western blot实验方法

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1、WesternblotWesternBlotting采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。试剂1.30%丙烯酰胺配方：丙烯酰胺29g甲叉双丙烯酰胺1g去离子水定容至100

2、mL配法：向烧杯中加入60mL去离子水，充分搅拌溶解丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，加去离子水定容至100mL，用045μm滤膜滤去杂质，于棕色瓶中（避光）4℃保存，用时恢复至室温且无沉淀。2.10%SDS配方：SDS10g去离子水定容至100mL配法：称量10g高纯度的SDS置于烧杯中，加入约80mL去离子水，50℃水浴溶解，定容至100mL，室温保存。3.10%过硫酸铵配方：过硫酸铵1g去离子水定容至10mL配法：临用前新鲜配制，或保存在-20℃，超过两周则扔掉。4.1.5MTris-Hcl（pH8.8）配方：Tris18.17g去离子水定容至100mL配法：称量1

3、8.17gTris置于烧杯中，加入约80mL去离子水，充分溶解搅拌，用浓盐酸调节pH值至8.8.将溶液定容至100mL高温高压灭菌后，室温保存。5.1.0MTris-Hcl（pH6.8）配方：Tris12.10去离子水定容至100mL配法：称量12.10gTris置于烧杯中，加入约80mL去离子水，充分搅拌溶解，用浓盐酸调节pH值至6.8.将溶液定容为100mL。高温高压灭菌后，室温保存。6.还原型5×SDS上样缓冲液配方：1.0MTris-Hcl（pH6.8）0.25mLDTT（二硫代苏糖醇）78mg溴酚蓝5mg甘油0.5mL去离子水溶解后定容至1mL配法：混匀

4、后，分装于1.5mL离心管中，4℃保存。上样时与样品1:4比例加样。1.电泳缓冲液配方：Tris3.03g甘氨酸18.77gSDS1g去离子水定容至1000mL配法：精确称量，加入约800mL去离子水，搅拌溶解，加去离子水定容至1L后，室温保存。2.电转缓冲液配方：甘氨酸8.7gTris17.4gSDS1.11g甲醇600mL去离子水定容至3000mL配法：加600mL去离子水充分搅拌溶解后，加1800mL去离子水定容至2400mL后，加甲醇600mL，室温保存，可重复使用3～5次。3.TBST缓冲液配方：NaCl8.8g1.0MTris-Hcl（pH6.8）20

5、mLTween-200.5mL去离子水定容至1000mL配法：向烧杯中加入800mL的去离子水，充分搅拌溶解，再加入0.5mLTween-20后充分混匀，加去离子水定容至1000mL，4℃保存4.封闭液配方：TBST100mLBSA5g配法：称量5gBSA（牛血清白蛋白）加入到100mL的TBST缓冲液中，充分搅拌溶解，4℃保存待用。方法1先作SDS-PAGE电泳，2转膜:分为湿转和半干转湿转:（1）泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移缓冲液浸泡（2）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用玻璃棒在凝胶上来回滚动到最边上以去除所有的气泡

6、。（3）转膜顺序：阴极碳板+海绵+滤纸+胶+膜+滤纸+海绵+阳极碳板（4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。（5）接通电源,选择合适的转膜电流和转膜时间,开始电泳转移。（6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。半干转(1)将凝胶和膜像三明治一样夹在用缓冲液湿润的滤纸之间进行转膜。(2)加入适量电转液.接通电源,选择合适的转膜电流和转膜时间,开始电泳转移。（3）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。3封闭将薄膜漂在5%脱脂乳液体中，4℃过夜，次日室温下用TBST洗涤薄膜3次,每次五分钟。4加一抗加入以适当比例用5%BSA的TBSbuffer稀释

7、的一抗，37℃孵育1小时或4℃过夜。由于一抗太贵,必要时可回收一抗。膜在室温下用TBST洗涤薄膜3次,每次五分钟。5加二抗：加入以适当比例用5%BSA的TBSbuffer稀释的二抗，37℃孵育1小时，室温下用TBST洗涤薄膜3次,每次五分钟。6显色：化学发光法。