发酵工艺实验讲义

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发酵工艺实验讲义邓静游见明四川理工学院生物工程系二00五年九月 试验一酒精发酵一、实验目的酒精发酵是典型的糖的无氧酵解途径。通过实验让学生理解糖的无氧酵解途径并了解厌氧发酵的工艺过程，同时掌握测定发酵醪液酒精含量的方法。二、实验原理在无氧的培养条件下，酵母菌利用糖发酵为酒精和二氧化碳的作用即为酒精发酵，反应式为：C6H12O62C2H5OH＋2CO2通过对发酵醪液酒精含量的测定，可以判断酒精发酵的进程。三、实验材料及仪器1.10升机械搅拌发酵罐；2.酒精蒸馏装置；3.酒精表0~12%；4.甘薯粉；5.活性干酵母；6.BF-7658淀粉酶；7.糖化酶。四、实验过程1.糖液制备⑴淀粉液化：以1﹕35的加水比，用70~80℃的温水调粉浆1000毫升，立即加入BF-7658淀粉酶（4000u）2.5%，于电炉上加热至90~93℃保温5~10分钟，继续加热煮沸1小时，加热时需补充水分。⑵淀粉糖化：将煮沸的醪液冷却至60~62℃，加入糖化酶（50000u）0.3%糖化30分钟，糖化完毕入发酵罐灭菌备用。2.酒精发酵⑴活性干酵母活化：按糖液量0.5%称取活性干酵母，用1﹕40的2%蔗糖溶液，38~40℃保温活化30分钟。⑵接种发酵：将活化好的酵母接入到发酵罐中，35~38℃培养发酵68~72小时。⑶酒精含量测定：观察并记录酒精发酵工艺过程。发酵醪温度每小时测1次，2小时记录1次；发酵醪液酒精含量每间隔12小时测定1次并记录。附酒精含量测定方法。附：酒精度的测定一原理 试样以蒸馏法除去不挥发物质，用比重瓶或酒精计测定蒸馏液之比重。根据蒸馏液的比重查比重—酒精度对照表或直接从酒精计读数求得酒精含量（%，v/v或%，w/w）。二仪器⑴蒸馏仪器蒸馏烧瓶容积，500ml。冷凝器，套管长度不短于400mm;内管直径9mm.⑵比重瓶主体容积25ml;温度计分度值为0.2摄氏度。⑶恒温水浴准确度0.1摄氏度。三操作⑴酒精体积百分浓度（%，v/v，）的测定方法取一清洁的100ml容量瓶，用被测试样荡洗2_3次。然后注满至近刻度，将容量瓶置于20℃水浴中20~30min，用20℃试样补足至刻度。将试样移入500ml蒸馏瓶，用50ml冷水分3次冲洗容量瓶，洗液一并移入蒸馏烧瓶。将烧瓶接入蒸馏装置。用装试样的原容量瓶作为接受器进行蒸馏。为防止酒精挥发，在气温较高时蒸馏，应将容量瓶浸入冰水浴中，并使应接管出口伸入容量瓶的球部。当蒸馏液体积达到容量的95~98%时停止蒸馏。用少许水洗涤应接管的头端，洗液并入容量瓶。塞好容量瓶，摇匀。如在刻度以上瓶颈沾有液滴，小心用少许水洗下。置容量瓶于20℃水浴中30min，并用清洁的毛细滴管或洗瓶加同样温度的水至刻度，再次摇匀。用比重瓶测定蒸馏液20℃的比重。由附录查得试样以体积百分比表示得酒精含量。当对分析结果仅要求达到一位小数得准确度的时候，可将蒸馏液用酒精计直接测定。㈡酒精重量百分浓度得测定方法称取100.00g试样于500ml蒸馏瓶中，加入50ml水，按操作㈠进行蒸馏。蒸馏液用一已称重的100ml容量瓶作为接受器，瓶内预先加入5ml水，并将冷凝器应接管出口插入水中。当蒸馏液达到96ml左右时停止蒸馏，用清洁得毛细滴管或洗瓶加水至蒸馏重量为100.0g，摇匀。用比重瓶测定蒸馏液的比重。由表查试样以重量百分数表示的酒精含量。四说明蒸馏过程中乙醇蒸汽的逃逸，会严重影响测定结果的准确性。因此蒸馏前必须仔细检查仪器各连接处是否严密。若蒸馏中出现漏气，必须重新测定。蒸馏时，应先小火加热，待溶液沸腾后再慢慢用大火焰。对于易产生泡沫的酒样加少量消泡剂。但是加过消泡剂的试样蒸馏残液，不能用来作浸出物的测定。葡萄酒和啤酒试样的挥发酸过高时，会使测定结果引入较大误差。应根据总酸测定结果，用氢氧化钠准确液中和后，再进行蒸馏。对于有高含量二氧实验二毛霉的分离和豆腐乳的制备1目的1.1学习毛霉的分离和纯化方法。 1.2掌握豆腐乳发酵的工艺过程。1.3观察豆腐乳发酵过程中的变化。2原理 豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成。民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代酿造厂多采用蛋白酶活性高的鲁氏毛霉或根霉发酵。