紫杉醇对人骨肉瘤细胞凋亡及对bcl2、bax基因表达的影响论文

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1、紫杉醇对人骨肉瘤细胞凋亡及对bcl2、bax基因表达的影响论文张春林，曾炳芳，董扬，张长青，眭述平，罗从风，陆男吉，高峰【摘要】目的了解紫杉醇诱导人骨肉瘤细胞的凋亡效果.freelanosteosaracellsinducedbypaclitaxel,andtherelationshipbetinedbycellcountinacytometerchamber.Viabilityorphologicalterationsittingelectronmicroscope.Thepercentageofapoptosisof

2、osteosaracellMG63easuredbyTdTmediateddUTPNickEndLabelingtechnique(TUNEL)stainingmethodandfloetryusingAnnexinV/PIdoublestainingmethodafter0,24,48,72and96hoursofcultureinthepresenceorabsenceofpaclitaxel.Theexpressionofapoptosisregulatedgenebcl2andbaxmunohistochem

3、icalstaining.ResultsAtimedependentanddosedependentcellgroorphologicalchangesofchromatincondensation,chromatincrescentformation,nucleusfragmentation.TheDNAcleavageprovedtheexpressionofapoptosisregulatedgenebax.ConclusionPaclitaxelisabletoinducetheapoptosisinhum

4、anosteosaracellsthroughtheinitiationofG2/Mphasearrestandinhibitingmitosisinbothatimedependentanddosedependentmanner.Thisapoptosismaybemediatedbydoancoulter公司。bcl2和bax单克隆抗体购自华美生物技术有限公司。1.2细胞培养和条件人骨肉瘤细胞MG63获得自中山大学病理系（细胞源自美国ATCC细胞库）。采用不同作用时间（24~96h）和不同浓度（0.001~1μm

5、ol·L-1）紫杉醇对骨肉瘤细胞MG63进行作用。1.3体外细胞生长抑制检测采用0.4%(G63细胞生存能力进行评估，细胞培养48h后，被不同浓度的紫杉醇作用24~96h，然后用0.25%胰酶消化收集，采用0.4%胎盼蓝染色，于细胞记数板记数计算活细胞率。每种条件重复3次，取均值。1.4电子显微镜观察细胞被0.1μmol·L-1紫杉醇作用后24~96h，用胰酶消化后收集，用4%戊二醛固定，浸泡于Epon821中，用包埋液包埋，于60℃烘箱内固化72h。超薄切片机切片约50~60nm厚，用3%醋酸铀枸橼酸铅双染色，然后用透

6、射电镜观察，并拍照。1.5TUNEL检测骨肉瘤细胞MG63凋亡采用原位缺口末端标记（TUNEL）检测试剂盒进行检测，阴性对照为不加入荧光素标记的dUTP。细胞用光镜和荧光显微镜观察。凋亡指数（AI）用以下公式来计算：AI=凋亡的细胞数目/总的细胞数×100%。1.6流式细胞术检测采用流式细胞术（AnnexinVFITCPI）对细胞周期和细胞凋亡进行动态观察检测，在FACSort流式细胞仪(BectonDickinson)上进行。检测数据采用ModiFitlTV2.0程序分析。1.7免疫组织化学染色采用免疫组织化学LS

7、AB法进行染色。出现棕色处表示抗原抗体结合处，用光镜观察并拍照(×200)，对照组不加一抗。阳性率(PR)用以下公式计算：PR=阳性细胞数/细胞总数×100%。1.8统计方法采用Duntt(2sided)检验ANOVA统计分析方法对资料进行统计分析。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1体外细胞生长抑制的检测图1不同浓度紫杉醇作用不同时间骨肉瘤细胞MG63活细胞率（略）紫杉醇对MG63细胞有明显的生长抑制作用。在同一浓度条件下，活细胞率随着作用时间的延长而降低；在相同作用时间条件下，活细胞率随着药物浓度的增高而降低，呈

8、现出时间依赖性和剂量依赖性关系，见图1。0.1μmol·L-1紫杉醇、5μmol·L-1ADM、6.6μmol·L-1DDP、1320μmol·L-1MTX处理48h，活细胞率分别为62.3%、40.4%、71.5%、80.1%，四组的差异有统计学意义（F=687.9,P0.05）。2.2细胞形态学改变