lysr家族调控因子fkbr1及其靶基因提高子囊霉素产量

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1、LysR家族调控因子FkbR1及其靶基因提高子囊霉素产量EngineeringoftheLysRfamilytranscriptionalregulatorFkbR1anditstargetgenetoimproveascomycinproduction一级学科：化学工程与技术学科专业：生物化工研究生：宋柯璟指导教师：闻建平教授天津大学化工学院二零一七年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津

2、大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要子囊霉素（FK52

3、0）是由吸水链霉菌子囊亚种合成的大环内酯类天然抗生素。子囊霉素及其衍生物具有抗真菌、抗疟疾、抗痉挛、免疫抑制以及促进神经再生等功能。尤其作为免疫抑制剂，子囊霉素在治疗免疫性疾病、皮肤疾病及器官移植排斥反应治疗方面引起了更多的关注。然而，目前子囊霉素的产量仍然较低，其生物合成的调控机制尚未研究清楚，限制了子囊霉素的进一步应用。为了探究子囊霉素合成调控机制，提高子囊霉素产量，本研究确定了子囊霉素合成相关的调控因子FkbR1，并对其功能进行了研究。以吸水链霉菌子囊亚种FS35作为初始菌株，敲除fkbR1导致子囊霉素的产量比FS35菌株下降了6

4、7.5%；fkbR1敲除菌株中回补表达fkbR1，子囊霉素产量基本恢复到亲代菌株的水平。过表达基因fkbR1导致子囊霉素的产量比FS35菌株提高了33.5%，达到了421.6mg/L。RT-PCR分析FS35菌株、fkbR1缺失菌株DfkbR1、fkbR1过表达菌株OfkbR1中子囊霉素合成基因的转录水平，结果显示：DfkbR1菌株中fkbE，fkbF，fkbS和fkbU的转录水平明显下调，而在OfkbR1菌株中fkbE，fkbF，fkbS和fkbU的转录水平明显上调；表明了FkbR1只影响基因簇上部分基因的转录水平。DfkbR1和FS

5、35菌株中引入含fkbR1启动子的β-葡糖苷酸酶报告系统，DfkbR1菌株中报告基因的转录水平及其酶活较FS35菌株显著提高，说明了FkbR1负调控自身基因fkbR1表达。通过体外凝胶迁移阻滞电泳分析（EMSA）和体内染色体免疫共沉淀（ChIP）确定了调控因子FkbR1直接调控的靶基因，结果表明FkbR1与fkbR1-fkbE间隔区结合，调控靶基因fkbE和fkbF的转录。通过基因工程改造手段，研究了靶基因fkbE和fkbF对子囊霉素合成的作用。过表达fkbE，子囊霉素的产量提高了45.6%；敲除fkbE，子囊霉素降低了75%。而过表达

6、基因fkbF，子囊霉素的产量没有明显变化；敲除基因fkbF，子囊霉素的产量降低了14.5%。表明FkbR1调控的靶基因fkbE是生物合成子囊霉素的关键基因。以正调控基因fkbR1和子囊霉素合成的关键基因fkbE为基础，构建了fkbR1和fkbE组合过表达菌株OfkbRE，子囊霉素产量比FS35菌株提高了69.9%，达到了536.7mg/L。本研究为合理改造调控基因及其靶基因，构建高产子囊霉素工程菌株提供了理论基础与策略。关键词：FkbR1；子囊霉素；转录调控因子；靶基因；吸水链霉菌子囊亚种IABSTRACTAscomycin(FK520

7、),amacrocyclicpolyketidenaturalantibiotic,displayshighantifungalandimmunosuppressiveactivity.Ascomycinanditsderivativesshowdiversebiologicalandpharmacologicalactivities,containingantispasmodic,anti-malarial,anti-fungal,nerveregenerationandfunctionalrecovery.Especiallyast

8、heeffectedimmunosuppressiveagents,ascomycinanditsderivativeshaveattractedattentionforpotentialtreatment