aldh和stpk基因敲除对明串珠菌产甘露醇的影响

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1、分类号：密级：UDC：编号：河北工业大学硕士学位论文aldh和stpk基因敲除对明串珠菌产甘露醇的影响论文作者：王立东学生类别：全日制学科门类：工学学科专业：生物工程指导教师：金红星职称：副教授DissertationSubmittedtoHebeiUniversityofTechnologyforTheMasterDegreeofBiologicalEngineeringEFFECTOFALDHANDSTPKGENEKNOCKOUTONMANNITOLPRODUCTIONINLEUCONOSTOCByWangLi-DongSupervisor:Associa

2、teProf.JinHong-XingMay2017I摘要甘露醇被广泛应用于食品、医药、化工和电子等多个领域。目前生产甘露醇的方法主要有四种，植物提取法生产甘露醇存在产品收率低、产物精制手续繁琐、水资源浪费严重等缺点；化学合成法生产甘露醇存在反应条件苛刻、产品纯化困难、环境污染严重等弊端；酶催化法需添加昂贵的辅酶因子，生产成本高；而微生物发酵法生产甘露醇具有产品质量高、转化率高、不产山梨醇等优点。明串珠菌是进行异型乳酸发酵的革兰氏阳性乳酸菌，FDA认可的食品级安全菌株，不产生内毒素，具有较高的产甘露醇能力。本研究分别敲除了明串珠菌的乙醛脱氢酶基因aldh和丝氨

3、酸/苏氨酸蛋白激酶基因stpk，得到相应的基因敲除菌株，再与原始菌株进行生理生化特性比对，从而研究碳代谢的变化规律，为基因工程育种奠定了基础。为探索乙醛脱氢酶对明串珠菌碳代谢的影响，通过两次同源重组构建了肠膜明串珠菌aldh基因敲除菌株。利用携带四环素抗性基因的自杀性同源重组载体，获得了携带抗性标记的aldh基因失活菌株。利用无抗性基因的自杀性同源重组载体，再进行电转化而获得了aldh敲除菌株。葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶、乙醛脱氢酶基因敲除的突变菌株比原始菌株甘露醇的产量提高了18.8%，乙醇产量下降了62%。为揭示丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶对明串珠菌碳代谢的影

4、响，通过两次同源重组构建了肠膜明串珠菌的stpk基因敲除菌株。利用携带α-淀粉酶基因的自杀性同源重组载体，获得了携带α-淀粉酶基因标记的stpk基因失活菌株；利用无标记基因的自杀性同源重组载体，再进行电转化而获得stpk基因敲除菌株。突变菌株的的预筛过程中，采用了蓝白筛选法。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除的突变菌株比原始菌株葡聚糖产量下降了12.8%，甘露醇产量提高了6%。关键词：明串珠菌甘露醇基因敲除乙醛脱氢酶丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶IIIABSTRACTMannitoliswidelyappliedtothefood,pharmaceutical,elect

5、ronandchemicalindustries.Thecurrentmethodsofproductingmannitolweredividedintofourcategories,themethodofplantextractionhassomedisadvantagessuchaslowyield,seriouswasteofwaterresources，andtheproductsrefinementisdifficult.Chemicalsynthesishassomedisadvantagessuchasthehigerreactioncondit

6、ions,seriousenvironmentalpollutionandpurificationofproductsismoredifficult.Themethodofenzymecatalysisneedstoaddexpensivecoenzymefactor,ithasthehighercostofproduction.themicroorganismfermentationhassomeadvantagessuchasthehighquality,highconversionrateanddoesn’tproducesorbitol.Leucono

7、stocisagrampositivelacticacidbacteria,itisrecognizedassafestrain(GRAS)anddoesn’tproduceendotoxin,Leuconostochasthehigherproductioncapacityofmannitol.Inthestudy,weknockedoutaldehydedehydrogenasegeneandserine/threonineproteinkinasegeneinLeuconostocstrainsrespectively.Wecomparedphysiol

8、ogicalcharacterizat