<0.01)，见表3及图2。表3灵芝多糖对各组糖尿病大鼠tgf-β1和co-ⅳ表达的影响（略）　　4讨论　　本实验结果表明stz诱导的糖尿病大鼠模型，8周后大鼠出现毛色无光泽、生长发育迟缓等症状，bg、ki、hba1c、uaer显著升高，病理上肾小球系膜细胞显著增生，系膜基质增多，肾小动脉内膜增生，管壁增厚，毛细血管腔狭窄，提示已出现dn早期表现。glp给药8周后糖尿病大鼠b］.北京:北京医科大学出版社,2001：219.　　［2］youyh,linzb.protectiveeffectsofganodermalucidumpolysaccharidespeptideoninjuryofmacrophagesinducedbyreactiveoxygenspecies［j］.actapharmacolsin,2002,23:787.　　［3］陈伟强,罗少洪,李红枝，等.灵芝多糖对高脂血症大鼠血脂及脂质过氧化的影响［j］.中国中药杂志,2005,30(17):1358.　　［4］zeisbergm,ericksenmb,hamanoy,eta1.differential expressionoftypeivcollagenisofomlsinratglomerularendothelialandmesangialcells［j］．bioehenbiophysresmun,2002,295(2):401.　　［5］undh.groentaldiabeticnephropathycontributestointerstitialfibrosis［j］．amjphysiol(renalphysio1),2000,278:554.　　［6］okudats.roleoftgf-betaintheprogressionofrenalfibrosis［j］.contribnephrol，2003,139:44.　　［7］danielsmc,mcclainda,crooked.transcriptionalregulationoftransforminggroinebiosynthesispathjmedsci,2000，319(3):138.　　［8］pantsulaiat.roleoftgf-betainpathogenesisofdiabeticnephropathy［j］．georgianmedneb,ziyadehfn,eta1.diabeticnephmpathyandtransforminggroingourvieemlosclerosisandfibrosisbuild-up［j］．serminnephm,2003,23(6):532.　　［10］erularexpressionofthrombos-pondin·1，transforminggroesangialresponsetodiabeticstimuli［j］.diabetologia,2005,48(12):2650.