食品发酵实验讲义

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实验一　α－淀粉酶的制备一、实验目的学习并掌握α－淀粉酶的制备工艺。二、实验原理α－淀粉酶广泛存在于植物、哺乳动物和微生物中。α－淀粉酶是内切酶，酶的作用点仅限于淀粉链的α－1，4糖苷键，对α－1，6糖苷键不能作用，但能越过α－1，6糖苷键，将α－1，4糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐变红棕色。在酶解的最初阶段，α－淀粉酶对淀粉的水解速度很快，但当水解到一定程度后，水解虽在继续进行，水解速度却变得缓慢。该酶的最小作用底物是麦芽三糖以上的低聚糖，对麦芽三糖的作用很弱，对麦芽糖没有水解能力。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是当今工业酶制剂的主要生产菌种之一，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。本实验利用高产α－淀粉酶的枯草芽孢杆菌T2生产α－淀粉酶用于制备淀粉水解糖。三、实验器材1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）T22.仪器：洁净工作台、灭菌锅、振荡培养箱、高速冷冻离心机、高压灭菌锅四、实验步骤1.培养基的制备与灭菌发酵培养基：蛋白胨5g，酵母膏2.5g，葡萄糖0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH2PO41g，MgSO4.7H2O0.25g，CaCl2.2H2O0.1g，H2O500mL，pH7.0。分装于100mL锥形瓶中，每瓶50mL，121℃灭菌20min。2.接种与产酶培养接种环灼烧灭菌后，轻轻刮取斜面种子培养基中的少量菌体，接入液体培养基中，并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦，使菌体分散于液体中。37℃振荡培养48h。3.离心将发酵液置高速冷冻离心机中10000r/min离心10min，除菌体，上清液即为α－淀粉酶粗酶液。13 实验二　糖化酶的制备一、实验目的学习并掌握黑曲霉发酵产生糖化酶的基本原理及操作方法。二、实验原理糖化酶又称葡萄糖淀粉酶(glucoamylase,EC3.2.1.3)，其作用方式不像α-淀粉酶那样无作用次序,而是从底物链的非还原性末端开始,顺次切下一个个葡萄糖单位,遇到分支处的α-1,6糖苷键时,可将α-1,6糖苷键切开,然后继续作用α-1,4糖苷键,直到产物全部成为葡萄糖为止。但糖化酶对α-1,6糖苷键的作用速度远不及对α-1,4糖苷键的作用速度，因此水解支链淀粉多的淀粉时，需延长水解作用时间或添加部分支链淀粉酶。我国糖化酶的生产主要由黑曲霉优良菌种经深层发酵精制提炼而成。本实验利用黑曲霉具有多种活力较强酶系的特点，利用淀粉类物质为原料，获得制备淀粉水解糖所需的糖化酶。三、实验材料1.菌种：黑曲霉（Aspergillusniger）2.仪器：洁净工作台、灭菌锅、振荡培养箱、高速冷冻离心机、高压灭菌锅四、实验步骤实验流程：保藏菌种®菌株活化及平板扩大培养®摇瓶培养1.菌株活化及扩大培养①制备PDA培养基：去皮马铃薯200g切成小块，加水约500mL，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20g，琼脂20g。溶化后加水定容至1000mL，分装于250ml锥形瓶中，121℃灭菌20min，自然pH。②接种：取灭菌后PDA培养基倒平板，冷却后，接种斜面保藏的黑曲霉（Aspergillusniger）菌种，28℃恒温培养3d。2.摇瓶发酵培养①发酵培养基的制备：玉米粉培养基：玉米粉30g,米糠5g,麸皮5g,加水1000ml,拌匀至无干粉又无结团，分装于250ml锥形瓶内，每瓶100ml,自然pH，121℃灭菌20min。