硝酸还原酶活性的测定

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1、赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L

2、磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。0.2mol/LKNO3：溶解20.22gKNO3于1000ml蒸馏水中。磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。NaNO2标准溶液：1gNaNO2用蒸馏水溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO25μg，用时稀释之。操作步骤1.．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2梍

3、3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/LKNO35ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去

4、而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测3.．绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度

5、相同，彼此可以比较。吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。实验作业1．试比较不同植物的酶活性。2．试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。参考文献1．陈薇、张德颐：1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生理学通讯，

6、1980(4)：45—49。2．周树、郑相穆：1985。硝酸还原酶体内分析方法的探讨，植物生理学通讯，1985(1)：47—49。3．Hageman,R.H.andD.P.．Hucklesby:1971.MethodsinEnzymology,23A:491—503.4．Radin.J.W.:1973.PlantPhysiology,51:332—336.5．Snell,F.D.andC.T.Snell:1949.ColorimetricMethodsofAnalysis,Vol.II,802—807硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法：（1g样）

7、（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29）亚硝酸钠标准溶液（1µg/ml）：称NaNO20.9857g,定容到1000ml，再吸5ml定容到1000ml。0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲溶液：30.0905gNa2HPO4·12H2O+2.4965gNaH2PO4·2H2O，加蒸馏水定容到1000ml。3mol/LHCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。1％磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml3mol/LHCl中。0.2％a-萘胺溶液：1.0ga-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml，贮于棕色瓶中

8、。0.1mol/LKNO3溶液：5.055gKNO3溶于500mln0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲溶液。0.025mol/LpH8