豆腐坯上接种毛霉，经过培养繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，在长时间后发酵中与淹坯调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使腐乳坯蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸，与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香等豆腐乳特色。3材料3.1菌种毛霉斜面菌种。3.2培养基（料）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），无.菌水、豆腐坯、红曲米、面曲、甜酒酿、白酒、黄酒、食盐3.3仪器和器具培养皿、500mL三角瓶、接种针、小笼格、喷枪、小刀、带盖广口玻瓶、显微镜、恒温培养箱。4流程4.1毛霉的分离配制培养基→毛霉分离→观察菌落→显微镜检。4.2豆腐乳的制备悬液制备→接种孢子→培养与晾花→装瓶与压坯→装坛发酵→感官鉴定5方法5.1毛霉的分离5.1.1配制培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。经配制、灭菌后倒平板备用。5.1.2毛霉的分离从长满毛霉菌丝的豆腐坯上取小块于5mL无菌水中，振摇，制成孢子悬液，用接种环取该孢子悬液在PDA平板表面作划线分离，于20℃培养1～2d，以获取单菌落。5.1.3初步鉴定5.1.3.1菌落观察呈白色棉絮状，菌丝发达。5.1.3.2显微镜检于载玻片上加1滴石碳酸液，用解剖针从菌落边缘挑取少量菌丝于载玻片上，轻轻将菌丝体分开，加盖玻片，于显微镜下观察孢子囊、梗的着生情况。若无假根和匍匐菌丝、或菌丝不发达，孢囊梗直接由菌丝长出，单生或分枝，则可初步确定为毛霉。5.2豆腐乳的制备5.2.1悬液制备5.2.1.1毛霉菌种的扩繁 将毛霉菌种接入斜面培养基，于25℃培养2d；将斜面菌种转接到种子培养基中，于同样温度下培养至菌丝和孢子生长旺盛，备用。52.1.2孢子悬液制备于上述三角瓶中加入无菌水200mL，用玻璃棒搅碎菌丝，用无菌双层纱布过滤，滤渣倒还三角瓶，再加200mL无菌水洗涤1次，合并滤于第一次滤液中，装入喷枪贮液瓶中供接种使用。5.2.2接种孢子用刀将豆腐坯划成4.1cm×4.1cm×1.6cm的块，将笼格经蒸汽消毒、冷却，用孢子悬液喷洒笼格内壁，然后把划块的豆腐坯均一竖放在笼格内，块与块之间间隔2cm。再用喷枪向豆腐块上喷洒孢子悬液，使每块豆腐周身沾上孢子悬液。5.2.3培养与晾花将放有接种豆腐坯的笼格放入培养箱中，于20℃ 左右下培养，培养20h后，每隔6h上下层调换一次，以更换新鲜空气，并观察毛霉生长情况。44～48h后，菌丝顶端已长出孢子囊，腐乳坯上毛霉呈棉花絮状，菌丝下垂，白色菌丝已包围住豆腐坯，此时将笼格取出，使热量和水分散失，坯迅速冷却，其目的是增加酶的作用，并使霉味散发，此操作在工艺上称为晾花。5.2.4装瓶与压坯将冷至20℃以下的坯块上互相依连的菌丝分开，用手指轻轻在每块表面揩涂一遍，使豆腐坯上形成一层皮衣，装入玻璃瓶内，边揩涂边沿瓶壁呈同心圆方式一层一层向内侧放，摆满一层稍用手压平，撒一层食盐，每100块豆腐坯用盐约400g，使平均含盐量约为16%，如此一层层铺满瓶。下层食盐用量少，向上食盐逐层增多，腌制中盐分渗入毛坯，水分析出，为使上下层含盐均匀，腌坯3～4d时需加盐水淹没坯面，称之为压坯。腌坯周期冬季13d，夏季8d。5.2.5装坛发酵5.2.5.1红方按每100块坯用红曲米32g、面曲28g、甜酒酿1kg的比例配制染坯红曲卤和装瓶红曲卤。先用200g甜酒酿浸泡红米和面曲2d，研磨细，再加200g甜酒酿调匀即为染坯红曲卤。将腌坯沥干，待坯块稍有收缩后，放在染坯红曲卤内，六面染红，装入经预先消毒的玻瓶中。再将剩余的红曲卤用剩余的600g甜酒酿兑稀，灌入瓶内，淹没腐乳，并加适量面盐和50度白酒，加盖密封，在常温下贮藏6个月成熟。5.2.5.2白方将腌坯沥干，待坯块稍有收缩后，将按甜酒酿0.5kg、黄酒1kg、白酒0.75kg、盐0.25kg的配方配制的汤料注入瓶中，淹没腐乳，加盖密封，在常温下贮藏2～4个月成熟。5.2.6质量鉴定将成熟的腐乳开瓶，进行感官质量鉴定、评价。6结果从腐乳的表面及断面色泽、组织形态（块形、质地）、滋味及气味、有无杂质等方面综合评价腐乳质量。实验三甜酒酿的制作1 目的1.1通过甜酒酿的制作了解酿酒的基本原理。1.2掌握甜酒酿的制作技术。2 原理    以糯米（或大米）经甜酒药发酵制成的甜酒酿，是我国的传统发酵食品。我国酿酒工业中的小曲酒和黄酒生产中的淋饭酒在某种程度上就是由甜酒酿发展而来的。    