②接种与产酶培养:取培养72h的黑曲霉平板，用打孔器打孔制成菌片。每个锥形瓶中接种12片，28℃振荡培养96h。3.离心将摇床培养4d的黑曲霉发酵液4层纱布过滤后离心（10000r/min，10min）除菌体，所得上清液即为糖化酶粗酶液。13 实验三糖化酶活力测定一、实验目的1.掌握糖化酶酶活定义及其计算方法。酶活定义：将1g固体酶粉（或1ml液体酶），于40℃、pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。2.掌握糖化酶的测定方法及原理。二、实验原理糖化酶是一种外切型糖苷酶，可从淀粉分子的非还原性末端依次水解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖。本实验根据3，5．二硝基水杨酸(DNS)与葡萄糖共热后被还原成棕红色的3－氨基－5硝基水杨酸在波长540nm处有较强光吸收且吸光度值与葡萄糖量呈正比的原理，利用分光光度计测定显色反应的吸光度值并根据吸光度值与葡萄糖含量的相互关系（见附图）确定糖化酶活力。附图：葡萄糖标准曲线三、实验材料1.仪器：恒温水浴锅、分光光度计、秒表、比色管、玻璃仪器等2.酶液：实验二所得粗酶液3.试剂13 （1）0.2mol/LpH4.5醋酸缓冲液：称取16.4g无水醋酸钠，溶解并定容至1000mL(A液)。取分析纯冰醋酸11.6mL定容至1000mL（B液）。分别取A液25.5mL，B液25.5mL混合,加50mL蒸馏水。（2）1mo1/LNaOH溶液:称取40gNaOH加蒸馏水溶解，定容至1000ml。（3）1%3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100g溶于400mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH5g，3，5-二硝基水杨酸5g，苯酚1g，亚硫酸钠0.25g，搅拌至溶。冷却后定容至500mL，储于棕色瓶室温保存。（4）2％可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉(预先于100～105℃烘干约2h)，加少量蒸馏水调匀，倾入80mL左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后定容至100mL。四、实验步骤　于甲、乙两支50mL比色管中，分别加入2％可溶性淀粉25mL及0.2mol/L醋酸缓冲液5mL，摇匀后置40℃恒温水浴中预热5～10min。在甲管中加入待测酶液2mL，乙管中加2mL蒸馏水作对照，摇匀，立即记时，准确反应30min。取出试管，各加1mo1/LNaOH溶液0.2mL终止酶反应，冷却至室温。吸取上述反应液与空白液各2.5mL于25mL比色管中，用蒸馏水定容至刻度。分别吸取稀释液2mL于试管中，加入2mLDNS，共同沸水浴3min，冷却至室温后测定540nm处的光吸收值。比色时空白液用于调零。五、实验结果根据下式计算出发酵液的酶活大小X＝A×B×32.2××n×2式中　X——糖化酶活力（u/mL）A——根据OD值查出的葡萄糖量B——吸取稀释后糖化液2mL，换算为1mL，即1/21/2——吸取酶液2mL，换算为1mLn——糖化液稀释倍数（10×）2——反应30min，换算成1h32.2——反应液的总体积（mL）13 实验四　淀粉水解糖的制备一、实验目的学习并掌握淀粉水解糖的酶法制备工艺。二、实验原理根据淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同，可将淀粉的水解方法分为酸解法、酸酶结合法和酶解法。酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步，第一步是利用α－淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。酶解法制葡萄糖的优点有：（1）酶水解过程条件比较温和，不需耐高温、高压和耐酸的设备，便于就地取材。