产超光谱β―内酰胺酶肠杆菌科细菌的表型与基因型分析

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1、产超光谱0—内酰胺酶肠杆菌科细菌的表型与基因型分析摘要：目的：研究产超光谱内酰胺酶（ESBL）肠杆菌科细菌的表型与基因型，探讨其耐药性机制。方法：对我院临床分离的50株产ESBL肠杆菌科细通过纸片扩散法，测定产酶菌对不同抗生素的MIC值，作出表型确证；同时采用PCR技术，用针对SHV、TEM、CTX-M基因的特异性引物进行扩增，确定ESBL基因型。结果:60株ESBLs菌株中，肺炎克雷伯氏菌占38.25%，大肠埃希氏菌49.63%，产气肠杆菌3.11%，阴沟肠杆采用菌2.67%,铜绿假单胞菌5.30%，其他1.04%PCR扩增后，SHV、TE

2、MjDCTX-M阳性率分别为21.6%、75.5%、和2.9%o可见我院流行的ESBLs菌株主要为大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌，且以TEM型为主。结论：PCR技术是监控产ESBLs菌株基因型的好方法，对临床抗生素的使用有指导意义。关键词：ESBLs耐药性PCR纸片扩散法细菌感染一直严重威胁着人类的生存。抗生素曾使人类有效控制了许多可怕的细菌感染性疾病，发病率和死亡率明显下降。然而，进入20世纪80年代，产超光谱0—内酰胺酶肠杆菌科细菌的表型与基因型分析摘要：目的：研究产超光谱内酰胺酶（ESBL）肠杆菌科细菌的表型与基因型，探讨其耐药性机制。方

3、法：对我院临床分离的50株产ESBL肠杆菌科细通过纸片扩散法，测定产酶菌对不同抗生素的MIC值，作出表型确证；同时采用PCR技术，用针对SHV、TEM、CTX-M基因的特异性引物进行扩增，确定ESBL基因型。结果:60株ESBLs菌株中，肺炎克雷伯氏菌占38.25%，大肠埃希氏菌49.63%，产气肠杆菌3.11%，阴沟肠杆采用菌2.67%,铜绿假单胞菌5.30%，其他1.04%PCR扩增后，SHV、TEMjDCTX-M阳性率分别为21.6%、75.5%、和2.9%o可见我院流行的ESBLs菌株主要为大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌，且以TEM型为

4、主。结论：PCR技术是监控产ESBLs菌株基因型的好方法，对临床抗生素的使用有指导意义。关键词：ESBLs耐药性PCR纸片扩散法细菌感染一直严重威胁着人类的生存。抗生素曾使人类有效控制了许多可怕的细菌感染性疾病，发病率和死亡率明显下降。然而，进入20世纪80年代，越来越多的细菌产生了耐药性，甚至多重耐药。本课题利用PCR测序等技术对来自本院的产内酰胺酶的肠杆菌的表型和基因型进行测定，研宄其耐药性机制，对于指导临床正确应用抗生素，减少医院内感染的发生，具有重要的临床应用价值。具体报道如下：1.临床材料1.1菌株来源本研究收集2013年10月〜2

5、014年6月间，本院从住院患者送检标本中分离到产ESBLs的肠杆菌科细菌共60株。主要有肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌产气肠杆阴沟肠杆菌、和铜绿假单胞菌等1.2试剂和仪器1.2.1主要试剂TaqDNA聚合酶购自Promega公司dNTP购自上海生物工程公司；质粒提取试剂盒、质粒纯化试剂盒均购自上海申能博彩生物科技有限公司。1.2.2实验仪器电泳仪（水平式）YW型，PTC-100TMPCR扩增仪，抑菌圈测定仪，数控超净工作台TOP-1300，紫外检测仪BIO-BAD2方法2.1ESBLS表型确证试验2.1.1药敏纸片：头孢曲松、头孢他陡、氨曲南、

6、头孢曲松+克拉维酸、头孢他啶+克拉维酸，氨曲南+克拉维酸，药敏纸片均购自英国Oxoid公司。质控菌株：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌购自卫生部药品鉴定所2.1.2?用临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的标准纸片扩散确证法测定。2.2ESBLs基因型确证试验2.2.1引物序列：blaSHV基因引物序列1:5'-TCGGGCCGCGTAGGCATGAT-3'、序列2:57-TCCcGcAGATAAATCACCA-3；blaTEM基因引物序列1:5'-ATAAAATT-CTTGAC-3'、序歹lj2:5'-TTACCAATGCTTAA-TCA-3';b

7、laCTX-M基因引物序列1:5'-CGTTTTGCGATGTGCAG-37、序列2:5Z-ACCGCGATGTCGTTGGT-3z。2.2.2PCR反应步骤：（1）煮沸提取所选5株代表性细菌DNA，制备模板；（2）PCR反应体系：引物1UL,dNTP（200Pmol/PL）1uL,Taq酶0.5U,DNA模板2UL，缓冲液（含Mg2+）5UL,加二次蒸馏水至总体积为50uL。（3）反应条件：94°C30min条件下预变性，94°C30s变性，45°C40s退火，72°C延伸45s,共35个循环。（4）扩增产物置琼脂糖凝胶中电泳lh，观察凝胶

8、成像。3结果经纸片扩散法得60株ESBLs菌株中，肺炎克雷伯氏菌占38.25%，大肠埃希氏菌49.63%，产气肠杆菌3.11%,阴沟肠杆菌2.67%,铜绿假单胞菌5