明串珠菌乙醛脱氢酶基因失活研究

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1、明串珠菌乙醛脱氢酶基因失活研究第一章绪论1-1明串珠菌概述明串珠菌是一类进行异型乳酸发酵、耐氧的革兰氏阳性细菌，是韩国泡菜的优势菌种，能够保持泡菜质量[1]。明串珠菌能够代谢产生乳酸、乙酸、乙醇、双乙酰、甘露醇、葡聚糖、乙偶姻等芳香化合物。它生长范围较为宽泛，主要存在于植物的表面和根部。明串珠菌的最适生长温度为20-30°C，耐酸性强，生长最适pH为5.5-6.2，在pH≤5的环境中可以生长，而在中性或初始碱性条件下生长较缓慢[2]。细胞呈椭球或者豆状，菌落常成对和短链出现，少数呈长链排列，直径

2、通常小于1.0mm，光滑、圆型、灰白色，不运动，不形成芽孢。明串珠菌的生长通常需要复合生长因子和氨基酸，需要烟酸、硫胺素和生物素，而不需要钴胺素和对-氨基苯甲酸。明串珠菌通常为接触酶（过氧化氢酶）阴性，不发酵多糖和醇类（甘露醇除外），无细胞色素，不水解精氨酸，很少酸化和凝固牛奶，不产吲哚，不水解蛋白，不还原硝酸盐，不溶血。明串珠菌对2000ppm万古霉素有抗性。明串珠菌也具有一定的益生特性。明串珠菌（Leuconostoc）归属于厚壁菌门（Firmicutes），芽孢杆菌纲（Bacilli），乳杆菌目（Lac

3、tobacillales），明串珠菌科（Leuconostocaceae）[3]。到目前为止，NCBI数据库所认可的明串珠菌属包括肠膜明串珠菌（L.mesenteroides）、肉明串珠菌（L.carnusum）、冷明串珠菌（L.gelidum）、欺诈明串珠菌（L.fallax）、阿根廷明串珠菌（L.argentinum）、嗜柠檬酸明串珠菌（L.citreum）、假肠膜明串珠菌（L.pseudomesenteroides）和乳酸明串珠菌（L.lactic）等13个种；其中肠膜明串珠菌包括3个亚种，即肠膜明串珠

4、菌肠膜亚种（L.mesenteroidessubsp.mesenteroides）、肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroidessubsp.dextranicum）和肠膜明串珠菌乳脂亚种（L.mesenteroidessubsp.cremoris）[4]。1-2基因失活基因失活是20世纪80年代发展起来的分子生物学技术，它通过重组载体DNA序列和靶细胞内染色体上同源DNA序列，利用DNA转化技术如电击转化、显微注射等将打靶载体导入受体细胞中，将载体DNA定点整合入受体细胞基因组的某一确定位点上，或与

5、靶细胞基因组上某一确定片段相置换，使受体细胞的某一特定基因失活，从而改变细胞的遗传特性[22]。借助基因失活可中止某一基因的表达，引入新基因及引入定点突变，既可以用突变基因或其它基因失活相应的正常基因，又可以用正常基因失活相应的突变基因。利用基因失活技术能够对细胞染色体进行精确的修饰和改造，而且经修饰和改造的基因能够随染色体DNA的复制而稳定复制、稳定遗传[23]。基因失活的基本步骤是：通过PCR技术扩增目的基因序列，在体外插入卡拉霉素、四环素、氯霉素等受体菌自身不具有的抗性标记，再将上述基因序列构建至一个环

6、状载体上，用DNA转化技术将构建好的同源重组载体转化入受体细胞内，用抗性标记初步筛选阳性重组子或进行目的基因功能的失活检测，再通过PCR、Southern杂交等做进一步验证。为了更好地区别单交换与双交换造成的重组，通常使用两个抗性标记。在发生单交换时，阴性和阳性抗性标记都会整合至基因组，导致两种标记都不存在；而发生双交换时，第二次同源重组会导致基因回复至野生型或失活目的基因，基因组上只有阳性标记，因此这样的重组子可以通过正负筛选而鉴别出。第二章明串珠菌电击转化的优化2-1实验材料明串珠菌是美国FDA认可的GR

7、AS菌，不产内毒素，能分泌特异性胞外蛋白且不会降解蛋白活性[37]，所以在食品技术中，明串珠菌是很好的表达不同蛋白的候选菌。由于明串珠菌是革兰氏阳性菌，转化方法成为了限制明串珠菌更深一步研究的关键因素。目前，明串珠菌所用到的转化方法主要有细菌接合转移和电击转化，早期研究是利用接合质粒[38]进行的，如今由于电转化方法的易操作和转化效率高而被普遍采用。本实验选择了自杀型质粒载体失活法，此法的主要缺点是整合几率低，需要数千碱基的同源序列，且对受体菌的感受态效率要求较高。所以必须首先得到较高的电击转化率，才能为外源

8、DNA进入明串珠菌提供保障。本文进行了明串珠菌的电击转化条件的优化工作，为深入研究明串珠菌奠定了基础。肠膜明串珠菌CGMCC1.10327，本实验室保藏。pC的构建....303321ErmAM基因的克隆....303322阳性重组子的筛选.......30333基因失活载体的构建....313331LALDH和RALDH基因的克隆....313332质粒重组.....3234讨论........3