（2）由于酶具有专一性，水解副反应少，所得糖液纯度高，淀粉的转化率高。（3）可在较高淀粉乳浓度下水解。酸解法一般使用10～12°Bé（含淀粉18%～20%）；酶解法用20～23°Bé（含淀粉34%～40%），而且可以采用粗原料。（4）用酶解法制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量高，有利于糖液的精制。三、实验材料1.材料：可溶性淀粉　α－淀粉酶　糖化酶　CaCl22.仪器：恒温水浴锅四、实验步骤1.淀粉的液化称取淀粉2g，加水至100mL，滴加NaOH调节pH为6.0～6.5，加0.11gCaCl2使Ca2＋浓度达到0.01mol/L，加入50mL实验一中枯草芽孢杆菌T2产生的α－淀粉酶粗酶液，在85～90℃下保温30min，碘液检测显棕色时，迅速升温至100℃，加热5min使α－淀粉酶失活，即可转入糖化阶段。2.淀粉的糖化将上述液化液降温至60℃，调整pH为4.0～4.5，按100u/g淀粉的量加入实验二中黑曲霉产生的糖化酶粗酶液，保温48h左右，分别在0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、6h、12h、24h、48h取反应液加入碘液5ml，观察颜色变化。五、实验结果接近碘液颜色时表明糖化完毕。13 实验五　柠檬酸的发酵与结晶一、实验目的掌握用液体发酵法生产柠檬酸及用钙盐法获得柠檬酸结晶的方法。二、实验原理以淀粉质为原料发酵生产柠檬酸的微生物，都需要先将淀粉分解成葡萄糖，然后再进一步由葡萄糖生成柠檬酸。由于黑曲霉自身能产生液化酶和糖化酶，且糖化酶活力较高，故柠檬酸生产的糖化、发酵是由黑曲霉（Aspergillusniger）一个菌株完成的，即黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。发酵前期我们利用了黑曲霉产生的糖化酶来制备淀粉水解糖（实验二），本实验利用钙盐法从后期黑曲霉柠檬酸发酵液中分离提取并获得柠檬酸的结晶。钙盐法结晶柠檬酸的主要原理是，在除杂后的发酵液中加钙盐生成柠檬酸钙沉淀，达到与其它可溶性杂质分开的目的；然后在柠檬酸钙中加入硫酸酸解，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，浓缩除去硫酸钙沉淀后的柠檬酸溶液即得柠檬酸结晶。主要反应式为：2C6H8O7·H2O+3CaCO3®Ca3(C6H5O7)2·4H2O↓+3CO2↑+H2OCa3(C6H5O7)2·4H2O+3H2SO4+4H2O®2C6H8O7·H2O+3CaSO4·2H2O↓CaCO3+H2SO4®CaSO4↓+H2O+CO2↑附录：1.根据柠檬酸的生成量，由上面反应式可计算出中和柠檬酸所需CaCO3的量（每中和C6H8O7·H2O100g需要CaCO371.5g）及酸解时加入H2SO4的量（每加入1gCaCO3需要H2SO40.98g）。2.柠檬酸含量的测定：吸取1mL除杂后的上清液，加入到100mL锥形瓶中，再加适量的去离子水，加2～3滴1％酚酞试剂，用0.1429mol／LNaOH进行滴定至微红色，计算用去的NaOH体积，记为柠檬酸的百分含量（每消耗1mLNaOH为1%的酸度，即每100ml柠檬酸溶液中所含柠檬酸的质量为1g），用柠檬酸的百分含量乘以发酵液的体积即柠檬酸的含量。三、实验材料1.仪器：恒温水浴锅，鼓风干燥箱，离心机2.发酵液：实验二中摇床培养4d的黑曲霉发酵液3.试剂：CaCO3，1％酚酞试剂硫酸溶液（1mol／LH2SO4）氢氧化钠溶液（NaOH，0.1429mol／L）13 四、实验流程柠檬酸发酵液®离心去除菌体及残渣®CaCO3中和上清液®离心得柠檬酸钙沉淀®H2SO4酸解®离心除硫酸钙沉淀®浓缩含柠檬酸的上清液®柠檬酸结晶五、实验步骤1.除杂：将实验二所得粗酶液加热至80℃保温30min，离心（4000r/min，10min）取上清，用酸碱滴定法测上清液中柠檬酸含量（方法见上附录）。2．