硝酸还原酶活力的测定.doc

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1、硝酸还原酶活力的测定一、试剂：（1）亚硝态氮标准溶液称取1g分析纯NaNO2溶于无离子水并定容至1000mL，然后再吸取1mL定容至1000mL,即为1μg/mL亚硝态氮的标准液。（2）0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液称取30.0905gNa2HPO4·12H2O与2.4965gNaH2PO4·2H2O，加无离子水溶解后定容至1000mL。（3）10g/L磺胺溶液称取1.00g磺胺溶于100mL3mol/LHCl中（取25mL浓盐酸加无离子水定容至100mL，即为3mol/LHCl）。（4）0.2g/L萘基乙烯胺溶液称取0.0200g萘基

2、乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。（5）0.1mol/LKNO3溶液称取2.5275gKNO3溶于250mL0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液。（6）0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲液称取8.864gNa2HPO4·12H2O和0.057gK2HPO4·3H2O，溶于1000mL无离子水中。（7）提取缓冲液称取0.1211g半胱氨酸和0.0372gEDTA，溶于100mL0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲液。（8）2mg/mLNADH溶液称取2mgNADH溶于1mL0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液(临用前配制

3、)。二．实验步骤（一）标准曲线制作取7支15mL干净的试管按表1顺序加入试剂，配成每管含0~2.0μg亚硝态氮的系列标准溶液，摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定，以每管中亚硝态氮的量（μg）为横坐标（x），吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线或建立回归方程。试剂管号1234567亚硝酸钠标准液/mL00.20.40.81.21.62.0蒸馏水/mL2.01.81.61.20.80.40.010g/L磺胺/mL44444440.2g/L萘基乙烯胺/mL4444444每管含亚硝态氮量/μg00.20.40.81.21.62.0

4、（一）硝酸还原酶活力测定1.酶液提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加4mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,4000r/min离心15min,上清液即为粗酶提取液2.酶反应取粗酶液0.4mL加入10mL试管中，再加入1.2mL0.1mol/LKNO3磷酸缓冲液和0.4mLNADH溶液，在25℃水浴中准确保温30min。在对照管中不加NADH溶液，而以0.4mL0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液代替。保温结束后立即加入1mL磺胺溶液终止酶反应。3.显色与测定在各管中加入1mL萘基乙烯胺溶液，显色15min后

5、于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定。根据从标准曲线查得的或由回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮量（μg），计算样品硝酸还原酶活力。三．结果处理及计算样品硝酸还原酶活力[μg/(g·h)]=X为反应液中酶催化产生的亚硝态氮量（μg）；Vt为提取酶时加入的缓冲液体积（mL）；Vs为酶反应时加入的粗酶液体积（mL）；m为样品鲜质量（g）；T为反应时间（h）。