小鼠b16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

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1、小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达【摘要】目的:克隆酪氨酸酶基因（TYR）,并在毕赤酵母中表达和纯化其融合蛋白,体外测定纯化的TYR活性。方法:利用RTPCR技术,从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆全长TYR,克隆至pMD18T载体,进行双链核苷酸序列测定。构建TYR毕赤酵母表达质粒pPICZaATYR并导入毕赤酵母PichiapastorisGS115,表达的重组蛋白用SDSPAGE和Westernblot进行分析,采用Co2+离子亲和层析柱纯化TYR并采用TYR多巴速率氧化法体外测定纯化的TYR活性。结果:克隆了TY

2、R基因。构建了重组表达质粒pPICZaATYR。SDSPAGE和Westernblot分析显示,在相对分子质量(Mr)为约53000处出现1条特异性蛋白带,且能与兔抗TYR抗体发生反应。结论:克隆TYR基因片段与基因库所登录的序列相一致,并在毕赤酵母中获得表达和纯化并在体外测定了纯化的TYR活性。【关键词】酪氨酸酶基因黑色素瘤细胞毕赤酵母　　酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)由酪氨酸酶基因（TYR）编码产生,是黑色素生物合成途径中的关键酶,其含量和活性直接影响着黑色素生成的速度和产量。黑色素具有独特的结构和性质,功能多种多样,在人体主要存在

3、于皮肤、眼睛及脑黑质等组织,对人体提供某种形式的保护作用,12但其作用机制尚不清楚。由TYR结构改变或表达失控所导致酪氨酸酶的量或者活性发生改变临床上会引起多种色素性皮肤病的发生［1］。临床上许多皮肤病:如黄褐斑、色素痣、白癜风、白化病等均是由TYR结构改变或表达异常导致酪氨酸酶的量或活性发生改变所引起。基因突变、酪氨酸酶活性异常升高、黑色素合成过度增加被认为是恶性黑色素肿瘤的起因,某些神经性疾病如着色性干皮病,帕金森氏综合症、老年痴呆症都与黑色素缺乏有关,这些疾病均为难治疗性疾病,目前尚未有特异有效的治疗方法。因此寻找调控TYR表达的有效方法对由T

4、YR表达失控引起的多种难治疾病的防治具有重要意义。　　1材料和方法　　1.1材料总RNA抽提试剂TRIzol试剂购自Pharmacia公司;DNA聚合酶为TaKaRa公司产品;兔抗TYR抗体由本研究室制备;SuperscriptOneStepRTPCR试剂盒、zeocin、Pichiapastoris表达菌株GS115和表达载体pPICZaA为Invitrogen公司产品;酵母提取物和蛋白胨为Oxoid公司产品;YPDS平板(20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,20g/L葡萄糖,1mol/L山梨糖醇,20g/L琼脂粉);BMGY培养基(13.

5、4g/LYNB,20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,0.04g/L生物素,100mmol/L磷酸缓冲液pH6.0,10mL/L甘油);BMMY培养基(13.4g/LYNB,20g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,0.04g/L生物素,100mmol/L磷酸缓冲液pH6.0,10mL/L甲醇)。Co2+12NTA琼脂糖介质为qiangen公司产品。限制性内切酶、DNAMarker、dNTP、T4DNA连接酶、克隆载体pMD18等购自TaKaRa公司;PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成。　　1.2方法　　1.2.1小鼠B16黑色素瘤细胞株常规

6、传代培养用含150mL/L胎牛血清,青霉素和链霉素各100mg/L的RPMI1640,37℃、50mL/LCO2饱和湿度环境培养18～24h,待细胞生长至对数生长期,用2.5g/L胰酶消化,计数并收集细胞即可抽提其RNA。TRIzol试剂抽提小鼠B16黑色素瘤细胞的总RNA,以14g/L琼脂糖凝胶电泳检测有无降解,紫外分光光度仪测定其浓度及纯度。　　1.2.2TYR的cDNA克隆参考小鼠的已知TYR基因序列(GenBankAccessionNumberD00440)利用DNAstarprimerSelect计算机软件设计如下PCR引物:Primer

7、sP1(sense)5′GCGAATTCATGTTCTTGGCTGTTTTGTATTGCC3′(EcoRIsiteunderlined),P2(antisense)5′GCCTCGAGTCACAGATGGCTCTGATACAGC3′(XhoIsiteunderlined),采用一步法RTPCR合成目的基因,操作过程按TITANIUMTMOneStepRTPCRKit推荐的程序进行。12　　把一步法RTPCR产物用8g/L的琼脂糖凝胶电泳分离后,割胶回收目的片段,并直接经T/A克隆连接入pMD18T载体中,通过菌液PCR进行初步鉴定后

8、进行DNA测序鉴定。　　1.2.3重组表达载体pPICZαAHisTYR的构建引物的设计合成根据重组质粒