CaCO3中和沉淀：根据柠檬酸的含量计算出CaCO3的添加量。在上述上清液中，边搅拌边缓慢加入CaCO3，然后置85℃恒温水浴中加热，保温搅拌30min，趁热离心（4000r/min，10min），并用80℃左右的热水洗涤离心后的沉淀。3．酸解：在柠檬酸钙沉淀中加入100mL去离子水调匀，再加热至85℃，加入H2SO4溶液（添加量根据中和所用CaCO3的量计算），边加边搅拌，之后继续保温搅拌30min，离心（4000r/min，10min），得清亮棕黄色的酸解液。4．浓缩：将酸解液置70℃鼓风干燥箱中，过夜浓缩。5．结晶：将浓缩液置50℃恒温水浴锅中结晶。50℃保温40min后关掉电源，自然降至室温，得柠檬酸结晶。六、实验结果1.将实验中所得数据填入下表项目测定或计算值柠檬酸含量中和所需CaCO3的量酸解时添加H2SO4溶液的体积2.描绘柠檬酸的晶体形态。七、注意事项结晶过程注意控制中和及酸解时加入的硫酸量不应过多，否则易造成结晶后得到黑糊状杂质。13 实验六　柠檬酸的纸层析鉴定一、实验目的掌握用纸层析鉴定柠檬酸的方法。二、实验原理纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法，由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛用于物质的分离及定性和定量分析。本实验用纸层析对实验五获得的柠檬酸进行鉴定，所用的展开剂是由水饱和的有机溶剂组成，由于水与滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低，形成固定相，而有机溶剂与滤纸亲和力弱，可在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各组分在两相中的分配系数不同，在流动相中的移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而在滤纸上形成距原点不等的层析点。Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离三、实验材料1.器材：新华1号滤纸，喷雾器,培养皿，吹风机等。2.试剂：2%柠檬酸标准溶液及2%草酸标准溶液展开剂：正丁醇：甲酸：水：冰醋酸=4：1：4：1（体积比）摇匀。显色剂：称取溴甲酚绿粉末0.1g移至研钵中，分数次加入适量的0.01mol/LNaOH溶液，仔细研磨直至溶解为止，最终用蒸馏水稀释至250ml，配成0.04%溴甲酚绿试剂。（注意展开剂要现配现用，出现分层后不能继续使用）四、实验步骤1.滤纸的准备：取滤纸（新华一号滤纸4×15cm）1张，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个“+”作为点样位置，共3个点。2.点样：分别点上标准柠檬酸溶液、标准草酸溶液、柠檬酸样品溶液，每个点样10uL重复2次，每次点样后要用吹风机冷风吹干，每点在纸上扩散的直径约3～5mm，注意点样时勿用手直接触碰滤纸。点样完毕用标签纸或大头针将滤纸做成筒形，点样面向外,注意纸的两边不要接触。3.展层：培养皿中加入展开剂，液层不要超过点样线，（高约1.5cm，约50～60mL溶剂）将筒状滤纸竖直放入，待溶剂到达标志线后取出，冷风吹干。展层时间约0.5～1h。4.显色：取出滤纸，用电吹风吹干,用喷雾器喷上显色剂后再吹干。五、实验结果1.绘出纸层析的显色结果；2.测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算Rf值。13 实验七　葡萄酒的酿制葡萄酒是葡萄汁发酵而成的低度酒精饮料，它的主要成分有单宁、酒精、糖分、有机酸等。葡萄酒的品种繁多，按酒色分为白葡萄酒、桃红葡萄酒、红葡萄酒；按酒中糖分含量分为干葡萄酒、半干葡萄酒、半甜葡萄酒、甜葡萄酒；按饮用方式分为餐前、佐餐和餐后葡萄酒；按酿造方法分为天然葡萄酒、加强葡萄酒、添香葡萄酒；按酒中CO2含量分为静酒和起泡酒。