甜酒酿是将糯米经过蒸煮糊化，利用酒药中的根霉和米曲霉等微生物将原料中糊化后的的淀粉糖化，将蛋白质水解成氨基酸，然后酒药中的酵母菌利用糖化产物生长繁殖，并通过酵解途径将糖转化成酒精，从而赋予甜酒酿特有的香气、风味和丰富的营养。随着发酵时间延长，甜酒酿中的糖分逐渐转化成酒精，因而糖度下降，酒度提高，故适时结束发酵是保持甜酒酿口味的关键。3 材料3.1材料    糯米、酒药3.2仪器和器具    手提高压灭菌锅，不锈钢丝碗，滤布，烧杯，不锈钢锅。 4 流程 5 方法5.1洗米蒸饭    将糯米淘洗干净，用水浸泡4h, 捞起放于置有滤布的钢丝碗中，于高压锅内蒸熟（约0.1Mpa, 9min），使饭“熟而不糊”。5.2淋水降温    用清洁冷水淋洗蒸熟的糯米饭，使其降温至35℃左右，同时使饭粒松散。5.3落缸搭窝    将酒药均匀拌入饭内，并在洗干净的烧杯内洒少许酒药，然后将饭松散放入烧杯内，搭成凹形圆窝，面上洒少许酒药粉。盖上培养皿盖。5.4保温发酵    于30℃进行发酵，待发酵2天后，当窝内甜液达饭堆2/3高度时，进行搅拌，再发酵1天左右即可。6 结果6.1发酵期间每天观察、记录发酵现象。6.2对产品进行感官评定，写出品尝体会。实验四细菌生长曲线的测定1 目的1.1 了解细菌生长曲线特点及测定原理1.2 学习用比浊法测定细菌的生长曲线 2 原理    将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。    测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。3 材料 3.1菌种    大肠杆菌3.2培养基   肉膏蛋白胨培养基3.3 仪器和器具    721分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。4 流程    种子液→标记→接种→培养→测定5 方法  5.1种子液制备    取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液中，静止培养18h作种子培养液。5.2标记编号    取盛有50mL无菌肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶11个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。5.3接种培养    用2mL无菌吸管分别准确吸取2mL种子液加入已编号的11个三角瓶中，于37℃下振荡培养。然后分别按对应时间将三角瓶取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。5.4生长量测定    将未接种的肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。6 结果6.1 将测定的OD值填入下表：时　间(h)      对照    0    1.5    3    4    6      8    10    12    14      16    20光密度值（OD600）6.2 以上述表格中的时间为横坐标，OD600 值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线综合型实验举例实验五米曲霉的固态培养及孢子数和蛋白酶活力的测定 1、实验目的：1.1学习米曲霉固态制曲的方法1.2掌握孢子测定的方法1.3掌握蛋白酶测定方法1.4了解不同条件对米曲霉产孢子数和蛋白酶活力的影响2、实验原理2.1米曲霉制曲原理米曲霉能产蛋白酶、淀粉酶、脂酶等多种酶，其广泛用于酱油、酱类产品的制作，形成酱油和酱类物质独特的色、香、味、体。将纯种的米曲霉接种在麸皮培养基上，保持适宜的条件，米曲霉以麸皮培养基中的糖和氨基酸为养分生长繁殖，并分泌各种酶。2.2蛋白酶活力测定原理蛋白质或多肽水解后生成的含苯环氨基酸对275nm波长紫外光具有最大的吸收值。利用蛋白酶催化酪蛋白的前后在三氯醋酸可溶物中紫外线光密度的变化，可测定酶活力的高低。3、实验材料和仪器3.1材料：麸皮、面粉、豆饼粉；米曲霉菌种；酒精（95％）；稀硫酸（1：10）；2％酪蛋白；4％三氯醋酸；氯化钠等。3.2仪器：固态培养箱；显微镜；血球计数仪；751分光光度计。4、工艺流程麸皮等蒸料冷却接种装箱培养翻料孢子数的测定蛋白酶活力的测定5操作方法麸皮和面粉等按一定比例加水混匀后，放入高压灭菌锅内在121℃蒸煮30min后，冷却到40℃后，接入米曲霉菌种，在一定温度下培养，观察和记录米曲霉生长的典型现象，在培养48h后测定其孢子数，在培养72小时后测定其蛋白酶活力。