陆地棉cytb5基因之克隆及表达概述

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1、陆地棉Cytb5基因之克隆及表达概述第一章文献综述1.1引言植物在生长发育过程中会受到各种不同因素的影响，包括生物和非生物因素(光照、温度、水分、激素、重金属、氧化等)，把对植物生长不利的各种环境因素统称为逆境胁迫[1]。干旱、盐渍、低温等逆境条件会导致植物水分缺失，影响植物的生长发育，甚至会导致植物死亡[2]。抗逆性是植物响应逆境胁迫的常见方式，主要表现形式有：调节自身生长发育、调节代谢活动、调节渗透平衡、主动关闭气孔以及调动各种功能蛋白参与的直接对抗逆境伤害的各种抗逆性反应[3]。自20世纪70年代以来，一些发达国家的学者就进行了大量逆境植物伤害的防治与治理研究，并发现

2、了一些对逆境植物毒害具有抑制作用的物质[4]。这些物质不仅能改善植物体生理机能、增强植物体的抗逆能力，而且对植物的生长发育都有一定的促进作用[5]。近年来，探索植物的抗逆机制、寻找与植物抗逆相关的基因和蛋白，培育抗逆新品种已成为研究热点。基因工程技术是70年代初兴起的一门新技术，可在分子水平通过改变一个或多个基因的活性来提高植物对不良环境的抵抗力。与传统育种方法相比，基因工程技术手段具有周期性短、精确度高、稳定性好等优点，且随着分子生物学与基因工程技术的迅猛发展，对于我们了解植物抗逆及研究其抗逆机制提供了良好的平台。因此，运用基因工程技术手段，分离与植物抗逆相关的基因，从分

3、子水平上研究植物的抗逆机制，从而提高植物的抗逆能力，具有极其重要的经济价值和社会价值。1.2植物抗逆机制研究进展逆境胁迫对植物的危害主要表现在形态结构和植物的生长发育上，它会抑制植物的营养生长和生殖生长，改变植物的发育过程。而其主要原因是逆境胁迫对植物的生理生化产生了很大的影响，如干旱胁迫、盐胁迫、有机污染、低温胁迫和激素胁迫等。干旱胁迫作用指的是在一定的环境条件下，植物蒸腾消耗的水分大于吸收的水分，植物体出现水分亏缺的情况。干旱胁迫对植物的影响主要表现在以下几个方面：生长受到抑制。植物生长发育过程中对水分高度敏感，尤其是叶片。叶片作为植物的营养器官，是植物进行光合作用、制

4、造养料、气体交换和水分蒸腾的主要场所，同时也是研究植物对逆境胁迫响应的重要方面。研究发现，植物在受到干旱胁迫时，其叶肉细胞的细胞膜系统、叶绿体、线粒体、细胞核等均会受到不同程度的破坏[6]，轻度的水分缺失就会使植物叶片的生长受到显著影响。水分缺失对植物生长有直接和间接两个方面的影响，直接的影响主要表现在缺水会改变细胞的形态，使细胞不能正常分裂。间接影响是指缺水会通过影响光合作用继而进一步影响植物整体的生长。膜系统受到损伤。细胞膜作为联系植物细胞与外界环境的纽带，有着非常重要的作用，它能够阻止细胞外物质自由进入细胞、维持细胞内环境的相对稳定，为细胞中各种生化反应的顺利进行提供

5、天然屏障。但另一方面，细胞为了完成某些特定的生理功能，需与外界环境发生物质﹑能量以及信息的交换。因此细胞必须具备一套完整的细胞膜系统，才能保证自身各种反应的正常进行，但是外界不良环境对植物的胁迫危害,首先表现在膜系统中。干旱胁迫对膜系统的影响主要表现为改变膜的通透性以及发生膜脂的过氧化作用。第二章材料与方法2.1材料菌株：感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α﹑BL21(DE3)均购自北京全式金生物有限公司；根癌农杆菌(Agrobacteriumtumerfaciens)菌株GV3101，由所在实验室保存。载体：克隆载体pGEM-T-eas

6、y购自北京全式金生物有限公司；原核表达载体PET32a﹑植物表达载体pBin438均由所在实验室保存。T4DNA连接酶、各种限制性内切酶、5'-FullRACEKit﹑3'-FullRACEKit、限制性内切酶BamHI、SalI、SDS-PAGE低分子量标准蛋白Marker均购自TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、cDNA反转录试剂盒(RevertAidHMinusFirstStrandcDNASynthesisKit)购自Promega公司；胶回收试剂盒(AgaroseGelDNAPurificationKit)﹑质粒（小量）提取试剂盒均购自上海捷瑞生

7、物工程有限公司；其余试剂均用国产分析纯试剂配制。2.2方法将棉花种子脱绒，用无菌水浸泡，置于25℃光照培养箱中培养，待种子露白后种于培养土（蛭石和营养土按1:1混合）中，在温室中生长，温度27℃，12h光照12h黑暗。棉花苗生长约21d时，可进行后续RNA的提取。将上述反应液置于50℃反应1h；向反应液中加入20μlCH3COONa(3M，pH5.2)、130μlRNase，充分混匀；再加入200μl苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀后离心，将上层水相转移至一新的离心管中；加入200&