葡萄酒的生产工艺成熟，原料来源丰富。既可工厂大规模生产，又可庄园小批量酿造。一、实验目的学习葡萄酒酿制的原理，掌握干白和干红葡萄酒酿制工艺。二、实验原理葡萄酒的酿造原理是利用葡萄皮自带的酵母或人工接种的酵母菌，将葡萄汁中的葡萄糖、果糖发酵，生成酒精、二氧化碳，同时生成副产物高级醇、脂肪酸、挥发酸和酯类等，并将葡萄原料中的色素、单宁、有机酸、果香物质、无机盐等所有与葡萄酒质量有关的成分，都带到发酵的原料酒中，再经陈酿澄清，使酒质达到清澈透明、色泽美观、滋味醇和、芳香宜人。三、实验材料与仪器1．材料：新鲜葡萄，活性干酵母菌，6％的亚硫酸，白砂糖，酒石酸(柠檬酸)，滤纸，酒精，皂土，纱布，漏斗。2.试剂：0.1mol／LNaOH标准溶液，4g/L浓度的碘液(精确浓度为3.97g/L)，2％可溶性淀粉溶液，1.0g/L标准葡萄糖溶液（盐酸酸化），1mol／LNaOH溶液，1/3浓度的硫酸。3.仪器：手持式糖度，酒精度计，密度计。四、干白葡萄酒的酿造1.工艺流程成熟的葡萄（红皮白肉或白葡萄）→分选→除梗破碎→榨汁→加二氧化硫→静置澄清→分离清汁→调整成分→发酵→分离酒泥→原酒→贮存→换容器→密闭贮存→下胶→过滤→冷冻→过滤→灌装→干白葡萄酒2．操作步骤（1）器具准备破碎葡萄之前，先将用具洗刷干净，发酵及贮酒容器用6％的亚硫酸溶液冲洗，或用硫磺烟熏进行消毒。所用器具应选择水缸、上釉陶缸、玻璃瓶、橡木桶、瓷盆等，不得用铁、铜制作的工具，因葡萄汁（酒）与铁、铜接触，会使铁、铜离子溶进葡萄汁，而使酒变质败坏。（2）原料与分选13 酿酒用的葡萄要成熟。成熟的葡萄种子为褐色或深褐色，绿色的葡萄果皮由绿色变为黄色或浅黄色，果实透明发亮。红色葡萄呈紫色或紫黑色，味酸甜。将采收的葡萄剔除霉烂的果子和青果以及其他杂质，取样化验酸度，糖度。（3）破碎与压榨将分选好的葡萄放在瓷盆内，除去果梗，榨取果汁，汁与皮渣分别放在不同的玻璃瓶内进行发酵。葡萄汁发酵后为一级酒，皮渣发酵后为普通酒。（4）果汁澄清葡萄经破碎榨汁后，按每升葡萄汁加入2.5ml6％的亚硫酸溶液（相当于添加二氧化硫150mg/L），静置24h待汁液澄清后，分离沉淀物，得澄清葡萄汁。（5）果汁成分调整我国大多数地区葡萄的含糖量在12％～20％，发酵后生成7％～11.7％的酒精，因酒精含量较低，所以需要在葡萄汁发酵期，补加白砂糖,使发酵后生成所需浓度的酒精。实际生产上，每生成1％酒需要1.7度糖（1.7％）。果汁含糖量调整到21-23％，用葡萄汁溶解糖并在发酵旺盛时添加。式中　m——加糖量（g）　0.625——1kg糖溶解后所占体积（L）　　　V——葡萄汁体积（L）　　ψ——需要达到的酒精含量（％）　　b——葡萄汁的含糖量（％）（6）酸度调整配制葡萄酒，要求果汁含酸量在0.8～1.2g/100ml为宜，果汁的酸度如果低于0.5g/100ml，可补加酒石酸或利用酸度高的品种葡萄混合发酵，使其酸度达到要求。(本实验不调)（7）发酵　将调整成分的果汁放在玻璃试剂瓶中，果汁量约为容器的80％，不宜过量，以防发酵时产生泡沫溢出而造成损失。瓶口盖上安有发酵栓的橡胶塞，使发酵产生的CO2排出，又不致使发酵瓶外的杂菌进入发酵瓶。本实验用添加0.04％的活性干酵母进行发酵，方法是先用30～40℃的水活化酵母20～30min。发酵过程中，一般温度为14～18℃，不允许超过20℃。可把发酵瓶放在盛水的浴盆内，通过调节浴盆内水温（比如加冰块或换水）控制发酵温度，也可把发酵瓶放在控温培养箱内进行发酵。当发酵进入旺盛期时（液面有大量气泡）一次性加入所要调整的糖（用正在发酵的葡萄汁溶解糖）低温发酵的时间较长，主发酵5～10d，后发酵为15～25d，当发酵液面较平静，温度下降，残糖小于4g/L时（口尝发酵液感觉不到甜味），表明发酵已完成。13 在发酵过程中，每天测两次温度和残糖。测量前，把温度计用70％酒精擦洗，把取样管经干热灭菌，以防发酵液染菌。取样及测温均应在发酵液位中部。（8）分离酒泥发酵结束15～20d或1个月后即可分离酒脚，把相同的酒合并入一个容器内，即用同品种、同类型的酒添至容器容积的90％～95％，同时按每升2.5ml加入6％的亚硫酸溶液,以防杂菌污染引起挥发酸升高。