5.1孢子数的测定方法5.1.1样品稀释精确称取种曲1g（称准至0.002g），倒入盛有玻璃珠的250ml三角瓶内，加入95%酒精5ml、无菌水20ml、稀硫酸（1:10）10ml，在旋涡均匀器上充分振摇，使种曲孢子分散，然后用三层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，务使滤渣不含孢子，最后稀释至500ml。5.1.2制计数板取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子稀释液1小滴滴于盖玻片的边缘处（不宜过多），让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止5min，待孢子沉降。5.3观察计数5.1.3观察用低倍镜头和高倍镜头观察，由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微调螺旋，才能不使之遗漏，如孢子位于格的线上，数上线不数下线，数左线不数右线。5.1.4计数使用16×25规格的计数板时，只计板上四个角上的4个中格（即100个小格），如果使用25×16规格的计数板时，除计四个角上的4个中格外，还需要计中央一个中格的数目（即80个小格）。每个样品重复观察计数不少于2次，然后取其平均值。5.1.5计算 （1）16×25的计数板  孢子数（个/g）=(N/100) ×400×10000×(V/G)=4×104×(NV/G)…………（1）式中N——100小格内孢子总数（个）V——孢子稀释液体积（ml）G——样品重量（g）（2）25×16的计数板孢子数（个/g）=(N/80)×400×10000×(V/G)=5×104×(NV/G) …………………………式中N——80小格内孢子总数（个）V——孢子稀释液体积（ml）G——样品重量（g）5.2酶活力的测定方法取试管两只，每只试管加入样品稀释液1ml，置于40度水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白5ml，精确保温10min。时间到后，各管立即加入0.4mol/L三氯醋酸5ml，以终止反应。继续水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心分离或过滤。取滤液用751分光光度计在275nm处测定其吸收度。空白实验2测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯醋酸5ml，使酶失活，在加酪蛋白。计算：在40度下每1min水解酪蛋白产生1Ug酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。蛋白酶活力单位＝ΔA/10×11×K×NK：常数，吸光度为1时蛋白酶活力单位，由酪氨酸标准曲线得出N:为稀释倍数6、各种因素对制曲的影响（主要是孢子数和酶活力的影响）6.1不同培养基配比的对制曲的影响培养基配比（质量百分比）孢子数（个/g）蛋白酶活力(U/g)麸皮麸皮90％＋面粉10％麸皮80％＋面粉20％麸皮70％＋面粉30％麸皮60％＋面粉40％麸皮50％＋面粉50％6.2不同水分量对制曲的影响以上面的结果确定培养基配比，考查不同水分对制曲的影响初始水分（水为混合物料的质量百分数）孢子数（个/g）蛋白酶活力(U/g)5560657075806.3不同接种量对制曲影响 以上面确定的水分和培养基，考查不同接种量制曲的影响接种量（孢子毫升数）孢子数（个/g）蛋白酶活力(U/g)1015202530356.4不同pH对制曲的影响以上面得到的水分、培养基和接种量考查不同起始pH对制曲的影响培养基原始pH孢子数（个/g）蛋白酶活力(U/g)5.566.577.586.5不同培养温度对制曲的影响以上面得到的数据考查不同温度对制曲的影响不同培养温度（℃）孢子数（个/g）蛋白酶活力(U/g)25283032356.6培养时间对制曲的影响在以上优化的条件下，考查不同培养时间对制曲的影响制曲时间（h）孢子数（个/g）蛋白酶活力(U/g)48566064687276806.7不同氯化钠浓度对蛋白酶活力的影响 在上面得到的条件制曲，采用不同浓度的氯化钠浸提蛋白酶，考查不同浓度达氯化钠对酶活力的影响氯化钠浓度（％）孢子数（个/g）蛋白酶活力(U/g)123456小结：根据上面的实验结果对影响米曲霉制曲的主要条件进行分析，得出结论。