植物体内硝酸还原酶活力的测定

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1、实验6植物体内硝酸还原酶活力的测定 硝酸还原酶(nitratereductase,NR),是植物氮素同化的关键酶,它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐(NO3ˉ+NADH+H+→NO2ˉ+NAD++H2O)。产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸(或对–氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯二胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下:   生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰,可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以Nμg/(g·h)为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单,适合快速、多组测定。离体法复杂,但重复

2、性较好。Ⅰ离 体 法二、实验材料、试剂与仪器设备(一)实验材料水稻、小麦叶片、幼穗等。(二)试剂1.亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于无离子水后定容至1000mL,然后再吸取5mL定容至1000mL,即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。2.0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液:Na2HPO4·12H2O30.0905g与NaH2PO4·2H2O2.4965g加无离子水溶解后定容至1000mL。3.1%磺胺溶液:1.0g磺胺溶于100mL3mol/LHCl中(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/LHCl)。4.0.02%萘基乙烯胺

3、溶液:0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中,贮于棕色瓶中。5.0.1mol/LKNO3溶液:2.5275gKNO3溶于250mL0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液。6.0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲液:8.8640gNa2HPO4·12H2O,0.0570gK2HPO4·3H2O溶于1000mL无离子水中。7.提取缓冲液:0.1211g半胱氨酸、0.0372gEDTA溶于100mL0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲液中。8.2mg/mLNADH溶液:2mgNADH溶于1mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液中(临用前配制)。(三)仪器设

4、备冷冻离心机,分光光度计,天平(感量0.1mg),冰箱,恒温水浴,研钵,剪刀,离心管,具塞试管,移液管,洗耳球。三、实验步骤1.标准曲线制作取7支洁净烘干的15mL刻度试管按表11–1顺序加入试剂,配成0~2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min,然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮(μg)为横坐标(x),吸光度值为纵坐标(y)建立回归方程。 表11-1制作标准曲线时各溶液加入量试剂管号1234567亚硝酸钠标准液(mL)0.00.20.40.81.21.62.0蒸馏水(mL)2.01.81.61.20.80.40.01%磺胺(mL)44444

5、440.02%萘基乙烯胺(mL)4444444每管含亚硝态氮(μg)00.20.40.81.21.62.0 2.样品中硝酸还原酶活力测定(1)酶的提取称取0.5g鲜样,剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min,取出置冰浴中加少量石英砂及4mL提取缓冲液,研磨匀浆,转移于离心管中在4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液。(2)酶的反应取粗酶液0.4mL于10mL试管中,加入1.2mL0.1mol/LKNO3磷酸缓冲液和0.4mLNADH溶液,混匀,在25℃水浴中保温30min,对照不加NADH溶液,而以0.4mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液代

6、替。3.终止反应和比色测定保温结束后立即加入1mL磺胺溶液终止酶反应,再加1mL萘基乙烯胺溶液,显色15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量(μg)。四、结果计算单位鲜重样品中硝酸还原酶活性=[μg/(g·h)]式中:X——反应液酶催化产生的亚硝态氮总量,μg。Vl——提取酶时加入的缓冲液体积,mL。V2——酶反应时加入的粗酶液体积,mL。W——样品鲜重,g。t——反应时间,h。Ⅱ活体法一、实验材料、试剂与仪器设备(一)实验材料植物的新鲜叶片(豌豆、王米、小麦、大豆等)。(二)试

7、剂1.1%磺胺试剂:1.0g磺胺溶于100mL3mol/LHCl中(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/LHCl)。2.α-萘胺试剂:称取α-萘胺0.2g,用含1mL浓盐酸的蒸馏水溶解,再用蒸馏水稀释至100mL。3.NaNO2标准液:称取0.1gNaNO2,用蒸馏水溶解,定容至100mL。之后,再吸出5mL,用蒸馏水稀释至1000mL。此液每毫升含有5μgNaNO2,用时再稀释。4.0.2mol/LKNO3:称取KNO32.002g,用蒸馏水溶解,移入100mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。5.0.1mol/L磷酸缓冲液,

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