酵母细胞的破碎及破碎率的测定

《酵母细胞的破碎及破碎率的测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、试验一酵母细胞的破碎及破碎率的测定一、实验目的1.掌握超声波破碎细胞的原理和操作；2.学习细胞破碎率的评价方法。二、实验原理频率超过15～20kHz的超声波，在较高的输入功率下（100～250W）可破碎细胞。本实验采用JY95-2D超生波细胞粉碎机，其工作原理是：JY92-2D超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器两部分组成。超声波发生器（电源）是将220V、50Hz的单相电通过变频器件变为20～25Hz、约600V的交变电能，并以适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械振动，震动波通过浸入在

2、样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。三、实验器材超声波细胞破碎机，电子显微镜，酒精灯，载玻片，血细胞计数板，接种针。四、试剂和材料（1）酵母细胞悬浮液0.2g/mL的啤酒酵母溶于50mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH为4.7）。（2）马铃薯培养基①马铃薯（去皮切块）200g；②琼脂20g；③蔗糖20g；④蒸馏水1000mL；⑤pH为6.5。选优质马铃薯去皮切块，加水煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，融化后补充加水至1000mL，分装，115℃灭菌2

3、0min。五、操作步骤（1）啤酒酵母的培养①菌种纯化。将酵母菌种转接至斜面培养基上，28～30℃，培养3～4d，培养成熟后，用接种环取一环酵母菌至8mL液体培养基中，28～30℃，培养24h。②扩大培养。将培养成熟的8mL液体培养基中的酵母菌全部转接至80mL液体培养基的锥形瓶中，28～30℃，培养15～20h。（2）破碎前计数取1mL酵母细胞悬浮液经适当稀释后，用血细胞计数板在显微镜下计数。（3）细胞超声波破碎-20-①将80mL酵母细胞悬浮液放入100mL容器中，液体浸没超声发射针1cm。②打开开

4、关，将频率设置中档，超声破碎1min，间歇1min，破碎20次。③取1mL破碎后的细胞悬浮液经适当稀释后，滴一滴在血细胞计数板上，盖上盖玻片，用电子显微镜进行观察，计数。计算细胞破碎率。④破碎后的细胞悬浮液，于12000r/min、4℃离心30min，去除细胞碎片。用Lowry法检测上清液蛋白质含量。六、结果与讨论1、用显微镜观察细胞破碎前后的形态变化。2、用两种方法对细胞破碎率进行评价：一种是直接计数法，对破碎后的样品进行适当的稀释后，通过在血球计数板上用显微镜观察来实现细胞的计数，从而计算出破碎率

5、；另一种是间接计数法，将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清液中的蛋白质含量，也可以评估细胞的破碎程度。试验二细胞核与线粒体的分级分离一、实验目的1.了解离心分离的原理；2.掌握差速离心法分离细胞器的方法及操作。二、实验原理细胞内不同的结构，密度和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆

6、、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。（1）匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。-20-（2）分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度

7、不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。（3）分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。三、实验器材普通离心机，高速离心机，匀浆器，平皿，载玻片，显微镜。四、试剂和材料小白鼠，0.9%NaCl溶液，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙，1%甲苯胺蓝，0.02%詹纳斯绿B染液。五、操作步骤（一）细胞核的分离提取操作步骤1.用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块

8、(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。2.将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。3.剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片I，做好标记，自