植物体内硝酸还原酶活力的测定

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1、实验6植物体内硝酸还原酶活力的测定 硝酸还原酶（nitratereductase,NR），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（NO3ˉ+NADH+H＋→NO2ˉ+NAD＋+H2O）。产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下：   生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以Nμg／（g·h）为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。Ⅰ离　体　法

2、二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦叶片、幼穗等。（二）试剂1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于无离子水后定容至1000mL，然后再吸取5mL定容至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg／mL的标准液。2．0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O30.0905g与NaH2PO4·2H2O2.4965g加无离子水溶解后定容至1000mL。3．1％磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100mL3mol/LHCl中（25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/LHCl）。4．0.02％萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100

3、mL无离子水中，贮于棕色瓶中。5．0.1mol/LKNO3溶液：2.5275gKNO3溶于250mL0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液。6．0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲液：8.8640gNa2HPO4·12H2O，0.0570gK2HPO4·3H2O溶于1000mL无离子水中。7．提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸、0.0372gEDTA溶于100mL0.025mol／LpH8.7的磷酸缓冲液中。8．2mg/mLNADH溶液：2mgNADH溶于1mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液中（临用前配制）。（三）仪器设备冷冻离心机，分光光度计，天平（感量0.1mg），冰箱，恒温

4、水浴，研钵，剪刀，离心管，具塞试管，移液管，洗耳球。三、实验步骤1.标准曲线制作取7支洁净烘干的15mL刻度试管按表11–1顺序加入试剂，配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（μg）为横坐标（x），吸光度值为纵坐标（y）建立回归方程。 表11-1制作标准曲线时各溶液加入量试剂管号1234567亚硝酸钠标准液（mL）0.00.20.40.81.21.62.0蒸馏水（mL）2.01.81.61.20.80.40.01％磺胺（mL）44444440.02％萘基乙烯胺（mL）4444444每管含亚硝态氮（μg）00.20.

5、40.81.21.62.0 2.样品中硝酸还原酶活力测定（1）酶的提取称取0.5g鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4mL提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中在4℃、4000r/min下离心15min，上清液即为粗酶提取液。（2）酶的反应取粗酶液0.4mL于10mL试管中，加入1.2mL0.1mol/LKNO3磷酸缓冲液和0.4mLNADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.4mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液代替。3．终止反应和比色测定保温结束后立即加入1mL磺胺溶液终止酶反应，再加1mL萘基乙烯胺溶液，显色

6、15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量（μg）。四、结果计算单位鲜重样品中硝酸还原酶活性=[μg／（g·h）]式中：X——反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg。Vl——提取酶时加入的缓冲液体积，mL。V2——酶反应时加入的粗酶液体积，mL。W——样品鲜重，g。t——反应时间，h。Ⅱ活体法一、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料植物的新鲜叶片（豌豆、王米、小麦、大豆等）。（二）试剂1.1%磺胺试剂：1.0g磺胺溶于100mL3mol/LHCl中（25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/LH

7、Cl）。2.α-萘胺试剂：称取α-萘胺0.2g，用含1mL浓盐酸的蒸馏水溶解，再用蒸馏水稀释至100mL。3.NaNO2标准液：称取0.1gNaNO2，用蒸馏水溶解，定容至100mL。之后，再吸出5mL，用蒸馏水稀释至1000mL。此液每毫升含有5μgNaNO2，用时再稀释。4.0.2mol/LKNO3：称取KNO32.002g，用蒸馏水溶解，移入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。5.0.1mol/L磷酸缓冲液，