添完后，再用发酵栓封闭，进入贮存期。（9）葡萄酒的贮存在贮存期应定期检查，经常保持贮酒室的卫生，切忌苍蝇侵入酒内并及时添加二氧化硫，添加量以化验为依据。酒中保持游离二氧化硫在30～50mg/L，小于需添加。室内定期消毒，冬季一般一月一次，夏季7～10d一次。①换容器（大规模生产称为换桶）：后发酵结束后，进行第2次换容器，大约5个月后进行第3次换容器。每次换容器后都应补充二氧化硫，使酒中保持游离二氧化硫在30-50mg/L。密封贮存。贮存约1年。②添满（大规模生产称为添桶）：每次换容器尽量使容器满载酒液。（10）下胶皂土下胶方法：将皂土用60～80℃的温开水浸泡，每天搅拌数次，制成6%的悬浮液，每升加6％的亚硫酸溶液1.6ml(相当于添加二氧化硫100mg/L),备用。按每升葡萄酒加0.4～1g/L(本实验加0.8g/L)加含有6%皂土的悬浮液，边加边搅拌后静置5～7d酒液彻底澄清后，虹吸分离沉淀物并过滤。（11）过滤原酒一般酒精含量为大于10%，含酸量0.5～0.7g/100ml，挥发酸含量在0.05g/100ml以下，含糖量在0.4g/100ml以下。（12）冷冻（生产上通常利用冬季温度降至-4～6℃维持7～15d后将酒与含酒石酸氢盐的酒泥分离，除去酒石）五、红葡萄酒酿造工艺1.工艺流程成熟的红葡萄→分选→去梗破碎→加二氧化硫→发酵→压榨→调整酒精含量→后发酵→换容器→贮存→换容器→贮存陈酿→下胶→过滤→→冷冻→过滤→灌装→干红葡萄酒2.操作步骤干红葡萄酒的酿造工艺与干白葡萄酒的酿造工艺相似。不同的是，葡萄破碎后不压榨，将皮肉汁混合发酵，以浸提果皮上的色素，不同的操作如下：（1）发酵　发酵温度可达33℃，生产中控制在28～30℃之间，主发酵期13 一般为3～5d。红葡萄酒发酵分以下3个阶段：发酵初期：主要为酵母繁殖阶段，初期果浆平静，随后在酵母的作用下，开始发酵，温度渐升，葡萄皮被产生的CO2顶浮于液面，进入发酵盛期。发酵盛期：称为主发酵期，每天需用干净的木棒搅拌2～3次，量大的也可用酒泵搅拌，将酒“帽”搅散压入汁中。当发酵3～5d后（根据葡萄品种和所要做酒的类型确定，如做解百纳类型的干红酒一般要5～6d视颜色浸提程度分离皮渣；做果香型干红酒一般需3～5d）分离皮渣，压榨。（2）压榨先用竹筛粗滤，然后将葡萄皮渣装入白布袋中，用手或木棒挤压榨汁，量大者可用螺旋式压榨机进行压榨。质量好的压榨酒可与粗滤原酒混合，装入经洗净消毒的贮酒容器中，但不得超过容量的95％以继续进行后发酵。压榨后的皮渣可进行蒸馏制取白兰地。（3）后发酵在后发酵期，控制品温不超过20℃，后发酵进行15～20d左右，当发酵液糖达4g/L以下时说明整个发酵结束。应及时添加SO2，并保证满容器，在原酒液上添加亚硫酸或高度酒精，防止染菌或氧化。（4）成品的调配根据产品标准和风格，将不同的品种、不同的年份酿成干酒进行勾兑（高档酒不允许调砂糖和脱臭酒精或白兰地），以达获得优异的感观质量和合格的理化指标。（5）冷冻(略)（6）过滤酒配制好之后进行过滤（方法同前），使酒液达到澄清透明。（7）装瓶杀菌将过滤的澄清酒液调整游离二氧化硫含量在30～40mg/L（游离二氧化硫约为总二氧化硫的2/3）后装瓶压盖，瓶装在低温、清洁卫生的场所保存。六、测定方法1.糖度测定斐林试剂滴定法，或用手持式折光仪测葡萄汁的糖度（°Bx），再通过查表得糖含量。2.酸度测定0.1mol/LNaOH标准溶液滴定。3.酒精含量测定发酵液经蒸馏后，用酒精比重计测得。4.游离硫、总硫测定①13 总二氧化硫的测定：取葡萄酒25mL，加入250mL碘量瓶中，加入10mL水稀释，再加入1mol/L氢氧化钠10mL，加塞，摇匀，反应10min，添加1/3浓度的硫酸3～5mL，2～3滴2％淀粉指示剂，立即用4g/L(此浓度的碘液1mL相当于二氧化硫1mg)的碘液测定。②游离二氧化硫的测定：在反应瓶中加入25mL酒样，加入20mL水稀释，添加1/3的硫酸3mL，2～3滴2％淀粉指示剂，立即用4g/L的碘液测定。13