天花粉蛋白对宫颈癌hela细胞凋亡及bax、bcl2基因表达的影响论文

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1、天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞凋亡及bax、bcl2基因表达的影响论文黄益玲，黄利鸣，胡火军，黎家华,张兆祥【摘要】目的研究天花粉蛋白对人宫颈癌HeLa细胞的诱导凋亡作用并探讨其对凋亡相关基因bax和bcl2表达的影响。方法不同浓度天花粉蛋白分别处理HeLa细胞24~72h后，MTT法检测细胞的生长活性,显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞周期,erck公司产品，噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司。一抗bcl2、bax鼠抗人单克隆抗体、βactin羊抗鼠单克隆抗体、二抗HRP标记的羊抗鼠IgG及兔抗羊IgG购于SantaCruzBiotec

2、hnology公司，TCS购自上海金山制药厂。1.1.2主要仪器及设备凝胶成像仪ThermalimagingsystemFTI500为PharmaciaBiotech产品，电转移槽为BioRad公司产品，STORM(PhospherImagerSystem)购自Dynamicmolecular公司。1.2方法1.2.1细胞培养人宫颈癌HeLa细胞为本室传代保存，培养于5%ＣＯ2、37℃湿化孵箱中。培养基MEM含10%FBS，0.1Ｕ/Ｌ青霉素,0.1Ｕ/Ｌ链霉素,取对数生长期细胞待用。1.2.2MTT法测定TCS对HeLa细胞的生长抑制作用取对数生长期

3、的HeLa细胞接种于96孔细胞培养板中(细胞数为每孔2×104个)，12h后加入不同浓度的TCS，每个浓度设6个平行孔，继续培养24、48、72h，每孔加入5μg/mlMTT溶液20μl继续培养4h后加入200μlDMSO溶解，测定570nm处光吸收值，计算细胞生长抑制率。1.2.3细胞形态学观察将处于指数生长期的HeLa细胞以不同浓度的TCS处理后，倒置显微镜下观察HeLa细胞的形态改变。1.2.4流式细胞仪DNA含量分析离心收集经TCS作用的细胞，以含0.2%FBS的PBS清洗后加入75%的冰冷乙醇固定,在10000r/min条件下离心5min，去乙

4、醇，以PBS洗涤2次，弃上清；用0.5mlPBS重新悬浮，然后加入等体积的细胞裂解缓冲液(含1％NP40，50mmol/LTrisHCl，40mmol/LEDTA，pH值7.5)室温作用5min，离心后加入RNase(终浓度30μg/ml)置37℃水浴中消化30min，离心后再加人1mlPI(终浓度50μg/ml)避光染色30min，以300目尼龙网滤过，上流式细胞仪检测，Multicycles软件分析结果。1.2.5TT法发现天花粉蛋白对HeLa细胞生长有明显的浓度依赖性抑制作用,显微镜下观察到细胞圆缩，染色体凝聚等凋亡细胞的形态学改变，流式细胞仪

5、直方图上亦出现特征性的亚二倍体峰，表明TCS对HeLa细胞具有明显的促凋亡作用。细胞凋亡受细胞内一系列基因的网络式精细调控,在细胞凋亡的调控因素中,bcl2家族基因倍受瞩目,其中bcl2基因是原癌基因，其突出作用是抑制细胞凋亡，bcl2蛋白广泛存在于细胞的线粒体膜、细胞膜内表面、内质网、核膜等处。而bax是bcl2的同源基因，它的过表达可拮抗bcl2的保护效应使细胞趋于凋亡67。bax一方面能和bcl2形成异源二聚体抑制凋亡,另一方面其自身还能形成同源二聚体诱导凋亡。有研究表明8，与bax分离的bcl2失去了抗凋亡能力，说明bcl2与b

6、ax的结合是bcl2发挥作用的前提。而当bax在细胞内超表达，并形成同源二聚体时,细胞对死亡信号的反应增强。所以bcl2与bax的比例，是决定细胞接受致病信号刺激后成活与否的关键因素。比例增高细胞不易发生凋亡,而比例降低则导致细胞凋亡。本实验经KN245凋亡中p53、bcl2、cmyc蛋白表达变化J.上海医学，2001,21(4):291294.［4］唐文皓,吴志全,樊嘉,等.天花粉蛋白对荷人肝癌裸小鼠的抑癌作用J.中华肝胆外科杂志,2003,9(4):228230.［5］罗文达，任昌明，朱敏，等.天花粉蛋白诱导NB4人白血病细胞凋亡研究J.

7、中国实验血液学杂志，2005，13（2）：278281.［6］CoryS,AdamsJM.Killingcancercellsbyflippingthebcl2/baxsilyinapoptosissignalling:frommechanisticinsightstotherapeuticopportunitiesJ.ClinExpPharmacolPhysiol,2004，31(3):119128.［8］ChengEH,C,olCell,2001,8(3):705711.